CN110330069A - 一种高效便捷去除水相溶液中内毒素的清除剂及其制备 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于清除水相溶液中内毒素的清除剂及其制备方法。该清除剂由表面固定有内毒素高亲和多肽(P16)的介孔二氧化硅纳米材料(MSP‑P16)组成。本发明具有操作简单，特异性强，清除效果好，无生物毒性，安全性好等优势，具有很好的应用前景。

Description

一种高效便捷去除水相溶液中内毒素的清除剂及其制备
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于清除水相溶液中内毒素的清除剂及其制备方法。
背景技术
细菌内毒素(endotoxin)是革兰氏阴性细菌细胞壁的特有结构物，为外源性致热源，当菌体裂解或人为破化其细胞壁后被释放出来。其主要化学成分为脂多糖(LPS)，包括类脂A、核心多糖和O-特异性抗原，其中类脂A是LPS毒性活性中心。内毒素具有一定的生物毒性，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及血管内凝血等，严重时甚至会引起多器官衰竭甚至死亡。
内毒素稳定且抗原性弱，只有在160℃以上加热2-4小时，或者强酸、强碱、强氧化剂条件下煮沸30分钟，内毒素的生物活性才能被破坏。与外毒素不同，内毒素在生物体内虽然能够被识别产生相应抗体，但是无中和作用，无法抵消其毒性，因此清除内毒素在生物研究及实际应用中极为重要。
最常见的细菌内毒素的清除手段有活性炭吸附、萃取、超滤、离子交换色谱等非选择性方法以及亲和色谱法等选择性去除方法。非选择性清除方法在清除内毒素的同时，相关性质的其他组分也被无差别的清除；另外，当内毒素含量较低时，非选择性方法不再适用。选择性方法是通过将与内毒素有亲和作用的配基(如组氨)固定在介质上(柱介质或膜介质)，利用配基的生物学特性达到分离的作用，具有去除率高选择性等优势。
内毒素清除剂通常是以大孔树脂、活性炭为载体，经过活化加载配基而得。作为内毒素吸附剂载体的大孔树脂在制备过程中通常会使用剧毒、致癌性的氯甲醚和硝基苯，这些试剂的残留存在极大的生物安全隐患。
发明内容
为了克服上述现有技术中的缺点与不足，本发明提供了一种清除水相溶液中内毒素的清除剂，对内毒素具有较好吸附、清除性能。该清除剂由表面固定有内毒素高亲和多肽(P16)的介孔二氧化硅纳米材料(MSP-P16)组成，基于氨基化的MSP易于被修饰，在其表面共价交联内毒素高亲和结合肽。
介孔二氧化硅纳米粒子(mesoporous silica nanospheres，MSP)是一种具有均一孔径、规律孔道、比表面积大及骨架结构稳定的无机纳米材料，其内外表面易于修饰且生物相容性好。MSP可通过溶胶-凝胶法、水热法和微波法合成，且调节反应条件可得到2～50nm孔径不同的纳米粒，在催化、吸附分离、化学传感及生物医学等领域得到广泛应用。尤其是生物医学领域，MSP在药物装载，靶向治疗，生物成像，体外诊断等多个方向发挥作用。
多肽P16来源于鲎抗LPS因子(LALF)，是由16个氨基酸残基组成的阳离子肽段，对LPS中类脂A的磷酸葡糖胺具有高亲和结合作用，其结合活性可与硫酸多粘菌素B(PMB)——一种公认的高亲和力内毒素结合肽相媲美，但PMB具有一定的生物毒性，限制了其大规模的应用。
采用的技术方案：
制备了一种表面共价交联有多肽P16的介孔二氧化硅(MSP-P16)纳米粒子作为内毒素清除剂，通过戊二醛作为交联剂将其固定到氨基化的MSP表面。其特异性多肽P16序列为：GCKPTFRRLKWKYKCG、CKPTFRRLKWKYKC、GCKPTFRRLKWKYKC、CKPTFRRLKWKYKCG、GCKPTFRRLKWKYKCG中一种以上。
制备所述的功能化介孔二氧化硅(MSP-P16)纳米粒子，按以下步骤进行：
(1)制备氨基化的介孔二氧化硅纳米粒：取一定量的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，四甲基联苯胺(TMB)，NaOH和水溶解、搅拌加热3～6h，然后迅速加入硅酸四乙酯(TEOS)混合均匀，反应2～4h后离心，用无水乙醇洗涤三次，过夜烘干。添加(NH4)2SO4/C2H5OH在80℃回流4-10h，去除模板。之后，样品离心，用无水乙醇洗两次，过夜干燥得到粉末MSP。然后，0.1g的MSP溶解在无水乙醇中，缓慢加入2-6mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)在80℃反应4-10h。最后，离心洗涤，得到氨基化的MSP。
(2)功能化MSP-P16清除剂的制备：称取氨基化的MSP(10-100mg)加入吡啶溶解(pH＝6.0)，涡旋15～30min，离心去除上清，加5％的戊二醛0.2～4mL，200rpm震荡2～6h，离心去上清，加吡啶洗三次再离心取沉淀。P16吡啶溶解液(0.1-1g·L-1)1mL加入到上述沉淀中，4℃涡旋20～30h，加戊二酸(pH＝8)0.5～4mL涡旋20～60min，离心10～20min取沉淀，然后用Tris-HCl(10mM，pH＝7.4)缓冲液洗三次，收集沉淀，干燥即得清除剂MSP-P16。
(3)内毒素的清除及检查：所述基于MSP-P16清除内毒素及效果检验的步骤包括：用细菌内毒素对照品及其检查用水配制成500～50000EU/mL浓度内毒素溶液1mL，加入5～20mg MSP-P16清除剂，涡旋5～20min后静置，离心分离得上清液，即为清除内毒素后的水相溶液。
取鲎试剂加0.1mL检查用水复溶，然后加入清除内毒素后的水相溶液0.1mL，封闭管口，摇匀后垂直放入37±1℃烘箱孵育60±2min，平行测定2～5管。取出，倒置观察是否有凝胶形成。
与现有的清除方法相比，本发明所提供的基于P16功能化的MSP清除内毒素具有以下优点：
(1)制备工艺简单，耗时短，成本低廉，可大量生产；
(2)选择性清除，清除效果好；
(3)无生物毒性，安全性好。
在完成发明的过程中，选择内毒素脂多糖(LPS)作为清除目标物，对所述的P16修饰的介孔二氧化硅纳米球(MPS-P16)清除剂的各项性能进行了反复测试。结果表明，对于内毒素的有明确的清除效果，在500～5000EU/mL水相溶液中内毒素一次清除率在95％以上。
附图说明
图1为功能化介孔二氧化硅(MSP-P16)清除剂清除LPS的示意图；
图2为制备得到的介孔二氧化硅(MSP)TEM图；
图3为功能化介孔二氧化硅(MSP-P16)清除剂的红外表征；
图4为凝胶法验证MSP-P16清除效果。
具体实施方式
以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
下面结合附图，通过具体实施例对本发明进一步详述。
实施例1：氨基化介孔二氧化硅纳米粒子(MSP)的制备
实验材料：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，购自上海阿拉丁试剂有限公司；四甲基联苯胺(TMB)，购自中国国药化学试剂有限公司；硅酸四乙酯(TEOS)，购自上海阿拉丁试剂有限公司；(NH4)2SO4，购自上海生工生物工程有限公司；无水乙醇，购自南京化学试剂股份有限公司；3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，购自中国国药控股化学试剂；鲎试剂(检测限为0.5EU/ml)，购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司。
实验仪器及设备：BSA2245-CW电子分析天平；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器；TGL-16C离心机；DHG-9143BS电热鼓风干燥箱。
实验过程：CTAB(1.0g)，TMB(7.0mL)和NaOH(3.5mL，2M)溶解在480mL超纯水中，80℃搅拌加热5h，然后5.0mL的TEOS迅速加入，混合均匀后，继续反应3h。在3000rpm离心后10min，无水乙醇洗涤三次，45℃烘干过夜得到固体。以上固体粉末添加(NH4)2SO4/C2H5OH(10mg/mL)在80℃回流8h。3000rpm离心5min，用无水乙醇洗两次，45℃烘干。称取0.1g的MSP溶解在20mL无水乙醇中，然后3mL的APTES快速加入，在80℃反应8h。最后，离心洗涤烘干，得到氨基化的MSP。图2为制备得到的介孔二氧化硅(MSP)TEM图。
实施例2：功能化清除剂(MSP-P16)的制备
实验材料：P16(序列：G-(CKPTFRRRKWKYKC)-G)由上海生工生物技术有限公司合成；吡啶，购自上海申博化工有限公司；戊二酸，购自北京百灵威科技股份有限公司；戊二醛，购自北京百灵威科技股份有限公司；Tris-HCl，购自赛国生物科技有限公司。
实验仪器及设备：BSA2245-CW电子分析天平；TCS10恒温混匀仪；TGL-16C离心机；DHG-9143BS电热鼓风干燥箱；红外分光光度计。
实验过程：称取25mg氨基化的MSP，加入1mL吡啶中溶解(pH＝6.0)，涡旋15min，离心去除上清，加5％的戊二醛1mL，200rpm震荡3h，离心去上清，用吡啶洗三次取沉淀。称取50μg P16加200μL吡啶溶解，加入到上述沉淀中，4℃涡旋24h，加0.5mL戊二酸(1mM，pH＝8)涡旋30min，离心10min取沉淀，用Tris-HCl(10mM，pH＝7.4)缓冲液洗三次，收集沉淀，氮气吹干即得。红外表征MSP-P16如图2所示，1647.24cm-1处为酰胺键的C＝O伸缩振动。
实施例3：MSP-P16清除水相溶液中内毒素及效果验证
实验材料：脂多糖(LPS)，购自美国Sigma有限公司；细菌内毒素检查用水，购自湛江安度斯生物有限公司；玻璃器皿均经过超纯水充分清洗后，高温灭菌处理；塑料制品均经H2O2浸泡后，超纯水充分冲洗。
实验仪器及设备：BSA2245-CW电子分析天平；DHG-9143BS电热鼓风干燥箱；XW-80A旋涡混合器；TCS10恒温混匀仪。
实验过程：称取LPS加细菌内毒素检查用水配制成2500EU/mL，5000EU/mL，12500EU/mL，称取MSP-P16清除剂200μg/份，分别加入1mL不同浓度的LPS溶液，涡旋10min后静置，然后离心分离出上清，即为清除内毒素后的水相溶液。
取鲎试剂加0.1mL检查用水复溶，然后分别加入清除内毒素后的水相溶液0.1mL，每组平行测定两管。封闭管口，摇匀后垂直放入37℃烘箱孵育60min。取出，倒置观察是否有凝胶成形。
结果如图3所示，MSP-P16组(右)溶液清澈，无凝胶形成，而对照组(左)形成乳白的凝胶附着在管底，且在LPS浓度高达5000EU/ml的溶液中仍能取得清除率95％的清除效果。
以上实施例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代和改进等，其均应在本发明请求保护的技术方案范围之内。

Claims (3)

1.一种去除水相溶液中内毒素的清除剂，其特征在于通过将能够特异性结合内毒素的多肽P16连接到介孔二氧化硅纳米微球上，构成内毒素特异性清除剂。所述的结合内毒素的多肽P16为GCKPTFRRLKWKYKCG、CKPTFRRLKWKYKC、GCKPTFRRLKWKYKC、CKPTFRRLKWKYKCG、GCKPTFRRLKWKYKCG中一种以上。
2.一种制备去除水相溶液中内毒素的清除剂的方法，按以下步骤进行：
称取氨基化的介孔二氧化硅纳米微球MSP(10-100mg)，加入吡啶溶解(pH＝6.0)，涡旋15～30min，离心去除上清，加5％的戊二醛0.2～4mL，200rpm震荡2～6h，离心去上清，加吡啶洗三次再离心取沉淀。P16吡啶溶解液(0.1-1g·L-1)0.5mL加入到上述沉淀中，4℃涡旋20～30h，加戊二酸(pH＝8)0.5～4mL涡旋20～60min，离心10～20min取沉淀，然后用Tris-HCl(10mM，pH＝7.4)缓冲液洗三次，收集沉淀，干燥即得清除剂MSP-P16。
3.根据权利要求1的清除剂去除水相溶液中内毒素的方法，用细菌内毒素对照品及其检查用水配制成500～50000EU/mL浓度内毒素溶液1mL或者实际包含有内毒素的水相样品1mL，加入5～20mg MSP-P16清除剂，涡旋5～20min后静置，离心分离得上清液，即为清除内毒素后的水相溶液。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1781937A (zh) * 2005-07-30 2006-06-07 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子、其合成方法和用途
CN101687632A (zh) * 2008-01-10 2010-03-31 延世大学校产学协力团 多孔中空二氧化硅纳米颗粒、所述二氧化硅纳米颗粒的制备方法以及包含所述二氧化硅纳米颗粒的药物载体和药物组合物
CN105294838A (zh) * 2015-09-22 2016-02-03 徐州市玛泰生物科技有限公司 一种抗菌肽及其应用
CN106397552A (zh) * 2016-09-06 2017-02-15 湖北中创医疗用品有限公司 一种去除重组蛋白a溶液中内毒素的方法
CN106552600A (zh) * 2016-10-18 2017-04-05 武汉理工大学 一种磁性壳核结构纳米粒子及其制备方法与应用
CN110041916A (zh) * 2019-05-16 2019-07-23 南京中医药大学 一种检测细菌内毒素的聚集诱导荧光多肽探针制备及应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1781937A (zh) * 2005-07-30 2006-06-07 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 酰胺化鲎抗内毒素因子线性模拟肽分子、其合成方法和用途
CN101687632A (zh) * 2008-01-10 2010-03-31 延世大学校产学协力团 多孔中空二氧化硅纳米颗粒、所述二氧化硅纳米颗粒的制备方法以及包含所述二氧化硅纳米颗粒的药物载体和药物组合物
CN105294838A (zh) * 2015-09-22 2016-02-03 徐州市玛泰生物科技有限公司 一种抗菌肽及其应用
CN106397552A (zh) * 2016-09-06 2017-02-15 湖北中创医疗用品有限公司 一种去除重组蛋白a溶液中内毒素的方法
CN106552600A (zh) * 2016-10-18 2017-04-05 武汉理工大学 一种磁性壳核结构纳米粒子及其制备方法与应用
CN110041916A (zh) * 2019-05-16 2019-07-23 南京中医药大学 一种检测细菌内毒素的聚集诱导荧光多肽探针制备及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PRIMOZ PRISTOVSEK等: "Structure of a Synthetic Fragment of the LALF Protein When Bound to Lipopolysaccharide", 《J.MED.CHEM.》 *

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