CN101387647A - 光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法 - Google Patents

光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101387647A
CN101387647A CNA2008101399386A CN200810139938A CN101387647A CN 101387647 A CN101387647 A CN 101387647A CN A2008101399386 A CNA2008101399386 A CN A2008101399386A CN 200810139938 A CN200810139938 A CN 200810139938A CN 101387647 A CN101387647 A CN 101387647A
Authority
CN
China
Prior art keywords
endotoxin
content
anhydrous dextrose
sample
test
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2008101399386A
Other languages
English (en)
Inventor
王勇
王岩
刘剑侠
张全刚
程平
王非
何玉梅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
XIWANG GROUP CO Ltd
Original Assignee
XIWANG GROUP CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by XIWANG GROUP CO Ltd filed Critical XIWANG GROUP CO Ltd
Priority to CNA2008101399386A priority Critical patent/CN101387647A/zh
Publication of CN101387647A publication Critical patent/CN101387647A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明的光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法，属于分析化学领域，技术方案是：利用光度法检测鲎试剂与内毒素反应后混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，确定待测无水葡萄糖样品中内毒素的具体含量的方法。利用这一原理，用已知含量的内毒素工作标准品，稀释成不同含量的工作标准品系列，测定出不同内毒素含量标准对应达到预设吸光度对应的时间，绘制出标准曲线。然后在一定条件下测定待测无水葡萄糖样品达到预设值所需要的时间，从而可计算出待测无水葡萄糖样品中内毒素的具体含量。

Description

光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法
所属技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法。
背景技术
由于注射引起哺乳动物和热体发热的一类物质，统称为热源，在GMP(药品生产管理规范)条件下生产的注射剂污染的热源就是细菌内毒素。而细菌内毒素是嵌在G-菌细胞壁的脂多糖结构(无毛状物)，能引起哺乳动物和人体发热。所以说，很多的用无水葡萄糖的输液厂家，都很注重糖中细菌内毒素的含量，以便避免人体的输液反应。现国家药典中，只对葡萄糖输液的内毒素含量进行了规定，而对无水葡萄糖原料药没有界定。
一般的细菌内毒素的检查法为凝胶法，凝胶法对于试验的温度、时间控制很严格，并且一次只能是有限的试验样品数量，否则在实验的时间和温度控制上就会出现误差。因为细菌内毒素检查的误差限值在50％≤λ≤200％，所以在出检测报告的时候，以最大误差计算，例如我们用灵敏度为0.5EU/mL的鲎试剂作凝胶试验，如果样品在此灵敏度下凝胶，则说明样品的内毒素含量小于1.0EU/mL。样品中的内毒素含量的具体数值不能准确地知道。并且当内毒素的含量小于0.03EU/mL时，用凝胶法容易产生假阳性，使结果出现错误判断，误导生产，给企业造成不必要的损失。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法，应用该方法，可定量的检测出无水葡萄糖中内毒素的具体含量。
本发明所述的光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法，是一种利用光度法检测鲎试剂与内毒素反应后混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，确定待测无水葡萄糖样品中内毒素的具体含量的方法。
利用这一原理，用已知含量的内毒素工作标准品，稀释成不同含量的工作标准品系列，测定出不同内毒素含量标准对应达到预设吸光度对应的时间，绘制出标准曲线。然后在一定条件下测定待测无水葡萄糖样品达到预设值所需要的时间，从而可计算出待测无水葡萄糖样品中内毒素的具体含量。
上述细菌内毒素含量测定方法的具体测试步骤如下：
将无水葡萄糖用细菌内毒素检查用水稀释成5％的溶液，然后加入到盛有0.1ml定量鲎试剂的测试管中，同时做阳性对照液，漩涡混匀后放入内毒素定量测定仪中，仪器自动进行数据采集，通过与原输入的标准曲线对比，计算出无水葡萄糖细菌内毒素含量。
本发明测试方法与凝胶法的比较如下：
 
项目 光度法 凝胶法
结果 对结果的解释更慎重。 有两倍的误差
反应速度 使用OD限值法，达到规定OD值即可结束试验。 规定1小时。
鲎试剂表示       制做标准曲线描述鲎试剂的检测能力，检测结果与最低检测限无关。                     用灵敏度复核试验来标定鲎试剂的灵敏度                                
干扰试验 快速；其大范围定量的特性，使干扰试验往往在一两次试验后完成；节约成本。             大量的搜索，要消耗大量的时间和试剂。
敏感性 较之凝胶法易受干扰，灵敏。 对干扰相对不敏感，较光度测定法不灵敏。                              
加样量 随仪器的不同而有所不同。 固定为：0.1ml的鲎试剂加0.1ml的样品。
具体实施方式
本发明所述检测方法是通过以下试验来建立和确认的。
一、标准曲线的制作和考察
1、标准曲线的制作
首先将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水1mL溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟，然后制备成2EU/mL、1EU/mL、0.5EU/mL、0.125EU/mL、0.0325EU/mL备用，然后将复溶好的光度测定法鲎试剂分装到10支定量分析专用试管中，每管分装0.1mL，接着将内毒素加入定量分析专用试管中，每个浓度做两支平行管，每管加量0.2ml，剩余两管各加入BET用水(细菌内毒素检查用水)0.2ml作为阴性对照。
2、标准曲线的有效性考察
 
管号 内毒素(EU/ml) 反应时间(秒) 变异系数 实测内毒素
1 0 >7200 0
2 0 >7200
3 2.0 790 0.36％ 2.0118
4 2.0 794
5 0.5 1159 1.01％ 0.5022
6 0.5 1140
7 0.125 1620 0.34％ 0.1217
8 0.125 1634
9 0.0325 2398 0.04％ 0.0318
10 0.0325 2381
结论：线性方程：LogT＝2.9783-0.2621LogC，相关系数γ＝-0.9999，标准曲线符合规定。
二.待测样品的制备方法和步骤
阴性对照液
在定量测试管中，加入0.2ml的内毒素检查用水，加入0.1ml的定量鲎试剂，混匀后，用封口膜封好。
供试品液
将5％的无水葡萄糖溶液0.2ml加入装好鲎试剂的试管中轻轻摇匀，也可在旋涡混合器上轻轻振荡一下，加样时千万要注意不要使溶液产生气泡，否则会影响光电检测，用封口膜将试管口封好。
阳性对照：
无水葡萄糖5％的阳性对照：吸取0.15mlBET水、0.15ml2EU/ml的细菌内毒素标准、0.30ml10％无水葡萄糖样品液到一小试管中，混合。然后吸取混合液0.2ml到含有0.1ml鲎试剂的定量小试管中，混合后，用封口膜封好。
三.干扰试验
1、限度的确定：
2005年版《中国药典》二部正文葡萄糖注射液
L＝0.5EU/mL
此葡萄糖注射液的浓度为10％，故折算成固体葡萄糖的量为5EU/g，因为水中本身也含有一定量的内毒素，因此确定固体葡萄糖产品的内毒素为2.5EU/g。
2、干扰试验的浓度的计算
按照药品检验指导原则，供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C＝λ/L＝0.0325/2.5＝0.13g/ml。
3、光度测定法干扰试验溶液的制备
 
编号 内毒素浓度 配制内毒素的溶液         平行管数
A 无 1.0mg/ml或0.5mg/ml   2
B 标准曲线的中点0.5EU/ml(设为λm)                   1.0mg/ml或0.5mg/ml   2
C 2.0EU/ml、0.5Eu/ml、0.125Eu/ml、0.0325Eu/ml四个浓度                  检查用水 每一浓度2
D 无 检查用水 2
A：稀释倍数未超过MVD的供试品溶液浓度为1.0mg/ml或0.5mg/ml，检查结果用Ct。
B：假如标准曲线中点或靠近中点的一个已知内毒素浓度的0.5EU/ml，且与溶液A有相同稀释倍数的供试液，检查结果用Cs。
C：标准曲线的可靠性试验项下描述的，用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。
D：阴性对照。
按所得线性回归方程分别计算供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Ct和Cs，再按下式计算试验条件下的回收率(R)。
R＝(Cs-Ct)/λm×100％
当内毒素的回收率在50％～200％之间，则认为在该试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。
4、供试品溶液
无水葡萄糖的稀释
用细菌内毒素检查用水，将无水葡萄糖稀释成10％的葡萄糖溶液，并将10％的葡萄糖液稀释到2倍原液和4倍原液。
5、干扰试验的系列的制备方法
取葡萄糖2倍稀释液、4倍稀释液，分别加入六支试管中，每管加0.3ml，，然后分别吸取0.3ml的内毒素标准溶液，浓度为1.0EU/ml加入其中两支试管中，另外吸取0.3ml的检查用水加入其中另外两支试管中，将四支试管混合均匀可得到10％葡萄糖的溶液的2倍、4倍稀释液干扰试验所用的样品溶液
6、干扰试验加样方法
取分装了0.1ml定量鲎试剂的专用试管8支。葡萄糖4倍、8倍稀释液干扰试验各4支，加样量为0.2ml。将样完毕后密封试管，将每支在漩涡混合器上点1～3秒，然后将试管插入定量检测仪，仪器开始采集数据。
7、试验结果记录见下表
 
管号 样品名称 批号 稀释倍数 外加内毒素(EU/ml) 反应时间(秒)     变异系数CV％     回收率RC％   实测内毒素EU/ml  
1 阴性对照 0.0 >3600
2 阴性对照 0.0 >3600
3 阳性对照 0.5 1138 0.25％ 0.5977
4 阳性对照 0.5 1142
5 葡萄糖稀释液 200510081 5％ 0.0 >3600
6 葡萄糖稀释液 200510081 5％ 0.0 >3600
7 葡萄糖稀释液 200510081 5％ 0.5 1245 1.32％ 94％ 0.4705
8 葡萄糖稀释液 200510081 5％ 0.5 1222
9 葡萄糖稀释液 200510081 10％ 0.0 >3600
10 葡萄糖稀释液 200510081 10％ 0.0 >3600
 
11 葡萄糖稀释液 200510081 10％ 0.5 1230 4.24 86％ 0.7327
12 葡萄糖稀释液 200510081 10％ 0.5 1306
结论：
无水葡萄糖的5％及10％溶液内毒素的回收率接近100％，平行样间的变异系数小于10％，符合试验要求，并由此得知，无水葡萄糖内毒素含量为零。

Claims (3)

1、一种光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法，其特征是一种利用光度法检测鲎试剂与内毒素反应后混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，确定待测无水葡萄糖样品中内毒素的具体含量的方法。利用这一原理，用已知含量的内毒素工作标准品，稀释成不同含量的工作标准品系列，测定出不同内毒素含量标准对应达到预设吸光度对应的时间，绘制出标准曲线。然后在一定条件下测定待测无水葡萄糖样品达到预设值所需要的时间，从而可计算出待测无水葡萄糖样品中内毒素的具体含量。
2、如权利要求1所述的细菌内毒素含量的方法，其特征为：首先将无水葡萄糖用BET用水稀释成10％的溶液，然后加入到盛有0.1ml定量鲎试剂的测试管中，漩涡混匀后放入内毒素定量测定仪中，仪器自动进行数据采集后，通过与原输入的标准曲线对比，定量计算出无水葡萄糖细菌内毒素含量。
3、如权利要求1或2所述的细菌内毒素含量的方法，其特征为：首先将无水葡萄糖用BET用水稀释成5％的溶液，然后加入到盛有0.1ml定量鲎试剂的测试管中，漩涡混匀后放入内毒素定量测定仪中，仪器自动进行数据采集后，通过与原输入的标准曲线对比，定量计算出无水葡萄糖细菌内毒素含量。
CNA2008101399386A 2008-09-08 2008-09-08 光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法 Pending CN101387647A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNA2008101399386A CN101387647A (zh) 2008-09-08 2008-09-08 光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNA2008101399386A CN101387647A (zh) 2008-09-08 2008-09-08 光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101387647A true CN101387647A (zh) 2009-03-18

Family

ID=40477187

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2008101399386A Pending CN101387647A (zh) 2008-09-08 2008-09-08 光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101387647A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102033044A (zh) * 2010-10-28 2011-04-27 江南大学 一种通过显色基质法测定注射级大豆磷脂中细菌内毒素含量的方法
CN102650593A (zh) * 2012-04-24 2012-08-29 湖南迪斯生物技术有限公司 一种内毒素真菌检测仪
CN102721795A (zh) * 2012-06-04 2012-10-10 贵州景峰注射剂有限公司 一种参芎葡萄糖注射液的细菌内毒素检查方法
CN104704370A (zh) * 2012-10-08 2015-06-10 通用电气公司 用于测试lal反应物质的预装载的测试基板、使用方法和制备方法
CN106872463A (zh) * 2015-12-10 2017-06-20 中国科学院大连化学物理研究所 将动态浊度法用于海藻酸盐材料中内毒素的定量检测方法
CN112505279A (zh) * 2020-12-04 2021-03-16 北京师范大学 一种利用纳米管膜压差检测生化尾水中内毒素浓度的方法

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102033044A (zh) * 2010-10-28 2011-04-27 江南大学 一种通过显色基质法测定注射级大豆磷脂中细菌内毒素含量的方法
CN102650593A (zh) * 2012-04-24 2012-08-29 湖南迪斯生物技术有限公司 一种内毒素真菌检测仪
CN102721795A (zh) * 2012-06-04 2012-10-10 贵州景峰注射剂有限公司 一种参芎葡萄糖注射液的细菌内毒素检查方法
US10302642B2 (en) 2012-10-08 2019-05-28 General Electric Company Sensitive and rapid method for detection of low levels of LAL-reactive substances
CN104704370B (zh) * 2012-10-08 2017-05-10 通用电气公司 用于测试lal反应物质的预装载的测试基板、使用方法和制备方法
US9678079B2 (en) 2012-10-08 2017-06-13 General Electric Company Microfluidic LAL-reactive substances testing method and apparatus
US9880166B2 (en) 2012-10-08 2018-01-30 General Electric Company Sensitive and rapid method for detection of low levels of LAL-reactive substances
US10082505B2 (en) 2012-10-08 2018-09-25 General Electric Company Centripetal microfluidic platform for LAL-reactive substances testing
CN104704370A (zh) * 2012-10-08 2015-06-10 通用电气公司 用于测试lal反应物质的预装载的测试基板、使用方法和制备方法
US10352934B2 (en) 2012-10-08 2019-07-16 General Electric Company Preloaded test substrates for testing LAL-reactive substances, methods of use, and methods of making
US10451622B2 (en) 2012-10-08 2019-10-22 Bl Technologies, Inc. Centripetal microfluidic platform for LAL reactive substances testing
US11422133B2 (en) 2012-10-08 2022-08-23 Bl Technologies, Inc. Centripetal microfluidic platform for LAL reactive substances testing
CN106872463A (zh) * 2015-12-10 2017-06-20 中国科学院大连化学物理研究所 将动态浊度法用于海藻酸盐材料中内毒素的定量检测方法
CN112505279A (zh) * 2020-12-04 2021-03-16 北京师范大学 一种利用纳米管膜压差检测生化尾水中内毒素浓度的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101387647A (zh) 光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法
CN109580946A (zh) 一种同时检测甲型和乙型流感病毒的试纸条及制备方法
CN205484299U (zh) 水质在线检测装置
Liang et al. One-step 3D printed flow cells using single transparent material for flow injection spectrophotometry
CN103994954A (zh) 一种低成本高精度雾霾测量仪
CN107255685A (zh) 一种检测化妆品中紫外吸收剂的高效液相色谱法
CN101819137A (zh) 尿碘测定仪及其分析方法
CN109580933A (zh) 一种检测流感病毒的试纸条及制备方法
CN102375060B (zh) 一种基于上转换发光十通道免疫层析的食源性致病菌检测试纸盘
CN104132913A (zh) 内毒素的检测和/或定量
CN102269744A (zh) 一种纺织品中二甲基甲酰胺残留量的快速检测方法
CN104181117A (zh) 一种检测纤维中蛋白质含量的方法
CN103792169A (zh) 一种煤粉悬浊液浓度的测量方法
CN104535566A (zh) 一种检测灭蝇胺的方法
Rutkowski et al. An ultramicro colorimetric method for determination of total and direct serum bilirubin
CN108195950A (zh) 基于气相色谱仪的标准气体稀释装置的稀释误差检测装置及其检测方法
CN101718709A (zh) 一种检测木糖醇注射液细菌内毒素的方法
CN106290203B (zh) 一种基于氯化血红素催化反应的四环素比色检测方法
CN108872271A (zh) 一种含铀管道中含铀液体浓度的检测方法及检测装置
CN104111281A (zh) 一种快速分析酒中塑化剂的方法
CN104931639B (zh) 一种快速测定材料中svoc散发特性参数的装置及方法
CN106546729A (zh) 一种去除干式免疫荧光定量法检测中血清基质效应的新工艺方法
CN104140396A (zh) 苯并咪唑类药物半抗原及其制备方法和应用
CN108469419A (zh) 采用酶标仪免疫透射比浊法高通量检测IgG含量的方法
CN201697872U (zh) 尿碘测定仪

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20090318