CN1547026A - 一种检测玻璃酸钠原料的细菌内毒素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种玻璃酸钠(HA)原料的细菌内毒素含量的灵敏、准确的检测方法。精密定量称取玻璃酸钠原料，用细菌内毒素检查用水稀释成2mg/ml。再稀释至不超过最大有效稀释倍数的各稀释级，先检查各稀释级的细菌内毒素；再从反应结果为阴性的最低稀释级开始做干扰实验，直至某高稀释级不存在干扰，可用该稀释级计算细菌内毒素值。本方法为玻璃酸钠原料的生产和科研提供了控制和测定细菌内毒素的方法。
Description
技术领域：
本发明属于微生物检验领域，涉及一种药物原料玻璃酸钠(又称透明质酸钠，简称HA)细菌内菌素检测方法，也就是检测玻璃酸钠原料中细菌内毒素含量的方法。
背景技术：
玻璃酸钠为一种高分子物质，具有保湿、润滑、优良载体等功用，而细菌内毒素是一种能引起人体发热、白细胞减少等一系列生理反应的物质。玻璃酸钠作为注射剂药物的原料时，应进行细菌内毒素含量的检查控制。目前国内只有我们对玻璃酸钠原料进行细菌内毒素控制，也没有文献报道关于玻璃酸钠原料细菌内毒素含量的检测方法。
发明内容：
本发明的目的是提供一种灵敏可靠方法，可快速地检查出玻璃酸钠原料中的细菌内毒素含量。
本发明的玻璃酸钠的细菌内毒素检查方法是：精密定量称取玻璃酸钠原料，用细菌内毒素检查用水稀释成2mg/ml.再稀释至不超过最大有效稀释倍数(MVD)的各稀释级的稀释液，备用。参照《中国药典》2000版附录“细菌内毒素检查法”，先检查各稀释级的细菌内毒素，再从反应结果为阴性的最低稀释级开始做干扰实验，直至某稀级剂不存在干扰，可用该浓度计算内毒素值。
本发明有如下的优点和积极效果
(1)、可以快速可靠地检测出玻璃酸钠原料的细菌内毒素含量。
(2)、通过先摸出反应结果为阴性的最低稀释剂再从此稀释级开始做干扰实验，可以省却大量的先期摸索工作，降低检验成本。
(3)、玻璃酸钠是高分子物质，粘度大，所以原始浓度的确定也减少了摸索初浓度的工作。
(4)、玻璃酸钠溶解和溶胀的时间和条件确定大大减少了由于溶解不充分以及溶解条件不好而引起检测结果的不准确。
本发明的具体实施方式：
一、实验准备
1、实验用具：本实验所用的玻璃器皿，均需超声清洗后再用蒸馏水冲洗三次，于180℃-200℃干烤至少2小时或250℃干烤1小时备用。
2、实验试剂：
75％的酒精棉球
细菌内毒素国家标准品
鲎试剂 规格0.1ml/支，应具有国家主管部门批准文号，且经过灵敏度复核符合规定的。
细菌内毒素检查用水 系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度鲎试剂在37+1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
二、细菌内毒素标准溶液的配制
取细菌内毒素工作标准品一支，用砂轮片轻轻划痕，用75％棉球擦拭启开，防止玻璃屑落入瓶中。
按规定加入细菌内毒素检查用水溶解其内容物，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备所需浓度的细菌内毒素标准溶液(2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ)，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟，备用。
三、供试品溶液的制备
供试品溶液的稀释：
精密定量称取玻璃酸钠原料10-20mg，用细菌内毒素检查用水稀释成2mg/ml(经多次实验得出的适宜浓度，因玻璃酸钠粘度比较大，如浓度高，则操作不易准确；浓度太低，则细菌内毒素不能准确检测到)作为原液，冰箱放置12-15小时，使其充分溶解振摇，再对倍稀释至各稀释级。
四、细菌内毒素检测
取鲎试剂，每支加入0.1ml细菌内毒素检查用水，复溶后，从中取1支加入0.1ml 2.0λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照，1支加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照，其余每2支作平行加入各稀释级的稀释液0.1ml，将试管中溶液轻轻摇匀后，于37±1℃恒温水浴箱中保温60±2分钟，记录反应结果。如果供试品稀释液反应结果全部为阳性，则应加大稀释倍数，进行试验。
五、干扰实验
1、含供试品的内毒素标准溶液的制备
用反应结果为阴性的最低稀释级的供试品稀释液在制备内毒素标准溶液的同时将细菌内毒素国家标准品以相同的方法制备成所需浓度的内毒素溶液(2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ)。
2、取准备好的鲎试剂36支，分成两组，放在试管架上，每组排成4列，每列4支。一组加入(2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ)四种浓度的内毒素标准溶液，每一浓度平行做4管；另一组加入(2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ)四种浓度的含供试品的内毒素标准溶液，每一浓度平等做4管。另取细菌内毒素检查用水和供试品稀释液各做两管阴性对照。
3、内毒素标准品溶液、细菌内毒素检查用水、含供试品的内毒素标准溶液、供试品稀释液的加样量为0.1ml。
4、将试管中溶液轻轻摇匀后，于37±1℃恒温水浴箱中保温60±2分钟，观察并记录结果。
5、结果观察与判断
如最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性时，按下式计算用细菌内毒素检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(Es)和用供试品稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(Et)。
Es＝1g(∑Xs/4)式中：Xs为细菌内毒素检查用水制成内毒素溶液的反应终点浓度的对数值；
Et＝1g(∑Xt/4)式中：Xt为供试品稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值。
当Es在0.5λ-2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时，且当Et在0.5Es-2.0Es(包括0.5Es和2.0Es)时则认为使用该鲎试剂，供试品在该稀释级不存在干扰，只有三个批次的鲎试剂在同一稀释级都不存在干扰现象时，才能证明这一稀释级确无干扰。否则应再对供试品的高一稀释级作干扰实验。
6、结果判定
细菌内毒素含量＝稀释倍数×鲎试剂灵敏度
Claims (5)
1、一种检测玻璃酸钠原料的细菌内毒素含量的方法，其特征在于精密定量称取玻璃酸酸原料10-20mg，用细菌内毒素检查用水稀释成2mg/ml，作为原液，冰箱放置12至15小时，再稀释至不超过最大有效稀释倍数的各稀释级，先检查各稀释级的细茵内毒素，再从反应结果为阴性的最低稀释级开始做干扰实验，直至某高稀释级不存在干扰，可用该稀释级计算细菌内毒素值。
2、如权利要求1所述的检测方法，其特征在于精密定量称取的玻璃酸钠重量为10-20mg.
3、如权利要求1所述的检测方法，其特征在于用原液的稀释浓度为2mg/ml。
4、如权利要求1所述的检测方法，其特征在于为充分溶解玻璃酸钠原料，冰箱放置12-15小时。
5、如权利要求1所述的检查方法，其特征在于做干扰实验的具体操作程序上：是先摸出反应结果为阴性的最低稀释级，再从此稀释级开始做干扰实验。
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