CN1945313A - 一种香菇多糖分子量与分子量分布的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种香菇多糖分子量与分子量分布的测定方法，此方法利用较低浓度的缓冲液作为流动相，利用五根色谱柱进行测定，克服了原有方法系统压力高、需要恒定柱温等缺点。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定方法，更具体地，本发明公开了一种多糖分子量和分子量分布的测定方法。
背景技术
香菇多糖是一种生物反应调节剂，它通过增强机体的抗肿瘤免疫防御反应或改变机体对肿瘤细胞的生物学效应而产生机体或细胞介导的抗肿瘤效果，发挥间接的抗肿瘤作用，被认为是继手术、放疗和化疗三大治疗手段之后的第四种治疗肿瘤的方法。研究其测定方法对于控制其质量具有很重要的意义。
目前测定香菇多糖分子量与分子量分布的方法有激光光散射法和高效凝胶渗透色谱法-HPGPC法(以下均简称为HPGPC法)，在国家食品药品监督管理局生产批件YBH07782006所附标准检测中香菇多糖分子量与分子量分布使用了HPGPC法。
在中国发明专利申请号为03112908.0发明名称为香菇多糖分子量与分子量分布测定方法的专利中公开了上述的HPGPC法，要求保护的是一种香菇多糖分子量及分子量分布测定方法，其特征在于：采用高效凝胶渗透色谱法-HPGPC；HPGPC的流动相可以是超纯水，0.1～0.5mol/L硝酸钠，0.1～0.5mol/L醋酸钠和磷酸盐缓冲溶液；HPGPC的分析柱可以选用适合多糖的色谱柱，可以用一～四根，分离范围为2,000,000～10,000道尔顿的色谱柱组成；HPGPC分析柱的柱温可保持在30℃～55℃；HPGPC的流速可以为0.1ml/min～1.0ml/min；绘制HPGPC相对标准曲线的标准物质可以是Dextran或者Pullulan；绘制HPGPC普适校正曲线的标准物质为香菇多糖的分级分离产品。
将上述方法具体应用于香菇多糖分子量及分子量分布测定有许多不足之处，首先所采用磷酸盐缓冲液容易长菌，室温下2天左右会变浑浊，有絮状物产生，而该方法进样后收集时间较长，大约2小时，一次试验包括校正曲线、理论板数测定、样品测定等经常会持续2～3天；其次所采用磷酸盐缓冲液浓度较大，在国家药品标准WS1-(X-032)-2004Z和生产批件YBH07782006、YBH14462005所附标准中浓度均为0.2mol/L(背景技术发明中公开的最佳实施例)，经常引起色谱系统压力升高，终断试验；而且在实验过程中必须严格控制柱温，而由于目前凝胶色谱柱较长，控制柱温需要特制的柱温箱，才能得到理想的基线，此种柱温箱不是一般液相色谱仪的标准配置，需订购特制，增加了实验的成本。
因此，虽然上述的HPGPC法在实践中可以使用，但仍需要更稳定的方便应用的测定香菇多糖分子量及分子量分布的HPGPC的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的申请人经过大量实验，改进了流动相和色谱柱，使用柠檬酸三钠和柠檬酸组成的缓冲液替代背景技术专利中公开的缓冲液，由于柠檬酸盐缓冲液在浓度较低时(0.09mol/L)就可以达到较好的峰形，而且由于浓度低，不易引起色谱压力升高而终断实验，柠檬酸盐还有一定的抗菌性.不易长菌，从而克服了背景技术专利中公开的缓冲液容易长菌，室温下2天左右会变浑浊，有絮状物产生且经常引起色谱系统压力升高，终断试验的缺点；本发明的申请人使用5支色谱柱串联，得到了更高的理论板数。本发明公开的方法不需柱温箱控制柱温，室温下即可获得理想的基线，增强了色谱系统的耐用性。另外，通过对多种流动相筛选，证明柠檬酸盐缓冲液、草酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、Tris-磷酸缓冲液均可以作为流动相使用；解决流动相长菌还可以通过向流动相中加入小剂量防腐剂解决。
更具体地，本发明公开了：
一种利用HPGPC法测定香菇多糖分子量与分子量分布的方法，其特征在于：色谱柱为五根或五根以上适合多糖的分离范围为2,000,000～10,000道尔顿的色谱柱；
流动相选用柠檬酸盐缓冲液、草酸盐缓冲液、Tris缓冲液(如Tris-盐酸缓冲液或Tris-磷酸缓冲液)、酒石酸盐缓冲液之一，其浓度范围0.05mol/L～0.1mol/L；
HPGPC的柱温为室温；
流速为0.1ml/min～1ml/min；
绘制HPGPC相对标准曲线的物质用葡聚糖。
上述公开的方法，其中流动相为柠檬酸盐缓冲液。
上述公开的方法，其中流动相柠檬酸盐缓冲液为柠檬酸三钠和柠檬酸的水溶液，其浓度为0.09mol/L，pH＝8。
上述公开的方法，其中流速为0.5ml/min。
上述公开的方法，其中香菇多糖用氢氧化钠溶液完全溶解后，用盐酸溶液调pH至7～8。
上述公开的方法，其中氢氧化钠溶液的浓度为0.5mol/L，盐酸溶液的浓度为0.5mol/L。
上述公开的方法，其中流动相中可以加入防腐剂，防腐剂可以是叠氮钠、甲醇、乙腈之一。
上述公开的方法，其中防腐剂为叠氮钠，
上述公开的方法，其中叠氮钠的用量为25mg/l。
利用本发明公开的方法，与背景技术专利中公开的方法进行了比较，并进行了室温留样实验系统适用性实验包括稳定性实验、精密度实验及方法的可靠性考察，结果表明本发明公开的方法具有可靠性高、准确性，同时具有更好的耐用性。
另外，需要说明的是，本发明中所言明的色谱柱为分离范围为2,000,000～1,000道尔顿的色谱柱，常用的有TSK-GEL PW、SW、GMH、Alpha系列，JORDI联合公司SEC系列，ZORBAX GF系列凝胶色谱柱，sephadex或agarose品牌凝胶色谱柱等，本发明中所言明的色谱柱为这些之一，最优的是二支多糖专用凝胶预柱多糖专用凝胶预柱TSK-5000PW 7.5×10cm和三支多糖专用凝胶柱TSK-5000PW 7.5×300cm一起使用，对于利用一到四根超长柱(如果市售柱有单只更长的，称超长柱)基本达到这五根凝胶柱联用从而达到本发明的使用效果的方法，也在本发明公开的范围之内。
具体实施方式：
以下实施例、实验例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制
标准品葡聚糖：购自中国生物制品检定所
供试品香菇多糖：石家庄精晶药业有限公司，实施例中产品批号为精晶药业有限公司产品批号。
仪器：岛津10AT型泵、岛津10A型示差折光检测器
色谱软件：凝胶色谱工作站(北京龙智达公司)
色谱柱：三支多糖专用凝胶柱TSK-5000PW 7.5×300cm；二支多糖专用凝胶预柱多糖专用凝胶预柱TSK-5000PW 7.5×10cm。
实施例1：
香菇多糖分子量与分子量分布的测定
流动相：0.09mol/L柠檬酸盐缓冲液
流动相的配制：0.09mol/L柠檬酸盐缓冲液(精密称取柠檬酸三钠26.46和柠檬酸0.63g，溶于1000ml超纯水中，抽滤，pH＝8)。
流速：0.5ml/min 示差折光检测器温度：35℃
柱温：室温 进样量：200ul
供试品溶液制备：取供试品2mg，加0.5mol/L氢氧化钠溶液0.5ml使溶胀，研磨，溶解，再滴加0.5mol/L盐酸溶液至pH试纸呈7～8，加水至2.0ml，摇匀，过滤。
标准曲线：取葡聚糖标准200万、13.38万、8.44万、4.11万、2.14万、1.00万，分别用流动相配置为1.0mg/ml的溶液。注入液相色谱仪，记录色谱图，输入各标准的重均分子量及k、α值(葡聚糖的k＝0.580，α＝0.338)，采用GCP专用软件建立工作曲线。
理论板数按葡萄糖(0.1％葡萄糖的水溶液)峰计算，应不小于2000；香菇多糖的分配系数(Kd)应为0-1之间。标样为已知分子量葡聚糖标准，重均分子量为10000-2000000的系列组分组成(共6个)，分别用流动相配制成1mg/ml溶液，过滤，取200μl进样。
取供试品溶液200ul注入液相色谱仪，记录色谱图，输入香菇多糖的k、α值(香菇多糖的k＝0.0539，α＝0.607)。采用GCP专用软件处理，计算。
香菇多糖重均分子量(Mw)为40万～80万道尔顿，大于2万道尔顿的组分大于等于90％。
与背景技术中专利公开的测定方法(简称原方法)进行相同批次样品的测定
取050601、060601、060602、060603样品，分别以上述方法和批件YBH07782006所附标准方法检测检查分子量和分子量分布，结果见表1。表中Mw、M90是龙智达GPC软件计算得到两个指标，Mw含义为供试品重均分子量，M90含义为供试品中分子量大于M90的部分占90％。根据测定法中要求，Mw在40万～80万之间，M90大于2万，即可判定符合规定(以下均同)。
表1：两种方法分子量分布检查结果对照
| 本发明公开的方法 | 050601 | 060601 | 060602 | 060603 |
| Mw | 681654 | 499278 | 489009 | 499590 |
| M90 | 55541 | 71351 | 76786 | 67700 |
| 原方法 | 050601 | 060601 | 060602 | 060603 |
| Mw | 699894 | 503983 | 496559 | 483940 |
| M90 | 50240 | 71951 | 74044 | 67238 |
四批样品分子量分布检测结果均符合规定。两种方法结果差异很小。
室温留样试验
试验方法
将060601、060602、060603香菇多糖原料药，置于室温环境中放置，分别在0、3个月取样，检测样品稳定性。
试验结果
香菇多糖原料药留样结果表明(见表2)，在室温条件下放置3个月后，分子量与分子量分布无明显变化，与原方法得到的结论一致。按照GMP要求，此留样检查还在进行中。
表2室温留样稳定性结果
| 考查项目 | 批号 | 新方法室温留样结果 原方法室温留样结果 | |||
| 0月 | 3月 | 0月 | 3月 | ||
| Mw | 060601060602060603 | 499278489009499590 | 509443494477493304 | 503983496559483940 | 501727508171497524 |
| M90 | 060601060602060603 | 713517678667700 | 771816817166479 | 719517404467238 | 721647126464984 |
系统适用性试验
理论板数：
以葡萄糖峰计算理论板数为9282，符合系统适用性要求。用国家药品标准WS1-(X-032)-2004Z或原专利中最佳实施例(0.2mol/L磷酸盐缓冲液)的方法，同样色谱柱和色谱仪条件下，测定葡萄糖峰计算理论板数为8957，本发明中公开的方法在缓冲液浓度降低为0.09mol/L后，理论板数仍略高。本发明申请人利用背景技术中公开的专利，采用0.1mol/L磷酸盐缓冲液对同一批样品进行同样的实验，结果证明不能达到理想的理论板数，达不到本发明的效果。
溶液稳定性实验
实验结果表明：供试品溶液在室温放置24小时，测定重均分子量稳定，M90略有下降，结果见表3
表3：溶液稳定性数据
| Mw | M90 | |
| 0小时 | 563162 | 75247 |
| 2.5小时 | 573842 | 77216 |
| 5小时 | 574409 | 77878 |
| 10小时 | 561595 | 61629 |
| 15小时 | 569730 | 57094 |
| 20小时 | 572393 | 57696 |
| 24小时 | 565411 | 54013 |
| 均值 | 568649 | |
| RSD％ | 0.92％ |
精密度实验
对供试品溶液连续进样六次，经GPC软件计算，实验结果表明：精密度较好。结果见表4。
表4：精密度试验结果表
| 精密度 | Mw | M90 |
| 1 | 513704 | 83687 |
| 2 | 521630 | 81905 |
| 3 | 523157 | 80199 |
| 4 | 528037 | 79995 |
| 5 | 555140 | 84483 |
| 6 | 521771 | 84041 |
| 均值 | 527239.8 | 82385.0 |
| RSD％ | 2.74％ | 2.40％ |
注：本实施例的流动相在室温下放置3～5日没有长菌。
实施例2：
香菇多糖分子量与分子量分布的测定
流动相：0.09mol/L柠檬酸盐缓冲液，加入少量叠氮钠(每1000ml中加入25mg)
流动相的配制：精密称取柠檬酸三钠26.46和柠檬酸0.63g，叠氮钠25mg溶于1000ml超纯水中，抽滤，pH＝8。
流速：0.5ml/min 示差折光检测器温度：35℃
柱温：室温 进样量：200ul
供试品溶液制备：取供试品2mg，加0.5mol/L氢氧化钠溶液0.5ml使溶胀，研磨，溶解，再滴加0.5mol/L盐酸溶液至pH试纸呈7～8，加水至2.0ml，摇匀，过滤。
标准曲线：取葡聚糖标准200万、13.38万、8.44万、4.11万、2.14万、1.00万，分别用流动相配置为1.0mg/ml的溶液。注入液相色谱仪，记录色谱图，输入各标准的重均分子量及k、α值(葡聚糖的k＝0.580，α＝0.338)，采用GCP专用软件建立工作曲线。
理论板数按葡萄糖(0.1％葡萄糖的水溶液)峰计算，应不小于2000；香菇多糖的分配系数(Kd)应为0-1之间。标样为已知分子量葡聚糖标准，重均分子量为10000-2000000的系列组分组成(共6个)，分别用流动相配制成1mg/ml溶液，过滤，取200μl进样。
取供试品溶液200ul注入液相色谱仪，记录色谱图，输入香菇多糖的k、α值(香菇多糖的k＝0.0539，α＝0.607)。采用GCP专用软件处理，计算。
香菇多糖重均分子量(Mw)为40万～80万道尔顿，大于2万道尔顿的组分大于等于90％。
理论板数：
以葡萄糖峰计算理论板数为8643，符合系统适用性要求。
供试品测定：
取050601、060601、060602、060603样品，以上述方法检查分子量和分子量分布，结果见表5。
表5：分子量分布检查结果
| 实施例2方法 | 050601 | 060601 | 060602 | 060603 |
| Mw | 673526 | 502336 | 500225 | 510490 |
| M90 | 72860 | 52052 | 54776 | 55114 |
注：本实施例中的流动相可以室温下连续使用10日以上，不长菌，系统压力不升高。
实施例3：
同实施例2，只是缓冲液的浓度改为0.05mol/L，防腐剂改为乙腈，乙腈的加入量为1％。
分子量分布检查结果与实施例2接近，理论板数稍有下降。
以葡萄糖峰计算理论板数为4125，符合系统适用性要求。
供试品060601批分子量和分子量分布结果如下：Mw＝511073，M90＝52784。
Claims (9)
1.一种利用HPGPC法测定香菇多糖分子量与分子量分布的方法，其特征在于：色谱柱采用五根或五根以上适合多糖的分离范围为2,000,000～10,000道尔顿的色谱柱组成；
流动相选用柠檬酸盐缓冲液、草酸盐缓冲液、Tris缓冲液如Tris-盐酸缓冲液或Tris-磷酸缓冲液、酒石酸盐缓冲液之一，其浓度范围为0.05mol/L～0.1mol/L；
HPGPC的柱温为室温；
流速为0.1ml/min～1ml/min；
绘制HPGPC相对标准曲线的物质用葡聚糖。
2.权利要求1公开的方法，其中流动相为柠檬酸盐缓冲液。
3.权利要求2公开的方法，其中柠檬酸盐缓冲液为柠檬酸三钠和柠檬酸的水溶液，其浓度为0.09mol/L，pH＝8。
4.权利要求1公开的方法，其中流速为0.5ml/min。
5.权利要求1公开的方法，其中香菇多糖用氢氧化钠溶液完全溶解后，用盐酸溶液调pH至7～8。
6.权利要求5公开的方法，，其中氢氧化钠溶液的浓度为0.5mol/L，盐酸溶液的浓度为0.5mol/L。
7.权利要求1公开的方法，其中流动相中可以加入防腐剂，防腐剂可以为叠氮钠、甲醇、乙腈之一。
8.权利要求7公开的方法，其中防腐剂是叠氮钠。
9.权利要求8公开的方法，其中叠氮钠的用量为25mg/l。
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| CN101441202B (zh) * | 2008-12-29 | 2011-08-10 | 河南工业大学 | 一种检测真菌多糖的方法 |
| CN105628797A (zh) * | 2014-10-28 | 2016-06-01 | 华仁药业股份有限公司 | 艾考糊精原料药分子量及其分布测定方法 |
| CN110174478A (zh) * | 2019-06-12 | 2019-08-27 | 劲牌有限公司 | 酒中β-葡聚糖分子量的测定方法 |
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2006
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