CN109797192B - 一种基于衰老相关β-半乳糖苷酶的快速定量衰老细胞检测方法 - Google Patents
一种基于衰老相关β-半乳糖苷酶的快速定量衰老细胞检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于衰老相关β‑半乳糖苷酶的快速定量衰老细胞检测方法，体外培养的贴壁细胞，弃去培养液，用PBS缓冲液清洗，然后加入染色液，置37℃无二氧化碳的培养箱，染色结束后转移全部染色液于离心管中，离心后弃染色液，PBS清洗蓝色产物，然后加入DMSO溶解，离心，取上清并测定溶液在640nm处的吸光度，同种方法建立衰老细胞个数与吸光度之间的标准曲线，测定吸光度后由标准曲线可知试验样的细胞衰老个数。本方法具有重现性高、可靠性高、客观性强、影响因素少和速度快等特点，可以实现对动物及人体衰老细胞的快速定量。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于衰老相关β-半乳糖苷酶的快速定量衰老细胞检测方法，采用酶标仪通过一定厚度溶液颜色的吸光度确定衰老细胞数量。
背景技术
随着人民日益增长的对美好生活的需要，越来越多的人开始关注健康；抗氧化及抗衰老方面的需求也随之增加。相应的，随着各方面技术的不断发展和人民群众的迫切需求，抗氧化、抗衰老方面的研究也逐渐增加，包括药物使用、外界刺激以及特殊食品对细胞衰老的影响等。细胞衰老的检测方法较多，但多数需要使用较昂贵的试剂，且步骤复杂繁多，对实验条件要求苛刻；成本相对较低的检测方法多通过反应产物的显色统计衰老细胞的个数，计数较耗时，且主观性较强，而且显色深浅有不同，常用的计数方法忽略了产物颜色深浅与细胞衰老程度的关系，为了更加准确的测定细胞衰老的数量和程度，本发明经过归一化处理建立了一种快速定量检测细胞衰老的方法。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明旨在提供一种基于衰老相关β-半乳糖苷酶的快速定量衰老细胞检测方法。本方法具有重现性高、可靠性高、客观性强、影响因素少和速度快等特点，可以实现对动物及人体衰老细胞的快速定量检测。
本发明基于衰老相关β-半乳糖苷酶的快速定量衰老细胞检测方法，包括如下步骤：
步骤1：标准曲线的绘制
建立细胞衰老个数与其对应的最大吸收波长处的吸光度之间的标准曲线，本发明中建立标准曲线相当于归一化处理，此过程增加了不同样品之间的可比性；
1a、用两个相同的25cm2的细胞培养瓶同时培养两瓶密度相同的细胞Ⅰ和Ⅱ，待细胞完全融合后，从培养箱中取出Ⅰ用于细胞计数，计数结果为x个；用PBS缓冲液清洗细胞Ⅱ2-3次，无需固定；
1b、向1a的细胞Ⅱ所得物中加入衰老细胞染色液5-8mL，在37℃不含CO2的培养箱中孵育48-96h；
1c、将1b所得物10000g-14000g离心2-10min得到蓝色产物，弃上清液后加入300-500μL DMSO溶解蓝色产物；待溶解后，10000-14000g离心2-10min以确保蓝色产物溶解充分，同时此操作可去除细胞碎片等杂质；
1d、吸取200μL上清液于96孔板中，在200-1000nm波长范围内，步长为20nm的条件下扫描溶解蓝色产物的DMSO溶液，得到吸收光谱曲线。蓝色产物溶液在640nm处有最大吸光度，所以本发明选择在640nm处测定样品的吸光度。吸取200μL上清液于96孔板中，在640nm处，测定样品的吸光度并记录，此吸光度对应的细胞个数为y个；根据1c中加入DMSO具体量的不同，y与x之间存在相应不同的线性关系，如，加入400μL DMSO溶解蓝色产物，则y＝200x/400；
1e、用DMSO稀释1倍所测的200μL上清液并混匀，再取混匀后的200μL在640nm处测定样品的吸光度，此吸光度对应的细胞个数为y/2，依次稀释并计数，根据细胞个数和吸光度绘制标准曲线，标准曲线的绘制需要至少5个不同的浓度点值。
步骤2：待测物的检测
2a、培养容器培养细胞融合至90％以上，从培养箱中取出待测细胞，用PBS缓冲液清洗细胞2-3次，无需固定；
2b、向2a所得物中加入衰老细胞染色液，衰老细胞染色液的加入体积与用此容器培养细胞时加入的培养基的体积相等，在37℃不含CO2的培养箱中孵育48-96h；
2c、将2b所得物10000g-14000g离心2-10min得到蓝色产物，弃上清液后加入DMSO溶解蓝色产物，可蜗旋或加热加快溶解速度；待溶解后，10000-14000g离心2-10min以确保蓝色产物溶解充分，同时此操作可去除细胞碎片等杂质；
加入DMSO的体积参考如下：6孔板培养的细胞染色后加入10μL-100μLDMSO、25cm2的培养瓶培养的细胞染色后加入70μL-700μLDMSO、75cm2的培养瓶培养的细胞染色后加入300μL-3000μLDMSO时其吸光度较适宜；上机测定时吸取体积均为200μL，于96孔板中，用此法测定其他容器培养的细胞衰老个数时，加入DMSO的体积可通过与以上三种容器细胞可贴壁面积的比较而确定。当细胞培养容器的底面积为A时，加入的DMSO体积B的范围为：(4.496A-38.2)μL-(44.96A-382)μL。
2d、吸取200μL上清液于96孔板中，在200-1000nm波长范围内扫描得到吸收光谱曲线；酶标仪测定要保证孔板中加入的溶液体积相同(50-400μL范围内的固定体积)，一方面便于建立标准，实现不同批次试验的可比性；另一方面保证测量光程相同。蓝色产物的DMSO溶液制备后要在72h内完成检测。随着放置时间的增加蓝色产物的DMSO溶液颜色逐渐变淡，为保证测定的准确性，蓝色产物完全溶解后尽量在72h内完成测定。蓝色产物溶液在640nm处有最大吸光度，所以本发明选择在640nm处测定样品的吸光度。在波长640nm、步长为20nm的条件下扫描溶解蓝色产物的DMSO溶液，得到吸收光谱曲线。吸光度与衰老细胞数量成线性相关，通过与标准曲线比对获得衰老细胞的数量。
所述衰老细胞染色液为碧云天细胞衰老β-半乳糖苷酶染色液(直接市购得到)。
本发明中所述衰老细胞是基于衰老相关β-半乳糖苷酶而论的，衰老相关的β-半乳糖苷酶是细胞衰老的检测指标之一，被认为是细胞衰老特异性的标志物以及衰老检测的金标准，是一种鉴别衰老细胞的标志酶，文中所述的衰老细胞是根据衰老相关β-半乳糖苷酶的染色情况界定的，用此标准判断“是”与“否”，归一化处理后更加科学准确的判断基于衰老相关β-半乳糖苷酶的衰老细胞的数量。
如果细胞衰老个数太多，导致相应体积的DMSO溶解蓝色产物后颜色过深，吸光度过大，则取一定比例的溶液，继续加入DMSO补足体积至200μL，其吸光度对应的细胞衰老个数除以所取溶液的比例即得细胞衰老总个数；例如，用600μL的DMSO溶解75cm2培养瓶中的晶体，取200μL测定时其吸光度大于1.2，则取100μL溶液，另加入100μL DMSO(保证测定体积为200μL)，其吸光度对应的细胞衰老个数乘以6即为75cm2培养瓶中细胞衰老的个数。不同批次检测的细胞培养密度以及染色时间越接近越好，尽可能减小误差，提高测定的准确性。
本方法只需比较衰老细胞反应溶液在最大吸收波长640nm处的吸光度，通过标准曲线计算即可快速测得较客观、准确的衰老细胞的数量。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
1、本发明检测细胞衰老个数时细胞无需固定。细胞固定液对实验人员有一定的毒害作用，现有技术统计细胞衰老个数均需对细胞进行固定，本发明无需对细胞固定，可直接染色，减少了操作步骤，同时减少操作人员与有毒有害试剂的接触。
2、减小由结晶颜色深浅不同、结晶位置不同造成的误差。本发明中的蓝色产物是衰老相关β-半乳糖苷酶催化X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生的，加入X-gal后，胞内有β-半乳糖苷酶的位置均会产生蓝色，所以一个细胞内可能出现一个以上蓝色产物的位置，如果使用计数方法统计衰老细胞个数，其结果可能会有偏差；另外，如果胞外存在β-半乳糖苷酶(见图1、2)，也会形成蓝色产物，计数方法会把胞外蓝色当作假阳性的细胞计算在内，也会影响计数结果。本发明使用DMSO溶解蓝色产物，根据溶液吸光度计算衰老细胞个数可减少以上因素对实验结果的影响。
3、本发明通过绘制标准曲线归一化处理检测结果。产物颜色深浅与细胞中衰老相关β-半乳糖苷酶的量有关，即与衰老程度有关，计数方法只能统计蓝色个数，无法把颜色深浅的因素考虑在内(见图1、2)，本发明通过衰老细胞个数与吸光度值之间的关系建立标准曲线，极大地减小了不同批次、不同操作人员及颜色深浅造成的误差，进而提高结果的准确性、可靠性和重现性。
4、快速。根据已建立的标准曲线，一次(2min之内)最多可读数96或384个样品，本发明与逐个计数相比极大的提高了检测速度。
附图说明
图1是计数法统计细胞衰老个数的显微图片，细胞衰老染色100×。
图2是计数法统计细胞衰老个数的显微图片，细胞衰老染色200×。
图3是细胞衰老个数与吸光度之间的标准曲线关系。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明技术方案作进一步分析说明。
以下实施例中所述PBS缓冲液的配制方法(1L配方)如下：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，浓盐酸调pH至7.4，定容到1L，即得pH7.4的PBS。
所述细胞衰老染色液为碧云天细胞衰老β-半乳糖苷酶染色液。
标准曲线的绘制过程如下：
建立细胞衰老个数与其对应的最大吸收波长处的吸光度之间的标准曲线，本发明中建立标准曲线相当于归一化处理，此过程增加了不同样品之间的可比性；
a、用两个相同的25cm2的细胞培养瓶同时培养两瓶密度相同的细胞Ⅰ和Ⅱ，待细胞完全融合后，从培养箱中取出Ⅰ用于细胞计数，计数结果为x个；用PBS缓冲液清洗细胞Ⅱ2-3次，无需固定；
b、向1a的细胞Ⅱ所得物中加入衰老细胞染色液5-8mL，在37℃不含CO2的培养箱中孵育48-96h；
c、将1b所得物10000g-14000g离心2-10min得到蓝色产物，弃上清液后加入300-500μL DMSO溶解蓝色产物；待溶解后，10000-14000g离心2-10min以确保蓝色产物溶解充分，同时此操作可去除细胞碎片等杂质；
d、吸取200μL上清液于96孔板中，在200-1000nm波长范围内，步长为20nm的条件下扫描溶解蓝色产物的DMSO溶液，得到吸收光谱曲线。蓝色产物溶液在640nm处有最大吸光度，所以本发明选择在640nm处测定样品的吸光度。吸取200μL上清液于96孔板中，在640nm处，测定样品的吸光度并记录，此吸光度对应的细胞个数为y个；根据1c中加入DMSO具体量的不同，y与x之间存在相应不同的线性关系，如，加入400μL DMSO溶解蓝色产物，则y＝200x/400；
e、用DMSO稀释1倍所测的200μL上清液并混匀，再取混匀后的200μL在640nm处测定样品的吸光度，此吸光度对应的细胞个数为y/2，依次稀释并计数，根据细胞个数和吸光度绘制标准曲线，标准曲线的绘制需要至少5个不同的浓度点值。
实施例1：
从培养箱中取出用25cm2细胞培养瓶已培养72h的人胃上皮细胞(Ges-1)，弃培养基，PBS清洗细胞3次，每次2mL；然后加入细胞衰老染色液4mL，在37℃无CO2的培养箱中孵育48h后取出细胞培养瓶，吹打培养瓶底面后转移全部液体于离心管中，11000g离心5min得到蓝色产物，加入300μLDMSO溶解蓝色产物，37℃加热1h，待完全溶解后，14000g离心3min，吸取200μL上清于96孔板中，在640nm测吸光值，吸光值为0.573，吸光度与衰老细胞数量成线性相关，每个25cm2细胞培养瓶衰老细胞个数约为470000。
实施例2：
从培养箱中取出用6孔板已培养48h的Ges-1，弃培养基，加1mL的PBS清洗细胞2次，然后加入细胞衰老染色液2mL，在37℃无CO2的培养箱中孵育72h，取出细胞培养瓶，吹打培养瓶底面后转移全部液体于离心管中，12000g离心4min得到蓝色产物，向其中加入220μLDMSO溶解蓝色沉淀，38℃加热1h，待完全溶解后，14000g离心4min，吸取200μL上清于96孔板中，在640nm测吸光值，吸光值为0.326，吸光度与衰老细胞数量成线性相关，衰老细胞个数约为230000。
表1细胞衰老个数与其对应的吸光度之间的关系
| 衰老细胞个数 | 50000 | 100000 | 200000 | 400000 | 800000 |
| 640nm处的吸光度 | 0.140 | 0.202 | 0.316 | 0.520 | 0.922 |
Claims (2)
1.一种基于衰老相关β-半乳糖苷酶的快速定量衰老细胞检测方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：标准曲线的绘制
建立细胞衰老个数与其对应的最大吸收波长处的吸光度之间的标准曲线；
1a、用两个相同的25cm2的细胞培养瓶同时培养两瓶密度相同的细胞，分别记为Ⅰ和Ⅱ，待细胞完全融合后，从培养箱中取出Ⅰ用于细胞计数，计数结果为x个；用PBS缓冲液清洗细胞Ⅱ 2-3次，无需固定；
1b、向1a的细胞Ⅱ所得物中加入衰老细胞染色液5-8mL，在37℃不含CO2的培养箱中孵育48-96h；
1c、将1b所得物10000g-14000g离心2-10min得到蓝色产物，弃上清液后加入300-500μLDMSO溶解蓝色产物；待溶解后，10000-14000g离心2-10min以确保蓝色产物溶解充分，同时去除细胞碎片等杂质；
1d、吸取200μL上清液于96孔板中，在波长200-1000nm范围内测定样品的吸光度并记录，此吸光度对应的细胞个数为y个；
1e、用DMSO稀释1倍所测的200μL上清液并混匀，再取混匀后的200μL在波长200-1000nm范围内测定样品的吸光度，此吸光度对应的细胞个数为y/2，依次稀释并计数，根据细胞个数和吸光度绘制标准曲线；
步骤2：待测物的检测
2a、培养容器培养细胞融合至90%以上，从培养箱中取出待测细胞，用PBS缓冲液清洗细胞2-3次，无需固定；
2b、向2a所得物中加入衰老细胞染色液，衰老细胞染色液的加入体积与用此容器培养细胞时加入的培养基的体积相等，在37℃不含CO2的培养箱中孵育48-96h；
2c、将2b所得物10000g-14000g离心2-10min得到蓝色产物，弃上清液后加入DMSO溶解蓝色产物，可蜗旋或加热加快溶解速度；待溶解后，10000-14000g离心2-10min以确保蓝色产物溶解充分，同时去除细胞碎片等杂质；
2d、吸取200μL上清液于96孔板中，在200-1000nm波长范围内扫描得到吸收光谱曲线；吸光度与衰老细胞数量成线性相关，通过与标准曲线比对获得衰老细胞的数量；
所述衰老细胞染色液为碧云天细胞衰老β-半乳糖苷酶染色液；
测定吸光度时，检测的波长为640nm。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：
蓝色产物完全溶解后在72h内完成测定，以保证测量的准确性。
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