CN103740836A - 用于检测肺炎支原体的荧光定量pcr引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测肺炎支原体的荧光定量PCR引物及其应用。本发明所提供的引物对特异于肺炎支原体的16SrRNA基因或ATPase基因，可为引物对1（序列1和序列2）或引物对2（序列3和序列4）或引物对3（序列5和序列6）。实验证明，利用本发明所提供的引物对对待测样本进行荧光定量PCR检测，与其他商品化检测引物以及IgM抗体检测法和培养法相比，本发明方法能够特异性检测MP，不受MP亲缘关系较近的4种常见病原支原体和呼吸道常见细菌和真菌病原菌的干扰。该方法除可以定性检测MP外还可以很好的定量检测MP，是一种快速、特异性强、灵敏度高、适合临床使用的检测所有株肺炎支原体的定量PCR检测技术，在临床检测中具有非常好的检测效果和应用价值。

Description

用于检测肺炎支原体的荧光定量PCR引物及其应用
技术领域
本发明属于病原体检测领域，涉及用于检测肺炎支原体的荧光定量PCR引物及其应用。
背景技术
肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）是呼吸道感染（包括社区获得性肺炎，CAP）中非常重要的病原体。肺炎支原体肺炎广泛存在于全球范围内，多为散发病例，约3-6年发生一次地区性流行，流行时间可长达1年，流行年份的发病率可以达到非流行年份的数倍，容易在学校、幼儿园及军队等人员比较密集的环境中集中发病。最近的一项包括亚洲地区在内的全球性CAP病原学调查结果显示，肺炎支原体肺炎占CAP的12％，在所有非典型病原体感染所导致的CAP中所占的比例超过了50％。与大多数国外地区相比，我国肺炎支原体肺炎的发病率可能更高。有研究表明，肺炎支原体已经超过了肺炎链球菌，成为成人CAP的首要致病原。
据报道，大于20%的社区获得性肺炎由肺炎支原体（MP）引起。由于肺炎支原体缺乏细胞壁，造成社区常用的β-内酰胺类抗生素对其无效，因此，为避免滥用抗生素，早期诊断尤为重要。间接诊断MP感染的抗体检测方法已广泛应用于临床检测，但是这些方法灵敏度不理想，且存在MP感染后持续阳性的现象。国外早已将PCR诊断技术应用于MP感染的诊断，但由于普通的PCR操作过程中易污染，使得假阳性率较高，临床应用受到限制。
实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR，QPCR）是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，1996年由美国Applied Biosystems公司首先推出，荧光定量PCR对PCR产物的检测原理做了很大的改进，它利用荧光染料在激发光的作用下，所释放的荧光光能的变化来动态直接反映出PCR扩增产物量的变化，因荧光信号变量和扩增产物量成正比，通过足够灵敏的自动化仪器对荧光的采集和分析，从而实现对起始模板定量及定性的分析。Sybr Green I是一种和DNA结合的荧光染料，在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射荧光信号，从而保证荧光信号的增高与PCR产物的增加完全同步。当进行实时监测时，可检测到DNA聚合酶进行DNA合成阶段荧光信号增加，而在模板变性阶段荧光信号减少。因此，在每一次PCR循环终点，可通过检测荧光来检测扩增DNA的增加量。
此技术除了具有传统PCR的特异性强、灵敏度高、检测时间短等特点外，还具有以下特点：全封闭反应，无需凝胶电泳等PCR后处理，减小对环境的污染；不使用有毒试剂，操作安全；采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确；定量范围宽，可达到10个数量级；仪器在线实时监测，结果直观。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测或辅助检测肺炎支原体的引物对。
本发明所提供的引物对特异于肺炎支原体的16SrRNA基因或ATPase基因。
具体而言，所述引物对为如下引物对1或引物对2或引物对3：
所述引物对1为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对；所述引物对2为由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对；所述引物对3为由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对。
进一步，组成所述引物对的两条单链DNA分子的摩尔比为1：1。
制备所述引物对的方法也属于本发明的保护范围。
该方法具体可包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。
本发明是另一个目的是提供一种用于检测或辅助检测肺炎支原体的试剂盒。
本发明所提供的用于检测或辅助检测肺炎支原体的试剂盒，可为实时荧光定量PCR试剂盒，具体可含有所述引物对和如下物质中的至少一种：dNTP、DNA聚合酶和荧光染料。
在本发明中，所述荧光染料具体为SYBR green。
制备所述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。
该方法具体可包括如下步骤：将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与如下物质中的至少一种包装于同一个试剂盒内：dNTP、DNA聚合酶和荧光染料。
在本发明中，所述荧光染料具体为SYBR green。
所述引物对或所述试剂盒在制备检测或辅助检测肺炎支原体的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
具体的，采用所述引物对或所述试剂盒通过实时荧光定量PCR检测肺炎支原体时，反应体系中，反应初始时上下游引物的终浓度均可为0.4μM；反应条件均可为：50℃2分钟，1个循环；95℃15分钟，1个循环；94℃15秒，56℃31秒，72℃20秒（单点采集荧光，SYBR green通道），40个循环。
进一步，在本发明中，进行实时荧光定量PCR的所述反应体系如下：2倍定量PCR反应液10μl，0.4μl的引物混合液（上下游引物的浓度均为20μM），以及7.6μl的去离子水，DNA模板2μl。其中，所述2倍定量PCR反应液为Qiagen公司产品，名称为QuantiTect SYBR Green PCR kit，目录号：204141。
在本发明中，以上所有的所述肺炎支原体均为人肺炎支原体，如肺炎支原体国际标准菌株FH（ATCC15531）。
实验证明，利用本发明所提供的引物对对待测样本进行荧光定量PCR检测，与其他商品化检测引物以及IgM抗体检测法和培养法相比，本发明检测引物对及试剂盒能够特异性检测MP，不受MP亲缘关系较近的4种常见病原支原体和呼吸道常见细菌和真菌病原菌的干扰。该方法除可以定性检测MP外还可以很好的定量检测MP，是一种快速、特异性强、灵敏度高、适合临床使用的检测所有株肺炎支原体的定量PCR检测技术，在临床检测中具有非常好的检测效果和应用价值。
附图说明
图1为本发明采用实施例1获得的引物MPP1对不同样品进行实时荧光定量PCR的扩增曲线图。其中，标注Positive的曲线为肺炎支原体国际标准株FH（ATCC15531）基因组DNA样品，标注P1-P4的曲线分别为将肺炎支原体国际标准株FH（ATCC15531）稀释4倍、16倍、64倍、256倍后的样品，其余曲线为四种支原体属病原基因组DNA样品和11种呼吸道常见细菌、真菌基因组DNA样品。
图2为本发明采用实施例1获得的引物MPP1对不同样品进行实时荧光定量PCR的电泳图。其中，P1：Mp阳性对照4倍稀释；P2：Mp阳性对照16倍稀释；P3：Mp阳性对照64倍稀释；P4：Mp阳性对照256倍稀释；Mg：生殖支原体（ATCC33530）；Mho：人型支原体（ATCC23114）；UU：解脲脲原体（ATCC27618）；Mpi：梨支原体（ATCC25960）；Mp和0：肺炎支原体国际标准株FH（ATCC15531）（浓度为4×108拷贝/ml）；1：流感嗜血杆菌（hin）；2：A型链球菌（gas）；3：表皮葡萄球菌（sep）；4：金黄色葡萄球菌（sau）；5：大肠杆菌（eco）；6：肺炎克雷伯菌（kpn）；7：卡他莫拉菌（bca）；8：鲍曼不动杆菌（aba）；9：肺炎链球菌（spn）；10：铜绿假单胞菌（pae）；11：白色念珠菌（cal）；NC和N：阴性对照；M：分子量标准（由大到小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）。
图3为本发明采用实施例1获得的引物对MPP1进行实时荧光定量PCR的标准曲线。
图4为采用中山大学达安基因股份有限公司MP FQ-PCR产品（目录号：DA-B064），对肺炎支原体国际标准株FH（ATCC15531），临床阳性样本，以及四种支原体属病原和11种呼吸道常见细菌、真菌进行实时荧光定量PCR检测的扩增曲线图。其中，Mpi为梨支原体（ATCC25960），Mg为生殖支原体（ATCC33530），UU为解脲脲原体（ATCC27618），sep为表皮葡萄球菌（ATCC12228），sau为金黄色葡萄球菌（ATCC25923），hin为流感嗜血杆菌（ATCC49247），Mp1：肺炎支原体临床阳性样本1，Mp2：肺炎支原体临床阳性样本2。其余曲线为人型支原体（ATCC23114）、A型链球菌（gas）（ATCC19615）、大肠埃希氏菌（eco）（ATCC25922）、肺炎克雷伯菌（kpn）（ATCC700603）、卡他莫拉菌（bca）（ATCC25238）、鲍曼不动杆菌（aba）（ATCC19606）、肺炎链球菌（spn）（ATCC49619）、铜绿假单胞菌（pae）（ATCC27853）和白色念珠菌（cal）（ATCC90028）。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、用于检测肺炎支原体的荧光PCR引物的获得
一、引物对的设计与合成
根据已发表在GenBank上的人肺炎支原体国际标准株FH（ATCC15531）的基因组DNA序列（GenBank序列号：CP002077），最终确定以该菌株的16S rRNA（GenBank序列号：AF132740）和ATPase基因序列（GenBank序列号：U43738）为模板，利用引物设计软件Primer Primier5.0，进行引物设计。避开与其他病原体同源性较高的区域，手工调整参数，扩增产物大小在150～300bp范围，引物的Tm值在54～64℃范围，共设计选取20对引物，其中针对16S rRNA序列的引物6对，针对ATPase序列的引物14对。获得的引物序列送英潍捷基（上海）贸易有限公司进行引物合成。
二、引物对可靠性检测
提取人肺炎支原体国际标准株FH（ATCC15531）的基因组DNA，进行QPCR实验，调整退火温度等参数，并将QPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，验证所设计合成的20对引物的可靠性，淘汰扩增效率低以及扩增产物不特异的引物对。经过初筛实验，保留16S rRNA引物4对，ATPase引物10对，并使用提取的临床阳性MP培养株基因组DNA进行验证，继续进入下一轮实验。
提取与肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）感染相似、临床症状难以区分的多种常见病原体实验室培养株基因组DNA，作为模板，分别使用上述初筛后的14对引物，与MP基因组DNA同时进行QPCR实验，通过优化反应条件，筛选出只对MP进行特异性扩增的引物序列。经过上述实验过程，得到如下3对PCR引物。
引物对MPP1，特异于MP ATPase基因，扩增产物大小为278bp，序列如下：
MPP1F：5’-GAGCCCGATGCTGTTGCTACAC-3’（序列1）；
MPP1R：5’-TCAGCTACATGGAGGTTGGTAGC-3’（序列2）。
引物对MPP2，特异于MP16S rRNA基因，扩增产物大小为133bp，序列如下：
MPP2F：5’-GCCGCGTGAACGATGAAGGTC-3’（序列3）；
MPP2R：5’-CGCGACTGCTGGCACATAGTTAG-3’（序列4）。
引物对MPP3，特异于MP16S rRNA基因，扩增产物大小为245bp，序列如下：
MPP3F：5’-GTGGAGCGGTGAAATGCGTAG-3’（序列5）；
MPP3R：5’-TCCCCGTCAATTCCGTTTGAG-3’（序列6）。
实施例2、用于检测肺炎支原体的荧光PCR引物的特异性检测及最低检测限的确定
本实施例采用肺炎支原体国际标准株FH（ATCC15531），以及四种支原体属病原和11种呼吸道常见细菌、真菌对实施例1得到的3个引物对进行特异性检测。其中，四种支原体属病原为：生殖支原体（ATCC33530）、人型支原体（ATCC23114）、解脲脲原体（ATCC27618）和梨支原体（ATCC25960）；11种呼吸道常见细菌、真菌为：流感嗜血杆菌（hin）（ATCC49247）、A型链球菌（gas）（ATCC19615）、表皮葡萄球菌（sep）（ATCC12228）、金黄色葡萄球菌（sau）（ATCC25923）、大肠埃希氏菌（eco）（ATCC25922）、肺炎克雷伯菌（kpn）（ATCC700603）、卡他莫拉菌（bca）（ATCC25238）、鲍曼不动杆菌（aba）（ATCC19606）、肺炎链球菌（spn）（ATCC49619）、铜绿假单胞菌（pae）（ATCC27853）和白色念珠菌（cal）（ATCC90028）。
分别提取如上所述的肺炎支原体国际标准株FH（ATCC15531），以及四种支原体属病原和11种呼吸道常见细菌、真菌的基因组DNA，并进行纯化后统一调整浓度为4×108拷贝/ml，以其为模板，分别采用实施例1得到的3个引物对进行实时荧光定量PCR。同时设置以水代替DNA模板的阴性对照。另外，对于人肺炎支原体国际标准株FH（ATCC15531）的基因组DNA再设置分别稀释4、16、64和256倍的四个样品。
实时荧光定量PCR反应体系：2倍定量PCR反应液10μl，0.4μl的引物混合液（上下游引物的浓度均为20μM），以及7.6μl的去离子水。上述成分混合均匀后，加入DNA模板2μl。该反应体系中，反应初始时，上下游引物以的浓度均为0.4μM。其中，2倍定量PCR反应液为Qiagen公司产品，名称为QuantiTect SYBR Green PCR kit，目录号：204141。
将样品管放入ABIPrism7500荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应：50℃2分钟，1个循环；95℃15分钟，1个循环；94℃15秒，56℃31秒，72℃20秒（单点采集荧光，SYBR green通道），40个循环。
反应结束后根据扩增曲线及电泳图谱判定结果。
实验重复三次。
结果显示：采用3个引物对分别进行实时荧光定量PCR检测时，均只有肺炎支原体国际标准株FH（ATCC15531）基因组DNA及其四个稀释样品可观察到明显的荧光强度变化，而其它样品与阴性对照一样，荧光强度均没有变化。其中，采用引物对MPP1时，扩增曲线如图1所示。采用3个引物对分别进行实时荧光定量PCR检测时，均只有肺炎支原体国际标准株FH（ATCC15531）基因组DNA及其四个稀释样品可观察到预期大小的目的条带，而其它样品与阴性对照一样，没有目的条带。其中，采用引物对MPP1时，PCR反应后的电泳图谱如图2所示。以上扩增曲线和电泳图谱的结果表明，实施例1获得的3个引物对肺炎支原体均具有良好的特异性。
另外，根据肺炎支原体国际标准株FH（ATCC15531）基因组DNA稀释4、16、64和256倍后样品的检测结果，以起始模板浓度（拷贝/ml）的对数为横坐标，以阈值循环数为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线公式为Ct=K×lgX0+b（Ct为阈值循环数；K为斜率；X0为起始模板浓度（单位：拷贝/ml）；b为截距）。
MPP1的标准曲线如图3所示，公式为：Ct=-4.46lgX0+54.86（r2=0.995414）。利用该标准曲线可以定量检测待检测样品中的MP浓度，最低检测限约达2138拷贝/ml（Ct为40时，X0的取值）。
本发明的发明人同时采用了中山大学达安基因股份有限公司MP FQ-PCR产品（目录号：DA-B064），对如上所述的肺炎支原体国际标准株FH（ATCC15531），临床阳性样本，以及四种支原体属病原和11种呼吸道常见细菌、真菌进行实时荧光定量PCR检测，所有操作按照产品说明书进行。
结果显示：中山大学达安基因股份有限公司MP FQ-PCR产品对梨支原体（Mpi），生殖支原体（Mg），解脲脲原体（UU），表皮葡萄球菌（sep），金黄色葡萄球菌（sau）和流感嗜血杆菌（hin）等出现不同程度的交叉反应，呈现出假阳性结果（图4）。
实施例3、用于检测肺炎支原体的荧光PCR引物的临床样本验证
本实施例中，发明人于发热门诊回顾性分析100例社区获得性肺炎患者（年龄≥14岁）的MP相关检测结果，以双份血清中MP-IgG抗体4倍及以上升高作为MP感染诊断“金标准”，分别评价中山大学达安基因股份有限公司MP FQ-PCR产品（目录号：DA-B064）、采用实施例1获得的引物对MPP1进行的实时荧光定量PCR法、IgM抗体检测法和培养法的检出率，灵敏度，特异性，阳性预测值，阴性预测值和阳性似然比。
在每例患者第一次门诊（即感染急性期）时，采集咽拭子放入2ml生理盐水中保存，和非抗凝静脉血2ml，其中，取咽拭子标本200μl两份，分别进行肺炎支原体培养，和肺炎支原体DNA提取（进而进行PCR检测），分离静脉血血清，分别进行IgM和IgG抗体检测；在每例患者发病14-28天时（即感染恢复期），采集非抗凝静脉血2ml，分离静脉血血清，进行IgG抗体检测。
肺炎支原体的培养法，具体如下：
采用经典的变色培养基液体培养法（参考文献“Waites KB，Bebear CM，RobertsonJA,et al.Cumitech34,laboratory diagnosis of mycoplasmal infections.F.S.Nolte,coordinating ed.Washington,DC:American Society for Microbiology,2001.”）。购买OXIOD公司的基础肉汤培养基（产品目录号为CM0403）、葡萄糖（产品目录号为LP0071）和培养添加剂（产品目录号为SR0059C），以及国药集团化学试剂有限公司的苯酚红（产品目录号为71032594），自行配制变色培养基（配方：每100ml中加入基础肉汤培养基2.1g，葡萄糖0.5g，培养添加剂1支，苯酚红0.01g）。取200μl入组患者咽拭子标本液，加入至2ml变色培养基中，37℃培养2-6周，以颜色由澄清红变澄清黄判为阳性，否则判为阴性。
肺炎支原体的实时荧光定量PCR检测法，具体如下：
利用德国Qiagen公司DNA提取试剂盒（货号51306），提取咽拭子标本的DNA核酸。采用本发明实施例1获得的引物对MPP1进行实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序参见实施例2。而采用中山大学达安基因股份有限公司MP FQ-PCR产品（目录号：
DA-B064）进行实时荧光定量PCR，所有操作按照说明书进行。以上两种实时荧光定量PCR，均设置阳性对照——肺炎支原体国际标准株FH（ATCC15531）基因组DNA（浓度为4×108拷贝/ml）。
肺炎支原体IgM和IgG抗体检测法，具体如下：
采用德国维润-赛润公司商品试剂盒（货号：ESR127G和ESR127M）定量测定感染急性期血清中肺炎支原体IgM和IgG抗体，以及感染恢复期血清中肺炎支原体IgG抗体，所有标本均由相同操作人员使用Thermo公司的Multiskan MK3型酶标仪进行检测。所有操作按照相应的试剂盒说明书进行。具体的结果判断标准为：抗体活性单位以U/ml表示，对于IgM抗体，>17U/ml判为IgM抗体阳性（即判为MP感染），13-17U/ml判为灰区，<13U/ml判为IgM抗体阴性（即判为未MP感染）；对于单次IgG抗体，>30U/ml判为IgG抗体阳性，20-30U/ml判为灰区，<20U/ml判为IgG抗体阴性；当感染恢复期血清IgG抗体阳性，且较感染急性期IgG抗体呈4倍或以上升高，定义为MP感染金标准（参考文献“Burak Turgut,Fatma Uyar,Fulya Ilhan,et al.Mycoplasma Pneumoniae andChlamydia Pneumoniae Sero-positivity in Patients With Age-Related Macular Degeneration.J Clin Med Res,2010,2(2):85–89.[4]Jonathan J Deeks and Douglas G Altman.Diagnostictests4:likelihood ratios.BMJ,2004,329(7458):168–169.”）。
实验重复三次，结果取平均值。
结果显示：在100例肺炎患者中，利用双份血清IgG抗体检测“金标准”诊断MP感染21例，阳性率21%。待评价4种方法的检出率、灵敏度、特异性、阳性预测值、性预测值和阳性似然比如表1和表2所示。可见，本发明所采用实施例1获得的引物对MPP1进行实时荧光定量PCR检测的方法，其阳性检出率最高。对于灵敏度、特异性、阳性预测值、性预测值和阳性似然比这5个指标，本发明所采用实施例1获得的引物对MPP1进行实时荧光定量PCR检测的方法，均显著高于其它三种对照方法。
表1不同方法阳性检出率的比较
Figure BDA0000457280990000081
表2不同方法检测灵敏度和特异性的比较
Figure BDA0000457280990000082
注：采用“阳性似然比”参数对不同检测方法进行评价。“阳性似然比”是一个相对独立的、更具临床意义的诊断性试验效果的评估指标，当阳性似然比>10或阴性似然比<0.1时，诊断或排除某种疾病的可能性就显著的增加（参考文献“Jonathan J Deeksand Douglas G Altman.Diagnostic tests4:likelihood ratios.BMJ,2004,329(7458):168–169.”）。
其中，检出率、灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和阳性似然比是按照如下方法计算得到的：
Figure BDA0000457280990000083
检出率=一种方法检测的阳性病例/全部病例，即E/I或G/I；
灵敏度=一种方法检测的真阳性（A）/金标准阳性（G）；
特异性=一种方法检测的真阴性（D）/金标准阴性（H）；
阳性预测值=一种方法检测的真阳性（A）/此种方法检测的全部阳性（E）；
阴性预测值=一种方法检测的真阴性（D）/此种方法检测的全部阴性（F）；
阳性似然比=灵敏度/（1-特异性）。
综上所述，本发明所提供的采用实施例1获得的引物对进行实时荧光定量PCR检测的方法，大大提高MP检测的准确性、特异性，并且避免抗体检测方法由于“窗口期”造成的假阴性，较培养法大大缩短检测时间，为更早的准确诊断提供有力保证。
Figure IDA0000457281070000011
Figure IDA0000457281070000021
Figure IDA0000457281070000031

Claims (9)

1.用于检测或辅助检测肺炎支原体的引物对，其特征在于：所述引物对特异于肺炎支原体的16SrRNA基因或ATPase基因。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：所述引物对为引物对1或引物对2或引物对3；
所述引物对1为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对；所述引物对2为由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对；所述引物对3为由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对。
3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于：组成所述引物对的两条单链DNA分子的摩尔比为1：1。
4.制备权利要求1-3中任一所述引物对的方法，包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。
5.用于检测或辅助检测肺炎支原体的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1-3中任一所述的引物对和如下物质中的至少一种：dNTP、DNA聚合酶和荧光染料。
6.制备权利要求5所述试剂盒的方法，包括如下步骤：将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与如下物质中的至少一种包装于同一个试剂盒内：dNTP、DNA聚合酶和荧光染料。
7.根据权利要求5所述的试剂盒或权利要求6所述的方法，其特征在于：所述荧光染料为SYBR green。
8.权利要求1-3中任一所述引物对，或权利要求5所述的试剂盒在制备检测或辅助检测肺炎支原体的产品中的应用。
9.根据权利要求1-8中任一所述的引物对或方法或试剂盒或应用，其特征在于：所述肺炎支原体为人肺炎支原体。
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