CN102565293A - 药物原料中细菌内毒素的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种药物原料中细菌内毒素的检测方法，包括以下步骤：药物原料的选择：选择易挥发、难溶于水药物原料；供试液的制备：称取计量所选择的药物原料，加热使其挥发，用等量细菌内毒素检查用水补充到原药物质量，得到供试液；对供试液采用常规方法检测药物原料中细菌内毒素。本发明提供的检测方法能够测定出采用已知方法无法直接测定的但异氟烷、恩氟烷、七氟烷等难容于水、易挥发的药物原料中的细菌内毒素，能从源头上对无菌产品质量进行控制，对保证制剂产品安全性有重要意义。检测过程中无需添加其它试剂，能够简便、可靠的检测样品中细菌内毒素的存在。

Description

药物原料中细菌内毒素的检测方法

技术领域

本发明属于微生物检验领域，具体涉及一种测定易挥发、难溶于水药物原料中细菌内毒素的方法。 

背景技术

无菌药品是指法定药品标准中列有无菌检查项目的制剂和原料药，包括无菌制剂和无菌原料药。“产品的无菌或其它质量特性绝不能只依赖于任何形式的最终处理或成品检验（包括无菌检查）。”是2010年版药品生产质量管理规范中，无菌药品管理的基本原则之一。

细菌内毒素是注射剂药品中的主要污染物质。细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。内毒素具有极强的生物学活性，特别是革兰氏阴性菌感染和静脉注射提取的内毒素溶液时，可导致动物体发生内毒素休克和死亡。很多严重疾病（如损失、烧伤、心、肾、消化系统、呼吸系统、肿瘤、心血管手术、自动免疫等方面的疾病）都直接或间接与革兰氏阴性菌感染及其释放的内毒素有关。

专利CN1116031C提供了一种静脉注射用乳化吸入全身麻醉药及其制备方法。该方法提示可将挥发性麻醉药制成静脉给药。挥发性药物如氟烷、地氟醚、异氟烷、恩氟烷、七氟烷等在制成静脉注射用药时，作为直接进入血液药物，细菌内毒素是药典规定必检项。同时为进一步控制无菌产品质量，除了严格按照GMP要求采用无菌生产工艺，还需在源头上把关，对原料的细菌内毒素进行控制是非常必要和有效的质量保证手段。

常规细菌内毒素检查法检测或量化样品细菌内毒素时，首先需对样品进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试样品溶液，再根据样品的性质确定内毒素限值和最大有效稀释倍数（MVD），最后采用凝胶法或光度测定法检查样品的细菌内毒素。但异氟烷、恩氟烷、七氟烷等挥发性原料难溶于水，采用已知方法无法直接检查出样品细菌内毒素。 

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、可靠方法，可快速检测易挥发性、不溶于水药物原料的细菌内毒素含量的方法。

本发明的目的是这样实现的：一种药物原料中细菌内毒素的检测方法，该检测方法包括如下步骤：

1）药物原料的选择：选择易挥发、难溶于水药物原料；

2）供试液的制备：称取计量所选择的药物原料，加热使其挥发，用等量细菌内毒素检查用水（BET）补充到原药物质量，得到供试液；

3）利用步骤2）中得到的供试液，采用常规方法检测药物原料中细菌内毒素。

步骤2）中对药物原料的加热温度为药物原料的沸点。

所述的药物原料为氟烷、地氟醚、异氟烷、恩氟烷或七氟烷。

本发明具有以下有益效果：

（1）检测过程中无需添加其它试剂，能够简便、可靠的检测样品中细菌内毒素的

存在。

（2）本发明提供的检测方法能够测定出采用已知方法无法直接测定的如异氟烷、恩氟烷、七氟烷等难溶于水、易挥发的药物原料中的细菌内毒素，能从源头上对无菌产品质量进行控制，对保证制剂产品安全性有重要意义。

具体实施方式

本发明的整体检测方案如下：

1）药物原料的选择：选择易挥发、难溶于水药物原料，如氟烷、地氟醚、异氟烷、恩氟烷或七氟烷；

2）供试液的制备：称取计量所选择的药物原料，加热到沸点使其挥发，用等量细菌内毒素检查用水（BET）补充到原药物质量，得到供试液；

3）利用步骤2）中得到的供试液，采用常规方法检测药物原料中细菌内毒素。

一、实验准备

1、实验用具：

1）数显恒温水浴锅，型号：HH-2，金坛市荣华仪器制造有限公司。

2）VORTEX-2旋涡混合器。

3）其它玻璃试验器械均超声后纯化水清洗三次，然后在250℃下干烤2小时以上。

、试验材料：

鲎试剂：规格为0.1ml/支，鲎试剂灵敏度标示值λ=0.5EU/ml；

有国家主管部门批准文号，并经过灵敏度复核符合规定的细菌内毒素工作标准品（WSE）（160EU/支）；

细菌内毒素检查用水（BET）：5ml/支（按药典要求，内毒素含量采用凝胶法检查应小于0.015Eu/m l的灭菌注射用水,采用光度测定法为小于0.005Eu/m l）。

以上材料市售可得。

二、溶液的配备

1、供试样品的制备

精密称取药物原料样品，将其置于加热锅中加热蒸干，然后取等重细菌内毒素检查用水补入，封口混合后作为供试样品。

经验证实验证明蒸干过程没有带入外源内毒素也没有损失样品内含有的内毒素，且本稀释级溶液对内毒素检查没有影响。否则需取更高稀释级溶液进行干扰试验。（干扰试验在实施例中详述。）

2、细菌内毒素标准溶液的配备

取细菌内毒素工作标准品1支，用砂轮轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭启开，加入1ml细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混合15分钟，然后制备2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ所需内毒素标准溶液，每次稀释均在漩涡混合器上混合30秒钟，封口备用。

三、细菌内毒素检测

限值的确定：参照注射液用法用量，按药典要求以L=K/M（L为供试品的细菌内毒素限值；K为人每千克体重每小时最大可接受的细菌内毒素剂量；M为人每千克体重每小时的最大供试品剂量）计算限值L，单位Eu/ml、Eu/mg或 Eu/U(活性单位)。

将制备好的供试样品，稀释到经过干扰试验验证的最大稀释倍数MVD（MVD=c*L/λ，c为供试品溶液浓度，），与细菌内毒素标准溶液混合成下表溶液：

注：其中1为供试品溶液；2为供试品阳性对照；3为阳性对照；4为阴性对照。

四、结果判断

37℃保温60分钟。若阴性对照溶液4的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液2均为阳性；阳性对照溶液3的平行管均为阳性，试验有效。

若溶液1的平行管均为阴性，判定样品细菌内毒素合格；若1的平行管均为阳性，判定样品细菌内毒素不合格。若1的平行管一管为阴性，一管为阳性，需复试。复试时，溶液1需做4支平行管，再依据结果判断原则判断。

以下实施例以异氟烷原料中细菌内毒素测定为例详细说明本发明，以使本专业技术人员更全面理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例  

根据限值计算L=0.045EU/mg（K=5EU/kg·hr，M=110mg/ kg·hr），确定异氟烷原料细菌内毒素限度L<0.045EU/mg。

、供试样品的制备

取2g异氟烷，加热55℃，使其蒸发干净，再补入细菌内毒素检查用水至2g作为供试液。

、制备方法的验证试验

（1）供试品内毒素检查：

按中国药典2010年版二部细菌内毒素检查法，对供试液用0.5Eu/ml的鲎试剂进行检查，取2ml细菌内毒素检查用水与样品同步处理做阴性对照，结果如下：

结果表明：1.混合液结果显阳性说明供试液在此方法下对鲎试剂与内毒素的凝胶反

应没有干扰影响或其影响可以忽略；2.供试液本身结果显阴性，有两种情况：供试品本身不含内毒素或者在蒸发过程中内毒素随之被蒸发。3.阴性对照显阴性表明实验过程和环境没有带入外源内毒素。

（2）回收率试验  

取2g异氟烷，同时加入1Eu/ml（2λ）的标准内毒素溶液2ml，稍稍振摇后置55℃水浴中使异氟烷蒸发干净，补水至2ml，作为供试液阳性对照。取2ml细菌内毒素检查用水与样品同步处理做阴性对照。依法检查。检查结果如下：

结果表明：试验环境和过程没有带入外源内毒素，且供试品在蒸发过程中没有带走其内含内毒素，蒸发过程对样品中内含内毒素的检出没有影响，回收率结果为100%，证明采用上述方法制备供试液可行。

、干扰试验  

按中国药典2010版细菌内毒素检查法项下规定，选用两个厂家的鲎试剂1、鲎试剂2（λ=0.5 Eu/ml）对连续生产的3个批次样品（批次1、批次2、批次3）进行干扰试验。用细菌内毒素检查用水和供试液分别将细菌内毒素标准品稀释成2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ系列浓度，每一浓度平行做4支，另取细菌内毒素检查用水和供试液各做2支阴性对照。结果如下表1、表2。

 

表1  干扰试验结果

（鲎试剂1 λ=0.5Eu/ml）     供试品规格：注射用

表2  干扰试验结果

（鲎试剂2 λ=0.5Eu/ml）     供试品规格：注射用

注：Es  细菌内毒素工作标准品溶液反应终点浓度的几何平均值

Et  细菌内毒素工作标准品供试品溶液反应终点浓度的几何平均值

Es=lg（∑Xs/4） Xs为细菌内毒素标准溶液反应终点浓度的对数值 

Et=lg（∑Xt/4） Xt为细菌内毒素标准品的供试品混合溶液反应终点浓度的对数值

结果表明： Es在0.5λ～2.0λ范围内，且Et在0.5Es～2.0Es范围内，说明本品在此浓度下对实验反应无干扰作用。表明：取异氟烷一定量于55℃水浴中蒸干，补等量体积细菌内毒素检查用水作为供试液，按照中国药典2010年版二部附录Ⅺ E细菌内毒素检查法进行细菌内毒素检测，每1mg本品中含内毒素的量应小于0.045Eu。该方法可行。

、细菌内毒素的检测和结果判定

使用经干扰试验验证后的方法，对3批样品进行细菌内毒素检查，结果见表3。（细菌内毒素限值为每1mg小于0.045Eu）。

表3  细菌内毒素检查结果

实施例

取恩氟烷一定量于55℃水浴中蒸干，补等量体积细菌内毒素检查用水作为供试液，按照中国药典2010年版二部附录Ⅺ E细菌内毒素检查法，取灵敏度λ为0.5Eu/ml的鲎试剂，进行细菌内毒素干扰试验，结果Es在0.5λ～2.0λ范围内，且Et在0.5Es～2.0Es范围内，说明本品在此浓度下对实验反应无干扰作用，可以采用水浴蒸干的方法处理恩氟烷后按照药典规定进行细菌内毒素的检查。

实施例

取七氟烷一定量于55℃水浴中蒸干，补等量体积细菌内毒素检查用水作为供试液，按照中国药典2010年版二部附录Ⅺ E细菌内毒素检查法，取灵敏度λ为0.5Eu/ml的鲎试剂，进行细菌内毒素干扰试验，结果Es在0.5λ～2.0λ范围内，且Et在0.5Es～2.0Es范围内，说明本品在此浓度下对实验反应无干扰作用，可以采用水浴蒸干的方法处理七氟烷后按照药典规定进行细菌内毒素的检查。

对氟烷、地氟醚经验证也可采用相同方法检查。 

Claims (3)

1.一种药物原料中细菌内毒素的检测方法，其特征在于：该检测方法包括如下步骤：

1）药物原料的选择：选择易挥发、难溶于水药物原料；

2）供试液的制备：称取计量所选择的药物原料，加热使其挥发，用等量细菌内毒素检查用水（BET）补充到原药物质量，得到供试液；

3）利用步骤2）中得到的供试液，采用常规方法检测药物原料中细菌内毒素。

2.根据权利1所述的药物原料中细菌内毒素的检测方法，其特征在于：步骤2）中对药物原料的加热温度为药物原料的沸点。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的药物原料为氟烷、地氟醚、异氟烷、恩氟烷或七氟烷。