CN106290272A - 一种实时检测大气颗粒物生物毒性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公布了一种实时检测大气颗粒物生物毒性的方法。本发明筛选出酵母菌对氧化应激有特异性灵敏响应的两种蛋白：SSA1和HSP60，利用基因荧光探针标记控制活体酵母菌该特异性蛋白的基因，使活体酵母菌作为大气颗粒物毒性的指示微生物，通过实时检测特定波长不同荧光蛋白表达浓度反演大气颗粒物的生物毒性。本发明在单个活体酵母菌水平上检测大气颗粒物的毒性，具有高灵敏度、低检测限等特点，可应用于大气颗粒物及生物成分对人体造成的健康效应的评估，衡量和实时监测空气质量。

Description

一种实时检测大气颗粒物生物毒性的方法
技术领域
本发明涉及一种实时检测大气颗粒物生物毒性的分析技术，具体是利用基因荧光探针标记控制活体酵母菌氧化应激相关特异性蛋白的基因，使活体酵母菌作为大气颗粒物毒性的指示微生物，通过实时检测特定波长不同荧光蛋白表达浓度反演大气颗粒物的生物毒性，可应用于大气颗粒物及生物成分对人体造成的健康效应的评估方法。
背景技术
近年来，中国多地频发重度雾霾，许多工作致力于研究其成霾的机理，其中燃煤、车尾气等列为重要的贡献源。大气颗粒物吸入后对于人体健康会造成一定的损害，包括引起呼吸道感染、过敏反应、癌症和婴儿的出生缺陷等等。最近几年越来越多的研究表明大气颗粒物的生物组分对其生物毒性具有非常重要的影响,包括血压增加等心血管疾病等。生物气溶胶颗粒作为一种特殊的颗粒物，具有独特的健康效应，主要表现在它能造成呼吸系统感染、导致过敏和毒性反应等三个方面。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的重要组成部分，其存在于大气的颗粒物中。每毫克PM中平均含有30EU的内毒素。人体吸入内毒素后能够引起一系列的炎症、过敏以及免疫反应，对人体健康会造成一定的影响。有报道显示0.1μg的内毒素就会引起人类的免疫反应。大量研究成果表明，大气颗粒物中含有的内毒素会在一定程度上增加颗粒物的生物毒性。
大气颗粒物的毒性是生物与化学成分共同作用的结果，忽略其中任何一部分成分的研究结果都会具有局限性。利用小鼠或呼吸系统上皮细胞的模型，通过暴露高浓度的大气颗粒物来观测其生物毒性与健康效应。但是，所用的小鼠或呼吸系统上皮细胞模型的灵敏度差，常常需要较高浓度的颗粒物才能观测到其生物效应，这与实际大气环境浓度有一定的差距，不能够很好地反推真实大气颗粒物毒性水平。大气颗粒物的毒性的监测需要全组分的高灵敏度的监测体系。国内外目前尚还没有发展出这种技术。
近年来，活体酵母菌作为一种活体传感器越来越受到关注，其中有关酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的研究最多。酵母菌通过表达特定蛋白来完成对外界环境刺激的响应。例如，酵母菌对外界活性氧(ROS)的特异性蛋白在外界活性氧的刺激下会显著增多，同时酵母菌对外界金属离子的刺激也会有特定的蛋白表达。研究表明颗粒物的氧化应激损伤是颗粒物健康效应的重要方式。此外，多项研究报道，酵母菌作为最简单的真核生物，其多种致病基因与人类的致病基因极其相似，所以利用酵母菌作为活体检测生物能够很好的推广到大气颗粒物对于人体健康效应的评估中去。
发明内容
为实现大气颗粒物对于人体的健康效应的生物毒性评估，本发明提供了一种利用基因荧光探针标记控制特异性蛋白表达的基因的活体酵母作为毒性指示微生物，结合酶标仪检测其荧光值的变化，从而分析大气颗粒物的毒性。本发明筛选出的酵母菌对氧化应激有特异性灵敏响应的蛋白为SSA1和HSP60两种。
本发明的技术方案如下：
一种实时检测大气颗粒物生物毒性的方法，是利用荧光蛋白标记的活体酵母菌作为指示微生物，分析大气颗粒物毒性的方法，包括如下步骤：
1)采集大气颗粒物(主要是PM2.5颗粒)，溶于水中制成一定浓度的大气颗粒物溶液；
2)培养SSA1和/或HSP60蛋白基因被荧光探针标记的酵母菌，制成一定浓度的酵母指示菌液；
3)将一定量的步骤1)中获得的大气颗粒物溶液与步骤2)中制备的酵母指示菌液混合，利用光学方法获取其特定波长荧光值，分析大气颗粒物的毒性。
上述步骤1)可利用TEFLON采样膜以及四通道大气颗粒物采样器采集大气中PM2.5的样品，采样时间为24h，采样流量为100L/min；然后称量采集到的样品，将其溶解在水中，优选制成浓度≥0.02mg/mL的大气颗粒物溶液，更优选为0.04mg/mL的大气颗粒物溶液。
上述步骤2)中，酵母蛋白HSP60和SSA1对氧化应激有灵敏响应，是发明人通过实验筛选出来的对大气颗粒物有响应的蛋白。优先选择绿色荧光蛋白(GFP)作为基因荧光探针标记控制这两种蛋白表达基因的酵母菌。特异性表达GFP标记的功能蛋白酵母菌菌株可以通过商业途径购得，也可以通过基因工程技术构建GFP和功能蛋白的融合基因，并获得转化的酵母菌菌株。GFP和功能蛋白的融合基因在酵母菌受到特异性外界刺激时进行表达，发出特异性的绿色荧光。
步骤2)可以将所述酵母菌在25℃的摇床中培养48小时，可制成浓度≥104个/mL(例如108个/mL)的酵母指示菌液备用。
上述步骤3)可以将样品加入到96孔板中，利用光学仪器如酶标仪读取96孔板的荧光值。设置动态连续读取荧光值，每隔一定时间(例如1分钟)读取一次荧光值，读取多次，读取时长优选为2小时。对于GFP标记的功能蛋白酵母菌菌株，酶标仪检测的荧光波长范围为480～520nm。
本发明通过荧光标记的特异性活体酵母菌作为指示微生物，利用酶标仪系统，检测大气颗粒物的生物毒性。本发明为大气颗粒物生物毒性的研究提供新的方法。本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明提出和创建了利用活体酵母菌作为指示微生物检测大气颗粒物的检测体系。
(2)本发明筛选出了两种酵母菌在大气颗粒物刺激下能够灵敏响应，特异性表达的蛋白。
(3)本发明的系统对大气颗粒物中的成分响应有选择性，可以监测特定成分毒性水平，如重金属铁、铜等；
(4)不同于现有的大气颗粒物毒性实验，本发明提出在单个活体酵母菌水平上检测大气颗粒物的毒性，具有高灵敏度、低检测限等特点；
(5)不同于现有的主要以颗粒物质量浓度为单位来衡量空气质量的大气颗粒监测手段，该系统能够实时在线监测特定大气条件下空气的生物毒性。
附图说明
图1.实施例1利用SSA1蛋白检测大气颗粒物生物毒性的实验结果。
图2.实施例1利用HSP60蛋白检测大气颗粒物生物毒性的实验结果。
图3.实施例2利用SSA1蛋白检测内毒素生物毒性的实验结果。
图4.实施例2利用HSP60蛋白检测内毒素生物毒性的实验结果。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
下述实施例中所用到的GFP标记功能蛋白为SSA1和HSP60，这两种酵母菌蛋白是氧化应激反应时特异性表达的蛋白，对于大气颗粒物的刺激能够快速、灵敏响应。实施例中所用到的酵母菌来源于从日本酵母基因源中心购买的裂殖酵母(Schizosaccharomyces)探针菌株AY160-14D。本领域技术人员也可以利用基因工程技术自行构建GFP标记特定蛋白的酵母菌，该方法属于公知技术，于此不再赘述。
实施例1.检测大气颗粒物的生物毒性
(1)利用Teflon采样膜和四通道大气颗粒物采样器采集北京大气中的PM2.5颗粒物，采样时间为24小时。称取采样膜上大气颗粒物的质量后将其溶解在超纯水溶液中，制成浓度为0.04mg/mL的颗粒物溶液；
(2)将上述颗粒物溶液溶液加入96孔板中，分别加入利用GFP标记的控制SSA1和HSP60蛋白表达基因片段的酵母菌菌液；
(3)将96孔板放入酶标仪中，利用酶标仪动态监测96孔板中各实验组荧光值的变化，酶标仪每隔1分钟读取一个荧光值，读取时间为2小时，读取波长为480～520nm；
(4)对酶标仪记录的荧光值进行分析，2小时后其荧光值检测结果如图1和图2所示。
实验结果：
1.从图1可以看出，与阴性对照组相比，当加入大气颗粒物后，酵母菌SSA1蛋白的表达量在检测的30min后开始显著上升，这种上升趋势一直维持到检测终点(2h后)；
2.从图2可以看出，HSP60蛋白对于大气颗粒物的反应更为灵敏，在加入大气颗粒物后，酵母菌HSP60的蛋白表达量立刻升高，且这种升高趋势一直维持到检测终点(2h后)。
实验结论：
该实验方法能够有效检测大气颗粒物的生物毒性，该反应体系能够做到灵敏快速反应，并能够观察毒性的实时变化，同时能够对生物毒性进行半定量标定。
实施例2.检测内毒素的生物毒性
(1)将购买的浓度为50ng/mL内毒素样品稀释为0.5ng/mL备用；
(2)将上述内毒素溶液加入96孔板中，分别加入利用GFP标记的控制SSA1和HSP60蛋白表达基因片段的酵母菌菌液；
(3)将96孔板放入酶标仪中，利用酶标仪动态监测96孔板中各实验组荧光值的变化，酶标仪每隔1分钟读取一个荧光值，读取时间为2小时，读取波长为480～520nm；
(4)对酶标仪记录的荧光值进行分析，2小时后其荧光值检测结果如图3和图4所示。
实验结果：
1.从图3可以看出，与阴性对照组相比，当加入内毒素后，酵母菌SSA1蛋白的表达量在检测的30min后开始显著上升，这种上升趋势一直维持到检测终点(2h后)；
2.HSP60蛋白对于内毒素的反应更为灵敏，在加入内毒素后，酵母菌HSP60的蛋白表达量立刻升高，且这种升高趋势一直维持到检测终点(2h后)。
实验结论：
该验方法能够有效检测内毒素的生物毒性，并且检测限较低。该反应体系能够做到灵敏快速反应，并能够观察毒性的实时变化，同时可以对内毒素的生物毒性进行半定量标定。
实施例3.比较不同城市大气颗粒物的生物毒性
1.利用四通道大流量大气颗粒物采样器和TEFLON采样膜采集北京、广州、兰州、海口等不同城市的PM2.5样品。
2.将采集到的样品制成浓度大于0.02mg/mL的颗粒物溶液备用。
3.将上述颗粒物溶液加入96孔板中，分别加入利用GFP标记的控制SSA1和HSP60蛋白表达基因片段的酵母菌菌液。
4.将96孔板放入酶标仪中，利用酶标仪动态监测96孔板中各实验组荧光值的变化，酶标仪每隔1分钟读取一个荧光值，读取时间为2小时，读取波长为480～520nm。
5.对于各城市颗粒物样品的荧光值进行分析，通过荧光值的相对强弱来说明各城市间大气颗粒物生物毒性的相对强弱关系。
本方法将指示酵母菌与酶标仪检测相结合，实现了对于不同种类物质的同一毒性指标进行检测，同时对比分析其毒性的差异。利用酶标仪与指示酵母菌相结合为大气颗粒物生物毒性机理的揭示提供了新的研究手段。
此外该方法如果能够配合微流控实时在线送样系统，就可以实现对于大气颗粒物生物毒性的实时在线检测，并对其生物毒性进行实时在线半定量标定。

Claims (9)

1.一种实时检测大气颗粒物生物毒性的方法，利用荧光蛋白标记的活体酵母菌作为指示微生物分析大气颗粒物的毒性，包括如下步骤：
1)采集大气颗粒物，溶于水中制成一定浓度大气颗粒物溶液；
2)培养SSA1和/或HSP60蛋白基因被荧光探针标记的酵母菌，制成一定浓度的酵母指示菌液；
3)将一定量的步骤1)中获得的大气颗粒物溶液与步骤2)中制备的酵母指示菌液混合，利用光学方法获取其特定波长荧光值，分析大气颗粒物的毒性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述大气颗粒物主要是PM2.5颗粒。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中利用TEFLON采样膜和四通道大气颗粒物采样器采集大气中PM2.5的样品，采样时间为24h，采样流量为100L/min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述大气颗粒物溶液的浓度≥0.02mg/mL。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述荧光探针为绿色荧光蛋白。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)将所述酵母菌在25℃的摇床中培养48小时，制成浓度一定浓度的酵母指示菌液。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)将样品加入到96孔板中，利用酶标仪读取96孔板的荧光值。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤3)利用酶标仪读取荧光值时，设置动态连续读取荧光值，每隔一定时间读取一次荧光值，读取多次，读取时长2小时。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对于绿色荧光蛋白标记功能蛋白的酵母菌，步骤3)酶标仪检测的荧光波长范围为480～520nm。
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