CN103424401B

CN103424401B - 一种快速检测鱼腥草注射液综合毒性的生物测试方法

Info

Publication number: CN103424401B
Application number: CN201310369652.8A
Authority: CN
Inventors: 赵军宁; 鄢良春; 郑晓秋; 朱雅宁; 赵炳祥
Original assignee: YAAN SANJIU PHARMACEUTICA CO Ltd; Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences SACMS
Current assignee: Huarun 39 (Ya'an) Pharmaceutical Co., Ltd.; Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences SACMS
Priority date: 2013-08-22
Filing date: 2013-08-22
Publication date: 2016-02-17
Anticipated expiration: 2033-08-22
Also published as: CN103424401A

Abstract

本发明公开了一种快速检测鱼腥草注射液综合毒性的生物测试方法，包括如下步骤：（1）制备测试用菌液：取发光细菌冻干粉，用氯离子浓度为0.1-1.0mol/L的溶液复苏，得测试用菌液；（2）检测：取鱼腥草注射液待检样品，用测试用菌液检测，确定发光强度抑制率为50%的样品稀释度以及稀释度-效应动力曲线。本发明方法检测准确度和灵敏度均较高，操作简单。

Description

一种快速检测鱼腥草注射液综合毒性的生物测试方法

技术领域

本发明涉及一种快速检测鱼腥草注射液综合毒性的生物测试方法。

背景技术

鱼腥草注射液具有广谱抗病毒、抗细菌作用，这种双重抗感染作用是一般抗菌药所不具备的，故为临床常用的抗感染产品，被列为《全国中医医院急诊科(室)必备中成药》，在临床上应用已有几十年。但是，其不良反应存在多发、普遍、临床表现的多样、不可预知、不良反应种类的不确定、批与批之间不良反应存在差异性等特点。从国家药品不良反应监测中心数据库收到的使用鱼腥草注射液等注射剂的不良反应病例报告来看，过敏反应、呼吸系统反应、心脑血管系统反应的构成比依次排在鱼腥草注射液不良反应的前三位。其中过敏反应报道数量最多，约占50％以上。主要表现为皮肤和全身过敏反应，一般停药或给予抗过敏治疗即可消除。主要的严重不良反应表现为过敏性休克，且发生率较高为29.84％，并有死亡病例发生。

虽然目前已经采取了诸多手段对鱼腥草注射液的质量进行了控制，如：1.药材原料质量控制(GAP)；2.辅料和内包装材料的控制；3.生产过程质量控制关键点(GMP)；4.质量标准的控制(采用多成分定量测定，指纹图谱等)；5.流通过程质量控制(GSP)；6.使用环节药品质量控制等，但仍然无法有效的保证其药效的一致性和降低其不良反应的发生率。因此，有必要引入新的方法辅助其质量控制。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种快速检测鱼腥草注射液综合毒性的生物测试方法。

本发明快速检测鱼腥草注射液综合毒性的生物测试方法，包括如下步骤：

(1)制备测试用菌液：取发光细菌冻干粉，用氯离子浓度为0.1-1.0mol/L的溶液复苏，得测试用菌液；

(2)检测：取待检样品，用测试用菌液检测，确定稀释度-效应动力曲线以及发光强度抑制率为50％的稀释度。

稀释度-效应动力曲线，是指待检溶液稀释度与发光强度抑制率的关系曲线。

步骤(1)中，所述发光细菌是费氏弧菌、明亮发光杆菌T3小种、青海弧菌及其它非致病发光细菌。

步骤(1)中，所述制备测试用菌液的方法是：取型号为CS234的费氏弧菌冻干粉1支，加入0.2-1.0ml的氯离子浓度为0.51mol/L的溶液，即得测试用菌液。

步骤(1)中，所述含氯离子的溶液的pH为5～9。

步骤(2)所述检测的方法如下：

a、预测试：取待检样品，用水稀释成5个梯度的待检液，体积百分比分别是：100％、25％、6.25％、1.5625％、0.39％，以氯离子浓度为0.1-1.0mol/L的溶液为标准液，在所述待测液和标准液中加入测试用菌液，菌液加入量为待检液或标准液体积的1/25～1/15，放置5～30min，检测发光强度，计算5个稀释度的发光度抑制率；

b、确定检测稀释度的上限及下限：根据步骤a的结果，以抑制率为90～100％的任一稀释度为上限，若样品原液的抑制率未达到90％，则以样品原液为上限；以抑制率为0～10％的任一稀释度为下限；

c、测试：在步骤b确定的稀释度上限和下限之间增配6～9个均匀稀释梯度的待检液，以氯离子浓度为0.1-1.0mol/L的溶液为标准液，在所述待测液和标准液中加入测试用菌液，菌液加入量为待检液或标准液体积的1/25～1/15，放置5～30min，检测发光强度，制作稀释度-效应动力曲线，计算抑制率为50％的稀释度。

本发明稀释度，是指待检溶液被冲淡的程度。例如，1ml鱼腥草注射液用3ml水稀释，稀释度为25％。

如果稀释度的值小，说明待检鱼腥草注射液的毒性大，如果稀释度的值大，说明待检鱼腥草注射液的毒性小。

抑制率为50％的稀释度，即本发明EC₅₀。

步骤a和步骤c中，所述待检液中加有含氯离子的溶液，其氯离子浓度为0.1-1.0mol/L；所述标准液中氯离子浓度为0.51mol/L。

步骤a和步骤c中，所述待检液和氯化钠溶液的pH为5～9。

步骤a和步骤c中，所述菌液加入量为待检液或标准液体积的1/20。

步骤a和步骤c中，所述放置时间为15min。

前述检测方法中，发光强度采用型号为LUMIStox300的生物毒性测试仪或其他具有发光强度检测功能的仪器。

本发明方法可以有效检测鱼腥草注射液的毒性，为其临床应用提供可靠依据，同时，本发明检测方法具有如下优点：(1)检测速度快：在1小时内可以得出结果，评估其综合毒性；(2)操作简单：无需灌胃、静脉注射等专业技术，操作简单，方便易行；(3)反应灵敏；利用现代灵敏的光电检测技术，能对极微弱的光强度变化进行检测，比一般生物细胞反应灵敏几个数量级；(4)能对综合毒性的大小进行判断；(5)细菌样本量大，克服了动物试验中样本数量少以及个体差异等影响。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1浓度1费氏弧菌发光强度随时间的变化图

图2浓度2费氏弧菌发光强度随时间的变化图

图3浓度3费氏弧菌发光强度随时间的变化图

图4浓度4费氏弧菌发光强度随时间的变化图

图5浓度5费氏弧菌发光强度随时间的变化图

图6厂家甲第一批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图7厂家甲第二批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图8厂家甲第三批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图9厂家甲第四批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图10厂家甲第五批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图11厂家甲第六批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图12厂家甲第七批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图13厂家甲第八批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图14厂家甲第九批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图15厂家甲第十批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图16厂家乙第一批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图17厂家乙第二批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图18厂家乙第三批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图19厂家乙第四批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图20厂家乙第五批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图21厂家乙第六批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图22厂家乙第七批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图23厂家乙第八批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图24厂家乙第九批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

图25厂家乙第十批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度-效应动力曲线

具体实施方式

实施例1本发明快速检测鱼腥草注射液综合毒性的生物测试方法

1实验材料

1.1菌种

费氏弧菌冻干粉（CS234），购自北京滨松光子技术股份有限公司，-20℃避光保存。

1.2主要试剂

复苏稀释液：0.51mol/L氯化钠溶液；

渗透压调节液：3.42mol/L氯化钠溶液；

鱼腥草注射剂，市售。

1.3主要仪器及器材

LUMIStox300生物毒性测试仪及配套的LUMIStherm预温槽和测试管（Dr.BrunoLangeGmbH）、BCD-539WF电冰箱（海尔）、PB-10酸度计（赛多利斯）

2实验方法

2.1测试用菌液的制备

从冰箱冷冻室（-20℃）取出费氏弧菌冻干粉1支，置于室温（20℃左右）平衡15min后，加入0.2-1.0ml复苏稀释液，于室温下放置10min，即可用于测试。

2.2预试验

将鱼腥草注射剂用蒸馏水按1：4稀释成5个梯度（即稀释度梯度）：100%、25%、6.25%、1.5625%、0.39%，按2.3所述制备成待测样品溶液，按2.5所述方法粗测一遍，确定上限及下限的浓度（即稀释度）范围。上限为抑制率达到90～100%时样品的浓度，若样品原液的抑制率未达到90%，则以样品原液为上限；下限为抑制率达到0～10%时样品的浓度。

2.3待测样品溶液制备

在上限和下限之间根据需要再增配6～12个浓度。将样品用蒸馏水稀释到各浓度，再将各浓度样品与渗透压调节液以17:3的比例混合，配制成待测样品溶液，使待测样品溶液氯离子浓度为0.51mol/L。

2.4空白对照液（标准液）制备

采用复苏稀释液作为空白对照液。

2.5发光强度测定

待测样品每个浓度准备3支测试管，每支测试管加入1ml待测样品，设3个平行样；空白对照液也取3支测试管，每支测试管加入1ml复苏稀释液，同样设置3个平行样。用移液器向各测试管中依次加入0.05ml测试用菌液，轻轻振荡，使之充分混匀，每个测试管加菌液的间隔时间为15秒，于育温槽中放置15min后用生物毒性测试仪依次间隔15秒测定各测试管的发光强度，按下式计算抑制率，以EC₅₀（抑制率等于50%时该样品的浓度值）表示各样品的毒性大小，EC₅₀值越小，毒性越大。

2.6方法学考察

2.6.1测定方法影响因素考察

2.6.1.1时间对发光强度的影响

测试管中加入不同体积的复苏稀释液和测试用菌液，制备成不同初始发光强度的测试样品（总体积为1.05ml，样品1为1.04ml复苏稀释液加入0.01ml测试用菌液,样品2为1.02ml复苏稀释液加入0.03ml测试用菌液,样品3为1.00ml复苏稀释液加入0.05ml测试用菌液,样品4为0.95ml复苏稀释液加入0.1ml测试用菌液,样品5为0.85ml复苏稀释液加入0.2ml测试用菌液）,轻轻振荡，使之充分混匀，每组样品做3个平行样。从混匀开始计时，每1分钟测定1次发光强度值，算出3个平行样的平均值，比较时间对不同初始发光强度的影响。

2.6.1.2pH值对发光强度的影响

取复苏稀释液加入NaOH或HCl，分别配成pH为3,4,5,6,7,8,9,10,11的复苏稀释液。分别取各pH值复苏稀释液1ml于测试管中（每组做3个平行样），向各测试管中依次加入0.05ml测试用菌液，轻轻振荡，使之充分混匀，分别于放置5min，10min，15min后用生物毒性测试仪测定发光强度值，比较pH值对发光强度的影响。

2.6.2精密度考察

2.6.2.1重复性考察

按上述确定的方法对3批鱼腥草注射剂样品（KZ-110501、KZ-110502、KZ-110503）进行测试、每批样品重复3次试验，对结果进行评价。

2.6.2.2中间精密度考察

（1）不同人员试验

按上述确定的方法，由两个工作人员在同一工作日对同一批鱼腥草注射剂样品（KZ-110503）进行测试，对结果进行评价。

（2）不同工作日试验

按上述确定的方法，由同一工作人员在不同工作日对同一批鱼腥草注射剂样品（KZ-110503）进行测试，对结果进行评价。

3结果

3.1测定方法影响因素考察

3.1.1时间对发光强度的影响

实验结果如表1和图1所示：

表1时间对不同初始发光强度的影响

由表1和图1～5可见，5个样品的发光强度值随时间的延长呈降低趋势，在5～30min内维持于一个相对稳定的水平，初始发光强度值越高，发光强度降低率越低。同时，实验发现，15min发光强度为500-1000时（样品3），检测结果较准确，成本也交低，因此，测试用菌液的加入量优选为菌液体积的1/20。

3.1.2pH值对发光强度的影响

实验结果如表2所示：

表2pH值对发光强度的影响

由表2可见，检测时，溶液pH值在5.0-9.0之间对发光强度的影响较小，抑制率在±10%之内，因此使用本发明检测方法检测时，溶液pH优选为5.0～9.0。

3.2精密度考察

3.2.1重复性试验

实验结果如表3和表4所示：

表3重复性试验结果

表43批鱼腥草注射剂样品EC₅₀值（%）

由表3和表4可见，本发明方法的重复性试验的相对偏差<15%，说明本发明方法的准确度高，可重复性好。

3.2.2中间精密度考察

3.2.2.1不同工作人员试验

表5不同工作人员试验结果

3.2.2.2不同工作日试验

表6不同工作日试验结果

由表5和表6可见，本发明方法的中间精密度试验的相对偏差<15%，说明书本发明方法的再现性好，准确度高。

实验说明，本发明方法可以有效检测鱼腥草注射液的毒性，可重复性好，再现性好，准确度高。

实施例2用本发明方法检测不同厂家不同批次的鱼腥草注射液

1.实验材料

同实施例1。

鱼腥草注射剂：甲厂家10批；

鱼腥草注射剂：乙厂家10批。

2.实验方法

厂家甲和厂家乙各10批鱼腥草注射液成品经传统方法检测，确定为合格产品。

采用实施例1的方法，对厂家甲和厂家乙各10批鱼腥草注射液成品进行发光强度测定，计算抑制率，用EC₅₀比较各样品的综合毒性大小。

2.1测试用菌液的制备

同实施例1。

2.2预试验

同实施例1。

2.3待测样品溶液制备

同实施例1。

2.4空白对照液制备

同实施例1。

2.5发光强度测定

同实施例1。

3结果

3.1厂家甲10批鱼腥草注射液综合毒性测试

表7厂家甲10批鱼腥草注射液成品样品抑制率（%）

表8厂家甲10批鱼腥草注射液成品样品EC₅₀值（%）

根据表7、表8以及图6～15中厂家甲10批次鱼腥草注射液成品的EC₅₀（发光强度抑制率为50%时的稀释度），可以看出，厂家甲10批次鱼腥草注射液成品的综合毒性大小为：K-101101≈K-101102>K-101103=K-100903≈K-100902≈K-100901>KZ-110503>KZ-110502≈091001≈KZ-110501。其中，KZ-110501批次鱼腥草注射液EC₅₀是K-101101批次鱼腥草注射液EC₅₀的2.5倍，说明前者的毒性显著低于后者的毒性。

3.2厂家乙10批鱼腥草注射液综合毒性测试

表9厂家乙10批鱼腥草注射液成品样品抑制率（%）

表10厂家乙10批鱼腥草注射液成品样品EC₅₀值（%）

根据表9、表10中厂家乙10批次鱼腥草注射液成品的EC₅₀（发光强度抑制率为50%时的稀释度），可以看出，厂家乙10批次鱼腥草注射液成品的综合毒性大小为：100501≈090924>201008403≈201008405≈201008402>090920>201008404≈201008406>100502=201008401。其中，201008401批次鱼腥草注射液EC₅₀是100501批次鱼腥草注射液EC₅₀的5.6倍，说明前者的毒性非常显著地低于后者的毒性。

实验说明，对于用传统方法检测质量均合格的鱼腥草注射液，本发明方可以测出其毒性有大有小，并且，毒性差别大，能够较好地解释现有鱼腥草注射液不良反应不一致的现象。

综上，本发明毒性检测方法的检测速度快，操作简单，反应灵敏，准确度高，可以检测鱼腥草注射液的毒性，为鱼腥草注射液的质量控制提供依据，应用前景良好。

Claims

1.一种快速检测鱼腥草注射液综合毒性的生物测试方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)制备测试用菌液：取型号为CS234的费氏弧菌冻干粉1支，加入0.2-1.0ml的氯离子浓度为0.51mol/L的溶液，即得测试用菌液；

(2)检测：取待检样品，用测试用菌液检测，确定稀释度-效应动力曲线以及发光强度抑制率为50％的稀释度；

步骤(2)所述检测的方法如下：

a、预测试：取待检样品，用水稀释成5个梯度的待检液，体积百分比分别是：100％、25％、6.25％、1.5625％、0.39％，以氯离子浓度为0.51mol/L的溶液为标准液，在所述待检液和标准液中加入测试用菌液，菌液加入量为待检液或标准液体积的1/20，放置15min，检测发光强度，计算5个稀释度的发光度抑制率；

c、测试：在步骤b确定的稀释度上限和下限之间增配6～9个均匀稀释梯度的待检液，以氯离子浓度为0.51mol/L的溶液为标准液，在所述待检液和标准液中加入测试用菌液，菌液加入量为待检液或标准液体积的1/20，放置15min，检测发光强度，制作稀释度-效应动力曲线，计算抑制率为50％的稀释度；

步骤a和步骤c中，所述待检液中加有氯化钠溶液，使待检液中氯离子的浓度为0.51mol/L。

2.根据权利要求1所述的测试方法，其特征在于：步骤(1)中，所述氯离子浓度为0.51mol/L的溶液的pH为5～9。

3.根据权利要求1所述的测试方法，其特征在于：步骤a和步骤c中，所述待检液和氯离子浓度为0.51mol/L的溶液的pH为5～9。