CN105481973A - 一种用于制备渔用免疫佐剂的多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了氨基酸序列如SEQ？ID？NO：1所示的多肽。本发明还公开了所述多肽在制备疫苗的免疫佐剂中的用途。本发明还公开了所述多肽制备的免疫佐剂和佐剂。本发明的IL-8多肽，能显著增强疫苗尤其是海豚链球菌亚单位疫苗的免疫保护效力，可以作为疫苗的佐剂使用；而且本发明多肽使用安全，制备简单、使用方便，为鱼类疾病的防治提供了新的有效选择。

Description

一种用于制备渔用免疫佐剂的多肽及其用途

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种用于制备渔用免疫佐剂的多肽及其用途。

背景技术

随着现代水产养殖集约化程度的日益提高，养殖鱼类暴发的疾病所造成的损失越来越严重，鱼类病害已经成为阻碍水产养殖业健康发展的重要因素。海豚链球菌(Streptococcusiniae，S.iniae)病是一种感染性极强的细菌性疾病，可在包括淡水鱼和海水鱼在内的多种野生或人工养殖鱼类中引起爆发性鱼病，导致鱼群大量死亡。而且，海豚链球菌还可以通过伤口感染人，引发人类蜂窝织炎、心内膜炎、关节炎、脑膜炎、脊髓炎等。

海豚链球菌病目前主要依靠化学药物进行防治，但化学疗法有很多弊端，会带来抗药性和药物残留问题。相比而言疫苗接种既可有效地预防水产动物疾病，又能避免抗生素等药物对水环境和水产品本身造成的污染，已成为国际上水产疫病防控的主流方向。

随着海豚链球菌基因工程疫苗的发展，对免疫佐剂的需求也大为增加。免疫佐剂也称佐剂或抗原佐剂，不仅可以增强抗原的免疫原性而且还可以提高免疫效果。传统免疫佐剂是简单化合物形式,如油佐剂或简单铝盐等。但是,由于许多佐剂可以引起剧烈的局部反应或全身毒性反应而应用受限。细胞因子是机体的自身成分，不会对机体产生毒副作用，相比传统佐剂具有独特的优势。

目前还没有将细胞因子用于制备海豚链球菌疫苗免疫佐剂的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于制备免疫佐剂的多肽及其用途。

本发明提供了一种氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的多肽。

本发明还提供了编码上述多肽的基因。

进一步地，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。

本发明还提供了氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的蛋白，或者上述基因在制备免疫佐剂中的用途。

其中，所述免疫佐剂是渔用疫苗的免疫佐剂。

其中，所述免疫佐剂是海豚链球菌亚单位疫苗的免疫佐剂。

进一步地，所述海豚链球菌亚单位疫苗的抗原是氨基酸序列如SEQIDNO：3所示的多肽。

本发明还提供了一种免疫佐剂，它是以氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的多肽，加入药学上可接受的辅助性成分制备而成的制剂。

本发明还提供了一种疫苗，它包括抗原以及上述免疫佐剂。

进一步地，所述抗原是氨基酸序列如SEQIDNO：3所示的多肽。

SEQIDNO：1所示多肽的氨基酸序列：

GEGKAERCFCQKKALEKVRPALVKKFEVFPPSASCSNTGIILSLKQGMKVCLDPEGNQGQKVLTGQKLKIKSKGRRGKKQKKIKQQN

SEQIDNO：2所示基因的核苷酸序列：

ggagaaggaaaagcagagcgttgtttctgccaaaagaaagcactggaaaaggtaagacctgcacttgtgaagaagtttgaggtattccctccaagtgcctcctgttcaaatactgggatcatattatctctgaagcaaggaatgaaggtctgcctggacccagaaggaaaccaaggacagaaagtcttaactggacagaaactaaagataaagtccaagggaagaaggggaaagaagcagaagaagatcaaacagcaaaactga

SEQIDNO：3所示多肽的氨基酸序列：

MSIITDVYAREVLDSRGNPTLEVEVYTESGAFGRGMVPSGASTGEHEAVELRDGDKSRYLGLGTEKAVDNVNNIIAEAIIGFDVRDQQAIDRAMIALDGTPDKGKLGANAILGVSIAVVRAAADYLEVPLYNYLGGFNAKVLPTPMMNIINGGSHSDAPIAFQEFMIMPVGAPTFKEALRWGAEVFHALKKILKERGLVTAVGDEGGFAPKFEGTEDGVETILKAIEAAGYEAGENGIMIGFDCASSEFYDKERGVYDYTKFEGEGAAVRTSAEQIDYLEELVNKYPIITIEDGMDENDWDGWKVLTERLGGRVQLVGDDFFVTNTDYLARGIKEEAANSILIKVNQIGTLTETFEAIEMAKEAGYTAVVSHRSGETEDSTIADIAVATNAGQIKTGSLSRTDRIAKYNQLLRIEDQLGEVAQYKGIKSFYNLKK

本发明的斑点叉尾鮰IL-8多肽，能显著增强疫苗尤其是海豚链球菌亚单位疫苗的免疫保护效力，可以作为疫苗的佐剂使用；本发明的免疫疫苗制备简单、安全有效；而且本发明多肽和疫苗使用方便，为海豚链球菌病的防治提供了新的有效选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是斑点叉尾鮰IL-8成熟肽基因的PCR扩增(A)和重组克隆质粒pMD19-T-mCcIL-8的PCR鉴定以及单、双酶切鉴定(B)图；

A.M：DNA分子质量标准(DL2000)；1：PCR产物；

B.M1：DNA分子质量标准(DL2000)；1：pMD19-T-mCcIL-8的PCR鉴定；2：pMD19-T-mCcIL-8的双酶切鉴定(EcoRⅠ和XhoⅠ)；3：pMD19-T-mCcIL-8的单酶切鉴定(EcoRⅠ)；M2：DNA分子质量标准(DL10000)。

图2是重组表达质粒pET32a(+)-mCcIL-8的PCR鉴定以及单、双酶切鉴定图；

M1：DNA分子质量标准(DL2000)；1：pET32a(+)-mCcIL-8的PCR鉴定；2：pET32a(+)-mCcIL-8的双酶切鉴定(EcoRⅠ和XhoⅠ)；3：pET32a(+)-mCcIL-8的单酶切鉴定(EcoRⅠ)；M2：DNA分子质量标准(DL10000)。

图3是重组表达质粒pET32a(+)-mCcIL-8表达产物的SDS-PAGE分析图；

M：蛋白质分子质量标准；1：未诱导表达pET-32a(+)/BL21(DE3)产物；2：诱导表达pET-32a(+)/BL21(DE3)产物；3：未诱导表达pET-32a(+)-mCcIL-8/BL21(DE3)产物；4：诱导表达pET-32a(+)-mCcIL-8/BL21(DE3)。

图4是重组表达质粒pET32a(+)-mCcIL-8表达产物的可溶性分析及纯化(A)和重组mCcIL-8蛋白的Western-blot检测(B)图；

A.M：蛋白质分子质量标准；1：未诱导表达pET-32a(+)/BL21(DE3)产物；2：诱导表达pET-32a(+)/BL21(DE3)产物；3：未诱导表达pET-32a(+)-mCcIL-8/BL21(DE3)产物；4：诱导表达pET-32a(+)-mCcIL-8/BL21(DE3)；5：诱导表达pET-32a(+)-mCcIL-8/BL21(DE3)超声波裂解上清；6、诱导表达pET-32a(+)-mCcIL-8/BL21(DE3)超声波裂解沉淀；7、纯化后的重组mCcIL-8蛋白；

B.M：预染蛋白分子质量标准；1：重组mCcIL-8蛋白。

图5是各组试验鱼血清溶菌酶活力图。

图6是各组试验鱼血清ACH₅₀活性图。

图7是各组试验鱼抗体水平检测图。

图8是qRT-PCR检测各组试验鱼免疫相关基因的表达图。

说明：图5-8中，大写字母A、B、C和D表示各组分别与PBS组、rmCcIL-8组、S.iniae-rENO组和S.iniae-rENO+rmCcIL-8组相比差异极显著(P<0.01)，小写字母a、b、c和d表示各组分别与PBS组、rmCcIL-8组、S.iniae-rENO组和S.iniae-rENO+rmCcIL-8组相比差异显著(P<0.05)。

图9是不同试验组攻毒后各组的累计死亡率统计图。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

本发明所用的实验材料与仪器如下：

1、动物

健康斑点叉尾鮰(80±10g)购于四川蒲江某养殖场，试验前暂养于四川农业大学水产系水泥养殖池(1.5×1.0×1.5m³)，暂养一周，期间每天按照鱼体重3％投喂商品浮性饲料，养殖水体为曝气自来水，水温26±3℃，每天换水一次，每次三分之一。

2、疫苗、质粒和菌株

亚单位疫苗S.iniae-rENO(S.iniaeα-Enolase，重组海豚链球菌eno基因亚单位疫苗，由本实验室构建)；克隆载体pMD19-T(Simple)购自宝生物工程(大连)有限公司；表达载体pET-32a(+)购于Invitrogen公司，由四川农业大学鱼病研究中心保存；大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司；斑点叉尾鮰源S.iniae分离株DGX07，由本实验室分离鉴定并保存。

3、试剂

脑心浸液培养基(Brainheartinfusion，BHI)购于美国Difco公司；样品保护剂(SampleProtectorforRNA/DNA)和试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG和His-Tag抗体购于ABGENT公司；DAB显色液、考马斯亮蓝R-250和可溶型单组分TMB底物溶液购自天根生化科技(北京)有限公司；T4DNA连接酶、预染和非预染蛋白质Marker购自Thermoscientific公司；绵羊红细胞(SRBC)购于郑州百基生物科技有限公司；麻醉剂(间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，简称MS222)购于上海布西化工科技有限公司；Tris碱、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS、过硫酸铵、TEMED、2-巯基乙醇、溴酚蓝、氨苄青霉素、微球菌粉、鸡蛋清溶菌酶、HBSS(无酚红)、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)和Ni-NTA-sefinoseColumn(BSP079-3)亲和层析柱购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

4、仪器

PowerPac100型蛋白电泳仪(Bio‐Rad)；SmartSpec3000型核酸蛋白检测仪(Bio‐Rad)；Biologicduoflow10/40型高压液相层析系统(Bio‐Rad)；StepOnePlus^TMReal‐TimePCRsystem(LifeTechnologies)；90‐1型恒温磁力搅拌器(上海泸西分析仪器厂)；新芝‐JY92‐ⅡDN超声波粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

实施例1本发明多肽的制备

1、本发明基因的制备

设计引物：上游引物(P1)5'端和下游引物(P2)5'端加上酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，序列如下：

P15'-CGGAATTCGGAGAAGGAAAAGCAGAG-3'(划线部分为EcoRⅠ酶切位点)；

P25'-CCCTCGAGTCAGTTTTGCTGTTTGATCT-3'(划线部分为XhoⅠ酶切位点)。

以斑点叉尾鮰脾脏cDNA为模板，P1和P2为引物，PCR扩增本发明IL-8基因(简称mCcIL-8)，采用25μL反应体系，见表1。

表1本发明基因的PCR扩增体系

PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃1min，59.7℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃，10min；12℃，forever。

扩增得到本发明IL-8基因(简称mCcIL-8)(见图1A)。

mCcIL-8基因的核苷酸序列如下所示：

ggagaaggaaaagcagagcgttgtttctgccaaaagaaagcactggaaaaggtaagacctgcacttgtgaagaagtttgaggtattccctccaagtgcctcctgttcaaatactgggatcatattatctctgaagcaaggaatgaaggtctgcctggacccagaaggaaaccaaggacagaaagtcttaactggacagaaactaaagataaagtccaagggaagaaggggaaagaagcagaagaagatcaaacagcaaaactga

2、构建重组表达载体及重组菌

将本发明IL-8基因纯化，连接pMD19-T(Simple)载体得pMD19-T-mCcIL-8重组载体(见图1B)。转化DH5α感受态细胞，然后抽提质粒pMD19-T-mCcIL-8。

用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切质粒pMD19-T-mCcIL-8，将酶切得到的IL-8基因片段连接到表达载体pET32a(+)，得重组表达载体pET-32a(+)-mCcIL-8(见图2)。

将pET-32a(+)-mCcIL-8转化至BL21(DE3)感受态细胞，得重组菌。

3、重组菌的诱导表达

(1)将重组菌划线接种于含Amp的LB固体培养基上，37℃过夜培养，次日挑取单菌落接种于10mLLB液体培养基中，200r/min振荡培养过夜；

(2)将上步培养的菌液按照1:50(V/V)的比例接种于含Amp的10mLLB培养基中，剧烈振培养至OD₆₀₀为0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导表达。同时设置未加入IPTG诱导的空载体转化菌、IPTG诱导的空载体转化菌和未加入IPTG诱导的pET-32a(+)-mCcIL-8转化菌作为对照。

(3)取1mL各表达的菌液4℃，8000g离心1min，弃去上清，沉淀用20mmol/L的Tris-HCl(pH＝8.0)洗涤一次后，加入4mL，20mmol/L的Tris-HCl(pH＝8.0)重悬。将含目的质粒的菌体连续冻融三次，然后在冰浴条件下超声波破碎菌体(150W下，工作3s，间隔5s，连续20次)。对破碎后的菌液在4℃，8000g离心10min，将上清转移至另一容器中；沉淀用1mL8Mol/L尿素溶解。对上清和沉淀各取40μL，分别加入10μL的5×SDS上样缓冲液，沸煮15min，瞬时离心后，进行SDS-PAGE(见图3)。

在诱导温度37℃，诱导IPTG浓度0.1mmol/L，诱导时间5h的条件下进行大量诱导表达，诱导后的菌体经反复冻融，超声波破碎后分离上清和沉淀，发现表达重组蛋白主要以包涵体形式存在(图4A，泳道6)

4、重组蛋白(重组mCcIL-8，简称rmCcIL-8)的分离纯化

将沉淀用含2M尿素的包涵体洗涤液洗涤，洗涤后8000r/min，10min离心倒去上清，连续洗涤三次，每次约5min；最后用含8M尿素的缓冲液溶解重组蛋白，溶解至清亮为准。将溶解后的溶液用0.45μm孔径的滤膜过滤。

按照Ni-NTA-SefinoseColumn(BSP079-3)纯化系统操作说明进行纯化。纯化后的蛋白经SDS-PAGE检验纯度后，分别在6M尿素、4M尿素、2M尿素和PBS缓冲液中进行梯度透析复性，透析后用聚乙二醇12000进行浓缩，用核酸蛋白仪检测浓度，重组蛋白经纯化、复性和浓缩后测其浓度为2.4Mg/mL(图4A，泳道7)。

小量分装后存储于﹣80℃备用。

5、重组蛋白的Western-blot检测

将重组蛋白采用12.5％浓度的凝胶进行SDS-PAGE电泳分离后，转移至PVDF膜上，进行重组蛋白的融合检测。具体步骤如下：

①将SDS-PAGE电泳后的凝胶浸泡在转移缓冲液中，并剪切6张与凝胶大小一致的滤纸和一张PVDF膜；

②将经转移缓冲液浸泡过的滤纸、海绵垫及经甲醇浸泡并用转移缓冲液漂洗过的PVDF膜，按照“海绵垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫”的顺序在转移盒负极上叠放；

③在冰浴条件下，100V转移3h；

④取出PVDF膜，加入3％的牛血清白蛋白(BSA)/TBST，37℃轻摇封闭2h；

⑤倒掉封闭液，TBST洗膜3次，10min/次；

⑥以0.5％的BSA/TBST的兔抗His-tag抗体(1:1000稀释)为一抗，37℃孵育1h；

⑦弃一抗，用TBST洗膜3次，10min/次，洗膜后用羊抗兔HRP-IgG(1:5000稀释)为二抗，37℃孵育1h，TBST洗膜3次，10min/次；

⑧按照增强型HRP-DAB底物显色试剂盒相关说明加入显色液，显色5～30min，待目的条带清晰可见，用双蒸水迅速洗膜终止显色，避光干燥保存。

重组蛋白进行Western-blot分析，结果表明目的条带与抗His单抗发生特异性反应(图4B，泳道1)，确证pET-32a(+)-mCcIL-8/BL21(DE3)分泌表达了重组mCcIL-8蛋白。

mCcIL-8蛋白的氨基酸序列如下所示：

GEGKAERCFCQKKALEKVRPALVKKFEVFPPSASCSNTGIILSLKQGMKVCLDPEGNQGQKVLTGQKLKIKSKGRRGKKQKKIKQQN

实施例2本发明亚单位疫苗的制备

一、抗原制备

以斑点叉尾鮰脾脏cDNA为模板，P3、P4为引物，

P3：5'-CGCGGATCCATGTCAATTATTACTGATG-3'(划线部分为BamHI酶切位点)；

P4：5'-CGGAAGCTTCTATTTTTTTAGGTTGTAG-3'(划线部分为HindIII酶切位点)；

扩增获得1308bp的S.iniaeа-enolase基因；

S.iniaeа-enolase基因的核苷酸序列如下所示：

将S.iniaeа-enolase基因插入pET32a(+)得到pET32-eno，进一步转入BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌株；

对重组菌株以0.1mMIPTG37℃诱导4h，离心收集菌体。菌体经超声波破碎后收集上清，按照Ni-NTA-SefinoseColumn(BSP079-3)纯化系统操作说明进行纯化；

纯化后的重组蛋白ENO(简称rENO)经SDS-PAGE检验纯度后，分别在梯度尿素和PBS缓冲液中进行梯度透析复性，透析后用聚乙二醇进行浓缩，得到S.iniae-rENO蛋白，用核酸蛋白仪检测浓度，备用。

S.iniae-rENO蛋白的氨基酸序列如下所示：

MSIITDVYAREVLDSRGNPTLEVEVYTESGAFGRGMVPSGASTGEHEAVELRDGDKSRYLGLGTEKAVDNVNNIIAEAIIGFDVRDQQAIDRAMIALDGTPDKGKLGANAILGVSIAVVRAAADYLEVPLYNYLGGFNAKVLPTPMMNIINGGSHSDAPIAFQEFMIMPVGAPTFKEALRWGAEVFHALKKILKERGLVTAVGDEGGFAPKFEGTEDGVETILKAIEAAGYEAGENGIMIGFDCASSEFYDKERGVYDYTKFEGEGAAVRTSAEQIDYLEELVNKYPIITIEDGMDENDWDGWKVLTERLGGRVQLVGDDFFVTNTDYLARGIKEEAANSILIKVNQIGTLTETFEAIEMAKEAGYTAVVSHRSGETEDSTIADIAVATNAGQIKTGSLSRTDRIAKYNQLLRIEDQLGEVAQYKGIKSFYNLKK

二、本发明疫苗制备

取S.iniae-rENO蛋白，加入实施例1得到的重组mCcIL-8蛋白，S.iniae-rENO蛋白与mCcIL-8蛋白的重量比为5:2，加上药学上可接受的辅料，制备而成。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

试验例1本发明多肽的免疫效果检测

1、实验试剂

利用核酸蛋白仪测定S.iniae-rENO蛋白和实施例1制备的重组蛋白(rmCcIL-8)的浓度，并用PBS将rENO蛋白稀释至250μg/mL，将rmCcIL-8蛋白稀释至100μg/mL。

2、免疫及采血

免疫前随机挑选5尾斑点叉尾鮰进行尾静脉采血，通过凝集试验检测其血清能否与菌株DGX07进行反应，同时将5尾试验鱼的肝脏和肾脏分别接种于BHI平板，观察有无细菌感染。鉴定结果都为阴性的试验鱼方可使用。

320尾健康斑点叉尾鮰随机分成4组，每组80尾，试验水温为26±3℃，各组免疫剂量为200μL，空白组注射无菌PBS，各组免疫一次，具体免疫程序见表2。

表2免疫程序和剂量

免疫后分别在第1、3、7、14、21、28、35、42和56d进行尾静脉采血，每个组随机选取5尾鱼用MS-222进行麻醉，每尾采集0.3mL。采集的血液室温静置2h后转入4℃冰箱，放置过夜，然后4000g离心30min，收集血清，放﹣20℃备用。

3、免疫指标检测

下述试验数据均用平均值±标准差(Mean±SD)表示，试验结果采用SPSS21.0软件进行统计学分析。在方差同质性检验后用单因方差分析对数据进行分析，若P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。

(1)血清溶菌酶活力检测

利用冻干的微球菌粉通过浊度分析法测定各组斑点叉尾鮰免疫后第1、3、7、14、21、28和56d的血清溶菌酶活力，每组三个样本，每样本重复三次。具体操作步骤如下：

①柠檬酸盐缓冲液(pH＝5.5，0.02mol/L)将待测血清稀释10倍；

②取15μL加入到U型底96孔板中，每个样品设置3个重复；

③每孔加入150μL，0.2Mg/mL的微球菌粉(用上述的柠檬酸盐缓冲液溶解稀释)，迅速在OD值为450nm的吸光度下测定初始吸光度；

④将含有底物的待测样品放置于37℃恒温箱孵育1h，在相同的吸光度下测定最终的OD值。

采用相同的方法，以鸡蛋白溶菌酶做标准曲线，测定值应该在标准曲线有效范围之内。溶菌水平以U/mL表示，0.001/min表示一个单位U。

试验结果：

各时间点各组试验鱼的血清溶菌酶活力见图5。

结果显示：S.iniae-rENO+rmCcIL-8组在免疫后第1、3和7d均极显著(P<0.01)高于S.iniae-rENO组，并于第3d达到峰值；S.iniae-rENO组和rmCcIL-8组在第1、3和7d均极显著(P<0.01)高于PBS组，分别于第7d和第3d达到峰值，S.iniae-rENO组在第14d极显著(P<0.01)高于PBS组；第21d后各组血清溶菌酶活性无显著差异。表明：在免疫后14d内，与对照组相比，重组mCcIL-8蛋白和亚单位疫苗S.iniae-rENO均能明显提高斑点叉尾鮰的溶菌酶活力，而当重组mCcIL-8蛋白与S.iniae-rENO混合使用后，刺激斑点叉尾鮰产生溶菌酶的能力更强。

(2)补体旁路途径溶血活性的测定(ACH₅₀)

测定各组斑点叉尾鮰免疫后第1、3、7、14、21、28和56d的ACH₅₀活性，每组三个样本，每样本重复三次。具体操作步骤如下：

①将绵羊红细胞(SRBC)用HBSS(无酚红)溶液洗涤三次，稀释浓度为2.5×10⁸cells/mL；

②待测血清稀释用HBSS缓冲液进行连续梯度稀释，分别为：10倍、20倍、40倍、80倍、160倍和320倍，并且使用相同体积的蒸馏水和HBSS分别作为完全溶血和不溶血对照；

③每个浓度下的液体取100μL加入到96孔板中，然后加入25μL的SRBC；

④将板子在20℃温和振荡条件下孵育100min，然后400g，4℃离心5min；

⑤小心吸取上清100μL加入到新的96孔板中，并在415nm下测定吸光度值。

值Y(SRBC在不同稀释度的溶解百分比)是于1995年由科学家Sunyer和Tort确定的。血清稀释系数X，由Y的对数表示，使用补体溶血方程式：logX/logY/(1-Y)表示。50％溶血/mL的稀释度为ACH₅₀。

试验结果：

重组mCcIL-8蛋白对斑点叉尾鮰ACH₅₀的影响见图6。结果：

S.iniae-rENO+rmCcIL-8组在免疫后第1和3d的ACH₅₀活性显著(P<0.05)高于S.iniae-rENO，于第7d达到峰值；S.iniae-rENO组在第1、3、7和14d均极显著(P<0.01)高于PBS组，于第7d达到峰值；rmCcIL-8组在第1、3、和7d均高于PBS组，其中第1和3d差异性达到极显著(P<0.01)，于第3d达到峰值；第21d后各组ACH₅₀活性无显著差异。表明：重组mCcIL-8蛋白能够提高斑点叉尾鮰ACH₅₀水平，且作为佐剂能提高S.iniae-rENO诱导鱼体产生ACH₅₀的水平。

(3)抗体水平检测

采用间接酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)法检测疫苗组和PBS组斑点叉尾鮰免疫后第7、14、21、28、35、42和56d的抗rENO抗体水平，每组三个样本，每样本重复三次，具体步骤为：

①包被：将抗原rENO蛋白用包被液稀释至50μg/mL，取100μL加入到96孔板(50μg/孔)，4℃过夜包被；

②用低盐洗涤液洗涤96孔板3次后，用1％的BSA封闭，250μL每孔，22℃湿盒孵育2h；

③用低盐洗涤液洗涤96孔板3次后，疫苗组待测血清分别用PBS稀释100倍，以注射PBS的鱼血清为阴性对照并且稀释同样倍数，各血清分别加入96孔板中，每孔100μL，22℃湿盒孵育3h或4℃过夜；

④用高盐洗涤液洗涤96孔板5次，最后一次孵育5min后，向孔中加入兔抗斑点叉尾鮰IgM血清(2000倍稀释)，100μL/孔，22℃湿盒孵育60min；

⑤用高盐洗涤液洗涤96孔板5次，最后一次孵育5min后，向孔中加入5000倍稀释的HRP标记的羊抗兔IgG血清，100μL/孔，22℃湿盒孵育60min；

⑥用高盐洗涤液洗涤96孔板5次，最后一次孵育5min后，加入100μL/孔染液，22℃孵育5min；

⑦向孔中加入100μL/孔的显色液，避光放置，室温显色15min后，每孔加入100μL的终止液，用酶标仪在450nm下记录结果。

试验结果：

采用间接ELISA的方法测定斑点叉尾鮰血清中抗rENO抗体水平见图7。

结果：在免疫后第14d检测到疫苗组出现了特异性抗体；

S.iniae-rENO+rmCcIL-8组在第14d到42d的抗体水平显著(P<0.05)高于S.iniae-rENO组，于第28d达到峰值；第35d抗体水平下降。表明：重组mCcIL-8蛋白能提高S.iniae-rENO的抗体水平。

(4)免疫相关基因的表达

在第一次攻毒(免疫后第28d)后的24h时，分别从疫苗组和PBS组中随机挑取5尾鱼，取其头肾组织并放入含组织样5倍体积样品保护剂的离心管中，提取头肾组织的总RNA，反转录为cDNA，进行实时定量反转录PCR(Quantitativerealtimereversetranscriptase-PCR，qRT-PCR)检测。

根据GenBank中斑点叉尾鮰EF-1a、IL-1β、TNF-α、CXCL10、MHCⅡβ、CD4-L2、MHCⅠα、CD8α和IFN-γ2等基因的序列送生工生物工程(上海)有限公司设计并合成qRT-PCR引物(表3)。对合成的引物进行特异性检测，以头肾cDNA为模板对各个基因进行PCR扩增。

表3qRT-PCR引物

首先将反转录后的cDNA模板进行5倍梯度稀释，进行qRT-PCR反应，制作标准曲线，其中EF-1a作为内参基因。如IL-1β和EF-1a标准曲线的相关系数：反应的扩增效率应在90-105％之间，R²>0.990，方可进行下一步反应。

qRT-PCR反应在StepOnePlus^TM仪器上进行，参照SYBRgreenPCRsupermix染料说明书，具体操作如下：

①PCR反应体系和条件

10μL的反应体系：5μL的染料，2.9μL的ddH₂O，上下游特异性引物各0.45μL，1μL的cDNA模板和0.2μL的ROX(Ⅰ)。反应条件：95℃，30s；(95℃，5s，58℃，30s)×40循环；95℃，15s。

②溶解曲线的制作

扩增反应结束后，降温至60℃，然后每个2s上升0.3℃，直到加热到95℃停止。Tm值(溶解温度)与PCR扩增产物的序列有关，对于某一PCR产物，其值是固定的。因此，可以通过对融解曲线分析，就可以确定PCR反应的特异性。

③定量数据的处理

在点样排版的过程中，每个组做3个生物重复，每个样品做3个技术重复，每次反应设置空白对照。采用2^-△△Ct法计算目的基因mRNA的表达量，各个目的基因的所有数据都是相对于内参基因EF-1a的表达量。

试验结果：

qRT-PCR结果见图8。

结果显示：相比于S.iniae-rENO组，S.iniae-rENO+rmCcIL-8组IL-1β、TNF-α、CXCL10、MHCⅡβ、CD4-L2和MHCⅠα等基因的相对表达量都呈现上升趋势，而IL-1β、TNF-α、CXCL10和MHCⅡβ等基因的相对表达量得到极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)上调。表明：在毒株S.iniaeDGX07攻毒24h后，重组mCcIL-8蛋白促使亚单位疫苗S.iniae-rENO产生更强的免疫反应和MHCⅡ类抗原提呈反应。

4、攻毒试验

将菌株DGX07在健康斑点叉尾鮰体内复壮后，接种于BHI肉汤，于28℃过夜培养。

在免疫后第21d从各组随机选取试验鱼25尾，在80×60×60cm³的水族箱中暂养一周后进行攻毒试验，试验水温用加热棒控制在28±1℃，养殖用水为曝气自来水，每天换水三分之一。以1.0×10⁸cfu/fish(20×LD₅₀)的剂量为攻毒浓度，每尾腹腔注射0.2mL，攻毒后连续观察14d，观察并记录死亡情况，对濒死和死亡鱼进行肝脏和肾脏的细菌接种，确定死亡原因。

以相对免疫保护率表示疫苗的保护效果：

相对免疫保护率(Relativepercentsurvival，RPS)＝[1-(免疫组死亡率％/对照组死亡率％)]×100％。

试验结果：

在免疫后第28d进行攻毒试验，得到S.iniae-rENO组和S.iniae-rENO+rmCcIL-8组的保护效应，具体数值见表4和图9。

表4各试验组攻毒后死亡情况统计

结果显示：攻毒后，rENO组和rENO加蛋白佐剂疫苗组对海豚链球菌均有保护力，RPS分别为49.99％和71.42％，无疫苗组第2d就开始陆续死亡，死亡高峰为第4d和第5d，而疫苗组死亡进程相对缓慢。可见，重组mCcIL-8蛋白佐剂能够提高S.iniae-rENO的RPS。

可见，重组mCcIL-8蛋白能够显著增强S.iniae-rENO诱导的溶菌酶活力和ACH₅₀活性；能够显著提高S.iniae-rENO诱导斑点叉尾鮰产生抗体的水平；能够促进IL-1β、TNF-α、CXCL10和MHCⅡβ等免疫调节因子的分泌来增强免疫反应，使S.iniae-rENO产生更强的免疫反应和MHCⅡ类抗原提呈反应；攻毒试验表明S.iniae-rENO只具有中等免疫保护效果，RPS为49.99％，重组mCcIL-8蛋白能提高S.iniae-rENO的RPS至71.42％，能增强S.iniae-rENO的免疫保护效力，诱导鱼体产生更强的保护免疫力。

综上，本发明的斑点叉尾鮰IL-8多肽能够显著增强S.iniae-rENO的免疫保护效力，能作为有效的细胞因子蛋白佐剂；本发明的免疫疫苗制备简单、安全有效；而且本发明多肽和疫苗使用方便，生产成本低，为海豚链球菌病的防治提供了新的有效选择，应用前景良好。

Claims (10)

1.氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的多肽。

2.编码权利要求1所述多肽的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。

4.权利要求1所述多肽，或者权利要求2或3所述基因在制备免疫佐剂中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述免疫佐剂是渔用疫苗的免疫佐剂。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述免疫佐剂是海豚链球菌亚单位疫苗的免疫佐剂。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述海豚链球菌亚单位疫苗的抗原是氨基酸序列如SEQIDNO：3所示的多肽。

8.一种免疫佐剂，其特征在于，它是以权利要求1所述多肽，加入药学上可接受的辅助性成分制备而成的制剂。

9.一种疫苗，其特征在于，它包括抗原以及权利要求8所述的免疫佐剂。

10.根据权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述抗原是氨基酸序列如SEQIDNO：3所示的多肽。