CN109387637A - 丹参注射液细菌内毒素检测方法 - Google Patents

丹参注射液细菌内毒素检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109387637A
CN109387637A CN201811189137.0A CN201811189137A CN109387637A CN 109387637 A CN109387637 A CN 109387637A CN 201811189137 A CN201811189137 A CN 201811189137A CN 109387637 A CN109387637 A CN 109387637A
Authority
CN
China
Prior art keywords
test
endotoxin
test sample
interference
bacterial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811189137.0A
Other languages
English (en)
Inventor
杨强
黄筱萍
李涛
廖远征
王瑾
姚欣
蒲虹橙
唐茜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SICHUAN SUNNYHOPE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Original Assignee
SICHUAN SUNNYHOPE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SICHUAN SUNNYHOPE PHARMACEUTICAL CO Ltd filed Critical SICHUAN SUNNYHOPE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority to CN201811189137.0A priority Critical patent/CN109387637A/zh
Publication of CN109387637A publication Critical patent/CN109387637A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种丹参注射液内毒素检查方法，属于药物领域，包括如下步骤：（1）内毒素限值L的确定；（2）鲎试剂灵敏度复核步骤；（3）干扰试验预试验，确定供试品至少稀释20倍；（4）供试品干扰试验步骤，确定不干扰稀释倍数为80倍；（5）供试品细菌内毒素检测步骤。本发明方法快速、灵敏，在确定了内毒素限值和稀释倍数后，可直接对待测供试品进行检测，无需再次进行试验来确定稀释倍数，在保证检测准确的同时，减少检验成本、提高检验效率、方便生产过程监控及检验工作的开展。

Description

丹参注射液细菌内毒素检测方法
技术领域
本发明属于药物领域，特别涉及一种丹参注射液细菌内毒素检测方法。
背景技术
细菌内毒素是G-菌细胞壁上的特有结构，其主要成分是脂多糖，具很强的热原活性。当内毒素通过注射等方式进入血液时，会导致不同程度的内毒素血症。因此，对于注射液应进行细菌内毒素的控制，以确保产品质量，保障用药安全。
细菌内毒素的检测常用方法是家兔热原法和鲎试剂法，目前运用较多的是鲎试剂法。采用该方法进行细菌内毒素检测之前，须进行干扰实验，排除供试品对鲎试剂实验的干扰，确保该方法的准确度。但是现有技术中，所采用的丹参注射液细菌内毒素检测方法存在操作繁琐费时，又不能用于生产过程中的质量监控。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种丹参注射液细菌内毒素检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
丹参注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)内毒素限值L的确定；
(2)鲎试剂灵敏度复核；
(3)干扰试验预试验，确定供试品至少稀释20倍；
(4)供试品干扰试验，确定不干扰稀释倍数为80倍；
(5)供试品细菌内毒素检测。
进一步的，所述细菌内毒素限值L的计算公式为：内毒素限值
进一步的，所述细菌内毒素限值定为：L＝5.0EU/mL。
进一步的，所述供试品干扰试验的次数为至少四次。
进一步的，所述丹参注射液细菌内毒素检测方法还包括热原法验证，所述热原法验证用于进一步验证不合格供试品。
本发明的有益效果为：
本发明方法快速、灵敏，在确定了内毒素限值和稀释倍数后，可直接对待测供试品进行检测，无需再次进行试验来确定稀释倍数，在保证检测准确的同时，减少检验成本、提高检验效率、方便生产过程监控及检验工作的开展。
具体实施例
实施例
1、实验材料及仪器
1.1鲎试剂
标示灵敏度(λ)0.125EU/mL，规格0.1mL/支，批号1712182；标示灵敏度(λ)0.06EU/mL，规格0.1mL/支，批号1607202，有效期均为二年，湛江安度斯生物有限公司生产。标示灵敏度(λ)0.25EU/mL，规格0.1mL/支，批号16060312；标示灵敏度(λ)0.125EU/mL，规格0.1mL/支，批号17080912；标示灵敏度(λ)0.06EU/mL，规格0.1mL/支，批号17061112有效期均为二年，福州新北生化工业有限公司生产。
1.2细菌内毒素检查用水
规格100mL/瓶，批号170322，含细菌内毒素<0.003EU/mL，湛江安度斯生物有限公司生产。
1.3细菌内毒素工作标准品(冻干)
效价80EU/支，批号150601-201783，中国食品药品检定研究院。
1.4药品
丹参注射液，规格10mL，批号1605105、1603101、1710105；规格20mL，批号1801110，四川升和药业股份有限公司。
1.5仪器
ZRD-A7140型十段编程鼓风干燥箱，温度范围5-300℃；TAL-40试管恒温仪，控温精度37±0.2℃，孔间温差≤0.1℃；ZH-2型孔式旋涡混合仪。
2、方法和结果
2.1细菌内毒素限值L的确定
本品肌内注射，一次2-4mL，一日1-2次；静脉注射，一次4mL(用50％葡萄糖注射液20mL稀释后使用)，一日1-2次；静脉滴注，一次10-20mL(用5％葡萄糖注射液100-5000mL稀释后使用)，一日1次。计算成人一日最大用量为20mL，以此剂量计算内毒素限值为
内毒素限值考虑本品在临床滴注时需使用5％葡萄糖注射液稀释，为了临床用药安全性，将本品细菌内毒素限值定为L＝5.0EU/mL。
2.2鲎试剂灵敏度复核
以细菌内毒素检查用水溶解内毒素工作标准品，并配制成含内毒素2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ系列浓度的溶液，依法进行加样操作。每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照，记录结果，并按式λC＝antilg(∑x/4)计算λC值，见表1。
表1鲎试剂灵敏度复核结果
注：(+)为形成凝胶且倒置180度不变形，(-)为未形成凝胶。
表1结果表明：每一批鲎试剂灵敏度测得值均在0.5λ～2.0λ范围内，符合要求。复核的鲎试剂均按标示灵敏度值使用。
2.3干扰试验预试验
目前，我国常用的鲎试剂灵敏度范围一般在1.0EU/mL～0.03EU/mL之间，故取本品，用细菌内毒素检查用水稀释2.5倍、5倍、10倍、20倍、40倍、80倍系列浓度进行预试。预试结果见表2。
表2丹参注射液细菌内毒素检查干扰试验预试验结果
注：(+)为形成凝胶且倒置180度不变形，(-)为未形成凝胶。
表2预试验结果显示，本品原液、稀释2.5倍、稀释5倍、稀释10倍浓度对内毒素与鲎试剂的反应存在抑制性干扰作用，稀释20倍或20倍以上，可能对反应无干扰作用，确定供试品至少稀释20倍。
2.4供试品干扰试验(1)
取供试品，用细菌内毒素检查用水稀释20倍后，按中国药典2015年版附录细菌内毒素检查法干扰试验项进行实验。
按公式Es＝lg(∑Xs/4)、Et＝lg(∑Xt/4)计算用BET水制成的内毒素标准溶液反应终点浓度的几何平均值(Es)和用供试品稀释液制成的内毒素溶液反应终点浓度的几何平均值(Et)，结果见表3。
表3丹参注射液细菌内毒素检查干扰试验结果(1)
注：(+)为形成凝胶且倒置180度不变形，(-)为未形成凝胶。
表3结果显示：丹参注射液稀释20倍，用湛江安度斯生物有限公司生产的鲎试剂试验，结果Et/Es＝1，表明供试品稀释20倍浓度的溶液，对细菌内毒素与鲎试剂的反应无干扰作用；用福州新北生化工业有限公司生产的鲎试剂试验，结果Et/Es>1，表明供试品稀释20倍浓度的溶液，对细菌内毒素与鲎试剂的反应存在干扰作用。
2.4供试品干扰试验(2)
取供试品，用细菌内毒素检查用水稀释40倍后，依法操作进行干扰试验。结果见表4。
表4丹参注射液细菌内毒素检查干扰试验结果(2)
注：(+)为形成凝胶且倒置180度不变形，(-)为未形成凝胶。
表4结果显示：丹参注射液稀释40倍后，用湛江安度斯生物有限公司和福州新北生化工业有限公司的鲎试剂，结果均为Et/Es<2，表明供试品稀释40倍浓度的溶液，对细菌内毒素与鲎试剂的反应无干扰作用。
2.4供试品干扰试验(3)
取供试品，用细菌内毒素检查用水稀释40倍后，依法操作进行干扰试验。结果见表5。
表5丹参注射液细菌内毒素检查干扰试验结果(3)
注：(+)为形成凝胶且倒置180度不变形，(-)为未形成凝胶。
表5结果显示，1611113批、1710105批丹参注射液稀释20倍、40倍，用湛江安度斯生物有限公司的鲎试剂试验，结果为Et/Es＝2，表明供试品稀释20倍、40倍浓度的供试品溶液，对细菌内毒素与鲎试剂的反应有一定的增强性干扰作用，但符合干扰试验要求，可以认为供试品稀释20倍、40倍后对反应无明显干扰作用。
2.4供试品干扰试验(4)
取供试品，用细菌内毒素检查用水稀释80倍后，依法操作进行干扰试验。结果见表6。
表6丹参注射液细菌内毒素检查干扰试验结果(4)
注：(+)为形成凝胶且倒置180度不变形，(-)为未形成凝胶。
表6结果显示，将161113批、1710105批供试品稀释80倍，用湛江安度斯生物有限公司的鲎试剂试验，对反应有轻微的增强性干扰作用，但符合干扰试验要求，可以认为无干扰作用；用福州新北生化工业有限公司的鲎试剂试验，对内毒素与鲎试剂的反应无干扰作用。
供试品1801110批试验结果，供试液阴性对照管呈阳性，添加内毒素2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ系列试验管呈阳性，表明本批供试品含有的细菌内毒素超过5EU/mL，或本批供试品稀释80倍后有较强的增强性干扰作用。
2.5供试品干扰试验(5)
取1801110批丹参注射液，用细菌内毒素检查用水稀释80倍后，重复进行干扰试验。结果见表7。
表7丹参注射液细菌内毒素检查干扰试验结果(5)
注：(+)为形成凝胶且倒置180度不变形，(-)为未形成凝胶。
表7结果显示，1801110批供试品稀释80倍后，使用湛江安度斯生物有限公司的鲎试剂进行重复干扰试验，结果供试液阴性对照管呈阳性，添加内毒素2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ系列试验管呈阳性，表明本批供试品含有的细菌内毒素超过5EU/mL，或本批供试品稀释80倍后有较强的增强性干扰作用。
2.5供试品细菌内毒素检查
取样品，用细菌内毒素检查用水稀释80倍，进行检查。结果见表8。
表8丹参注射液细菌内毒素检查
结果：实验成立，供试品管呈阴性。1603101、1605105、1611113、1710105批供试品结果符合质量标准规定；1801110批供试品结果不符合质量标准规定。
2.6热原法验证
对1801110批供试品进行热原检查，结果本批样品不合格。

Claims (5)

1.丹参注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)内毒素限值L的确定；
(2)鲎试剂灵敏度复核；
(3)干扰试验预试验，确定供试品至少稀释20倍；
(4)供试品干扰试验，确定不干扰稀释倍数为80倍；
(5)供试品细菌内毒素检测。
2.根据权利要求1所述的丹参注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于：
所述细菌内毒素限值L的计算公式为：
3.根据权利要求2所述的丹参注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于：所述细菌内毒素限值定为：L＝5.0EU/mL。
4.根据权利要求3所述的丹参注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于：所述供试品干扰试验的次数为至少四次。
5.根据权利要求1所述的丹参注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于：还包括热原法验证，所述热原法验证用于进一步验证不合格供试品。
CN201811189137.0A 2018-10-12 2018-10-12 丹参注射液细菌内毒素检测方法 Pending CN109387637A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811189137.0A CN109387637A (zh) 2018-10-12 2018-10-12 丹参注射液细菌内毒素检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811189137.0A CN109387637A (zh) 2018-10-12 2018-10-12 丹参注射液细菌内毒素检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109387637A true CN109387637A (zh) 2019-02-26

Family

ID=65427539

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811189137.0A Pending CN109387637A (zh) 2018-10-12 2018-10-12 丹参注射液细菌内毒素检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109387637A (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0670796A (ja) * 1992-05-08 1994-03-15 Seikagaku Kogyo Co Ltd 前処理剤、前処理方法、前処理された試料による測定法、測定用キット及び感染症の診断方法
US5310657A (en) * 1989-10-30 1994-05-10 Whittaker Bioproducts, Inc. Kinetic assay for endotoxin using limulus amebocyte lysate and chromogenic substrate
CN102721795A (zh) * 2012-06-04 2012-10-10 贵州景峰注射剂有限公司 一种参芎葡萄糖注射液的细菌内毒素检查方法
CN103592442A (zh) * 2013-10-29 2014-02-19 王明丽 一种检测重组猪干扰素α1冻干粉针剂中细菌内毒素含量的方法
CN103837673A (zh) * 2014-03-18 2014-06-04 张嵩 一种检测盐酸溴己新原料的细菌内毒素含量的方法
CN104232739A (zh) * 2014-08-18 2014-12-24 中国大冢制药有限公司 枸橼酸原料中细菌内毒素的检测方法
CN107727863A (zh) * 2017-09-14 2018-02-23 三峡大学 酵母浸出物中内毒素含量的检测方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5310657A (en) * 1989-10-30 1994-05-10 Whittaker Bioproducts, Inc. Kinetic assay for endotoxin using limulus amebocyte lysate and chromogenic substrate
JPH0670796A (ja) * 1992-05-08 1994-03-15 Seikagaku Kogyo Co Ltd 前処理剤、前処理方法、前処理された試料による測定法、測定用キット及び感染症の診断方法
CN102721795A (zh) * 2012-06-04 2012-10-10 贵州景峰注射剂有限公司 一种参芎葡萄糖注射液的细菌内毒素检查方法
CN103592442A (zh) * 2013-10-29 2014-02-19 王明丽 一种检测重组猪干扰素α1冻干粉针剂中细菌内毒素含量的方法
CN103837673A (zh) * 2014-03-18 2014-06-04 张嵩 一种检测盐酸溴己新原料的细菌内毒素含量的方法
CN104232739A (zh) * 2014-08-18 2014-12-24 中国大冢制药有限公司 枸橼酸原料中细菌内毒素的检测方法
CN107727863A (zh) * 2017-09-14 2018-02-23 三峡大学 酵母浸出物中内毒素含量的检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
丁红等主编: "《中华医药研究与实践 1996 第2卷》", 30 September 1996, 太原：山西科学技术出版社 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108872582A (zh) 一种基于DNAWalker的适配体传感器、制备方法及其应用
CN104062243A (zh) 一种FXa活性检测试剂及其制备方法和应用
CN104048931A (zh) 一种肝素含量的检测方法
CN104232739A (zh) 枸橼酸原料中细菌内毒素的检测方法
CN108303307A (zh) 一种定量检测皮肤制剂中透明质酸含量的方法
Zawadiak et al. Concurrent iodimetric determination of cumene hydroperoxide and dicumenyl peroxide used for reaction control in dicumenyl peroxide synthesis
CN109387638A (zh) 参麦注射液细菌内毒素检测方法
CN105510590B (zh) 盐酸半胱氨酸细菌内毒素的检测方法
CN103048453B (zh) 一种糖类抗原ca19-9的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法
CN109387637A (zh) 丹参注射液细菌内毒素检测方法
CN101929992B (zh) 一种总有机碳分析仪测定药品包装材料易氧化物的方法
CN101718709A (zh) 一种检测木糖醇注射液细菌内毒素的方法
CN112881382A (zh) 一种食品添加剂柠檬酸钠中硫酸盐含量的测定方法
CN102539352B (zh) 一种硫氰酸盐中氰根的测定方法
WO2023124925A1 (zh) 一种高效低耗检测盐酸平阳霉素原料中痕量铜元素的方法
CN109470533B (zh) 一种用于便携式血糖仪的人源全血基质质控品的制备方法
CN104698053B (zh) 一种二氧化钛‑碳棒微电极、制备方法及其检测血液中对乙酰氨基酚浓度的应用
CN105445467B (zh) 焦亚硫酸钠细菌内毒素的检测方法
CN102721795A (zh) 一种参芎葡萄糖注射液的细菌内毒素检查方法
CN115436542A (zh) 一种鉴别猪肠粘膜肝素中羊来源肝素掺杂比例的方法
Novi et al. Optimization sonication time and dilution factor in determining the concentration of endotoxin challenge vial with kinetic turbidimetric method
WO2022061637A1 (zh) 一种低分子量岩藻糖化糖胺聚糖含量测定方法
CN104166004A (zh) 凝血因子ⅷ质控品制备方法
CN107727863A (zh) 酵母浸出物中内毒素含量的检测方法
CN111781365A (zh) 一种凝胶法检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination