CN111781366A - 一种检测过氧化氢溶液中内毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测过氧化氢溶液中内毒素的方法，通过催化分解将过氧化氢溶液进转化为相同体积的水，避免过氧化氢溶液内过氧化氢和内毒素接触后导致鲎试剂无法与过氧化氢内部含有的内毒素产生凝结的问题；本发明以鲎试剂法为基础，通过在过氧化氢溶液中添加催化剂的方法对过氧化氢溶液进行检测前处理，然后将经过前处理的过氧化氢溶液以鲎试剂法进行检测，避免过氧化氢溶液中的过氧化氢和内毒素解接触后无法凝结，产生过氧化氢溶液中的过氧化氢影响内毒素检测结果的问题。
Description
技术领域
本发明涉及过氧化氢溶液内毒素检测方法技术领域，具体为一种检测过氧化氢溶液中内毒素的方法。
背景技术
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。内毒素的危害是非常严重的，它会引起：1.发热反应：人体对于细菌内毒素极为敏感。极微量(1～5ng/kg)内毒素就能引起体温上升；2.白细胞反应：细菌内毒素进入宿主体内以后，由于细胞发生移动并黏附到组织毛细血管上，血流中占白细胞总数60％～70％的中性粒细胞数量迅速减少；3.内毒素休克：大量内毒素作用于机体的巨噬细胞、中性粒细胞以及补体系统和凝血系统等，会导致微循环障碍，出现微循环衰竭、低血压、缺氧、酸中毒等，于是导致病人休克。因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类(如一次性注射器，植入性生物材料)必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。
生物制药中的每一个环节都有可能污染内毒素使产品不合格，不仅给生产企业造成很大的经济损失，也会直接影响该企业的信誉和形象。随着国家药监部门对生物制品质量的要求不断提高，对内毒素的要求也越来越高；生物制品中内毒素的来源主要有：菌毒种、生产环境、不规范操作、设备及器械、原辅材料等。对于生物制品生产中内毒素污染的控制最主要的措施是生产过程控制，即严格按GMP要求进行生产，严格无菌操作，防止内毒素产生。
细菌内毒素最常用的检查法一般是鲎试剂试验法，1964年由美国学者Levin和Bang发现微量革兰氏阴性菌内毒素也可以引起凝胶反应，从而在1968年创立了一种定性或定量检测微量细菌内毒素的体外分析方法(鲎试剂检测法)。其检测原理是：鲎体内有一种变形细胞，细胞内中血蓝蛋白，一旦接触到细菌的内毒素，就会激活蛋白凝固原，导致凝集现象的发生。鲎试剂检测法操作简便，所以得到广泛的使用，但是鲎试剂法的前提是要排除待测溶液中某种成分对鲎试剂灵敏度的干扰；过氧化氢消毒剂或过氧化氢原料在生物制药行业中是经常会被用到的。这就要求当过氧化氢作为原辅料，以及作为A/B级洁净区消毒剂时，必须检测内毒素含量，当内毒素含量过高时必须采取一定的措施消除内毒素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测过氧化氢溶液中内毒素的方法，利用过氧化氢分解后会产生同过氧化氢体积相同体积的水这一特性，将过氧化氢溶液转换为相同体积的水，转化过程中共过氧化氢溶液的体积不变，并且在不增加或减少过氧化氢内毒素的前提下，将过氧化氢进行分解；以鲎试剂法为基础，通过在过氧化氢溶液中添加催化剂的方法对过氧化氢溶液进行检测前处理，然后将经过前处理的过氧化氢溶液以鲎试剂法进行检测，避免过氧化氢溶液中的过氧化氢和内毒素解接触后无法凝结，产生过氧化氢溶液中的过氧化氢影响内毒素检测结果的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种检测过氧化氢溶液中内毒素的方法,包括如下步骤：
步骤一、准备检测用装置：准备检测所需要的装置，包括砂轮、旋涡混合器、干热烘干箱、移液器以及培养箱；所述装置需要分别检查是否可用，并选取可用的所述装置分别进行清洁杀菌；
步骤二、准备检测用原料：准备检测所需要的原料，包括过氧化氢溶液、实验用水、细菌内毒素工作标准品、鲎试剂和催化剂，所述过氧化氢的含量为0—100％，所述鲎试剂的规格为0.1ml/支，且鲎试剂需要选用经过灵敏度复核符合规定的鲎试剂，所述鲎试剂共准备八支；
步骤三、准备检测用容器：准备检测所需要的容器，包括装液玻璃容器以及平行管；所述装液玻璃容器采用带有刻度的试管；所述平行管的数量在八个以上；
步骤四、准备检测用辅助材料：准备检测所需要的辅助材料，包括催化剂；所述催化剂采用MnO2；
步骤五、检测前去热源：将步骤三中准备的装液玻璃容器或步骤四中准备的催化剂分别放置在步骤一中准备的干热烘干箱内部，进行干热去热源做工；所述装液玻璃容器需在170-190℃温度下干热2-4小时；所述催化剂需在175-185℃温度下干热2.5-4小时；所述实验用水为成品无热源的BET水；
步骤六、去热源后冷却：将步骤五中经过去热源做工的装液玻璃容器或催化剂分别从干热烘干箱中取出，并将所述装液玻璃容器冷却至20-24℃；所述催化剂需要冷却为20-26℃；
步骤七、样品前处理：使用步骤一中准备的移液器取步骤一中准备的过氧化氢溶液若干毫升放入步骤六中已经去热源后冷却完成的装液玻璃管中，取经过步骤五中已经去热源并冷却至一定温度的催化剂若干克，将所述催化剂放于所述装液玻璃管内，使所述催化剂和所述装液玻璃管内的所述过氧化氢进行充分反应，得到样品；
步骤八、样品静置：将通过步骤七得到的样品进行静置，静置一段时间后，装液玻璃管中的MnO2在所述装液玻璃管内部发生沉淀，MnO2样品静置完成后，MnO2在所述装液玻璃管底部形成沉淀物，在所述装液玻璃管内部的过氧化氢溶液的上部形成上清液；静置过程中装样品的装液玻璃管应保持水平，所述静置在室温下进行；
步骤九：静置后取样：对通过步骤八得到的静置完成的样品进行取样；所述取样是指使用步骤一中准备的移液器取所述样品的上清液放入步骤三中准备的一个未使用的装液玻璃容器内部；
步骤十、取样后检测：采用鲎试剂检测法对经过步骤九取出的样品进行检测。
所述步骤五中的玻璃容器的干热温度185℃或175℃中的任一温度；所述玻璃容器的干热时间为3小时或3.5小时；所述步骤五中的催化剂的干热温度为178℃或182℃中的任一温度；所述催化剂的干热时间为3小时或3.5小时。
所述步骤六中的装液玻璃容器冷却后温度为22℃、23℃或24℃中的任一温度；所述步骤六中的催化剂或实验用水的冷却后温度为22℃、23℃、24℃、25℃或26℃中的任一温度。
所述步骤七中的催化剂质量为0.1-1g；所述步骤七中的过氧化氢和所述催化剂充分反应是指放入所述催化剂后的所述过氧化氢溶液内部不再有气泡产生。
所述催化剂采用0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.7g、0.8g、0.9g以及1g中的任一克数。
所述步骤八中的静置时间为半小时以上。
所述静置时间为45分钟。
所述步骤二中的热源去除步骤为在180℃下干燥3—4小时。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明检测过氧化氢溶液中内毒素的方法，利用过氧化氢分解后会产生同过氧化氢体积相同体积的水这一特性，将过氧化氢溶液转换为相同体积的水，转化过程中共过氧化氢溶液的体积不变，并且在不增加或减少过氧化氢内毒素的前提下，将过氧化氢进行分解。
2、本发明检测过氧化氢溶液中内毒素的方法，以鲎试剂法为基础，通过在过氧化氢溶液中添加催化剂的方法对过氧化氢溶液进行检测前处理，然后将经过前处理的过氧化氢溶液以鲎试剂法进行检测，避免过氧化氢溶液中的过氧化氢和内毒素解接触后无法凝结，产生过氧化氢溶液中的过氧化氢影响内毒素检测结果的问题。
附图说明
图1为本发明的样品前处理的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
过氧化氢催化分解化学式为2H2O2+MnO2＝＝2H2O+O2+MnO2(MnO2为催化剂)，通过公式可以看出1mol液态的过氧化氢分解后生成1mol的液态水，分解之后溶液的体积并不会变化。
一种检测过氧化氢溶液中内毒素的方法,包括如下步骤：
步骤一、检测前准备：准备检测所需要的容器和溶液，包括含量15％、25％、65％、75％、85％、95％以及100％中的任一过氧化氢溶液、十个以上的数量带有刻度的试管、干热烘干箱、移液器、实验用水、75％酒精棉球若干、砂轮、封口膜、旋涡混合器、0.1ml/支的鲎试剂八支和培养箱；
步骤二、检测前去热源：将装液玻璃容器或催化剂或实验用水分别放置在步骤一中准备的干热烘干箱内部，进行干热去热源做工；所述装液玻璃容器需在182℃或185℃任一温度下干热3.5小时，或者在175℃或178℃任一温度下干热3小时；所述催化剂需在178℃或179℃温度下干热3.5小时，或者在182℃温度下干热3小时；所述实验用水为成品去热源的BET水；经过去热源做工的装液玻璃容器或催化剂分别从干热烘干箱中取出，并将所述装液玻璃容器冷却至22℃；所述催化剂需要冷却为24℃；
步骤三：样品前处理：使用步骤一中准备的移液器取步骤一中准备的过氧化氢溶液若干毫升放入已经去热源后冷却完成的装液玻璃管中，取已经去热源并冷却至一定温度的催化剂0.5克，将所述催化剂放于所述装液玻璃管内，使所述催化剂和所述装液玻璃管内的所述过氧化氢进行充分反应，得到样品；工作流程如图1所示：
步骤四、配制检测用供试品溶液：检测用供试品溶液的内部含有0.1ml的检测用供试品溶液和0.1ml的BET水；
步骤五、配置细菌内毒素标准溶液：选取一支细菌内毒素工作标准品，轻弹所述细菌内毒素工作标准品的瓶壁，使所述细菌内毒素工作标准品内部的粉末落入所述细菌内毒素工作标准品的瓶底，使用步骤一中准备的砂轮在所述细菌内毒素工作标准品的瓶颈上轻轻划痕，使用步骤一中准备的75％酒精棉球对所述瓶颈上的划痕进行擦拭，开启所述细菌内毒素工作标准品，开启后，在所述细菌内毒素工作标准品的内部加入1ml的BET水，使所述BET水溶解所述细菌内毒素工作标准品内部的内容物，使用步骤一中准备的封口膜将所述细菌内毒素工作标准品的瓶口封严，然后放置在步骤一中准备的旋涡混合器上，混合15分钟，得到细菌内毒素标准溶液；
步骤六、制备一定浓度的细菌内毒素标准溶液：在经过步骤五得到的细菌内毒素标准溶液内部，添加一定量的BET水，添加的BET水将内毒素标准品稀释制成0.06EU/ml(2λ)浓度的内毒素标准溶液，在上述稀释过程中，每稀释一步，均需在漩涡混合器上混合30或32秒钟。
步骤七、制备对照组溶液：使用0.1ml检测用供试品溶液+0.1mlBET水配置成添加溶液A；使用0.1ml检测用供试品溶液+0.1mlBET水配置成添加溶液B；使用0.1mlBET水+0.1ml2λ的内毒素标准溶液配置成添加溶液C；使用0.2mlBET水配置成添加溶液D
步骤八、鲎试剂加样：按照下述的表1制备相应的添加溶液A、添加溶液B、添加溶液C以及添加溶液D，选取步骤一中准备的鲎试剂八支，轻弹所述鲎试剂的瓶壁使所述鲎试剂内部的粉末落入瓶底，用步骤一中准备的75％的酒精棉球擦拭瓶口后开启，使用移液器，分别将所述添加溶液A、所述添加溶液B、所述添加溶液C和所述添加溶液D添加到所述鲎试剂的反应管内部，每浓度平行两管；当样品超过一批时，C管D管可共用；
表1：细菌内毒素检查溶液制备表
| 溶液 | 溶液配制 | 平行管 |
| A | 0.1ml检测用供试品溶液+0.1mlBET水 | 2管 |
| B | 0.1ml检测用供试品溶液+0.1ml2λ的内毒素标准溶液 | 2管 |
| C | 0.1mlBET水+0.1ml2λ的内毒素标准溶液 | 2管 |
| D | 0.2mlBET水 | 2管 |
步骤九、培养：将步骤八得到的加样鲎试剂放入步骤一中准备的培养箱中，选择下述培养条件之一进行免振培养即可：
(1)在38.5下培养55分钟；
(2)在37.8下培养59分钟；
(3)在38.2下培养31分钟；
步骤十、结果判定：分别取出加样鲎试剂，将每一个试管从培养箱中直接拿出，平滑倒转180°。若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁脱落，记录结果为阳性。如果没有形成完整的凝胶或凝胶不坚实、变形并从管壁脱落，则结果为阴性。当试验有效，如A溶液2管均为阴性，则符合规定；A溶液2管均为阳性，则不符合规定；A溶液1管阴性1管阳性，需进行复试；复试时，溶液A做4个平行管，若重复检测有效且4管平行管均为阴性，则符合规定，否则不符合规定。
综上所述：该检测过氧化氢溶液中内毒素的方法，通过加热醇类溶液，然后用鲎试剂检测法对处理后的醇类溶液进行内毒素检测，在现有技术技术支持的基础上，结合自身的方式拓展，提高检测的针对性；利用加热蒸发法，在不减少内毒素的前提下，尽量取出溶液中的醇类，减少检测溶液内部的整体醇类含量，提高装置的整体检测精准性，减少醇类含量对检测结果的影响。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种检测过氧化氢溶液中内毒素的方法,其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、准备检测用装置：准备检测所需要的装置，包括砂轮、旋涡混合器、干热烘干箱、移液器以及培养箱；所述装置需要分别检查是否可用，并选取可用的所述装置分别进行清洁杀菌；
步骤二、准备检测用原料：准备检测所需要的原料，包括过氧化氢溶液、实验用水、细菌内毒素工作标准品、鲎试剂和催化剂，所述过氧化氢的含量为0—100％，所述鲎试剂的规格为0.1ml/支，且鲎试剂需要选用经过灵敏度复核符合规定的鲎试剂，所述鲎试剂共准备八支；
步骤三、准备检测用容器：准备检测所需要的容器，包括装液玻璃容器以及平行管；所述装液玻璃容器采用带有刻度的试管；所述平行管的数量在八个以上；
步骤四、准备检测用辅助材料：准备检测所需要的辅助材料，包括催化剂；所述催化剂采用MnO2；
步骤五、检测前去热源：将步骤三中准备的装液玻璃容器或步骤四中准备的催化剂分别放置在步骤一中准备的干热烘干箱内部，进行干热去热源做工；所述装液玻璃容器需在170-190℃温度下干热2-4小时；所述催化剂需在175-185℃温度下干热2.5-4小时；所述实验用水为成品无热源的BET水；
步骤六、去热源后冷却：将步骤五中经过去热源做工的装液玻璃容器或催化剂分别从干热烘干箱中取出，并将所述装液玻璃容器冷却至20-24℃；所述催化剂需要冷却为20-26℃；
步骤七、样品前处理：使用步骤一中准备的移液器取步骤一中准备的过氧化氢溶液若干毫升放入步骤六中已经去热源后冷却完成的装液玻璃管中，取经过步骤五中已经去热源并冷却至一定温度的催化剂若干克，将所述催化剂放于所述装液玻璃管内，使所述催化剂和所述装液玻璃管内的所述过氧化氢进行充分反应，得到样品；
步骤八、样品静置：将通过步骤七得到的样品进行静置，静置一段时间后，装液玻璃管中的MnO2在所述装液玻璃管内部发生沉淀，MnO2样品静置完成后，MnO2在所述装液玻璃管底部形成沉淀物，在所述装液玻璃管内部的过氧化氢溶液的上部形成上清液；静置过程中装样品的装液玻璃管应保持水平，所述静置在室温下进行；
步骤九：静置后取样：对通过步骤八得到的静置完成的样品进行取样；所述取样是指使用步骤一中准备的移液器取所述样品的上清液放入步骤三中准备的一个未使用的装液玻璃容器内部；
步骤十、取样后检测：采用鲎试剂检测法对经过步骤九取出的样品进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种检测过氧化氢溶液中内毒素的方法，其特征在于：所述步骤五中的玻璃容器的干热温度185℃或175℃中的任一温度；所述玻璃容器的干热时间为3小时或3.5小时；所述步骤五中的催化剂的干热温度为178℃或182℃中的任一温度；所述催化剂的干热时间为3小时或3.5小时。
3.根据权利要求1所述的一种检测过氧化氢溶液中内毒素的方法，其特征在于：所述步骤六中的装液玻璃容器冷却后温度为22℃、23℃或24℃中的任一温度；所述步骤六中的催化剂或实验用水的冷却后温度为22℃、23℃、24℃、25℃或26℃中的任一温度。
4.根据权利要求1所述的一种检测过氧化氢溶液中内毒素的方法，其特征在于：所述步骤七中的催化剂质量为0.1-1g；所述步骤七中的过氧化氢和所述催化剂充分反应是指放入所述催化剂后的所述过氧化氢溶液内部不再有气泡产生。
5.根据权利要求4所述的一种检测过氧化氢溶液中内毒素的方法，其特征在于：所述催化剂采用0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.7g、0.8g、0.9g以及1g中的任一克数。
6.根据权利要求1所述的一种检测过氧化氢溶液中内毒素的方法，其特征在于：所述步骤八中的静置时间为半小时以上。
7.根据权利要求6所述的一种检测过氧化氢溶液中内毒素的方法，其特征在于：所述静置时间为45分钟。
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2020
- 2020-07-24 CN CN202010723738.6A patent/CN111781366A/zh active Pending
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