CN105973875B - 一种药物微毒测试体系的质量控制方法 - Google Patents

一种药物微毒测试体系的质量控制方法 Download PDF

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Abstract

本发明一种药物微毒测试体系(Microtox assay)的质控方法，包括如下步骤：(1)参照品溶液的制备：取ZnSO4·7H2O，溶解，制备浓度分别为5.0mg·L‑1、20.0mg·L‑1、40.0mg·L‑1、80.0mg·L‑1及100.0mg·L‑1等的ZnSO4·7H2O溶液，再分别与20％氯化钠溶液以17:3的体积比混合，得系列溶液，作为标准曲线各点测定溶液；(2)测试用菌液的制备：取费氏弧菌，复苏，得测试用菌液，测定发光强度；(3)检测：取步骤(1)的参照品溶液，加入测试用菌液中，分别测定发光强度，绘制标准曲线，并在检测过程中随行质控样品溶液，即可。本发明方法建立的药物微毒测试体系的质控方法的灵敏度高、精密度及准确度高、稳定性好，可以用于药物毒性的检测，应用前景良好。

Description

一种药物微毒测试体系的质量控制方法
技术领域
本发明涉及一种药物微毒测试体系的质量控制方法。
背景技术
药物的毒性是影响药物安全性最主要的因素，因此，检测药物的毒性非常重要。
发光细菌药物微毒急性毒性测试体系具有反应快、检测灵敏、操作简便、成本较低等优点,已经被应用于药物，尤其是中药注射剂毒性的快速测试。但是，由于没有质量控制参照体系，其检测准确度不高。
目前，有文献报道采用氯化汞、硫酸锌作为毒性参照品进行检测的，但是未建立一套完整的体系，导致检测的准确性还是难以保证。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种药物微毒测试体系的质量控制方法。
本发明药物微毒测试体系的质控方法的建立方法，包括如下步骤：
(1)参照品溶液的制备：取ZnSO4·7H2O，溶解，制备浓度分别为5.0 mg·L-1、20.0mg·L-1、40.0mg·L-1、80.0mg·L-1及100.0mg·L-1等的ZnSO4·7H2O 溶液，再分别与20％氯化钠溶以17:3的体积比混合，得系列溶液，作为标准曲线各点测定溶液；
(2)测试用菌液的制备：取费氏弧菌，复苏，得测试用菌液，测定发光强度；
(3)检测：取步骤(1)的参照品溶液，加入测试用菌液中，分别测定发光强度，绘制标准曲线，即可。
优选地，步骤(1)中，另制备浓度分别为15.0mg·L-1、50.0mg·L-1及 90.0mg·L-1的ZnSO4·7H2O溶液，再分别与20％氯化钠溶液以17:3的体积比混合，得系列溶液，作为质控样品溶液；步骤(3)中，随行质控样品溶液。
随行质控样品溶液：是指样品检测同时的质控样品溶液。
步骤(2)中，所述复苏的方法是：取费氏弧菌冻干粉，加入浓度为3％氯化钠溶液，混匀，即可。
优选地，复苏的方法是：取费氏弧菌冻干粉，在15℃放置15min，加入氯化钠溶液后，混匀10min。
进一步优选地，每1支CS234的费氏弧菌冻干粉，加入1.0ml的氯离子浓度为3％的溶液，即得测试用菌液。
步骤(3)中，100μl测试用菌液中加入1ml参照品溶液。
步骤(3)中，在菌液中加入参照品溶液后，混匀，放置10min后测定发光强度。
本发明还提供了一种检测药物毒性的检测方法，步骤如下：
a、按照前述的方法制备测试用菌液、制作标准曲线及质控样品；
b、在测试用菌液中加入待检药物前测试菌液的初始发光强度，在测试用菌液中加入待检药物后10min测定反应后发光强度，根据初始发光强度、反应后发光强度和标准曲线确定待检药物的毒性即可。
步骤b中，随行参照品的质控样品。
本发明方法建立的药物微毒测试的质控体系的灵敏度高、精密度及准确度高、稳定性好，可以用于药物毒性的检测，应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1ZnSO4·7H2O标准毒物标准曲线
具体实施方式
实验材料：
1、菌种 费氏弧菌(Vibrio fischeri，V.f.)CS234冻干粉，编号D15G046、D15G037、D15G038、D15G039、D15G056、D15G033，北京滨松光子技术股份有限公司，-20℃避光冻存。
2、试剂 复苏稀释液(3％氯化钠溶液)，批号20150717，北京滨松光子技术股份有限公司。渗透压调节液(20％氯化钠溶液)，批号20150717，北京滨松光子技术股份有限公司。七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)，AR，批号 2015030101，成都市科龙化工试剂厂。
3、仪器 LUMIStox 300型生物毒性测试仪、LUMIS-therm型预温槽和测试管(Dr.Bruno Lange GmbH公司)；ME203/02型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；KCL-2000型恒温恒湿箱(东京理化器械株式会社)；Z-2000型原子吸收分光光度计(日立公司)；锌空心阴极灯(北京有色金属研究院)；Integral 5型纯水仪(法国Milli-Q公司)。
实施例1 本发明药物微毒测试的质控方法的建立
1、质控体系建立方法
精密称取ZnSO4·7H2O 50.0mg置于500ml容量瓶中，超纯水充分溶解、定容，即得100.0mg·L-1储备液。取储备液用超纯水稀释，得浓度分别为5.0 mg·L-1、20.0mg·L-1、40.0mg·L-1及80.0mg·L-1系列溶液，再将各浓度标准毒物与渗透压调节液以17:3混合，作为参照品溶液，用于绘制标准曲线；
另外，可以制备浓度分别为15.0mg·L-1、50.0mg·L-1及90.0mg·L-1的 ZnSO4·7H2O溶液，再分别与20％氯化钠溶液以17:3的体积比混合，得系列溶液，作为质控样品溶液；
费氏弧菌CS234冻干粉于恒温箱15℃中平衡15min，加入复苏液1ml 后混匀10min，取100μl菌液测试初始发光强度后立即加入1ml参照品溶液，反应10min后再次测试对照管及样品管发光强度，根据发光强度绘制标准曲线。
在前述质控体系建立的基础上，可以进行药物毒性检测，具体是在测试用菌液中加入待检药物，测定发光强度，根据发光强度和标准曲线确定待检药物的毒性，可随行参照品的质控样品。
实施例2 本发明药物微毒测试的质控方法的筛选
1、实验方法
用Plackett-Burman法将反应条件中的6个因子进行全面考察。选择11 因子2水平的实验设计，共进行12次实验，以B、D、F、H、K为空项估计试验误差，A、C、E、G、J、L分别代表平衡时间、复苏液体积、复苏时间、菌液体积、样品体积和反应时间，每个因素取高低两水平，以各测试组方差P值及发光系数的均值偏差D值为判断标准选择最佳组合。使用到发光菌的所有操作均在15℃±1℃条件下完成。
表1 Plackett-Burman实验设计因子与水平
Figure BDA0000976281630000041
ISO 11348-3:2007的标准选择D＜3％者为合格组合。
2、实验结果
结果如下表2所示：
表2 Plackett-Burman实验设计及结果(n＝2)
Figure BDA0000976281630000042
由实验结果可以看出，费氏弧菌CS234冻干粉于恒温箱中平衡15min，加入复苏液1ml后混匀10min，取100μl菌液测试初始发光强度后立即加入 1ml复苏液(对照)或待测样品，反应10min后再次测试对照管及样品管发光强度。
以下用实验例的方式来说明本发明的有益效果：
1、实验方法
1.1线性范围、灵敏度、精密度及准确度检测：
精密称取ZnSO4·7H2O 50.0mg置于500ml容量瓶中，超纯水充分溶解、定容，即得100.0mg·L-1储备液。取储备液用超纯水稀释，得浓度分别为5.0 mg·L-1、20.0mg·L-1、40.0mg·L-1及80.0mg·L-1系列溶液，再将各浓度标准毒物与渗透压调节液以17:3混合，作为标准曲线的各点，按照实施例2所优化的条件进行测试，ZnSO4·7H2O标准曲线各点的反应终浓度为3.86mg·L-1、 15.45mg·L-1、30.91mg·L-1、61.82mg·L-1和77.27mg·L-1。以式1-4计算抑制率Ht(％)和均值偏差D，并以抑制率均值Ht(％)-ZnSO4·7H2O(mg·L-1) 作图，拟合得到标准曲线方程及相关系数R2；灵敏度用定量下限即3.86mg·L-1 (终浓度)标准毒物的精密度和准确度表示。另取ZnSO4·7H2O储备液用超纯水配制15.0mg·L-1、50.0mg·L-1及90.0mg·L-1溶液，再将各浓度标准毒物与渗透压调节液以17:3混合，作为质控样品，反应终浓度分别为11.59mg·L-1、 38.64mg·L-1和69.55mg·L-1，用以考察方法学的精密度(批间、批内)和准确度，精密度以相对标准差RSD％表示，准确度以测得值与实际值的百分比表示。
fkt＝Ikt/I0 式(1)
Figure BDA0000976281630000051
Figure BDA0000976281630000052
Ht＝(Ict-It)/Ict×100％ 式(4)
注：式(1)中I0为对照管发光菌初始发光强度，Ikt为对照管发光菌与复苏稀释液接触一定时间后的发光强度，fkt为发
Figure BDA0000976281630000053
系数。式(2)中D为发光系数的均值偏差，fkt为2个平行管fkt的平均值。式(3)中Ict为样品管发光菌初始发光强度的校正值，Ic为样品管发光菌初始发光强度。式(4) 中It为样品管发光菌与样品接触一定时间后的发光强度，Ht为样品对发光强度的抑制率(％)。
1.2稳定性 取ZnSO4·7H2O储备液及15.0mg·L-1、50.0mg·L-1、90.0 mg·L-1质控样品进行Zn2+稳定性考察。由于原子吸收分光光度计测量Zn2+的线性范围在0.2ppm-0.9ppm，故将储备液稀释到0.538ppm(以Zn2+计)后考察0h、2h、4h、6h、8h、24h、48h、72h及120h的稳定性，质控样品分别稀释到0.137ppm、0.457ppm、0.822ppm考察0h、2h、4h、6h及8h的稳定性，并以相应浓度的渗透压调节液作为对照，需过夜样品密封后置在4℃冰箱内保存。
1.3数据分析
Design Expert 8.0.5b软件进行Plackett-Burman实验设计及数据分析。PEMS3.1软件进行标准曲线的拟合及IC50的计算。
2、实验结果
2.1线性范围、灵敏度、精密度及准确度
由表4及图1可见，测试三次，定量下限样品及质控样品精密度均＜10％，准确度在87.81％-101.43％范围内。ZnSO4·7H2O溶液在3.86mg·L-1-77.27 mg·L-1范围内标准曲线方程为y＝21.78Ln(x)-15.14，R2＝0.998，本方法下 ZnSO4·7H2O对费氏弧菌CS234的IC50为19.90mg·L-1。
表4 ZnSO4·7H2O质控样品精密度、准确度及定量下限灵敏度考察结果(n＝2)
Figure BDA0000976281630000061
3.4稳定性
由表5可见，ZnSO4·7H2O储备液及其质控样品分别连续考察120h和8 h，其RSD％均＜2％，提示在室温及4℃保存条件下稳定性良好。
表5 ZnSO4·7H2O储备液及质控样品稳定性考察结果(n＝3)
Figure BDA0000976281630000062
综上，本发明药物微毒测试的质控方法的灵敏度高、精密度及准确度高、稳定性好，可以用于药物毒性的检测，应用前景良好。

Claims (3)

1.一种药物微毒测试体系的质控方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）参照品溶液的制备：取ZnSO4·7H2O，溶解，制备浓度分别为5.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、40.0 mg·L-1、80.0 mg·L-1及100.0 mg·L-1的 ZnSO4·7H2O溶液，再分别与20%氯化钠溶液以17:3的体积比混合，得系列溶液，作为标准曲线各点上的测定溶液；
（2）测试用菌液的制备：取1支CS234的费氏弧菌冻干粉，复苏，得测试用菌液，测定初始发光强度；所述复苏的方法是：费氏弧菌冻干粉在15℃平衡15min，加入1.0ml的氯离子浓度为3%的氯化钠溶液，混匀10min；
（3）检测：取步骤（1）的参照品溶液，加入测试用菌液中，分别测定发光强度，绘制标准曲线即可；步骤（3）中，100 μl测试用菌液测定初始发光强度后立即加入1ml步骤（ 1）所得的参照品溶液，混匀，放置10min后测定发光强度；
步骤（1）中，另制备浓度分别为15.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1及90.0 mg·L-1的 ZnSO4·7H2O溶液，再分别与20%氯化钠溶液以17:3的体积比混合，得系列溶液，作为质控样品溶液；
步骤（3）中，随行质控样品溶液。
2.一种检测药物毒性的检测方法，其特征在于：步骤如下：
a、按照权利要求1所述的方法制备测试用菌液、制作标准曲线；
b、在测试用菌液中加入待检药物前测试菌液的初始发光强度，在测试用菌液中加入待检药物后10min测定反应后发光强度，根据初始发光强度、反应后发光强度和标准曲线确定待检药物的毒性，即可。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤b中，随行参照品的质控样品。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108627503B (zh) * 2017-05-05 2021-03-02 四川省中医药科学院 一种银杏内酯注射液质量检测方法
CN114577785B (zh) * 2022-05-05 2022-09-30 杭州泽天春来科技有限公司 一种水质毒性检测方法及系统

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101514373A (zh) * 2009-03-02 2009-08-26 吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心 实时荧光定量pcr快速检测鸭病毒性肠炎的方法及试剂盒
CN103149199A (zh) * 2012-12-25 2013-06-12 北京城市排水集团有限责任公司 水质急性毒性高通量快速测定试剂盒制作及使用方法
CN103424401A (zh) * 2013-08-22 2013-12-04 四川省中医药科学院 一种快速检测鱼腥草注射液综合毒性的生物测试方法
CN103868916A (zh) * 2013-11-15 2014-06-18 四川省中医药科学院 一种快速检测中药综合毒性的生物测试方法
CN104215479A (zh) * 2013-05-30 2014-12-17 四川省中医药科学院 一种快速检测中药注射剂综合毒性的生物测试方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101514373A (zh) * 2009-03-02 2009-08-26 吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心 实时荧光定量pcr快速检测鸭病毒性肠炎的方法及试剂盒
CN103149199A (zh) * 2012-12-25 2013-06-12 北京城市排水集团有限责任公司 水质急性毒性高通量快速测定试剂盒制作及使用方法
CN104215479A (zh) * 2013-05-30 2014-12-17 四川省中医药科学院 一种快速检测中药注射剂综合毒性的生物测试方法
CN103424401A (zh) * 2013-08-22 2013-12-04 四川省中医药科学院 一种快速检测鱼腥草注射液综合毒性的生物测试方法
CN103868916A (zh) * 2013-11-15 2014-06-18 四川省中医药科学院 一种快速检测中药综合毒性的生物测试方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"发光细菌急性病毒-费氏弧菌冻干法方法建立及质控";孙成华 等;《现代科学仪器》;20141231(第6期);第156-158页 *
发光菌急性毒性测试的质量控制研究;叶文波 等;《中国卫生检验杂志》;20110930;第21卷(第9期);第2217-2218页 *

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