CN105510590B - 盐酸半胱氨酸细菌内毒素的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种盐酸半胱氨酸细菌内毒素的检测方法，包括以下步骤：a.（Ⅰ）按照质量比为盐酸半胱氨酸：碳酸钠=20：15‑20：17的比例称取两种物质并混合，加入细菌内毒素检查用水，使混合溶液中供试品盐酸半胱氨酸的浓度为100mg/ml；（Ⅱ）用细菌内毒素检查用水将供试品盐酸半胱氨酸稀释到1.25mg/ml‑5mg/ml；b.取动态显色法鲎试剂，开启后加入细菌内毒素检查用水复溶；c.将1.25mg/ml‑5mg/ml的供试品盐酸半胱氨酸与步骤b中复溶的鲎试剂等体积混合，放入反应试管中并插到动态试管检测仪中，计算内毒素的含量。本发明避免了动物热原检查法的不足，重现性强，灵敏度高，操作简便。
Description
技术领域
本发明涉及鲎属溶成剂的生物物质，具体是一种盐酸半胱氨酸细菌内毒素的检测方法。
背景技术
半胱氨酸（cysteine，Cys），是一种生物体内常见的氨基酸, 为含硫α-氨基酸之一, 存在于许多蛋白质、谷胱甘肽中, 可由体内的蛋氨酸转化而来, 可与胱氨酸互相转化。半胱氨酸对酸稳定, 而在中性及碱性溶液中易被空气氧化为胱氨酸, 微量铁及重金属可促进其氧化。
盐酸半胱氨酸为氨基酸类药物, 为白色结晶或结晶性粉末, 有臭, 味酸。盐酸半胱氨酸易溶于水, 在乙醇中极微溶解, 在丙酮中几乎不溶。盐酸半胱氨酸有还原性, 可防止非酶褐变和抗氧化作用, 还可用于治疗尿道疾病, 也可用于治疗放射性药物中毒, 重金属中毒, 中毒性肝炎, 血清病等, 并能预防肝坏死症，也可作为常用的抗氧剂，以防止产品氧化。
随着制药工业的发展和科学技术的进步，人们发现革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖 (Lipoplysaccharide)和微量蛋白(Protein)的复合物——细菌内毒素，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质，当机体内毒素浓度阈值>0.005ng/ml时，即可刺激体温调节中枢导致机体发热。
细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的兰色血液中提取变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥而成的生物试剂，专用于细菌内毒素检测。目前国际上销售的鲎试剂有两种，一种称美洲鲎试剂（LAL），由美国生产；另一种称东方鲎试剂（TAL）。TAL与LAL有相同的功效。细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为 0.0001pg/ml，比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，特别适用于注射用原辅料、注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，也是受到各国药典承认的一种通用方法。
盐酸半胱氨酸原料按照《中国药典》2015年版的规定，需要采用家兔升温法进行热原检查。该方法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，按时观察记录家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。家兔法检测内毒素的灵敏度为 0.001pg/ml，试验结果接近人体真实情况，是公认的比较可靠的热原检查方法。但其操作繁琐费，影响因素众多，检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。
目前已经有学者用鲎试剂法检测盐酸半胱氨酸原料的细菌内毒素，其结果是验证了鲎试剂法的可行性，但他们采用的是最常见的凝胶法及动态浊度法来检测的。凝胶法也是药典规定的方法，实验设备要求低，但是该方法是一个限度测定法，这种方法只能分析产品中内毒素的含量有没有超过标准, 而不能够得出确切的定量结果。动态浊度法是最常用的定量测定法, 其比凝胶法灵敏很多，但在灵敏度、检测范围、线性、抗干扰能力、检测结果可靠性等方面均不能得到令人满意的结果，且对鲎试剂消耗量较大，不利于鲎的保护和可持续发展。
因此，需要一种新的检测盐酸半胱氨酸细菌内毒素的方法，可避免以上动物热原检查法、凝胶法、动态浊度法的不足，检测细菌内毒素既省时又省经济，能够满足注射剂及其原辅料检测的需要。
发明内容
本发明就是为了解决凝胶法和动态浊度法检测细菌内毒素在灵敏度、检测范围、线性、抗干扰能力等方面存在的不足，所提出的一种盐酸半胱氨酸细菌内毒素的检测方法。
本发明是按照以下技术方案实现的。
一种盐酸半胱氨酸细菌内毒素的检测方法，包括以下步骤：
a.反应溶液制备
（Ⅰ）按照质量比为盐酸半胱氨酸：碳酸钠=20：15-20：17的比例称取两种物质并混合，加入细菌内毒素检查用水，使混合溶液中供试品盐酸半胱氨酸的浓度为100mg/ml；
（Ⅱ）用细菌内毒素检查用水将供试品盐酸半胱氨酸稀释到1.25mg/ml-5mg/ml；
b.试剂复溶
取动态显色法鲎试剂，开启后依动态显色法鲎试剂使用说明加入细菌内毒素检查用水复溶；
c.加样及反应
将1.25mg/ml-5mg/ml的供试品盐酸半胱氨酸与步骤b中复溶的鲎试剂等体积混合，放入反应试管中并插到动态试管检测仪中，计算内毒素的含量。
步骤a（Ⅰ）中盐酸半胱氨酸：碳酸钠的质量比为5 ：4。
步骤a（Ⅱ）中供试品盐酸半胱氨酸的稀释浓度为2.5 mg/ml。
步骤a（Ⅰ）中的碳酸钠经160-190℃干烤4h以上处理后与盐酸半胱氨酸混合。
所述碳酸钠经170℃干烤4h以上处理后与盐酸半胱氨酸混合。
步骤c中检测温度为37±1℃，最长检测时间为60±2min，检测波长为340nm-660nm。
所述检测波长为405nm。
本发明获得了如下的有益效果。
本发明公开了一种盐酸半胱氨酸原料中细菌内毒素的检测方法，确定使用盐酸半胱氨酸的无干扰稀释浓度及干扰排除方式（以盐酸半胱氨酸与碳酸钠混合，混合比例为20：15-20：17，最佳比例为5：4，排除pH对细菌内毒素检测的干扰）；然后将待测的盐酸半胱氨酸原料稀释成1.25mg/ml-5mg/ml，最佳稀释浓度为2.5mg/ml待测溶液，进行细菌内毒素检测。本发明的盐酸半胱氨酸原料中细菌内毒素的检测方法，可避免动物热原检查法的不足，解决了新开发注射液产品中盐酸半胱氨酸原料的细菌内毒素检查问题；从源头上对无菌产品质量进行定量控制，对保证输液产品的安全性有重要意义。该方法有生物化学的理论基础，更科学；利用酶的分子生化反应，专属性高，重现性强，准确度和灵敏度高；操作简单快速，无需特殊仪器设备，实用性强。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
1.实验材料
1.1供试品
1.2 试剂及仪器
2. 标准曲线选择及最低有效浓度的确定
2.1标准曲线的选择(参见《中国药典》2015年版)
按注射剂每支最大装量为20mL，使用盐酸半胱氨酸抗氧剂最大浓度为0.2%, 临床安全系数为10倍计算，临床一次使用抗氧剂的量为400mg。内毒素限值L = K /M =5 EU/kg÷( 400 mg÷60 kg) =0.75EU/mg。
本试验选取5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml进行干扰初筛试验，故依据。内毒素限值，系列反应溶液中可能含有的最大内毒素量为0.75EU/mg×5mg/ml=3.75 EU/ml，而鲎试剂检测最高灵敏度为0.005 EU/ml，故本次试验选择标准曲线为4点曲线，各点浓度为5EU/ml，0.5 EU/ml，0.05 EU/ml，0.005EU/ml。
2.2最低有效浓度的确定
最低有效浓度MVC=λ/ L=0.005EU/ml÷ 15EU/g=0.33mg/ml
3. 干扰初筛试验
称取1g盐酸半胱氨酸和0.6g碳酸钠（170℃干烤4小时以上除热原）混合， 加10 ml细菌内毒素检查用水(BET水)溶解，得混合溶液浓度为160mg/ml，供试品盐酸半胱氨酸的浓度为100mg/ml。本试验选取5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml进行试验。
3.1反应溶液制备
称取1.0g盐酸半胱氨酸和0.6g碳酸钠（170℃干烤4小时以上），混合后加10 mlBET水溶解，得混合溶液浓度为160mg/ml，供试品盐酸半胱氨酸的浓度为100mg/ml。
供试品（溶液A）稀释过程:
内毒素标准品（溶液C）稀释过程：
供试品阳性对照（溶液B）稀释过程：
阴性对照（溶液D）：细菌内毒素检查用水。
3.2试剂复溶
取动态显色法鲎试剂2支，开启后加入1.25ml 细菌内毒素检查用水复溶，待溶液澄清后，用无热原吸头转移合并至1支。
3.3加样及反应：
将0.1ml上述制备的溶液A、B、C、D分别与0.1ml 鲎试剂加入8×75mm反应试管中，轻轻混匀，插入动态试管检测仪中反应，使用软件计算回收率、内毒素含量等数值。
3.4试验结果
药典要求
（Ⅰ）阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间；
（Ⅱ）标准曲线的相关系数│r│≥0.980；
（Ⅲ）回收率R满足：50%≤R≤200%。
初步确定往样品中加入一定量碳酸钠混合,加BET水溶解后稀释到2.5mg/ml使用动态显色法试剂可排除盐酸半胱氨酸对细菌内毒素检查的干扰，盐酸半胱氨酸与碳酸钠的混合比例为5：4。
4.干扰试验及细菌内毒素定量测定
根据干扰初筛试验结果，初步确定往样品中加入碳酸钠加BET水溶解后稀释到2.5mg/ml使用动态显色法试剂可排除盐酸半胱氨酸对细菌内毒素检查的干扰，盐酸半胱氨酸与碳酸钠混合比例为5：4。本试验取三批盐酸半胱氨酸进行干扰试验。
4.1反应溶液制备
称取三批20120301、20131201、20141201称取1.0g盐酸半胱氨酸和0.6g碳酸钠（170℃干烤4小时以上）混合，加10 mlBET水溶解，得混合溶液浓度为160mg/ml，供试品盐酸半胱氨酸浓度为100mg/ml。
三批20120301、20131201、20141201供试品（溶液A）按以下稀释过程稀释：
内毒素标准品（溶液C）稀释过程：
三批20120301、20131201、20141201供试品阳性对照（溶液B）按以下稀释过程稀释：
阴性对照（溶液D）：细菌内毒素检查用水。
4.2试剂复溶
取动态显色法鲎试剂2支，开启后加入1.25ml 细菌内毒素检查用水复溶，待溶液澄清后，用无热原吸头转移合并至1支。
4.3加样及反应
将0.1ml上述制备的溶液A、B、C、D分别与0.1ml 鲎试剂加入8×75mm反应试管中，轻轻混匀，插入动态试管检测仪中反应。
4.4试验结果
药典要求
（Ⅰ）阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间；
（Ⅱ）标准曲线的相关系数│r│≥0.980；
（Ⅲ）回收率R满足：50%≤R≤200%。
在盐酸半胱氨酸中加入碳酸钠溶解后稀释到2.5mg/ml使用动态显色法试剂可排除盐酸半胱氨酸对细菌内毒素检查的干扰，盐酸半胱氨酸与碳酸钠混合比例为5：4。
Claims (7)
1.一种盐酸半胱氨酸细菌内毒素的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.反应溶液制备
（Ⅰ）按照质量比为盐酸半胱氨酸：碳酸钠=20：15-20：17的比例称取两种物质并混合，加入细菌内毒素检查用水，使混合溶液中供试品盐酸半胱氨酸的浓度为100mg/ml；
（Ⅱ）用细菌内毒素检查用水将供试品盐酸半胱氨酸稀释到1.25mg/ml-5mg/ml；
b.试剂复溶
取动态显色法鲎试剂，开启后依动态显色法鲎试剂使用说明加入细菌内毒素检查用水复溶；
c.加样及反应
将1.25mg/ml-5mg/ml的供试品盐酸半胱氨酸与步骤b中复溶的鲎试剂等体积混合，放入反应试管中并插到动态试管检测仪中，计算内毒素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种盐酸半胱氨酸细菌内毒素的检测方法，其特征在于：步骤a（Ⅰ）中盐酸半胱氨酸：碳酸钠的质量比为5 ：4。
3.根据权利要求1所述的一种盐酸半胱氨酸细菌内毒素的检测方法，其特征在于：步骤a（Ⅱ）中供试品盐酸半胱氨酸的稀释浓度为2.5 mg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种盐酸半胱氨酸细菌内毒素的检测方法，其特征在于：步骤a（Ⅰ）中的碳酸钠经160-190℃干烤4h以上处理后与盐酸半胱氨酸混合。
5.根据权利要求4所述的一种盐酸半胱氨酸细菌内毒素的检测方法，其特征在于：所述碳酸钠经170℃干烤4h以上处理后与盐酸半胱氨酸混合。
6.根据权利要求1所述的一种盐酸半胱氨酸细菌内毒素的检测方法，其特征在于：步骤c中内毒素的检测温度为37±1℃，最长检测时间为60±2min，检测波长为340nm-660nm。
7.根据权利要求6所述的一种盐酸半胱氨酸细菌内毒素的检测方法，其特征在于：所述检测波长为405nm。
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