CN103149200A - 一种基于发光细菌法的大气颗粒物综合毒性检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及构建一种利用发光细菌对大气颗粒物进行综合毒性检测的方法，具体包括：利用大气颗粒物采样器进行大气颗粒物样品的采集，将载有大气颗粒物样品的滤膜破碎成细小碎片，转移到具塞PC管底部，加入盐酸浸提液进行恒温振荡浸提，充分浸提后离心，取上清液调节pH值后再次离心，测定上清液对发光细菌的发光抑制率，来表征大气颗粒物的综合毒性水平。本发明通过盐酸浸提大气颗粒物样品中的毒性物质，用毒性检测仪直接检测样品浸提液的综合毒性，构建了一种大气颗粒物综合毒性检测的便捷方法，规避了传统方法的不足。本发明费时较少、操作简便、结果准确，具有广阔的应用前景。

Description

一种基于发光细菌法的大气颗粒物综合毒性检测方法
技术领域
本发明涉及一种利用发光细菌对大气颗粒物进行综合毒性检测的快速检测方法，属于分析检测技术的范畴，具体涉及发光细菌的综合毒性检测方法领域。
背景技术
大气颗粒物是指分布在空气中的固态或液态颗粒状物质，根据其空气动力学，其直径大小一般分为：直径小于或等于100μm的总悬浮颗粒物(TSP)、直径小于或等于10μm的可吸入颗粒物(PM10)以及直径小于或等于2.5μm的可入肺颗粒物(PM2.5)等。由于大气颗粒物粒径小、比表面积大，因而其吸附性极强，很容易成为空气中其它物质的载体，形成吸附有多种污染物的大气固体颗粒，漂浮在空气中，极易形成雾霾等天气现象。大气颗粒物中含有多种有毒有害物质，包括：重金属、硫化物、多环芳烃类、多环苯类、微量元素以及病原微生物等。这些悬浮颗粒物不仅会对能见度、降水、空气质量、生态环境等造成不良影响，同时粒径较小的细颗粒物很容易通过呼吸系统进入生物体内，由于颗粒物上吸附有多种有毒有害物质，能够引发肺炎、气喘等呼吸道疾病，威胁人体健康，常常会给人类健康安全带来严重危害。因此，开展大气颗粒物的综合毒性检测工作刻不容缓。
常规的大气颗粒物采样后，通过滤膜称重法能够准确确定空气中不同粒径的大气颗粒物的质量，但是由于大气颗粒物特殊的小颗粒形态，留在滤膜上的样品采样总质量较少，而常规的毒理学检测(以水蚤、藻类、鱼类、大型哺乳动物等作为受试生物)需要采集足够多的样品量才能开展，因此很难利用常规的毒理学检测方法开展大气颗粒物的毒理学指标的检测。目前，我国尚未建立大气颗粒物样品综合毒性检测的规范方法，因此，构建一种能够对较少采样量的大气颗粒物样品进行综合毒性检测的方法，对大气颗粒物污染进行及时、快速、准确、定量的综合毒性检测的工作已刻不容缓。
目前，发光细菌法检测综合毒性作为一种新兴技术已经广泛应用于水环境污染的综合毒性检测领域。发光细菌是一类在正常的生理条件下能够产生可见荧光的细菌，当毒性物质与发光细菌接触时，毒性物质会对细菌的正常新陈代谢活动产生影响，在一定的浓度范围内，细菌的发光强度与毒性物质浓度之间存在理论上的负相关关系，毒性越强，对发光细菌的代谢活动抑制作用越强，发光细菌的发光强度越弱。目前常用于毒性检测的发光细菌主要有以下几种：费氏弧菌、明亮发光杆菌和青海弧菌等。发光细菌法检测有毒物质综合毒性的检测方法是：在15℃的温度条件下，以蒸馏水作为对照，将环境样品溶液与水合后的发光细菌悬液混合，充分混合15分钟后，测定样品对发光细菌的发光抑制率来表征，或以EC50值(造成50％发光抑制效应时样品的浓度)、TU值(毒性单位，达到50％发光抑制率时样品的稀释倍数)等指标来表达样品的综合毒性水平。也可以参考我国国家标准方法GB/T 15441-1995中环境样品的毒性水平表达方法：以标准毒性物质氯化汞的当量浓度来表示，或者采用美国EPA推荐的标准毒性物质氯化锌的当量浓度表示。与传统的毒理学检测技术相比，发光细菌法是建立在细菌发光生物传感技术基础上的毒性检测技术，具有检测快速、灵敏度高、适应性强、重复性好等优点。能够适应样品量小的物质的综合毒性检测。
因此，本发明是构建一种利用发光细菌对毒性物质的敏感性和较低的检测限来检测大气颗粒物综合毒性的检测方法。
发明内容
本发明针对目前大气颗粒物尚未建立综合毒性检测方法，通过连续酸浸提方法对大气颗粒物样品中的水溶性有毒物质进行浸提，利用发光细菌法-费氏弧菌对有毒有害物质的灵敏性和较低的检测限，建立一种简便的大气颗粒物综合毒性检测方法，降低了对采样量的要求，从而能够开展大气颗粒物样品进行综合毒性的快速检测，测定大气颗粒物的综合毒性水平。
本发明是建立一种基于发光细菌法的大气颗粒物综合毒性检测方法，所述方法包括以下步骤：
步骤(1)样品的采集与保存：利用大气颗粒物采样器采集大气颗粒物样品，采样结束后，用铝箔纸包裹好样品滤膜，密闭低温保存，防止样品中毒性物质的损失；
步骤(2)样品的破碎：将载有大气颗粒物样品的滤膜剪成细小碎片，将全部碎片转移到100mL的具塞PC管底部；
步骤(3)样品的浸提：往有样品滤膜碎片的PC管中加入浸提液，置于恒温水浴振荡器上，进行振荡浸提，浸提出大气颗粒物样品中的毒性物质；
步骤(4)样品浸提液的离心分离：样品充分浸提后，取出PC管，将含有破碎样品和浸提液转移到离心管中，置于低温离心机上离心分离；
步骤(5)调节样品浸提液的pH值：离心后，取出离心管，取上清浸提液用氢氧化钠溶液调节pH至6～8之间；
步骤(6)二次离心：用离心机对已调节好pH的样品液再次离心；
步骤(7)样品的毒性检测：取二次离心后的浸提液上清液，利用SDI MicrotoxModel 500温控毒性仪，测定其对发光细菌的15分钟发光抑制率，来表征大气颗粒物样品的毒性水平，每个样品平行测定3次，相对偏差不超过10％，结果取3次测定的平均值，其中，以空白滤膜按照大气颗粒物滤膜相同的处理方法得到的浸提液作为空白对照；
步骤(8)样品毒性的表达：采用发光抑制率、氯化汞/氯化锌当量浓度、EC50/TU来表示浸提液的综合毒性水平。
优选的，本方法不仅适用于SDI Microtox Model 500温控毒性仪标配的费氏弧菌，还适用于明亮发光杆菌等海洋发光细菌。
优选的，将载有大气颗粒物样品的滤膜剪成细小的碎片进行破碎，样品膜的破碎规格为0.1～0.5cm2。
优选的，对利用浸提液提取样品滤膜上样品中的毒性物质，选择的浸提液为0.1mol/L的盐酸溶液，浸提液的加入量为40mL。
优选的，样品的连续浸提是在恒温水浴振荡器上进行的，振荡速度为200转/分钟，振荡时间为16小时，水浴温度为15～25℃。
优选的，调节样品液的pH时用10mol/L的氢氧化钠溶液调节样品液pH值至6～8之间，样品液的体积增加量仅为1％左右；同时，调节pH产生的NaCl浓度低于费氏弧菌的最适反应盐度，不影响测定的结果。
优选的，调节pH值前后进行了两次离心，离心条件均为：转速3000转/分钟，时间10分钟。
优选的，用SDI Microtox Model 500温控毒性仪检测浸提样品液对发光细菌-费氏弧菌15分钟的发光抑制率，用来表征大气颗粒物样品的综合毒性水平；或者通过发光抑制率与稀释度的关系计算EC50值和TU值，或同氯化汞/氯化锌进行综合毒性的当量浓度比对，来表征大气颗粒物的综合毒性水平。
本发明建立了一种大气颗粒物综合毒性检测的快速检测方法，选择0.1mol/L的盐酸溶液作为浸提液对样品中的毒性物质进行浸提，比传统的水提法具有更好的浸提效果；通过利用高浓度的氢氧化钠溶液调节样品浸提液的pH，不但保证了样品液体积的增加量较小，产生的NaCl浓度低于费氏弧菌的最适盐度浓度，可以通过调节NaCl浓度达到最适盐度，不会影响检测结果的准确性；通过二次离心的方法，去除了pH调节过程中样品浸提液中的不溶性物质，提高了检测结果准确度；本方法利用发光细菌法进行检测，样品与发光细菌的反应时间仅为15分钟，能够迅速获得检测结果，适应大批量样品的快速检测，大大缩短了综合毒性的检测时间，提高了检测效率。
附图说明
图1.大气颗粒物综合毒性检测方法技术路线图。
图2.样品滤膜破碎程度对浸提效果的影响。
图3.选择纯水和不同浓度的盐酸作为浸提液的浸提效果比对。
图4.不同的水浴浸提温度温度对浸提效果的影响。
图5.不同的振荡浸提时间对浸提效果的影响。
图6.为根据本发明实施例的大气颗粒物样品综合毒性检测结果。
图7.为氯化汞-发光抑制率标准曲线。
图8.为根据本发明实施例的大气颗粒物样品的EC50测定。
具体实施方式
下面参照附图对本发明进行更全面的描述，其中说明本发明的示例性实例。
大气颗粒物样品综合毒性检测的技术路线图如图1所示，具体操作分为以下8个步骤：
(1)大气颗粒物样品的采集与保存：严格按照环境空气质量监测规范等相关规范流程，利用大气颗粒物采样器采集大气颗粒物样品，本实例中利用大气颗粒物采样器采集大气颗粒物PM2.512小时，采样结束后，取下滤膜，用铝箔纸包裹好后置于聚乙烯自封袋中，排尽空气，密闭保存于-20℃的冰箱中，以防止样品中毒性物质的损失。
(2)样品的破碎：将载有大气颗粒物样品的滤膜剪成0.1～0.5cm2的碎片，转移到100mL的具塞PC管底部。
滤膜样品的破碎规格不同，与样品浸提液的接触程度不同，样品中有毒物质的浸提效果存在差异。按照不同的碎片面积分别将样品滤膜进行破碎，规格分别为0.1～1.2cm2不等，见图2。将不同破碎面积规格的滤膜样品碎片全部转移到不同的100mL的具塞PC管底部。按照后续步骤进行综合毒性检测确定浸提效果，研究发现，破碎面积大于0.5cm2，浸提效果明显下降，破碎面积0.1～0.5cm2时，具有较好的浸提效果。
(3)样品的浸提：浸提液选择0.1mol/L盐酸溶液，将40mL的浸提液加入含有已破碎样品滤膜的100mL具塞PC管中，置于200转/分钟的恒温水浴振荡器上振荡16小时，控制温度为15～25℃，对大气颗粒物样品中的有毒物质进行浸提。
浸提液的pH会影响样品中有毒物质的浸提效果，考虑到碱性环境大部分重金属离子的溶解度较小，因此选择中性和酸性环境对样品中的有毒物质进行浸提。同时考虑到浸提液还需要调节pH至发光细菌的检测范围：pH6～8，结合发光细菌-费氏弧菌的最适盐度环境2％-3％，因此浸提液选择不同浓度梯度的盐酸溶液。图3为不同浓度的盐酸的浸提效果比对研究结果，研究发现，浓度大于0.1mol/L盐酸溶液具有较好的浸提效果。但浸提液的盐酸浓度又不宜过高，这是因为如果浸提液盐酸浓度过高，在pH的调节时需要加入大量的高浓度NaOH溶液，而且会生成NaCl，不但会导致样品体积的增大，而且会导致盐度的增高，影响检测结果，因此选择0.1mol/L的盐酸作为浸提液，在进行pH调节后生成的NaCl低于最适盐度，可以继续调解反应体系的盐度，不妨碍发光细菌的发光。
图4是浸提时水浴浸提温度对浸提效果的影响，结果显示温度在15～25℃之间时，浸提效果最好。
图5是浸提时间均会对样品浸提效果的影响，结果显示，浸提16小时后，浸提效果最好。
(4)样品浸提液的离心分离：充分振荡浸提后，将含有破碎样品和浸提液转移到离心管中，置于低温离心机上，转速3000转/分钟的条件下离心10分钟，将上清液倒入新的PC管中.
(5)浸提液pH值调节：根据浸提液盐酸浓度和最终浸提液体积计算样品浸提液中H+的量，用10mol/L的氢氧化钠溶液调节样品液pH值至6～8之间.
(6)二次离心分离：为了减少pH变化对浸提液澄清度的影响，对已调节好pH值的浸提液进行二次离心，转速为3000转/分钟，离心时间为10分钟，取上清液备用待测综合毒性.
(7)样品的综合毒性检测：取二次离心后的浸提液，利用SDI MicrotoxModel 500温控毒性仪，测定其对发光细菌-费氏弧菌15分钟的发光抑制率，来表征大气颗粒物样品的毒性水平，每个样品平行测定3次，相对偏差不超过10％，以3次测定平均值作为最终的检测结果。其中以空白滤膜按照大气颗粒物滤膜相同的处理方法得到的溶液作为空白对照。
(8)样品毒性的表达：大气颗粒物样品的综合毒性以发光抑制率表示：直接采用发光抑制率来表达浸提液的毒性大小。发光抑制率越大，样品浸提液的毒性越大，发光抑制率越小，样品浸提液的毒性越小。样品的发光抑制率与毒性级别关系如下：
Figure BSA00000860958900081
本实例中，图6为大气颗粒物样品的发光抑制率三次测定结果分别为84.2％、83.7％和85.2％，其最终的发光抑制率测定结果为84.4％，毒性等级为IV级，毒性级别为剧毒。
此外，样品综合毒性还可用氯化汞/氯化锌当量浓度表达，当样品的发光抑制率大于50％时，也可用EC50/TU表达。
氯化汞/氯化锌当量浓度：建立氯化汞/氯化锌浓度与费氏弧菌发光抑制率的相关关系曲线并进行拟合，获得氯化汞/氯化锌浓度-发光抑制率标准曲线，以样品的发光抑制率在氯化汞/氯化锌-发光抑制率标准曲线上查询相当于氯化汞/氯化锌的当量浓度来表示浸提样品的综合毒性大小。本实例中以氯化汞为例，建立氯化汞-发光抑制率标准曲线，见图7，将本大气颗粒物样品的发光抑制率与氯化汞标准曲线进行比对，得到样品综合毒性相当于0.124mg/L的氯化汞。
EC50/TU：当发光抑制率超过50％时，可测定其EC50值和毒性单位TU值。需要将浸提液样品进行稀释，测定其稀释度与发光抑制率的相关关系并进行拟合，在相关关系拟合曲线上确定发光抑制率为50％时的样品的稀释百分比来表示样品浸提液的的EC50。以达到50％发光抑制率时浸提样品的稀释倍数作为样品的TU毒性单位值。本大气颗粒物样品浸提液的EC50为62.13％，见图8，表示样品浸提液稀释到原来的62.13％时，发光抑制率为50％；TU为1.61，表示本样品浸提液稀释1.61倍后的发光抑制率为50％。
以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (8)

1.一种基于发光细菌法的大气颗粒物综合毒性检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤(1)样品的采集与保存：利用大气颗粒物采样器采集大气颗粒物样品，采样结束后，用铝箔纸包裹好样品滤膜，密闭低温保存，防止样品中毒性物质的损失；
步骤(2)样品的破碎：将载有大气颗粒物样品的滤膜剪成细小碎片，将全部碎片转移到100mL的具塞PC管底部；
步骤(3)样品的浸提：往有样品滤膜碎片的PC管中加入浸提液，置于恒温水浴振荡器上，进行振荡浸提，浸提出大气颗粒物样品中的毒性物质；
步骤(4)离心：充分浸提一段时间后，将上清液转移到离心管中，置于离心机上离心；
步骤(5)调节样品浸提液的pH值：离心后，取出离心管，取上清浸提液用氢氧化钠溶液调节pH至6～8之间；
步骤(6)二次离心：用离心机对已调节好pH的样品液再次离心；
步骤(7)样品的毒性检测：取二次离心后的浸提液上清液，利用SDIMicrotox Model 500温控毒性仪，测定其对发光细菌的15分钟发光抑制率，来表征大气颗粒物样品的毒性水平，每个样品平行测定3次，相对偏差不超过10％，结果取3次测定的平均值，其中，以空白滤膜按照大气颗粒物滤膜相同的处理方法得到的浸提液作为空白对照；
步骤(8)样品毒性的表达：采用发光抑制率、EC50/TU、氯化汞当量浓度或氯化锌当量浓度来表示浸提液的综合毒性水平。
2.根据权利要求1所述的基于发光细菌法的大气颗粒物综合毒性检测方法，其特征在于，本方法不仅适用于SDI Microtox Model 500温控毒性仪标配的费氏弧菌，还适用于明亮发光杆菌等海洋发光细菌。
3.根据权利要求1所述的基于发光细菌法的大气颗粒物综合毒性检测方法，其特征在于，将载有大气颗粒物样品的滤膜剪成细小的碎片，以保证样品滤膜在浸提过程中能与浸提液充分接触，使浸提更加充分，测定结果更能准确反映样品真实的综合毒性水平，所述样品膜的破碎规格为0.1～0.5cm2。
4.根据权利要求1所述的基于发光细菌法的大气颗粒物综合毒性检测方法，其特征在于，对样品膜进行浸提以提取其中的毒性物质，选择的浸提液为0.1mol/L的盐酸溶液，浸提液的加入量为40mL。
5.根据权利要求1所述的基于发光细菌法的大气颗粒物综合毒性检测方法，其特征在于：样品的连续浸提是在恒温水浴振荡器上进行的，振荡速度为200转/分钟，振荡时间为16小时，水浴温度为15～25℃。
6.根据权利要求1所述的基于发光细菌法的大气颗粒物综合毒性检测方法，其特征在于，调节样品液的pH时，计算样品液的体积，确定样品液中H+的量，用10mol/L的氢氧化钠溶液调节样品液pH值至6～8之间，样品液的体积增加量仅为1％左右；同时，调节pH产生的NaCl浓度低于费氏弧菌的最适反应盐度，不影响测定的结果。
7.根据权利要求1所述的基于发光细菌法的大气颗粒物综合毒性检测方法，其特征在于，调节pH值前后进行了两次离心，步骤(4)和(6)的离心条件均为：转速3000转/分钟，时间10分钟。
8.根据权利要求1所述的基于发光细菌法的大气颗粒物综合毒性检测方法，其特征在于，用SDI Microtox Model 500温控毒性仪检测浸提样品液对发光细菌-费氏弧菌15分钟的发光抑制率，用来表征大气颗粒物样品的综合毒性水平；或同氯化汞/氯化锌进行综合毒性的当量浓度比对，或者通过发光抑制率与稀释度的关系计算EC50值和TU值，来表征大气颗粒物的综合毒性水平。
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