CN102033044A - 一种通过显色基质法测定注射级大豆磷脂中细菌内毒素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测注射级大豆磷脂中细菌内毒素含量的灵敏、准确的方法。属于药用辅料的细菌内毒素检测领域。方法是用鲎试剂显色基质法测定注射级大豆磷脂中的细菌内毒素含量。精密称定大豆磷脂，用细菌内毒素检查用水配制成10mg/ml的大豆磷脂溶液，再稀释至不超过最大有效稀释倍数的各稀释级，干扰试验结果表明10mg/ml的大豆磷脂溶液经三倍以上稀释，对显色基质鲎试剂定量内毒素含量的测定不存在干扰作用，可用该稀释级计算大豆磷脂中的细菌内毒素值。本方法为注射级大豆磷脂的生产和科研提供了控制和测定细菌内毒素的方法。
Description
技术领域
本发明属于药用辅料的细菌内毒素检测领域，涉及一种药物辅料大豆磷脂中细菌内毒素的检测方法。
背景技术
大豆磷脂是一种植物来源的磷脂，具有脂肪和胆固醇含量低、乳化稳定性好、成本低等优点，医药行业中常用精制的天然磷脂作为制备各种药物制剂的乳化剂和辅料。其中，磷脂作为静脉注射脂肪乳注射液的乳化剂是其最常用的医药用途之一。磷脂作为其乳化剂，能经受热压灭菌不被破坏，对生物体毒性很小，能量高，乳化效果好，形成油粒高度分散而均匀，性能优于其它乳化剂。磷脂作为形成脂质体双分子膜的基本材料是其又一常用的医药用途。磷脂具有安全无毒、乳化性能好的特性，其典型的双亲分子特性，使脂质体具有亲油亲水性，包裹范围更广。
出于安全性考虑，大豆磷脂作为注射剂的乳化剂或辅料时，为保证终产品的质量，有必要对其进行细菌内毒素含量的检查，控制其中细菌内毒素的限度。目前没有文献报道关于磷脂中的细菌内毒素的含量的测定方法。
发明内容：
本发明的目的是提供一种灵敏、可靠的方法，可快速检查出注射级大豆磷脂中的细菌内毒素含量。
技术方案：本发明注射级大豆磷脂的细菌内毒素的检查方法是精密称定注射级大豆磷脂，用细菌内毒素检查用水溶解成10mg/mL的大豆磷脂溶液，稀释至不超过最大有效稀释倍数(MVD)的各稀释级的稀释液备用。先建立细菌内毒素标准曲线，然后参照中国药典2010版附录“细菌内毒素检查法”，检查各稀释级磷脂溶液的细菌内毒素，对各稀释级进行干扰试验，选择回收率最接近100％的稀释倍数进行内毒素检测，可用该稀释级计算磷脂中的细菌内毒素值。
一、供试品的制备及最大可稀释倍数(MVD)的确定
样品在无菌条件下精密称定，用细菌内毒素检查用水(BET水)溶解成初始溶液。供试品的最大可稀释倍数按下面公式计算：
式中：C为样品浓度；L为样品的细菌内毒素限制；λ为细菌内毒素标准曲线最低浓度。
二、细菌内毒素标准曲线的建立和可靠性测试
内毒素标准品溶液的制备：用BET水将细菌内毒素标准品稀释为10EU/mL的内毒素溶液，再稀释为0.1EU/mL的内毒素溶液，以0.1EU/mL的内毒素溶液为母液稀释为不同的浓度梯度。配置好的内毒素标准品溶液在4小时内用完。
标准曲线的线性相关系数|r|＞0.980时，实验有效，|r|≤0.980时，实验无效。
三、细菌内毒素检查的操作步骤：
取无热原试管，加入100μL细菌内毒素检查用水、内毒素标准品溶液或供试品；再加入100μL鲎试剂溶液，混匀，37℃温育40分钟；温育结束，加入100μL显色基质溶液，混匀，37℃温育6分钟；温育结束，加入500μL偶氮化试剂1溶液，混匀；加入500μL偶氮化试剂2溶液，混匀；加入500μL偶氮化试剂3溶液，混匀，静置5分钟，于545nm波长处读吸光度值。每管做2-4个平行。
四、干扰试验
鲎试验法受环境因素影响较大，培养条件、操作环境可能引起结果差异，且大豆磷脂为药典中未建立内毒素检查的品种，因此需先进行干扰实验，步骤如下：
1.选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度(设为λm)，作为磷脂干扰试验中添加的内毒素浓度，配置含λm内毒素的磷脂溶液为阳性对照，测量出该溶液的内毒素浓度，为Cs。
2.测量出未添加外源内毒素的磷脂溶液内毒素浓度，为Ct。
3.按公式计算该实验条件下的回收率
当R在50％-200％之间，则认为在此实验条件下磷脂溶液不存在干扰作用。
当R在50％-200％之外，需对供试品进行系列稀释(稀释倍数不得超过最大有效稀释倍数MVD)或进行其他处理消除干扰，每一稀释溶液都重复步骤1-3，直到内毒素的回收率R在50％-200％之间。选择回收率R最接近100％的稀释倍数进行内毒素检测。
本发明的有益效果：
1可以快速可靠的检测出磷脂中的细菌内毒素。
2通过对各稀释级做干扰试验，确定不干扰浓度，可以省却大量的先期摸索工作，降低检测成本。
具体实施方式
实施例1.细菌内毒素限制(L)的确定
参考进口注册标准，注射用卵磷脂的内毒素含量应≤6EU/g即0.006EU/mg。
实施例2.供试品溶液的制备及最大可稀释倍数(MVD)的确定
样品在无菌条件下精密称定，磷脂用细菌内毒素检查用水(BET水)溶解成10mg/mL的初始溶液(1mg/mL的初始溶液浓度过小，超出检测限；100mg/mL的初始溶液需用浓度高一点的标准曲线，但是溶液浑浊，干扰增强)。限制L为0.006EU/mg，标准曲线最低浓度为0.01EU/mL，供试品的最大可稀释倍数
实施例3.标准曲线可靠性试验
标准曲线的建立按照细菌内毒素检查的操作步骤进行。以0.1EU/mL的内毒素溶液为母液稀释成0.01～0.1EU/mL的细菌内毒素标准溶液。以吸光值为纵坐标、内毒素浓度为横坐标绘制标准曲线。以吸光值对浓度进行回归处理，得回归方程为y＝24.514x-0.0242，R2＝0.9908，|r|≥0.980，所以标准曲线成立。
实施例4.干扰试验
选择标准曲线中点0.05EU/mL设为λm，作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度，不同稀释倍数样品内毒素含量和回收率结果见表1：
表1不同稀释倍数样品内毒素含量和回收率
Claims (6)
1.一种显色基质法检测注射级大豆磷脂的细菌内毒素含量的方法，其特征在于精密定量称取注射级大豆磷脂原料，用细菌内毒素检查用水稀释成10mg/mL作为原液，超声溶解，再稀释至不超过最大有效稀释倍数的各级稀释液，对各稀释级溶液进行干扰试验，选择回收率最接近100％的稀释倍数进行内毒素检测，可用该稀释级计算大豆磷脂中的细菌内毒素值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于准确称取注射级大豆磷脂原料0.0090～0.0110g，用细菌内毒素检查用水稀释成10mg/mL的原液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于大豆磷脂溶液采用超声溶解，超声时间为20～40min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于用细菌内毒素检查用水对大豆磷脂的原液进行稀释，稀释倍数为2～6倍。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于对各稀释级大豆磷脂溶液进行干扰试验，选择回收率最接近100％的稀释倍数进行内毒素检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于将两倍于终浓度的内毒素溶液与两倍于终浓度的注射级大豆磷脂样品溶液等体积混合，内毒素和样品溶液间相互稀释，得到两者所需终浓度的混合液，作为干扰试验中样品的阳性对照。
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