CN110041916A - 一种检测细菌内毒素的聚集诱导荧光多肽探针制备及应用 - Google Patents

一种检测细菌内毒素的聚集诱导荧光多肽探针制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术及临床医学诊断领域，涉及一种用于检测细菌内毒素的新型聚集诱导荧光多肽探针的制备及应用。基于聚集诱导发光效应(AIE)，在其结构上修饰一种多肽，利用其与细菌内毒素的特异性结合产生线性荧光增强，从而检测细菌内毒素浓度。本发明具有操作简单，检测快速准确、特异性强、灵敏度高等优势，具有很好的应用前景。

Description

一种检测细菌内毒素的聚集诱导荧光多肽探针制备及应用
技术领域
本发明属于生物生物技术及临床医学诊断领域，涉及一种用于检测细菌内毒素的新型聚集诱导荧光多肽探针的制备及应用。基于聚集诱导荧光效应(AIE)分子，在其结构上修饰一种多肽，利用其与细菌内毒素的特异性结合产生线性荧光增强，从而检测细菌内毒素浓度。
背景技术
细菌内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的特有结构，当细菌死亡、崩解或被破化其细胞壁后释放出来。其化学组成包括类脂A、核心多糖和O-特异性抗原，其中类脂A是细菌内毒素毒性活性成分，核心多糖在不同菌株内结构恒定，而O-特异性抗原高度可变。细菌内毒素具有一定的生物毒性，可引起发热反应、微循环障碍、内毒素休克及血管内凝血等，严重时甚至会引起多器官衰竭甚至死亡。[参见(a)T.Gutsmann，A.Schromm andK.Brandenburg，Int.J.Med.Microbiol.，2007，297，341-352.；(b)R.J.Ulevitch andP.S.Tobias，Annu.Rev.Immunol.，1995，13，437-457.]
目前，应用最广的细菌内毒素的检测手段为鲎试剂法，包括凝胶法和比色法。鲎试剂是由海洋节肢动物鲎的血液变形细胞裂解物制成，含有能被内毒素激活的凝固酶原，产生凝集反应，能够定性或定量检测细菌内毒素。[参见(a).Dinarello C A.Molecularmechanisms in endotoxin fever.Agents&Actions，1983，13(5-6)：470-486；(b).Gutsmann T，Howe J，U，et al.Structural prerequisites for endotoxicactivity in the Limulus test as compared to cytokine production inmononuclear cells.Innate Immunity，2010，16(1)：39.]
但是，鲎试剂的检测受多种因素干扰，如反应时间，体系pH值，温度等，易出现假阳性结果，需要严格遵循的相关操作。[参见Beutler B，Rietschel E T.Timeline：Innateimmune sensing and its roots：the story of endotoxin.Nat Rev Immunol，2003，3(2)：169-176.]更重要的是，由于鲎生长周期长，生存化境恶化，过度捕捞等众多因素导致鲎资源的急剧下降，几乎面临灭绝。酶联免疫吸附法也是一种检测内毒素的手段，可在适当的浓度范围进行半定量检测，但特异性不强、费用昂贵限制了其应用范围。因此，发展一种快速、简单和灵敏的检测细菌内毒素技术在生物研究和临床诊断上具有重要意义。
另一方面，传统的荧光生色团在高浓度下荧光会减弱甚至不发光，这种现象被称为“聚集诱导荧光猝灭(AQC)”，这一现象的存在严重限制了荧光生色团的应用。相反，基于聚集诱导荧光(AIE)现象的研究自报道以来，持续受到科研工作者的广泛关注，当AIE分子处于高分散状态(如稀溶液中)，能量通过分子自旋形式释放，荧光强度较弱甚至不发光，当浓度升高或聚集时，分子内旋受限(RIR)，辐射通道打开，从而荧光增强。[参见(a).J.Mei，N.L.C.Leung，R.T.K.Kwok，J.W.Y.Lam and B.Z.Tang，Chem.Rev.，2015，115，11718；(b)D.Ding，K.Li，B.Liu and B.Z.Tang，Acc.Chem.Res.，2013，46，2441.]这种荧光效应与聚集程度有着良好的相关性。目前研究发现和设计的AIE分子均具有螺旋桨式结构，如四苯乙烯(TPE)、六苯基噻咯(HPS)、二苯乙烯基蒽、多芳基吡咯等。稀溶液中，其外围苯环通过单键围绕中心旋转，以非辐射形式消耗能量；在聚集状态下，AIE分子的“螺旋桨”也能防止π-π堆积，有效避免荧光猝灭。
利用聚集诱导荧光(AIE)技术已在基因表达、疾病检测、环境监测、预防医学、食品监督等诸多领域均有贡献，具有广阔的应用前景。但应用于细菌内毒素的快速检测还未见报道。
发明内容
本发明提供了一种聚集诱导荧光多肽探针及其检测细菌内毒素的应用。通过将能够特异性结合细菌内毒素的多肽连接到聚集诱导荧光增强发光分子上，构成荧光探针TPE-pep。该探针可以与溶液中的细菌内毒素分子特异性结合，使得诱导荧光分子聚集，从而产生明显的荧光增强，用于定量检测溶液中的细菌内毒素。在本文的上下文中，术语“聚集诱导发光”或者“AIE”是指荧光化合物在稀溶液中几乎不发光，而在与目标物结合后呈现聚集态发射强荧光的现象。
采用的技术方案：
一种用于检测细菌内毒素的聚集诱导荧光多肽探针TPE-pep，由聚集诱导发光化合物与细菌内毒素特异性多肽连接而成，其特异性多肽序列为：GCKPTFRRLKWKYKCG、CKPTFRRLKWKYKC、GCKPTFRRLKWKYKC、CKPTFRRLKWKYKCG、GCKPTFRRLKWKYKCG中一种以上。通过将多肽与1-(4-羧基苯)-1，2，2-三苯乙烯共价结合形成多肽探针TPE-pep，将TPE-pep配成适合浓度的检测液，将其加入到一系列具有梯度浓度的细菌内毒素标准溶液中，在300～400m激发光激发，发射波长400～600m处，检测TPE-pep的发射峰荧光强度。
制备所述的检测细菌内毒素的聚集诱导荧光多肽探针TPE-pep，按以下步骤进行：
(1)将聚集诱导发光化合物1-(4-羧基苯)-1，2，2-三苯乙烯(5～10mg)溶解于溶剂二甲基亚砜，加入3～15mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)2～10mg，在室温下振荡30～60分钟，然后将所述多肽(5-15mg)加入上述溶液中，室温反应12～24小时。
(2)其中，聚集诱导发光化合物1-(4-羧基苯)-1，2，2-三苯乙烯与细菌内毒素特异性多肽的摩尔比为1∶1～5∶1，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的总用量与聚集诱导发光化合物1-(4-羧基苯)-1，2，2-三苯乙烯的摩尔比为5∶1～10∶1。反应完毕后，通过高效液相色谱进行分离，洗脱液由含1％体积的三氟乙酸乙腈和1％体积三氟乙酸的水组成，进行梯度洗脱，分离，冷冻干燥。
利用制备的聚集诱导荧光多肽探针TPE-pep检测细菌内毒素，按以下步骤进行：
用无菌水配制所述的多肽探针TPE-pep的浓度为1-10μM，将其加入到一系列具有梯度浓度的细菌内毒素标准溶液(0.02-4μM)中，混旋5分钟后，在300～400nm激发光，检测TPE-pep的发射波长400～600nm下荧光强度。计算方法：标准曲线法。根据荧光强度与参考样品细菌内毒素的值做标准曲线。实际样品可根据其荧光强度值在标准曲线上算出。
与现有的技术相比，本发明所提供的基于AIE效应的聚集诱导荧光多肽探针TPE-pep检测细菌内毒素具有以下优点：
(1)探针为人工合成的多肽序列，技术成熟，获取周期短。而鲎试剂法需要从稀有生物血液制品内提取处理获得。
(2)操作步骤少，属于“一步法”，对实验条件要求不高。而鲎试剂受温度、反应时间、反应温度等众多因素干扰，对实验人员操作要求较高。
(3)检测时间短，即配即测。而常用的鲎试剂检测需要在37°反应一段时间，且时间过短(或过长)会导致假阴性(或假阳性)的发生。
在完成发明的过程中，选择细菌内毒素(LPS)作为检测目标物，对所述的基于AIE效应的多肽探针的各项性能进行了反复测试。结果表明，对于LPS检测的线性范围为0.01-2μM，方法检测限为7.65nM。
附图说明
图1为聚集诱导荧光多肽探针TPE-pep检测LPS的示意图；
图2为聚集诱导荧光多肽探针TPE-pep的HPLC图；
图3为多肽探针TPE-pep在不同浓度的细菌内毒素溶液中荧光图(激发波长EX＝340nm，发射波长EM为400～600nm)；
图4为多肽探针TPE-pep在不同浓度的LPS溶液中荧光线性图(激发波长EX＝340nm，发射波长EM＝480nm)；
图5为多肽探针TPE-pep在检测细菌内毒素(LPS)与腺嘌呤核苷三磷酸ATP、葡萄糖(Glu)、谷胱甘肽(GSH)、吲哚乙酸(LAA)、肝素6糖(DP6)、牛血清白蛋白(BSA)、二磷酸鸟苷(GDP)等别的生物大分子特异性差别图。
具体实施方式
以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
下面结合附图，通过具体实施例对本发明进一步详述。
实施例1：检测细菌内毒素的聚集诱导荧光多肽探针TPE-pep制备
实验材料：多肽其序列为：GCKPTFRRLKWKYKCG，生工生物工程(上海)股份有限公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，批号090M14531V，上海阿拉丁试剂有限公司；琥珀酰亚胺(NHS)，批号MKBG7914V，上海阿拉丁试剂有限公司；
实验仪器及设备：高效液相色谱仪，美国安捷伦公司。
实验过程：
将聚集诱导荧光化合物1-(4-羧基苯)-1，2，2-三苯乙烯6mg溶解于溶剂二甲基亚砜，11mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)7mg也加入上述溶液中，在室温下振荡30～60分钟，然后将所述多肽8mg加入上述溶液中，室温反应16小时。反应之后，将混合溶液通过0.2μm的过滤头过滤，然后用液相色谱仪进行分离纯化，其分离溶剂为洗脱液由含1％体积的三氟乙酸乙腈和1％体积三氟乙酸的水组成，进行梯度洗脱，分离，-50℃冷冻干燥，即得检测细菌内毒素的聚集诱导荧光多肽探针TPE-pep。HPLC图如图2所示。
实施例2：TPE-pep对溶液中不同浓度的LPS的检测
实验材料：细菌内毒素脂多糖(LPS)，购自美国Sigma有限公司；HEPES缓冲液，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；荧光96孔板，购自美国康宁(Corning)有限公司；玻璃器皿均经过超纯水充分清洗后，高温灭菌处理。
实验仪器及设备：AY120电子分析天平；TCS10恒温混匀仪；TECAN SPARK 10M多功能酶标仪；光豪ZF-20D紫外暗箱。
实验过程：精密称取LPS加HEPE缓冲液将其配置成浓度为400μg/ml(即40μM)的标准溶液，然后按照浓度梯度稀释成4μM、3μM、2μM、1.4μM、0.4μM、0.3μM、0.2μM、0.14μM、0.04μM、0.03μM和0.01μM这11个浓度。每次稀释时均需要在震荡器上充分分散1min。精密称取TPE-pep探针配制成浓度为10μM的检测液，避光保存待用。分别取各浓度LPS及空白溶液500μL，加入等体积的检测液(溶液中各组分浓度变为原来的1/2)，充分震荡混匀后于紫外暗箱中观察。然后取200μL混匀后的反应液转移到96孔板中，用多功能酶标仪设置激发波长为340nm，检测发射波长在区间400～600nm的荧光强度(间隔为5nm)。图3为多肽探针TPE-pep荧光强度与LPS浓度的关系图。取波长480nm处荧光强度为纵坐标，LPS浓度为横坐标，利用归一化以2μM浓度LPS对应的荧光强度值为1，绘制浓度与荧光强度的线性关系图，如图4所示。可以看出荧光强度与浓度在0.01-2μM区间有很好的线性，并且通过3σ/s计算检测限为7.65nM(σ为10次测量空白对照荧光强度的标准偏差，s为荧光线性的斜率)。
实施例2：干扰物对探针检测LPS的影响
实验材料：细菌内毒素脂多糖(LPS)，购自美国Sigma有限公司；HEPES缓冲液，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；ATP，购自；腺苷-5″-三磷酸二钠盐(ATP)、L-谷氨酰胺(Gln)、谷胱甘肽(还原型)(GSH)、L-抗坏血酸(L-Ascorbic Acid，LAA)、D-(+)-麦芽糖一水合物(DP6)，购自罗恩试剂有限公司；牛血清白蛋白(BSA)，购自碧云天生物技术有限公司；荧光96孔板，购自美国康宁(Corning)有限公司；玻璃器皿均经过超纯水充分清洗后，高温灭菌处理。
实验仪器及设备：AY120电子分析天平；Thermo mixer震荡仪；TECAN SPARK 10M多功能酶标仪；光豪ZF-20D紫外暗箱。
实验过程：精密称取LPS与干扰物(ATP、Gln、GSH、LAA、DP6、BSA及冰醋酸)，配制成摩尔浓度相等的标准溶液(均为2μM)，将干扰物与LPS等体积混合，然后向LPS、干扰物及混有干扰物的LPS中分别加入TPE-pep探针，于紫外灯下观察，如图5A混有干扰物的LPS溶液中TPE-pep荧光强度没有明显的差别，而纯干扰物相对LPS显示较弱荧光增强甚至没有。然后取200μL混匀后的反应液转移到96孔板中，用多功能酶标仪设置激发波长为340nm，检测发射波长为480nm处的荧光强度，图5B显示为各干扰物对LPS的溶液荧光强度的影响均未产生明显的干扰。
以上实施例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代和改进等，其均应在本发明请求保护的技术方案范围之内。

Claims (3)

1.一种检测细菌内毒素的聚集诱导荧光多肽探针，其特征在于通过将能够特异性结合细菌内毒素的多肽连接到聚集诱导荧光分子上，构成荧光多肽探针TPE-pep。所述的结合细菌内毒素的多肽为GCKPTFRRLKWKYKCG、CKPTFRRLKWKYKC、GCKPTFRRLKWKYKC、CKPTFRRLKWKYKCG、GCKPTFRRLKWKYKCG中一种以上，所述的聚集诱导荧光分子为1-(4-羧基苯)-1，2，2-三苯乙烯。
2.一种制备检测细菌内毒素的聚集诱导荧光多肽探针的方法，按以下步骤进行：
(1)将聚集诱导发光化合物1-(4-羧基苯)-1，2，2-三苯乙烯(5～10mg)溶解于溶剂二甲基亚砜，加入3～15mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)2～10mg，在室温下振荡30～60分钟，然后将所述多肽(5-15mg)加入上述溶液中，室温反应12～24小时。
(2)其中，聚集诱导荧光化合物1-(4-羧基苯)-1，2，2-三苯乙烯与所述多肽的摩尔比为1∶1～5∶1，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的总用量与聚集诱导发光化合物1-(4-羧基苯)-1，2，2-三苯乙烯的摩尔比为5∶1～10∶1。反应完毕后，通过高效液相色谱进行分离，洗脱液由含1％体积的三氟乙酸乙腈和1％体积三氟乙酸的水组成，进行梯度洗脱，分离，冷冻干燥。
3.根据权利要求1的多肽探针检测细菌内毒素的方法，用无菌水配制所述的多肽探针的浓度为0.01-10μM，将其加入到一系列具有梯度浓度的细菌内毒素标准溶液(0.02-4μM)中，混旋5分钟后，在300～400nm波长激发下，检测TPE-pep的发射波长400～600nm下荧光强度。计算方法：标准曲线法。根据荧光强度与参考样品细菌内毒素的值做标准曲线。实际样品可根据其荧光强度值在标准曲线上算出。
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