CN110607340B - 一种坯革综合毒性的检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种用发光细菌检测坯革综合毒性的方法，是以浓度低于2.5%wt NaCl溶液作为浸提剂，浸提坯革中弱结合的化学物质，获得坯革浸提液。在浸提液中加入NaCl，使其浓度为2.5%wt，调节pH 7.0；或用2.5%wt NaCl溶液，稀释浸提液为适宜的浓度梯度，并调节pH 7.0；为毒性测定样品。取培养后的发光细菌，加入样品液，混匀后静置，测定发光强度。样品毒性的表达：以2.5%wt NaCl溶液为空白，测量静置后混合液的相对发光强度、半数相对发光强度浓度EC50。本发明以氯化钠溶液为浸提剂，浸提坯革样品中的毒性物质，用毒性检测仪直接检测浸提液的综合毒性，构建了一种坯革综合毒性检测的便捷方法，规避了传统方法的不足。

Description

一种坯革综合毒性的检测方法
技术领域
本发明涉及发光细菌的综合毒性检测方法领域，具体涉及一种基于发光细菌的坯革综合毒性检测方法。
背景技术
生皮经前处理、鞣制、染整和涂饰工段后，制备为成革，而经鞣制尚未涂饰的革称为坯革。坯革中含有多种化学物质，如铬、醛、酚类、表面活性剂、树脂类等物质，这些物质可能在加工、使用过程及废弃后溢出，成为危害健康和环境生态的污染物。这些污染物不仅各有其毒性，而且各种污染物质混合、相互作用也会产生潜在的毒性。文献“Investigationinto the hazards of finished Cr-tanned leather as both product and waste”（Peng LQ ,Li Y, Han WM, Long WJ , Zhang WH,. Shi B. Journal of the Society ofLeather Technologists and Chemists,2019(103):43-48）报道了用去离子水模拟雨水，渗滤铬鞣成革对发光细菌的生态毒性，提出综合毒性是对成革生态性评价必不可少的补充。
现有关于皮革生态性的检测技术，局限于成革中部分有害成分如HCHO、Cr6+的含量测定，针对每一种有害成分，萃取方式各异。例如GB/T19941-2005采用十二烷基磺酸钠溶液，萃取皮革中游离甲醛；GB/T22807-2008采用磷酸氢二钾缓冲溶液，萃取皮革中六价铬。QB/T2721-2005采用蒸馏水萃取皮革2 h，其目的是去除过量吸附的水溶性皮革化学品，未考虑弱结合（如静电、氢键作用）化学品的萃取。实际上，在环境光照及温度、湿度、pH变化下，皮革中弱结合的化学品进一步转化和释放的风险增大，而采用不同类鞣剂鞣制的坯革，表面电荷甚至有电性差异，与复鞣、染色等化学品结合的方式各异。针对坯革有害物质的浸出技术，尚未见报道。
我国是皮革生产的大国，制革过程产生原皮重30%左右的坯革革屑废弃物。但目前世界各国针对废弃物的生态毒性的特性鉴别，尚处于起步阶段，特性鉴别包括浸提和生物测试。生物测试的受试生物包括大鼠、小鼠等哺乳动物，以及鱼、水蚤和藻类，其缺陷是只有专业分析测试机构才具备测试条件，检测样品的周期相对较长，检测过程复杂，检测成本较高，不适合生产过程控制生态性的快速和简便的需要。
我国是皮革生产、消费和出口大国，建立准确可靠、灵敏度高的坯革污染物检测技术，从整体上提高我国制革行业环境中污染物综合毒性检测能力，为我国绿色制革化学品和清洁工艺的研发提供重要的理论依据以及指导意见，保证皮革制品的质量安全和避免国际间的贸易争端，具有非常重要的理论和实践意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的只检测单一污染物、而综合毒性筛查操作复杂、时间长、检测成本较高的缺点，提供一种基于发光细菌的操作易控、经济实用的坯革毒性检测方法。
本发明提供了一种基于发光细菌的坯革综合毒性检测方法之一，包括以下步骤：
（1）预处理：对坯革取样干燥，恒温恒湿后，进行粉碎；
（2）浸提：将预处理后的坯革加入浸提剂，恒温水平震荡一定时间，过滤得浸提液；
（3）毒性检测：向浸提液中加入氯化钠，使氯化钠浓度为2.5% wt，调节pH 7.0±0.2，然后再加入培养的测试用菌密度的新鲜发光细菌液，混匀后静置，测定发光强度；
（4）毒性表达：以2.5% wt NaCl溶液的发光强度为对照，计算静置后浸提液的相对发光强度。
进一步的，所述预处理方法具体为：将坯革按照QB/T 2708-2005或四分法取样，于45 ℃干燥48小时后，置于标准空气中，20±2°C，相对湿度65±5%恒温恒湿48h，然后切碎至4×4 mm的皮粉，恒温恒湿保存备用。
进一步的，所述坯革为经过鞣制、染色和加脂但尚未涂饰的坯革。
进一步的，所述步骤（2）中，浸提剂与坯革的液固比（mL/g）为20：1~40：1，恒温25~30°C，水平60~100 rpm振荡浸提8~24 h，过滤方法为通过0.45 um的滤膜。
进一步的，所述浸提剂为0.1~0.3% wt的NaCl溶液，并用HCl或NaOH调节pH为4.0~9.0。
进一步的，所述发光细菌液中的发光细菌为明亮发光杆菌T3。
进一步的，所述发光细菌液的培养方法为：
（1）制备发光细菌培养基：取胰蛋白胨5.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，Na2HPO4 5.0g/L，K2HPO4 5.0g/L，NaCl 30g/L，甘油3.0 g/L，去离水溶解，调节pH至7.0；
（2）培养过程：取明亮发光杆菌T3接种于装有培养基的锥形瓶中，置于20℃、200rpm振荡的摇床，培养18~20 h后，立即取发光效果最好的菌种二次接种，再置于20℃、200rpm摇床，每2 h测定新鲜菌液发光强度，培养18~20 h达生长对数稳定期，用于测试。
进一步的，所述测试用菌密度的确定方法为：取培养18~20 h的生长达对数稳定期的发光细菌新鲜菌液，以2.5% wt NaCl稀释至不同菌密度，各取50 uL依次加入950 uL0.10 mg/L HgCl2溶液，含2.5% wt NaCl，静置15 min，利用LumiFox6000生物毒性测试仪测定发光强度，平行测定3次，以2.5% wt NaCl溶液为空白，使相对发光强度为50±5％的菌液，为测试用菌密度。
进一步的，所述步骤（4）以2.5 % wt NaCl对照样的发光强度平均值I0，和待检测样品的发光强度平均值I，按R=I/I0 ×100%计算浸提原液的相对发光强度R；相对发光强度R越大，毒性越小。
本发明还提供了一种基于发光细菌的坯革综合毒性检测方法之二，包括以下步骤：
（1）预处理：对坯革取样干燥，恒温恒湿后，进行粉碎；
（2）浸提：将预处理后的坯革加入浸提剂，恒温水平震荡一定时间，过滤得浸提液；
（3）将浸提液采用2.5% wt NaCl稀释，形成浓度梯度，使其相对发光强度范围为0%~100%，并调节pH 7.0±0.2；然后再加入培养的测试用菌密度的新鲜发光细菌液，混匀后静置，测定发光强度；
（4）毒性表达：以2.5% wt NaCl溶液的发光强度为对照，计算静置后浸提液的半数相对发光强度浓度EC50。
进一步的，所述预处理方法具体为：将坯革按照QB/T 2708-2005或四分法取样，于45 ℃干燥48小时后，置于标准空气中，20±2°C，相对湿度65±5%恒温恒湿48h，然后切碎至4×4 mm的皮粉，恒温恒湿保存备用。
进一步的，所述坯革为经过鞣制、染色和加脂但尚未涂饰的坯革。
进一步的，所述步骤（2）中，浸提剂与坯革的液固比（mL/g）为20：1~40：1，恒温25~30°C，水平60~100 rpm振荡浸提8~24 h，过滤方法为通过0.45 um的滤膜。
进一步的，所述浸提剂为0.1~0.3% wt的NaCl溶液，并用HCl或NaOH调节pH为4.0~9.0。
进一步的，所述发光细菌液中的发光细菌为明亮发光杆菌T3。
进一步的，所述发光细菌液的培养方法为：
（1）制备发光细菌培养基：取胰蛋白胨5.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，Na2HPO4 5.0g/L，K2HPO4 5.0g/L，NaCl 30g/L，甘油3.0 g/L，去离子水溶解，调节pH至7.0；
（2）培养过程：取明亮发光杆菌T3接种于装有培养基的锥形瓶中，置于20℃、200rpm振荡的摇床，培养18~20 h后，立即取发光效果最好的菌种二次接种，再置于20℃、200rpm摇床，每2 h测定新鲜菌液发光强度，培养18~20 h达生长对数稳定期，用于测试。
进一步的，所述测试用菌密度的确定方法为：取培养18~20 h的生长达对数稳定期的发光细菌新鲜菌液, 以2.5% wt NaCl稀释至不同菌密度，各取50 uL依次加入950 uL0.10 mg/L HgCl2溶液，含2.5% wt NaCl，静置15 min，利用LumiFox6000生物毒性测试仪测定发光强度，平行测定3次，以2.5% wt NaCl溶液为空白，使相对发光强度为50±5％的菌液，为测试用菌密度。
进一步的，所述步骤（4）以待检测样品稀释的系列浓度为横坐标，以相对发光强度R为纵坐标，作剂量效应曲线，并从该曲线上读取相对发光强度为50%时所对应的浓度，即半数相对发光强度浓度EC50；EC50值越大，毒性越小。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明采用的发光细菌检测法，建立在细菌发光生物传感技术基础上。明亮发光杆菌为海洋菌，在一定盐浓度和pH范围，处于生长对数期的细菌，发光能力强且发光稳定，当环境变化或有毒物质存在时，细菌荧光素酶失活或细胞呼吸被抑制，发光减弱，减弱的程度与有毒物质毒性的大小正相关。发光细菌法成本低廉，具有检测快速、灵敏度高、适应性强等优点。因此本方法完全能够用于坯革综合毒性检测。
2.本发明以标准毒性参照物0.10 mg/L HgCl2确定测试的新鲜菌液密度，使检测结果稳定，重复性好。
3.以氯化钠调节离子强度、盐酸或氢氧化钠调节pH，浸提坯革中弱结合的毒性物质，有效避免了浸提剂与坯革中可浸提组分的反应，操作简便有效。
4.本方法利用发光细菌法进行检测，样品与发光细菌的反应时间短，能够迅速获得检测结果，适应大批量样品的快速检测，大大缩短了综合毒性的检测时间，提高了检测效率和准确度。
附图说明
图1为本发明所述检测方法流程图。
图2为实施例1中铬鞣坯革浸出液剂量-毒性效应曲线图。
图3为实施例2中浸出液的剂量-毒性效应曲线图。
图4为对比例中浸出液的剂量-毒性效应曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员可以根据上述的发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种基于发光细菌的铬鞣坯革综合毒性检测方法，参照图1，所述方法包括如下步骤：
（1）坯革样品预处理：坯革样源自浙江海宁瑞星皮革有限公司，严格按照QB/T2708-2005取样，于45℃干燥48小时后，置于标准空气中恒温恒湿48h，Retsch SM 100 切割研磨仪切碎至4×4mm，样品袋密封，标准空气中恒温恒湿保存备用。
（2）样品浸提：称样5.0 g置于250 mL的锥形瓶，加入100 mL 经0.1 M HCl调节pH为4.0 的0.1% wt NaCl溶液，置于ZWY-2102C恒温振荡器，恒温25℃，转速100 rpm，水平振荡 8h后，用0.45um滤膜过滤。滤液用2.5% wt的NaCl溶液稀释10个浓度梯度，分别含浸出液（V/V）为：6%、12%、18%、24%、30%、36%、42%、48%、54%和60%，用0.1M NaOH调节所有稀释样品pH为7.0±0.2，立即进行毒性评价。
（3）浸提液的毒性检测：本发明采用明亮发光杆菌T3新鲜菌液测定坯革综合毒性。发光细菌培养基的制备如下：胰蛋白胨5.0g/L，酵母粉5.0g/L，Na2HPO4 5.0g/L，K2HPO45.0g/L，NaCl 30g/L，甘油3.0g/L，去离子水溶解，调节pH至7.0。培养操作的流程为：配制1L培养基，按每瓶100 mL分装于250 mL锥形瓶中，用棉花、纱布、报纸包扎后，于高温灭菌锅中121 ℃灭菌20 min备用。取明亮发光杆菌T3冻干粉，加入2.5 %氯化钠溶液在20~25 ℃复苏15 min。取1 mL复苏的明亮发光杆菌接种于锥形瓶，置于20 ℃、200 rpm振荡的摇床，培养18~20 h左右发光强度到达最大值，可进行收获。取1.5 mL发光效果最好的菌种二次接种后，置于20 ℃、200 rpm摇床，每2 h测定细菌发光强度。具体测定方法：50 uL新鲜菌液，加入950 uL 2.5 wt .％的NaCl，混匀放置15 min，LumiFox6000生物毒性测试仪测定发光强度。在本实施例培养条件下，发光细菌在前11 h的培养阶段不发光。进入对数生长期后发光强度迅速增加，培养至18~20 h时发光强度趋于最大且发光稳定。因此本实验采用18~20 h的新鲜菌液进行毒性试验。
取1.0 mL培养19 h的发光细菌液5份，依次加入2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL和4.0mL的2.5% wt NaCl溶液混匀，获得不同菌密度的发光细菌稀释液。取50 uL不同菌密度的发光细菌稀释液，依次加入950 uL 0.10 mg/L HgCl2溶液（含2.5% wt NaCl），静置15min，利用LumiFox6000生物毒性测试仪测定发光强度，平行测定3次，以2.5% wt NaCl溶液为空白，计算相对发光强度。其中，相对发光强度为50±5％的菌液，为测试用菌密度。
取50 uL经HgCl2校准菌密度的发光细菌液，依次加入950 uL步骤（2）浸出液的系列浓度梯度样，混匀后静置15 min，利用LumiFox6000生物毒性测试仪测定发光强度，平行测定3次，相对偏差不超过10％，结果取3次测定的平均值。
（4）样品的毒性表达：以浸提液的浓度为横坐标，以发光细菌相对发光强度为纵坐标，作剂量效应曲线（见图2）。计算可得铬鞣坯革浸出液的EC50值为30.15%±1.0%，换算为铬鞣坯革的EC50值（mg/kg坯革，即ppm）EC50(ppm)= EC50(%)*(5/100)*106=15076 ± 900.1 ppm，毒性较低。
实施例2
一种基于发光细菌的铬鞣坯革综合毒性检测方法，参照图1，所述方法包括如下步骤：
（1）坯革样品预处理：铬鞣坯革屑源自浙江明星皮塑有限公司，对坯革屑按照四分法取样，于45℃干燥48小时后，置于标准空气中恒温恒湿48h，Retsch SM 100 切割研磨仪切碎至4×4mm，样品袋密封，标准空气中恒温恒湿保存备用。
（2）样品浸提：称样4.0 g置于250 mL的锥形瓶，加入120 mL pH为7.0的0.3% wtNaCl溶液，置于ZWY-2102C恒温振荡器，恒温25℃，转速60 rpm，水平振荡 24 h后，用0.45um滤膜过滤，滤液用2.5% wt NaCl溶液稀释为10个浓度梯度，即含浸出液（V/V）10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%和100%，0.1 M NaOH 调节pH 7.0±0.2，立即进行毒性评价。
（3）浸提液的毒性检测：本发明采用明亮发光杆菌T3新鲜菌液测定坯革综合毒性。本实施例发光细菌液的制备与实施例1相同。取确定菌密度的菌液50 uL，依次加入950 uL步骤（2）制备的系列浸提液稀释样，混匀后静置15min，利用LumiFox6000生物毒性测试仪测定发光强度，平行测定3次，相对偏差不超过10％，结果取3次测定的平均值。
（4）样品的毒性表达：以2.5% wt NaCl溶液为参比，浸提稀释液的浓度为横坐标，相对发光强度为纵坐标，绘制剂量-效应曲线，见图3。可得铬鞣坯革屑浸提液的EC50 值为51.29%±2.68%，换算为铬鞣坯革屑的EC50(ppm)= EC50(%)* (4/120)*106 = 17097 ± 892ppm，毒性较低。
对比例
称实施例2样品4.0 g置于250 mL的锥形瓶，加入120 mL pH为7.0的去离子水，置于ZWY-2102C恒温振荡器，恒温25℃，转速60 rpm，水平振荡 24h后，用0.45 um滤膜过滤，滤液用2.5% wt NaCl溶液稀释为10个浓度梯度，即含浸出液（V/V）10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%和100%，0.1 M NaOH调节pH 7.0±0.2，立即进行毒性评价。浸出液的剂量-毒性效应曲线见图4对比例。其余步骤同实施例2。
对实施例2和对比例进行相应的浸提效果测试，测试结果如表1所示。可以看出，本发明（实施例2）提供的浸提剂，与去离子水（对比例）相比，虽然浸提物质总量差异不大，但毒性更高，且偏差大于10%。
表1 浸提剂的浸提效果对比表
。
实施例3
一种基于发光细菌的多糖醛鞣坯革综合毒性检测方法，参照图1，所述方法包括如下步骤：
（1）坯革样品预处理；坯革由广东德美精细化工股份有限公司提供，严格按照QB/T2708-2005取样，于45℃干燥48小时后，置于标准空气中恒温恒湿48h，Retsch SM 100 切割研磨仪切碎至4×4mm，样品袋密封，标准空气中恒温恒湿保存备用。
（2）样品浸提：称样3.0 g置于250 mL的锥形瓶，加入120 mL经0.1 M NaOH调节pH为9.0的0.1% wt NaCl溶液，置于ZWY-2102C恒温振荡器，恒温30℃，转速80 rpm，水平振荡24h后，用0.45 um滤膜过滤，滤液加入NaCl,使其浓度为2.5% wt，0.1 M HCl调节pH7.0±0.2，立即进行毒性评价。
（3）浸提液的毒性检测：本发明采用明亮发光杆菌T3新鲜菌液测定坯革综合毒性。本实施例发光细菌，源自低温保存在甘油管中的明亮发光杆菌液，恢复至室温后，经与实施例1相同的两次优化接种，取第二次接种培养19 h的发光细菌液，以标准毒性参照物HgCl2确定测试菌密度。取确定菌密度的菌液50 uL，加入950 uL浸提液，混匀后静置15min，利用LumiFox6000生物毒性测试仪测定发光强度，平行测定3次，相对偏差不超过10％，结果取3次测定的平均值。
样品的毒性表达：以2.5% wt NaCl溶液为参比，浸提原液的相对发光强度为80.2±3.2 %，毒性极低。

Claims (7)

1.一种坯革综合毒性的检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：
（1）预处理：对坯革取样干燥，恒温恒湿后，进行粉碎；
（2）浸提：将预处理后的坯革加入浸提剂，恒温水平震荡一定时间，过滤得浸提液；
（3）毒性检测：向浸提液中加入氯化钠，使氯化钠浓度为2.5% wt，调节pH 7.0±0.2，然后再加入培养的测试用菌密度的新鲜发光细菌液，混匀后静置，测定发光强度；
（4）毒性表达：以2.5% wt NaCl溶液的发光强度为对照，计算静置后浸提液的相对发光强度；
其中，步骤（2）中，浸提剂与坯革的液固比为20：1~40：1，所述液固比的单位为mL/g，恒温25~30°C，水平60~100 rpm振荡浸提8~24 h，过滤方法为通过0.45 um的滤膜；
所述浸提剂为0.1~0.3% wt的NaCl溶液，并用HCl或NaOH调节pH为4.0~9.0；
所述发光细菌液中的发光细菌为明亮发光杆菌T3。
2.一种坯革综合毒性的检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：
（1）预处理：对坯革取样干燥，恒温恒湿后，进行粉碎；
（2）浸提：将预处理后的坯革加入浸提剂，恒温水平震荡一定时间，过滤得浸提液；
（3）将浸提液采用2.5% wt NaCl稀释，形成浓度梯度，使其相对发光强度范围为0%~100%，并调节pH 7.0±0.2；然后再加入培养的测试用菌密度的新鲜发光细菌液，混匀后静置，测定发光强度；
（4）毒性表达：以2.5% wt NaCl溶液的发光强度为对照，计算静置后浸提液的半数相对发光强度浓度EC50；
其中，步骤（2）中，浸提剂与坯革的液固比为20：1~40：1，所述液固比的单位为mL/g，恒温25~30°C，水平60~100 rpm振荡浸提8~24 h，过滤方法为通过0.45 um的滤膜；
所述浸提剂为0.1~0.3% wt的NaCl溶液，并用HCl或NaOH调节pH为4.0~9.0；
所述发光细菌液中的发光细菌为明亮发光杆菌T3。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述预处理方法具体为：将坯革按照QB/T 2708-2005或四分法取样，于45 ℃干燥48小时后，置于标准空气中，20±2°C，相对湿度65±5%恒温恒湿48h，然后切碎至4×4 mm的皮粉，恒温恒湿保存备用；所述坯革为经过鞣制、染色和加脂但尚未涂饰的坯革。
4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述发光细菌液的培养方法为：
（1）制备发光细菌培养基：取胰蛋白胨5.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，Na2HPO4 5.0g/L，K2HPO45.0g/L，NaCl 30g/L，甘油3.0 g/L，去离子水溶解，调节pH至7.0；
（2）培养过程：取明亮发光杆菌T3接种于装有培养基的锥形瓶中，置于20℃、200 rpm振荡的摇床，培养18~20 h后，立即取发光效果最好的菌种二次接种，再置于20℃、200 rpm摇床，每2 h测定新鲜菌液发光强度，培养18~20 h达生长对数稳定期，用于测试。
5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述测试用菌密度的确定方法为：取培养18~20 h的生长达对数稳定期的发光细菌新鲜菌液， 以2.5% wt NaCl稀释至不同菌密度，各取50 uL依次加入950 uL 0.10 mg/L HgCl2溶液，含2.5% wt NaCl，静置15 min，利用LumiFox6000生物毒性测试仪测定发光强度，平行测定3次，以2.5% wt NaCl溶液为空白，使相对发光强度为50±5％的菌液，为测试用菌密度。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（4）以2.5 % wt NaCl对照样的发光强度平均值I0，和待检测样品的发光强度平均值I，按R=I/I0 ×100%计算浸提原液的相对发光强度R；相对发光强度R越大，毒性越小。
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（4）以待检测样品稀释的系列浓度为横坐标，以相对发光强度R为纵坐标，作剂量效应曲线，并从该曲线上读取相对发光强度为50%时所对应的浓度，即半数相对发光强度浓度EC50；EC50值越大，毒性越小。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101339134A (zh) * 2008-08-14 2009-01-07 上海市农业科学院 一种快速检测蔬菜综合毒性的方法
CN103149200A (zh) * 2013-03-05 2013-06-12 中国环境科学研究院 一种基于发光细菌法的大气颗粒物综合毒性检测方法
CN104215479A (zh) * 2013-05-30 2014-12-17 四川省中医药科学院 一种快速检测中药注射剂综合毒性的生物测试方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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