CN112415156A - 一种阿尼芬净原料药细菌内毒素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细菌内毒素的检测方法，具体的说是涉及一种阿尼芬净原料药细菌内毒素的检测方法。该方法将阿尼芬净原料药用四氢呋喃溶解，制成阿尼芬净初溶液,再用细菌内毒素检查用水稀释制成浓度为0.04mg/ml‑0.34mg/ml的阿尼芬净溶液，然后参照《中国药典》2015年版四部1143细菌内毒素检查法中的凝胶法检查，本发明提供的细菌内毒素检测方法，操作简便，灵敏准确，完全能满足阿尼芬净作为注射剂原料药检查细菌内毒素的要求，从而对原料药的质量进行控制，保证注射剂产品的安全性。

Description

一种阿尼芬净原料药细菌内毒素的检测方法

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，涉及细菌内毒素的检查方法，具体的说是涉及一种阿尼芬净原料药细菌内毒素的检测方法。

背景技术

阿尼芬净为半合成的棘白菌素，具有抗真菌活性，能抑制真菌细胞壁中1,3-β-D-葡聚糖合成酶，从而抑制真菌中的主要成分1,3-β-D葡聚糖的合成。体外抗菌试验显示，本品具有抗白色念珠菌、光滑念珠菌、和热带念珠菌活性。能有效的对抗白色念珠菌感染。细菌内毒素是注射剂药品中的主要污染物质，大量进入血液就会引起发热反应—“热原反应”，危害人体健康，甚至危及生命，故注射剂质量标准中规定需要检查细菌内毒素。阿尼芬净作注射剂药物的原料时，应进行细菌内毒素的检查控制，为了临床安全用药，内毒素限值L控制在1.5EU/mg。阿尼芬净在水中不溶，按照《中国药典》2015年版四部1143细菌内毒素检查法常规方法不能进行检查，因此需要找到一种既能溶解样品，又能使供试品溶液不干扰内毒素检查的方法，满足阿尼芬净原料药的细菌内毒素检查需要。

发明内容

本发明目的在于提供一种阿尼芬净原料药细菌内毒素的检测方法，以解决现有技术存在的问题。

本发明为解决这一问题所采取的技术方案是:

一种阿尼芬净原料药细菌内毒素的检测方法，其特征在于该方法将阿尼芬净原料药用四氢呋喃溶解，制成阿尼芬净初溶液,再用细菌内毒素检查用水倍比稀释制备各灵敏度鲎试剂对应的阿尼芬净溶液，制成浓度为0.04mg/ml-0.34mg/ml的阿尼芬净溶液，然后参照《中国药典》2015年版四部1143细菌内毒素检查法中的凝胶法检查。

所述的阿尼芬净原料药细菌内毒素的检测方法，其特征在于所述四氢呋喃用经0.22μm的除菌滤膜过滤。

所述的阿尼芬净原料药细菌内毒素的检测方法，其特征在于所述阿尼芬净用四氢呋喃溶解制备初溶液，初溶液浓度为1.3mg/ml-11.0mg/ml，初溶液用检查用水倍比稀释32倍以上。

所述的阿尼芬净原料药细菌内毒素的检测方法，其特征在于该方法具体操作如下：

步骤一：阿尼芬净溶液制备:取阿尼芬净原料药，精密称定，加入经0.22μm的除菌滤膜过滤的四氢呋喃，使阿尼芬净充分溶解，制成浓度为1.3mg/ml-11.0mg/ml的溶液作为初溶液，用细菌内毒素检查用水倍比稀释32倍以上，制成浓度为0.04mg/ml-0.34mg/ml的阿尼芬净溶液；

步骤二：取灵敏度复核合格的λ为0.06 EU/ml -0.5 EU/ml的鲎试剂进行试验，每支鲎试剂用0.1ml检查用水复溶，8支试管，取2支加入0.1ml内毒素标准溶液（2λ），作为阳性对照，取2支加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照，2支加入0.1ml阿尼芬净溶液，2支加入0.1ml含2λ细菌内毒素的阿尼芬净溶液；

步骤三：轻轻混匀后封闭试管管口垂直放入36-38℃（37±1）℃的恒温箱内保温58-62分钟即(60±2)分钟，反应结束将试管从恒温箱中取出，缓缓倒转180°观察记录，试管内形成凝胶且不变形不从试管壁滑落者为阳性（用“+”表示），未形成凝胶或形成凝胶不坚实、变形并从试管壁滑落者为阴性（用“-” 表示）；

步骤四：结果判断：当阳性对照试管均为阳性，阴性对照试管为阴性，阿尼芬净溶液（简称供试品）阳性试管为阳性，试验有效；供试品2试管均为阴性时，供试品内毒素符合规定，供试品的2试管均为阳性时，则供试品不符合规定，若供试品溶液的2试管中一试管为阴性，一试管为阳性，需进行复试，复试时平行做4试管，若所有平行试管均为阴性，则阿尼芬净溶液符合规定，否则供试品不符合规定。

试验中，首先对阿尼芬净原料的细菌内毒素限值进行确定。

注射用阿尼芬净内毒素限值L计算：L=K/M[注射剂K=5EU/(kg·h)，阿尼芬净最大剂量M=1.11mg/(kg·h)]，注射用阿尼芬净的内毒素的限度为4.5EU/mg，并考虑到注射剂中辅料的加入及临床上联合用药，为了保证注射用阿尼芬净的临床用药的安全性，将原料药的细菌内毒素限值定为L=1.5EU/mg。

注射用阿尼芬净最小有效稀释浓度（MVC）的计算。

最小有效稀释浓度计算公式为:MVC=λ/L，其中L为供试品的细菌内毒素限值，阿尼芬净原料药的L为1.5EU/mg。λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度，当λ为0.5 EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml或0.03EU/ml时，相对应的阿尼芬净最小有效稀释浓度（MVC）如表1所示。

表1 阿尼芬净最小有效稀释浓度MVC

内毒素标准溶液制备：取细菌内毒素标准品一支，按规定加入细菌内毒素检查用水溶解其内容物，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备所需浓度的细菌内毒素标准溶液（2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟，备用。

干扰试验中溶液制备及试验平行支数：

溶液A：即供试品溶液，平行试验2支。

溶液B：干扰试验系列，即含内毒素浓度为（2λ、1λ、0.5λ、0.25λ）的供试品溶液系列；每个浓度平行试验4支。

溶液C：含内毒素浓度为（2λ、1λ、0.5λ、0.25λ）的内毒素标准溶液系列；每个浓度平行试验2支。

溶液D：内毒素检查用水，即阴性对照，平行试验2支。

鲎试剂复溶：取鲎试剂安瓿，用砂轮在瓶颈部划痕，用酒精棉球擦拭后开启，每支用0.1ml细菌内毒素检查用水复溶后轻轻摇匀。

鲎试剂灵敏度复核

按2015年版中国药典四部1143的要求对鲎试剂进行灵敏度复核。取复溶后的0.1ml/支的鲎试剂安瓿18支，其中16支分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液（2λ、λ、0.5λ、0.25λ），每个内毒素浓度平行做4支。另外2支加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。轻轻混匀后封闭管口垂直放入（37±1）℃的恒温箱内保温(60±2)分钟。将试管从恒温箱中取出，缓缓倒转180°，管内形成凝胶且不变形不从管壁滑落者为阳性（用“+”表示），未形成凝胶或形成凝胶不坚实、变形并从管壁滑落者为阴性（用“-” 表示）。当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验有效。按公式λc=antilg（∑X/n）计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。鲎试剂灵敏度复核结果见表2。所用鲎试剂的灵敏度测定值均在0.5λ～2λ之间(包括0.5λ和2λ)，符合规定。

表2鲎试剂灵敏度复核试验

细菌内毒素检查：取鲎试剂，每支加入0.1ml细菌内毒素检查用水复溶后，其中2支平行加入0.1ml2λ的细菌内毒素标准溶液作为阳性对照，2支加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照，2支平行加入供试品溶液0.1ml，2支加入含2λ内毒素的供试品溶液，将8支管中溶液轻轻摇匀后，于37±1℃恒温箱中保温60±2分钟，记录反应结果。

本发明人经反复研究发现，采用四氢呋喃可解决阿尼芬净原料药的溶解性问题，而且通过稀释一定倍数可以排除样品溶液对细菌内毒素检查的干扰。通过回收试验可知，四氢呋喃不会破坏供试品中细菌内毒素，而在一定浓度时会干扰内毒素和鲎试剂的凝胶反应，因此可以通过稀释一定倍数的方法排除溶剂和供试品的干扰，即可用于检查内毒素限值L为1.5EU/mg的阿尼芬净原料药。

本发明提供的阿尼芬净细菌内毒素检查法，操作简便，灵敏准确，完全能满足阿尼芬净作为注射剂原料检查细菌内毒素的要求。对原料药的质量进行控制，保证注射剂产品的安全性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

本发明所用仪器：LRH-250生化培养箱、XW-80A旋涡混合器、SW-CJ-1B洁净工作台、DHG-9108A电热鼓风干燥箱、电子天平（sartoriusR200D）；试验所用玻璃器皿均为市售，在250℃烘烤1h，以去除可能存在的外源性细菌内毒素。

本发明所用试药规格及生产厂家（见表3）

表3 试药规格及生产厂家

实施例1阿尼芬净原料药溶解实验

阿尼芬净在水中不溶解，不能直接进行细菌内毒素的干扰试验和检测，需采用适宜的方式使阿尼芬净溶解后进行测定。制剂中使用了吐温-80作为助溶剂，因此考察了不同浓度的吐温-80对供试品溶解情况。文献中尚未有使用纯有机溶剂溶解样品进行细菌内毒素试验的先例，但考虑阿尼芬净的结构和极性，试验用有机溶剂对阿尼芬净前处理。供试品前处理方案见表4，由表4可知，方案1、2、3阿尼芬净不能溶解，可以排除。方案4-7阿尼芬净可以溶解，进一步考察阿尼芬净原料药溶解后用内毒素检查用水倍比稀释后的情况，结果见表5，由表5可知，方案12、13和方案15可行，四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺可以溶解阿尼芬净，经内毒素检查用水倍比稀释后，阿尼芬净没有析出，仍呈澄清透明的溶液，可以进行进一步的试验。

表4 供试品前处理方式的考察试验一

表5 供试品前处理方式考察试验二

实施例2 四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺的干扰试验

四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺可以解决阿尼芬净溶解问题，但这两种溶剂是否影响内毒素与鲎试剂的凝胶反应从而干扰测定，下面的对两种有机溶剂进行的干扰预试验和干扰试验，可以说明和解决这一问题。

干扰预试验方法：本试验为考察溶剂（N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃）的不干扰稀释倍数。选择两个厂家的λ=0.25的鲎试剂，将试验溶剂用内毒素检查用水分别稀释4倍、8倍、16倍、32倍、64倍和128倍作为溶剂稀释液；取细菌内毒素工作标准品稀释制成1.0EU/ml（相当于4λ）的标准溶液，取4λ标准溶液0.5ml分别与稀释4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍的溶剂0.5ml混合，制成含内毒素浓度为0.5EU/ml(2λ)的溶剂的阳性对照溶液；并做阳性对照和阴性对照（结果见表6）。由结果可知，N,N-二甲基甲酰胺在稀释128倍以上、四氢呋喃在稀释32倍以上时，对细菌内毒素和鲎试剂反应的干扰作用可以消除。由试验可知，两种溶剂对内毒素的测定反应都有干扰作用，干扰作用为抑制作用。当溶剂浓度减小时，这种抑制作用逐渐减小直至消除。在相同稀释倍数下四氢呋喃较N,N-二甲基甲酰胺表现出更小的干扰抑制作用，因此，采用四氢呋喃作为溶剂溶解阿尼芬净作为初溶液，稀释32倍以上得到供试品溶液。采用N,N-二甲基甲酰胺为溶剂溶解阿尼芬净作为初溶液，需要稀释128倍以上才能获得无溶剂干扰的试品溶液，供试品溶液的有效浓度范围小，因此可以认为，优选的以四氢呋喃溶解阿尼芬净制备初溶液。为了确保消除溶剂的干扰作用，采用稀释32倍和64倍的四氢呋喃做干扰试验。

表6 溶剂的干扰预试验结果

注：“+”表示反应结果为阳性，“-”表示反应结果为阴性，以下表格中示意相同，不再重复标注。

四氢呋喃的干扰试验：根据预实验结果，选择两个厂家的λ=0.25的鲎试剂，分别对三个厂家的四氢呋喃进行干扰试验。四氢呋喃用内毒素检查用水分别稀释32倍和64倍作为供试品溶液（溶液A），另制备含细菌内毒素分别为2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的供试液干扰试验系列（溶液B）和鲎试剂灵敏度对照系列（溶液C），以内毒素检查用水为阴性对照（溶液D）。结果见表7。结果显示均在0.5λ～2λ范围内,故可以判定四氢呋喃在稀释32倍、64倍的溶液对细菌内毒素的测定均无干扰作用。

表7 四氢呋喃稀释液细菌内毒素干扰试验结果

四氢呋喃内毒素测定

由表7的结果同时可获知，四氢呋喃稀释32倍后内毒素小于0.25EU。选择更高灵敏度的鲎试剂对稀释32倍的四氢呋喃进行测定，如表8所示，使用λ=0.03的鲎试剂，分别对三个厂家的四氢呋喃进行测定，四氢呋喃用内毒素检查用水稀释32倍作为供试品溶液，另制备含细菌内毒素为2λ的供试液阳性对照，含细菌内毒素为2λ的阳性对照，以检查用水为阴性对照。结果显示四氢呋喃稀释32倍的溶液内毒素小于0.03EU。

表8 四氢呋喃（稀释32倍）内毒素检查结果

实施例3 阿尼芬净的干扰预试验

基于对有机溶剂四氢呋喃的细菌内毒素检查干扰的研究，认为可以使用四氢呋喃溶解阿尼芬净，制备初溶液，再用BET水稀释至不干扰浓度，作为供试液进行阿尼芬净的细菌内毒素检查。下面实施的干扰预试验、干扰试验和回收试验对检查方法做进一步的说明。

阿尼芬净干扰预试验：用两个厂家0.25EU/ml的鲎试剂进行试验。取阿尼芬净原料药，用四氢呋喃溶解制成11.0mg/ml的初溶液，用内毒素检查用水逐级稀释制得1.37mg/ml、0.68mg/ml、0.34mg/ml、0.17mg/ml、0.08 mg/ml、0.04 mg/ml系列稀释液作为供试品溶液系列。另配制与供试品溶液相同浓度梯度并含2λ细菌内毒素的溶液作为供试品阳性对照系列，每个浓度平行做两管，同时作阳性对照、阴性对照。结果见表9。由结果可知，供试品溶液对鲎试剂与细菌内毒素的反应有抑制作用，但当阿尼芬净浓度在0.34mg/ml及以下时，其抑制作用可以被排除，即阿尼芬净的四氢呋喃溶液最大不干扰浓度为0.34mg/ml。在本试验中，从初溶液稀释32倍得到0.34mg/ml的供试品溶液，即溶剂四氢呋喃的稀释倍数为32倍，无干扰作用，与四氢呋喃稀释液干扰研究结果一致。

表9 阿尼芬净干扰预试验结果

由预试验结果可知，用四氢呋喃溶解阿尼芬净后，用内毒素检查用水稀释32倍以上时可以消除四氢呋喃的干扰，阿尼芬净浓度在0.34mg/ml以下时可以排除干扰作用。稀释倍数增加，干扰作用越小。

实施例4 以阿尼芬净初溶液浓度为11.0mg/ml，制备浓度为0.34mg/ml的阿尼芬净溶液为供试品溶液进行干扰试验。

选择两个厂家λ为0.25EU/ml的鲎试剂，阿尼芬净用四氢呋喃溶解制成11.0mg/ml的初溶液，经细菌内毒素检查用水稀释32倍（浓度0.34mg/ml）作为供试品溶液进行干扰试验。制备含2λ、λ、0.5λ、0.25λ的含供试品的细菌内毒素系列溶液（溶液B），每一浓度平行做四管。并用BET水制备含2λ、λ、0.5λ、0.25λ的细菌内毒素标准溶液系列（溶液C），每一浓度平行做两管。同时作阴性对照(溶液D)、供试品阴性对照（溶液A），各平行做两管。结果见表10。结果显示，反应结果均在0.5λ～2λ之间，表明阿尼芬净用四氢呋喃溶解后用检查用水稀释32倍，得到的浓度为0.34mg/ml的阿尼芬净供试液，对鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应无干扰。

表10 阿尼芬净干扰试验结果（浓度0.34mg/ml）

实施例5 以阿尼芬净初溶液浓度为8mg/ml，稀释40倍（浓度0.2mg/ml）后制得阿尼芬净溶液作为供试品溶液进行干扰试验，结果见表11，反应结果均在0.5λ～2λ之间，试验结果符合要求。

表11 阿尼芬净干扰试验结果（浓度0.2mg/ml）

实施例6 以阿尼芬净初溶液浓度为5.5mg/ml，稀释32倍（浓度0.17mg/ml）后制得的阿尼芬净溶液作为供试品溶液进行干扰试验，结果见表12，反应结果均在0.5λ～2λ之间，试验结果符合要求。

表12 阿尼芬净干扰试验结果（0.17mg/ml）

实施例7 以阿尼芬净初溶液浓度为1.3mg/ml，稀释32倍（浓度0.04mg/ml）后制得的阿尼芬净溶液作为供试品溶液进行干扰试验，根据表1选择λ为0.06EU/ml的鲎试剂进行试验，结果见表13，反应结果均在0.5λ～2λ之间，试验结果符合要求。

表13 阿尼芬净干扰试验结果（浓度0.04mg/ml）

实施例8 阿尼芬净内毒素回收试验

阿尼芬净用四氢呋喃溶解制成初溶液，加入不等量内毒素标准溶液，用检查用水稀释32倍以上，制备含内毒素为2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的供试品溶液（溶液B），按照干扰试验的方法进行内毒素检查，考察内毒素的回收情况，用两个厂家λ为0.06EU/ml的鲎试剂进行试验，结果如表14所示。反应结果均在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ），回收结果符合要求，表明四氢呋喃对细菌内毒素的测定无影响。在阿尼芬净中加入四氢呋喃不会影响内毒素的检测，阿尼芬净初溶液用内毒素检查用水稀释32倍以上时，在不小于有效测试浓度下，选择相应的鲎试剂进行内毒素的检查无干扰作用。

表14 阿尼芬净初溶液加内毒素回收试验结果

实施例9 阿尼芬净细菌内毒素检查

取3批阿尼芬净原料药各22mg，用四氢呋喃溶解制成初溶液，用细菌内毒素检查用水稀释初溶液32倍，制成浓度不低于0.17mg/ml的供试品溶液。选择λ为0.25EU/ml的鲎试剂，按照凝胶法的试验方法进行检查，结果见表15。结果表明试验有效，3批样品的细菌内毒素检查均符合规定。

表15 阿尼芬净原料内毒素检查结果

以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (4)

1.一种阿尼芬净原料药细菌内毒素的检测方法，其特征在于该方法将阿尼芬净原料药用四氢呋喃溶解，制成阿尼芬净初溶液,再用细菌内毒素检查用水倍比稀释制备各灵敏度鲎试剂对应的阿尼芬净溶液，制成浓度为0.04mg/ml-0.34mg/ml的阿尼芬净溶液，然后参照《中国药典》2015年版四部1143细菌内毒素检查法中的凝胶法检查。

2.根据权利要求1所述的阿尼芬净原料药细菌内毒素的检测方法，其特征在于所述四氢呋喃用经0.22μm的除菌滤膜过滤。

3.根据权利要求1所述的阿尼芬净原料药细菌内毒素的检测方法，其特征在于所述阿尼芬净初溶液浓度为1.3mg/ml-11.0mg/ml。

4.根据权利要求1所述的阿尼芬净原料药细菌内毒素的检测方法，其特征在于该方法具体操作如下：

步骤一：阿尼芬净溶液制备:取阿尼芬净原料药，精密称定，加入经0.22μm的除菌滤膜过滤的四氢呋喃，使阿尼芬净充分溶解，制成浓度为1.3mg/ml-11.0mg/ml的溶液作为初溶液，用细菌内毒素检查用水倍比稀释32倍以上，制成浓度为0.04mg/ml-0.34mg/ml的阿尼芬净溶液；

步骤二：取灵敏度复核合格的λ为0.06 EU/ml -0.5 EU/ml的鲎试剂进行试验，每支鲎试剂用0.1ml检查用水复溶，8支试管，取2支加入0.1ml内毒素标准溶液（2λ），作为阳性对照，取2支加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照，2支加入0.1ml阿尼芬净溶液，2支加入0.1ml含2λ细菌内毒素的阿尼芬净溶液；

步骤三：轻轻混匀后封闭试管管口垂直放入36-38℃的恒温箱内保温58-62分钟，反应结束将试管从恒温箱中取出，缓缓倒转180°观察记录，试管内形成凝胶且不变形不从试管壁滑落者为阳性，未形成凝胶或形成凝胶不坚实、变形并从试管壁滑落者为阴性；

步骤四：结果判断：当阳性对照试管均为阳性，阴性对照试管为阴性，阿尼芬净溶液阳性试管为阳性，试验有效；阿尼芬净溶液2试管均为阴性时，阿尼芬净溶液内毒素符合规定，阿尼芬净溶液的2试管均为阳性时，则供试品不符合规定，若供试品溶液的2试管中一试管为阴性，一试管为阳性，需进行复试，复试时平行做4试管，若所有平行试管均为阴性，则阿尼芬净溶液符合规定，否则阿尼芬净溶液不符合规定。