CN110592033A

CN110592033A - 一种牙鲆海豚链球菌pdha1多表位多肽

Info

Publication number: CN110592033A
Application number: CN201910685693.5A
Authority: CN
Inventors: 绳秀珍; 刘敏; 战文斌; 唐小千; 邢婧
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2019-07-28
Filing date: 2019-07-28
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2039-07-28
Also published as: CN110592033B

Abstract

本发明提供一种牙鲆海豚链球菌PDHA1多表位多肽，包含有四个由多肽接头进行连接的海豚链球菌PDHA1蛋白表位肽，所述的海豚链球菌PDHA1蛋白表位肽的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1‑4。本发明再一个方面提供一种海豚链球菌PDHA1多表位疫苗，其中抗原为上述的多表位多肽。本发明所制备的PDHA1多表位疫苗能够为牙鲆抗S.iniae感染提供较强的免疫保护，且保护效果明显好于PDHA1重组亚单位疫苗以及S.iniae全菌灭活疫苗。

Description

一种牙鲆海豚链球菌PDHA1多表位多肽

技术领域

本发明属于免疫抗原制备技术领域，具体涉及一种牙鲆海豚链球菌(Streptococcus iniae)丙酮酸脱氢酶E1α亚单位(PDHA1)的多表位多肽，及该多表位多肽在制备疫苗中的应用。

背景技术

海豚链球菌(S.iniae)是一种革兰氏阳性菌，呈卵圆形，菌体直径约1.5μm，有荚膜，链状排列，属链球菌科链球菌属(Streptococcus)。海豚链球菌广泛分布于海淡水环境中，可感染多种海淡水养殖鱼类如牙鲆(Paralichthys olivaceus)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、真鲷(Chrysophrysmajor)、罗非鱼(Oreochromis nilotica)等，给水产养殖业造成重大的经济损失。海豚链球菌也可感染人类，引起细菌性蜂窝织炎、脑膜炎、心内膜炎和感染性关节炎。使用抗生素及化学药物可防止海豚链球菌病的暴发，但是容易产生耐药菌株，造成药物残留影响水产品的质量安全，同时也会污染水环境。相对于药物防治，疫苗接种被普遍认为是一种控制鱼类病害的有效方法，具有安全、环保的优点，能为鱼体提供有效的保护。

目前，已有海豚链球菌福尔马林灭活疫苗、改良活疫苗、DNA疫苗和亚单位疫苗的研究资料，但尚无关于海豚链球菌表位疫苗的报道。表位是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称抗原决定簇(antigenic determinant)，它是TCR/BCR及抗体特异结合的基本单位。表位可分为连续表位(线性表位)和不连续表位(构象表位)，在免疫应答中，根据抗原表位所识别的TCR和BCR不同，分为T细胞表位和B细胞表位。B细胞表位分为线性表位和构象表位，表位大小一般不超过20个氨基酸，能被机体识别且能够刺激机体产生抗体，是蛋白质抗原性的基础，也是诱导机体产生免疫应答的基本结构。自然发生的免疫反应不能识别所有的表位，而是集中于相对较少的表位。由于表位在疫苗设计、疾病预防、诊断和治疗等方面具有巨大的潜力，因此，表位的研究成为热点。表位疫苗是以抗原表位为基础制备的新型疫苗，相较于传统疫苗，避免了完全抗原中其它不利表位的副作用，提高了安全性，代表未来疫苗的研制方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种牙鲆海豚链球菌PDHA1多表位多肽，并使用该多表位多肽来制备疫苗；从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种牙鲆海豚链球菌PDHA1多表位多肽，包含有四个由多肽接头进行连接的海豚链球菌PDHA1蛋白表位肽，所述的海豚链球菌PDHA1蛋白表位肽的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1-4；

所述的多肽接头，其氨基酸序列为GGGG、EAAAK、AAY、GPGPG；更优选的，所述的多肽接头为KK；

作为优选，所述的牙鲆海豚链球菌PDHA1多表位多肽的一种具体氨基酸序列为SEQID NO:5；

编码上述多表位多肽的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:6；

本发明还提供一种重组工程菌株，用于重组表达上述的多表位多肽。

本发明再一个方面提供一种海豚链球菌PDHA1多表位疫苗，其中抗原为上述的多表位多肽。

本发明所制备的PDHA1多表位疫苗能够为牙鲆抗S.iniae感染提供较强的免疫保护，且保护效果明显好于PDHA1重组亚单位疫苗以及S.iniae全菌灭活疫苗。

附图说明

图1：海豚链球菌PDHA1蛋白的二级结构分析图；

图2：海豚链球菌PDHA1蛋白分子三级结构模型；

图3：ELISA检测合成肽与牙鲆血清抗体的反应，其中A为PDHA1抗原表位多肽与牙鲆抗PDHA1血清结合反应；B为表位多肽与牙鲆抗海豚链球菌血清结合反应；

图4：模拟表位串联肽MEPIP的亲水性、抗原性及表面可及性预测图；

图5：多表位多肽rMEPIP反应原性鉴定，其中M：分子量标准蛋白；1：阴性对照，未加诱导剂的表达菌；2：加入诱导剂的表达菌；3：纯化后的蛋白；4：重组蛋白与牙鲆抗S.iniae血清反应；5：阴性对照；

图6：海豚链球菌攻毒后FKC、rPDHA1、rMEPIP及PBS组牙鲆的相对免疫保护率；

图7：免疫FKC、rPDHA1、rMEPIP及PBS后牙鲆外周血、头肾CD4-1⁺/CD4-2⁺/CD8β⁺T淋巴细胞比例变化柱状图，其中A/A1：各组外周血、头肾中CD4-1⁺T淋巴细胞比例变化柱状图；B/B1：各组外周血、头肾中CD4-2⁺T淋巴细胞比例变化柱状图；C/C1：各组外周血、头肾中CD8β⁺T淋巴细胞比例变化柱状图；

图8：免疫FKC、rPDHA1、rMEPIP及PBS后牙鲆外周血(A)、脾脏(B)、头肾(C)sIgM⁺淋巴细胞比例变化柱状图；

图9：ELISA测定免疫FKC、rPDHA1、rMEPIP及PBS后1-7w牙鲆血清中总抗体水平的变化柱状图(A)，以及抗海豚链球菌特异性抗体水平的变化柱状图(B)。

具体实施方式

本发明提供的海豚链球菌PDHA1蛋白的B细胞串联多表位多肽分子结构序列，通过分析获得的抗原表位的连接顺序和间隔序列，确定以KK接头的连接顺序为最佳串联方式，设计获得各表位间相对独立，抗原参数好的海豚链球菌PDHA1多表位串联序列。

下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明。

实施例1：生物信息学方法分析PDHA1蛋白的B细胞线性抗原表位

1、预测抗原表位

1)以海豚链球菌PDHA1蛋白氨基酸序列(WP_003099247.1)为分析材料，利用SOPMAServer对海豚链球菌PDHA1蛋白的二级结构进行预测。结果显示，PDHA1基因中无规则卷曲占25.78％，β-转角为13.04％。α-螺旋和延伸链即β-折叠分别占45.65％和15.53％，各种结构在海豚链球菌PDHA1蛋白氨基酸序列中的分布情况见图1。

2)应用DNAStar Protean生物信息学软件及在线网站(IEDB:http://tools.iedb.org/main/bcell/and ProtScale:http://us.expasy.org/)分析蛋白二级结构中的柔性区域和可塑性区域，预测氨基酸的亲水性(Hydrophilicity Plot-Kyte-Doolittle)、柔韧性(Flexible Regions-Karplus-Schulz)、抗原性(Antigenic Index-Jameson-Wolf)和表面可及性(Surface Probability Plot-Emini)，通过综合各个软件和网站分析上述多参数预测结果，取位于β-转角和无规则卷曲区域，以及亲水性指数≥0、表面可及性指数≥1和抗原性指数≥0的氨基酸区段作为可能的蛋白B细胞线性表位。经分析预测获得5条PDHA1蛋白的B细胞线性表位，详细见表1。

表1：海豚链球菌PDHA1蛋白的B细胞线性抗原表位预测表

(3)用PyMOL明确优势表位在蛋白三维结构中的位置，结果显示P1、P2、P4、P5肽段序列大部分位于蛋白结构表面，而P3肽段序列则位于蛋白结构内面(图2)。

因此，根据各表位在蛋白三维结构中的位置，初步确定了4条海豚链球菌PDHA1蛋白表位，其氨基酸序列与位置如下：

P1：NHRGHGQSIAKDMD(aa 65-78)(SEQ ID NO:1)；

P2：AGKATGVSKGRGGS(aa 87-100)(SEQ ID NO:2)；

P4：KYRTKEEVDAWKEK(aa 252-265)(SEQ ID NO:3)；

P5：RAYLTAEGIATDEE(aa 272-283)(SEQ ID NO:4)。

2、间接酶联免疫法(ELISA)筛选鉴定有效抗原表位

(1)将原核表达的海豚链球菌PDHA1蛋白及灭活S.iniae与弗氏完全佐剂按1:1的比例混合均匀免疫牙鲆，14天后再用与弗氏不完全佐剂1:1混匀的蛋白加强免疫，加强免疫后14天尾静脉取血，分离血清用于检测。

(2)人工合成预测获得的表位多肽，每条多肽合成量为5mg，合成多肽纯度大于95％。

(3)将合成的表位肽溶解于PBS中，并调整浓度为40.0、20.0、10.0、5.0和2.5μg/mL,每孔100μL加入96孔酶标板中，同时设置空白对照，4℃包被过夜或37℃孵育3h。

(4)弃去孔内包被液后，每孔加入180μL PBST(含0.5％的Tween-20的PBS)洗涤3次，每次5min；200μL/孔3-5％的牛血清白蛋白(BSA)，37℃封闭1.5h。

(5)弃去封闭液后PBST洗涤3次，每次5min；不同抗原浓度的1-10孔中分别加入稀释度为1:10、1:50、1:100、1:200、1:400的血清，37℃孵育1h，孵育阴性血清作为对照。

(6)洗涤3次，然后每孔加入100μL鼠抗牙鲆IgM单克隆抗体(2D8，1:1000)，37℃孵育1h。

(7)洗涤3次；每孔加入100μL碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG(1:3000)，37℃孵育45min。

(8)洗涤3次；每孔加入100μL pNPP发色液，显色3-5min后，用酶标仪测定吸光值(405nm)。以P/N≥2.1判断为阳性，筛选出抗原和抗体的最佳反应浓度。

(9)根据条件优化的结果调整多肽浓度包被酶标板，以牙鲆抗蛋白PDHA1和抗全菌血清为一抗，用酶标仪测定吸光值(405nm)。计算阳性血清与阴性血清吸光值之比(P/N)，当P/N≥2.1时为阳性，并根据OD值的大小间接反映各表位免疫反应性的高低。

结果显示，预测的表位肽P3与抗血清的反应性明显低于其他4个表位肽，结合三维结构分析结果，最终选择了P1、P2、P4和P5表位。表位肽P1、P2、P4、P5均能与牙鲆抗PDHA1血清抗体发生较强反应，且反应活性依次为P1＞P2＞P5＞P4；另外，4个表位肽均能与牙鲆抗S.iniae血清反应(图3)，说明筛选获得的表位保留了海豚链球菌蛋白PDHA1的免疫反应性。

实施例2：串联多表位多肽分子结构的设计及重组表达载体的构建

1、串联多表位多肽的构建

(1)将鉴定获得的抗原表位采用不同多肽接头(GGGG，EAAAK，AAY，KK，GPGPG)及不同连接方式排列组合进行串联，确定最佳连接方式。结果显示PDHA1以KK接头(P1-KK-P2-KK-P3-KK-P4)的连接顺序进行串联后，各表位间相对独立，抗原参数好(图4)。该串联多表位多肽命名为MEPIP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5:

NHRGHGQSIAKDMDKKAGKATGVSKGRGGSKKKYRTKEEVDAWKEKKKRAYLTAEGIATDEE。

(2)获得各表位的基因序列，同时根据大肠杆菌表达系统的核苷酸嗜性将接头多肽对应的核苷酸序列逆转为相应的基因序列(SEQ ID NO:6)，并在串联多表位PDHA1(MEPIP)基因序列5’端和3’端分别加上BamHⅠ/SacⅠ和SacⅠ/HindIII酶切位点、保护性碱基以及终止密码子，经密码子优化后获得多表位多肽序列，送至上海生工生物工程有限公司合成并克隆至pET-28a质粒，形成重组质粒。

2、重组多表位疫苗的表达和纯化

(1)重组表达

将测序后含有重组质粒的阳性菌接种于6mL含卡那抗生素的LB液体培养基中(抗生素与培养基配比为1:1000)，37℃恒温震荡培养5h。转接到600mL已添加600μL卡那抗生素的LB液体培养基中扩大培养，当OD600达到0.6时取出1mL菌液用作后续SDS实验对照组，剩余菌液加入6mL IPTG(0.1M)诱导剂，继续震荡培养12h后取1mL诱导后的菌液，8000×g离心5min，灭菌PBS重悬，用于诱导效果检测。

(2)十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

取20μL已重悬的未诱导和诱导的菌液于灭菌的0.5mL离心管中，加入等量样品缓冲液，混匀后煮沸15min，冷却。取蛋白分子量标准品(Marker)加入等量的样品缓冲液，煮沸5min，冷却。将处理过的样品加入上样孔中，每孔内加样品10μL，在恒流条件下，起始时用低电流(30-40mA)，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，加大电流(50-70mA)，电泳至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳，取出凝胶；放置在考马斯亮蓝染液中染色1h。置于脱色液中，于摇床上缓缓摇晃进行脱色，直至条带清晰，停止脱色。

(3)蛋白层析纯化

①确认诱导成功的菌液用离心机离心(8000×g，10min，4℃)，弃上清，收集菌体，PBS洗涤1次，用约40-50mL的Binding buffer(Na₂HPO₄ 14.5g；NaH₂PO₄ 1.48g；NaCl 29.3g；尿素480g；40mM咪唑；pH 7.4，超纯水定容至1L，滤膜过滤)重悬，置于冰上，超声破碎仪破碎(3s on，3s off，功率37％)至淡黄色清澈液体，8000×g离心5min后，取上清，4℃保存待用。

②连接仪器：连接上样杯、His标签蛋白亲和层析柱等，检测装置密闭性。

③清洗管道和层析柱：用超纯水清洗仪器管道A、B和蛋白亲和层析柱，然后用配制好的0.2M NiSO₄溶液活化层析柱，再用超纯水清洗上样管道和层析柱至离子水平趋于稳定。

④Binding buffer平衡层析柱：将上样管A置于Binding buffer中，调仪器模式，以20mL/min清洗上样管，清洗1min，随后调整为Load模式以2mL/min清洗层析柱至离子水平趋于稳定。

⑤上样：用10mL注射器将样品缓缓推入上样杯中，调整为Inject模式，以流速1mL/min上样5-6mL至吸光度值曲线趋于稳定。

⑥Binding buffer再次平衡层析柱：调整模式为Load模式，流速为2mL/min，Binding buffer洗脱未与Ni2+结合的杂蛋白至离子水平曲线趋于稳定。

⑦收集：Elution buffer(Na₂HPO₄ 14.5g；NaH₂PO₄ 1.48g；Na₂HPO₄ 14.5g；NaH₂PO₄1.48g；NaCl 29.3g；尿素480g；500mM咪唑；pH 7.4，超纯水定容至1L，滤膜过滤)进行洗脱，设定收集体积(100-200mL)，以20mL/min清洗B管，清洗1min，调整为Load模式2mL/min，洗脱目的蛋白并收集。重复以上步骤，进行样品收集。

⑧样品收集结束后，依次用Stripping buffer、超纯水、20％酒精清洗管和层析柱，最后拆除层析柱于4℃保存。

(4)Western Blot鉴定多表位多肽的反应原性

①SDS-PAGE步骤参考实例4中的操作步骤，将SDS-PAGE的凝胶浸泡于电泳缓冲液中(Gly 14.42g，Tris-Base 3.03g，甲醇200mL，蒸馏水定容至1L)，剪取与分离胶相同大小的PVDF膜，甲醇中浸润30s后超纯水中浸泡2min，置于电泳缓冲液中。

②将转膜黑夹子浸泡于电泳缓冲液中，铺上3层滤纸后，PVDF膜朝上置于滤纸上，再将分离胶铺在PVDF膜上，最后铺上已浸润过缓冲液的3层滤纸，合上夹子固定，置于转移槽中，连接电泳仪，30V、2h条件下进行电转移。

③取出PVDF膜甲醇中稍作浸润后，丽春红(丽春红粉末0.5g，冰乙酸1mL，加蒸馏水定容至100mL)染色，将Maker剪下，然后将膜剩余部分用超纯水冲洗至无色后，浸泡于3-5％BSA，37℃封闭1h；

④PBST洗涤3次，每次5min，牙鲆抗灭活S.iniae血清和健康牙鲆血清作为一抗，倒入平皿中，PVDF膜浸入其中，37℃恒温培养箱中孵育1h；

⑤PBST洗涤3次后，加入鼠抗牙鲆IgM单抗(1:3000)，37℃孵育1h；PBST洗涤3次后，加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG抗(1:5000)孵育，37℃孵育1h；

⑥将PVDF膜放入氮唑蓝/5-溴-4-氯-3吲哚-磷酸盐(NBT-BCIP)发色液(避光条件下，66μL NBT贮存液，10mL NBT-BCIP底物缓冲液中，33μL BCIP贮存液)中发色，并以去离子水洗涤终止反应。

结果显示，重组质粒MEPIP的阳性表达菌经IPTG诱导后，在14kDa处条带加粗，且与预期蛋白分子量大小一致，而作为阴性对照的未诱导大肠杆菌在相同位置条带没有加粗，证明成功诱导表达了目的蛋白MEPIP。诱导表达成功的重组蛋白经His亲和层析柱纯化后条带单一，表明纯化效果理想，并通过Western blot分析重组蛋白与牙鲆抗S.iniae血清的反应情况，结果显示rMEPIP能发生显色反应，表明构建的多表位多肽具有良好的反应原性(图5)。

实施例3：PDHA1多表位疫苗在为牙鲆抗S.iniae感染提供免疫保护中的应用

(1)牙鲆的免疫与取样

①实验设置实施例2制备的多表位多肽MEPIP的重组蛋白(rMEPIP)、重组亚单位疫苗(rPDHA1)、灭活海豚链球菌(FKC)及PBS阴性对照共4个组，每组牙鲆100尾，BCA法测定蛋白浓度并用无菌PBS调整各蛋白浓度至2mg/mL，用弗氏完全佐剂润滑后的注射器分别吸取疫苗蛋白及弗氏完全佐剂，连接管连接，注射乳化器混匀至其混合物在水中不扩散。阴性对照组注射等体积的佐剂和PBS。

②免疫前及免疫后1d、3d、5d、7d、2w、3w、4w、5w、6w、7w每组随机取牙鲆，取样前用MS-222(100mg/L)麻醉牙鲆。取外周血、脾、头肾于抗凝剂中并提取白细胞用于流式细胞术检测。于1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w尾静脉取外周血，4℃静置过夜，5000×g离心10min获得血清，置于-20℃备用。取牙鲆脾脏、头肾、后肠的部分组织，用灭菌PBS冲洗后置于组织保护液中于-20℃中保存。

(2)攻毒实验

疫苗免疫后5周，对照组和免疫组各组分别随机取30尾牙鲆，进行攻毒实验，用于相对免疫保护率(RPS)的测定。-80℃取出S.iniae毒力株NUF849于冰上静置，解冻后接种于5mL BHI液体培养基中，28℃震荡培养4h后转接于600mL BHI液体培养基中扩大培养，28℃下震荡培养24h后，5000×g，4℃离心10min，倒掉培养基，无菌PBS重悬菌体，重复洗涤3次，收集菌体。无菌PBS调整菌液浓度至10⁷cfu/mL于4℃保存备用。每尾牙鲆腹腔注射100μL浓度为10⁷cfu/mL的S.iniae进行攻毒，每日观察并持续记录，统计各组牙鲆15天的发病及死亡状况，计算相对免疫保护率：RPS(％)＝(对照组死亡率-免疫组死亡率)/对照组死亡率×100％。

结果显示，灭活疫苗FKC、重组亚单位疫苗rPDHA1、多表位疫苗rMEPIP和PBS组的死亡率分别为46.67％、30.0％、23.33％和90％，由此可根据公式计算得到FKC、rPDHA1、rMEPIP各组的免疫保护率分别为48.15％、62.96％和74.07％(图6)，多表位疫苗rMEPIP明显高于PDHA1重组亚单位疫苗和全菌灭活疫苗。

(3)多表位疫苗免疫后牙鲆T/B淋巴细胞比例的应答

①每组随机取12尾牙鲆，取牙鲆外周血、脾脏和头肾，利用percoll不连续密度梯度离心分离获取牙鲆外周血白细胞。将提取的牙鲆外周血白细胞用无菌PBS缓冲液稀释成细胞密度为1×10⁷cells/ml的细胞悬液。

②分别以兔抗牙鲆CD4-1(1:1000)、CD4-2(1:1500)、CD8β(1:1000)多抗和鼠抗牙鲆IgM单抗2D8(1:1000)为第一抗体孵育白细胞，孵育骨髓瘤上清作为阴性对照，37℃恒温培养箱中孵育1.5h。

③于680×g、4℃离心5min，并用800μL无菌PBS重悬，重复此操作3次。

④分别加入Alexa Fluor 647标记的羊抗兔IgG(1:1000)、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG(1:256)，37℃孵育45min；

⑤洗涤后，用200μL无菌PBS重悬。利用流式细胞仪检测外周血、脾脏和头肾中CD4-1⁺、CD4-2⁺、CD8β⁺T淋巴细胞及sIgM⁺B淋巴细胞比例。

结果显示，各免疫组外周血、脾脏、头肾中CD4-1⁺、CD4-2⁺、CD8β⁺T淋巴细胞比例均呈现先上升后下降的趋势，于第3d/5d达到峰值(图7，以外周血和头肾为例)；各免疫组sIgM⁺B淋巴细胞水平上升，且于第4w/5w达到峰值，表明各免疫组均能够诱导鱼体产生免疫，其中rMEPIG组在各个组织中sIgM⁺B淋巴细胞峰值水平均高于其他组(图8)。

(4)ELISA检测牙鲆血清总抗体水平

①用移液枪将各免疫组各时间点牙鲆血清，每孔200μL加入96孔酶标板中4℃包被过夜或37℃孵育3h；以健康牙鲆血清作为阴性对照，每组设3个平行。

②甩去孔内包被液，倒扣于滤纸上，每孔加入200μL PBST，置于摇床上，洗涤3次，每次5min。

③200μl/孔加入3-5％牛血清白蛋白(BSA)，37℃培养箱中封闭1.5h。

④洗涤后，每孔加入100μl鼠抗牙鲆IgM单克隆抗体(2D8，1:1000)，37℃孵育1h。

⑤洗涤后，每孔加入100μl碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG(1:3000)，37℃孵育45min。

⑥洗涤后，每孔加入100μl pNPP发色液(10ml发色液中加入5-10mg PNPP-Na)，显色3-5min后，用酶标仪测定吸光度值(405nm)。

结果显示，免疫组均能诱导总抗体水平的上升，于第1w开始上升，第4w达到峰值后缓慢下降。其中rPDHA1免疫组诱导的牙鲆总抗体水平较其他免疫组高(图9，A)。

(5)ELISA检测牙鲆抗血清中特异性抗体水平

①无菌PBS调整海豚链球菌浓度至10⁹cfu/mL，用移液枪每孔加入200μL于96孔酶标板中4℃包被过夜或37℃孵育3h。

③200μL/孔加入3-5％BSA，37℃培养箱中封闭1.5h。

④洗涤后每孔加入100μL各免疫组各时间点牙鲆血清，以健康牙鲆血清作为阴性对照，每组设3个平行，37℃孵育1h。

⑤洗涤后每孔加入100μL鼠抗牙鲆IgM单克隆抗体(2D8，1:1000)，37℃孵育1h。

⑥洗涤后每孔加入100μL碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG(1:3000)，37℃孵育45min。

⑦洗涤后每孔加入100μL pNPP发色液，显色3-5min，用酶标仪测定吸光值(405nm)。

结果显示，各免疫组中，抗S.iniae的特异性抗体的产生均呈现先增加达到峰值后逐渐降低的趋势。多表位疫苗rMEPIP组的抗菌特异性水平高于PDHA1重组研单位疫苗以及全菌灭活疫苗组(图9，B)。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明请求保护的范围。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种牙鲆海豚链球菌PDHA1多表位多肽

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asn His Arg Gly His Gly Gln Ser Ile Ala Lys Asp Met Asp

1 5 10

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Gly Lys Ala Thr Gly Val Ser Lys Gly Arg Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Lys Tyr Arg Thr Lys Glu Glu Val Asp Ala Trp Lys Glu Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Ala Tyr Leu Thr Ala Glu Gly Ile Ala Thr Asp Glu Glu

1 5 10

<210> 5

<211> 62

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asn His Arg Gly His Gly Gln Ser Ile Ala Lys Asp Met Asp Lys Lys

1 5 10 15

Ala Gly Lys Ala Thr Gly Val Ser Lys Gly Arg Gly Gly Ser Lys Lys

20 25 30

Lys Tyr Arg Thr Lys Glu Glu Val Asp Ala Trp Lys Glu Lys Lys Lys

35 40 45

Arg Ala Tyr Leu Thr Ala Glu Gly Ile Ala Thr Asp Glu Glu

50 55 60

<210> 6

<211> 186

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caccgtggac atggtcaatc aattgcaaaa gacatggatc ttaagaagaa agctacagga 60

gtctcaaaag ggcgtggtgg ctcaatgcat aagaagcgta ctaaagaaga agttgatgct 120

tggaaagaaa aagatccaaa gaagtacctt acagcagaag gaattgcaac agatgaggaa 180

cttgat 186

Claims

1.一种牙鲆海豚链球菌PDHA1多表位多肽，其特征在于，所述的多表位多肽包含有四个由多肽接头进行连接的海豚链球菌PDHA1蛋白表位肽，所述的海豚链球菌PDHA1蛋白表位肽的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1-4。

2.如权利要求1所述的多表位多肽，其特征在于，所述的多肽接头是氨基酸序列为GGGG、EAAAK、AAY、GPGPG的多肽接头。

3.如权利要求1所述的多表位多肽，其特征在于，所述的多肽接头是氨基酸序列为KK的多肽接头。

4.如权利要求1所述的多表位多肽，其特征在于，所述的多表位多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

5.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1-4任一项所述的多表位多肽。

6.如权利要求5所述的基因，其特征在于，所述的基因的的核苷酸序列为SEQ ID NO:6。

7.一种重组工程菌株，其特征在于，所述的重组工程菌株用于重组表达权利要求1-4任一项所述的多表位多肽。

8.一种海豚链球菌疫苗，其特征在于，所述的疫苗中使用的抗原包含有权利要求1-4任一项所述的多表位多肽。

9.如权利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述的多表位多肽是使用权利要求7所述的重组工程菌株表达制备的。

10.如权利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗中使用了亚单位疫苗佐剂。