CN110794140A - 一种难溶注射剂细菌内毒素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新的难溶注射剂细菌内毒素检测方法，检测方法如下：将难溶注射剂粉末溶解在与水不互溶的有机溶剂中，然后用细菌内毒素检查用水萃取有机相中的细菌内毒素，取水相溶液作为供试品溶液，采用凝胶法进行细菌内毒素检测。该方法有效解决了内毒素被样品包裹而不能全部释放的问题，且有机溶剂不干扰检测，对保证难溶性注射剂的安全性具有非常重要的意义。

Description

一种难溶注射剂细菌内毒素的检测方法

技术领域

本发明属于微生物检验领域，具体涉及一种难溶注射剂细菌内毒素的检测方法。

技术背景

无菌药品是指法定药品标准中列有无菌检查项目的制剂和原料药，包括无菌制剂和无菌原料药，产品的无菌绝不能只依赖于任何形式的最终处理或成品检验。细菌内毒素是注射剂药品中的主要污染物质。在注射剂产品开发中，为了保证患者用药安全，需对注射剂中细菌内毒素含量进行严格的控制。

细菌内毒素是热原的主要代表物质，内毒素大量进入血液就会引发热原反应，导致发热、白细胞反应、内毒素休克及扩散性血管内凝血等。凝胶法是2015版中国药典收录的细菌内毒素检查法之一，使用鲎试剂来定性检测内毒素。这种检测方法易操作、准确性好、实用性较强。采用凝胶法检测难溶注射剂中的细菌内毒素时，因难溶注射剂粉末不溶于细菌内毒素检查用水，内毒素不能完全检出，通常需开发专门的检测方法进行检测内毒素含量测定。

CN 109387638 A公开了一种参麦注射液内毒素检查方法，该专利中通过干扰预试验，确定供试品至少稀释16倍才能消除干扰，实现供试品检测，表明凝胶法适用于参麦注射液等注射剂产品细菌内毒素检测。然而，采用凝胶法进行难溶注射剂粉末细菌内毒素的检测时，样品几乎不溶于细菌内毒素检查用水，导致难溶注射剂粉末中包裹的细菌内毒素无法提取，故不能采用细菌内毒素检查用水直接溶解稀释的方法进行检测。

CN 103837673 A公开了一种检测难溶性盐酸溴己新原料的细菌内毒素含量的方法，该专利中通过用DMSO溶解盐酸溴己新粉末，进一步采用细菌内毒素检查用水稀释至1600倍制成盐酸溴己新供试液，实现细菌内毒素检查。然而，高浓度的DMSO会干扰鲎试剂凝集反应，使用DMSO溶解难溶性注射剂粉末后，必须继续使用细菌内毒素检查用水稀释至16倍以上，才能有效排除DMSO引起的假阴性干扰。因此，DMSO稀释法不适用于一些最大有效稀释倍数低于16倍和用DMSO也难以有效溶解的难溶性注射剂细菌内毒素的检测。

由于鲎试剂与内毒素的反应需在水溶液中进行，只有样品完全溶解才能确保被样品颗粒包裹的内毒素完全释放。因此，对于难溶注射剂粉末细菌内毒素的检测，需要新的方法以弥补现存方法的缺陷，实现难溶注射剂粉末中细菌内毒素限度控制。

发明内容

为了克服难溶注射剂粉末不溶于细菌内毒素检查用水，导致难溶性注射剂细菌内毒素检测难度较大的问题，本发明提供一种新的难溶注射剂细菌内毒素检测方法，检测方法如下：将难溶注射剂粉末溶解在有机溶剂中，然后用细菌内毒素检查用水萃取有机相中的细菌内毒素，取水相溶液作为供试品溶液，采用凝胶法进行细菌内毒素检测。

所述有机溶剂与水不互溶；进一步所述有机溶剂为卤代烷烃、未取代烷烃、芳香烃、醚、酯或其两种及以上混合溶剂；更进一步所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、乙醚、异丙醚、醋酸甲酯、醋酸乙酯或其两种及以上混合溶剂。

所述细菌内毒素检查用水的体积用量≤V，V＝m/c，m为难溶注射剂活性成分的质量，c为难溶注射剂活性成分最小有效稀释浓度，在高于最小有效稀释浓度下进行内毒素检测。

根据《中国药典》2015版，难溶注射剂最小有效稀释浓度c＝λ/L，λ为鲎试剂的标示灵敏度；L为供试品的细菌内毒素限值，L＝K/M。

本发明所述难溶注射剂细菌内毒素的检测方法，其难溶注射剂供试品溶液制备方法如下：将定量的难溶注射剂粉末用有机溶剂溶解，再加入细菌内毒素检查用水，漩涡数分钟，充分萃取有机溶剂中的细菌内毒素，静置分层，移取水相溶液，可选择性用细菌内毒素检查用水进一步稀释，制成供试品溶液，然后采用凝胶法对其进行细菌内毒素检测。所述有机溶剂与水不互溶，进一步所述有机溶剂为卤代烷烃、未取代烷烃、芳香烃、醚、酯或其两种及以上混合溶剂；更进一步所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、乙醚、异丙醚、醋酸甲酯、醋酸乙酯或其两种及以上混合溶剂。所述细菌内毒素检查用水的总体积用量≤V，V＝m/c，m为所取难溶注射剂粉末中活性成份的质量，c为该活性成分的最小有效稀释浓度。

另外本发明还提供了一种难溶注射剂细菌内毒素的检测方法，具体包括以下步骤：

a)难溶注射剂细菌内毒素限值L和最小有效稀释浓度c的确定；

b)鲎试剂灵敏度复核；

c)有机溶剂干扰实验：取适量有机溶剂，加入不同浓度的细菌内毒素标准溶液，充分混合，静置分层，移取水相溶液，可选择性用细菌内毒素检查用水进一步稀释，制成含2λ、λ、0.5λ、0.25λ细菌内毒素的溶液，进行有机溶剂干扰实验检测；

d)难溶注射剂干扰实验：将难溶注射剂粉末用有机溶剂溶解，加入不同浓度的细菌内毒素标准溶液和细菌内毒素检查用水，充分混合，静置分层，移取水相，可选择性用细菌内毒素检查用水进一步稀释，制成含2λ、λ、0.5λ和0.25λ内毒素标准品的难溶注射剂干扰溶液，进行难溶注射剂粉末干扰实验检测；

e)难溶注射剂粉末细菌内毒素检测：将难溶注射剂粉末溶解在有机溶剂中，然后用细菌内毒素检查用水萃取有机相中的细菌内毒素，取水相溶液，可选择性用细菌内毒素检查用水进一步稀释，作为难溶注射剂供试品溶液进行细菌内毒素检测；

所述步骤c)～e)中的检测采用凝胶法进行。

所述步骤c)～e)中的有机溶剂与水不互溶，进一步所述步骤c)～e)中有机溶剂为卤代烷烃、未取代烷烃、芳香烃、醚、酯或其两种及以上混合溶剂；更进一步所述步骤c)～e)中有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、乙醚、异丙醚、醋酸甲酯、醋酸乙酯或其两种及以上混合溶剂。

所述步骤e)中细菌内毒素检查用水的总体积用量≤V，V＝m/c，m为所述步骤e)中难溶注射剂粉末中活性成份的质量，c为该活性成分的最小有效稀释浓度。

所述步骤d)中难溶注射剂干扰溶液与所述步骤e)中难溶注射剂供试品溶液稀释倍数相同。

另外本发明还提供了一种难溶注射剂双羟萘酸多奈哌齐细菌内毒素的检测方法，具体包括以下步骤：

a)难溶注射剂双羟萘酸多奈哌齐细菌内毒素限值L和最小有效稀释浓度c的确定；

b)鲎试剂灵敏度复核；

c)有机溶剂干扰实验：取适量有机溶剂，加入不同浓度的细菌内毒素标准溶液，漩涡充分萃取有机溶剂中的细菌内毒素，静置分层，移取水相溶液，可选择性用细菌内毒素检查用水进一步稀释，制成含2λ、λ、0.5λ、0.25λ细菌内毒素的系列溶液进行有机溶剂干扰实验检测；

d)双羟萘酸多奈哌齐干扰实验：将双羟萘酸多奈哌齐用少量有机溶剂溶解，加入不同浓度的细菌内毒素标准溶液和细菌内毒素检查用水，漩涡充分萃取有机溶剂中的内毒素，静置分层，移取水相溶液，可选择性用细菌内毒素检查用水进一步稀释，制成含2λ、λ、0.5λ和0.25λ内毒素标准品的双羟萘酸多奈哌齐干扰溶液，然后进行双羟萘酸多奈哌齐干扰实验检测；

e)双羟萘酸多奈哌齐供试品溶液细菌内毒素检测：将与步骤d)相同质量的双羟萘酸多奈哌齐用与步骤d)相同体积的有机溶剂溶解，再加入细菌内毒素检查用水，漩涡充分萃取有机溶剂中的细菌内毒素，静置分层，移取水相溶液，可选择性用细菌内毒素检查用水进一步稀释，制成双羟萘酸多奈哌齐供试品溶液，然后进行细菌内毒素检测；

所述步骤c)～e)中的检测采用凝胶法进行。

所述步骤c)～e)中的有机溶剂与水不互溶，进一步所述步骤c)～e)中有机溶剂为卤代烷烃、未取代烷烃、芳香烃、醚、酯或其两种及以上混合溶剂；更进一步所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、乙醚、异丙醚、醋酸甲酯、醋酸乙酯或其两种及以上混合溶剂，优选二氯甲烷。

所述步骤e)中细菌内毒素检查用水的总体积用量≤V，V＝m/c，m为所述步骤e)中双羟萘酸多奈哌齐的质量，c为双羟萘酸多奈哌齐注射剂最小有效稀释浓度。

所述步骤d)中双羟萘酸多奈哌齐干扰溶液与所述步骤e)中双羟萘酸多奈哌齐供试品溶液稀释倍数相同。

本发明有益的技术效果是：采用二氯甲烷等有机溶剂将难溶注射剂粉末溶解后，再使用细菌内毒素检查用水萃取有机溶剂中的细菌内毒素进行检测，该方法可以有效提取难溶性注射剂中的细菌内毒素，实现难溶性注射剂细菌内毒素检测，而且采用的有机溶剂不干扰检测，避免了现有技术中有机溶剂干扰检测的问题，方法操作简便，准确性高，重现性好，对保证注射剂的安全性具有非常重要的意义。

具体实施方式

为了更充分理解本发明，特给出以下具体实施例，但本发明不限定于以下实施例。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动，如选取其他与内毒素检查用水不互溶的有机溶剂溶解难溶性注射剂，或其他与内毒素检查用水不互溶的有机溶剂的混合物溶解难溶性注射剂，或将本方法应用于需要其他难溶性粉末样品的细菌内毒素检测，都被视为包括在本发明内。

本发明中实施例均以双羟萘酸多奈哌齐难溶性注射剂粉末为例，其细菌内毒素限度计算如下：

双羟萘酸多奈哌齐为长效肌肉注射剂，根据临床前动物实验研究，2个月的药效需要主成份约789.47mg。根据细菌内毒素限度值公式L＝K/M计算其细菌内毒素限度值L＝5EU/(kg·h)*60kg*1h/789.47mg＝0.38EU/mg，为保用药安全，研究过程中将限值(L)缩小至0.18EU/mg。

根据公式c＝λ/L计算注射用双羟萘酸多奈哌齐最小有效稀释浓度，c＝0.06EU/mL/0.18EU/mg＝0.33mg/mL，干扰实验选择0.66mg/mL作为供试品溶液浓度。λ为鲎试剂的标示灵敏度，本发明中实施例均选用0.06EU/mL灵敏度的鲎试剂。

对比实施例1：

操作步骤为：移取DMSO 0.5mL，分别使用细菌内毒素检查用水稀释2、4、8、16和32倍，漩涡3min充分混匀，作为供试品溶液(溶液A)。同时用每个浓度的稀释液将细菌内毒素标准品稀释成含2λ的DMSO阳性对照溶液(系列溶液B)。取细菌内毒素对照品，用细菌内毒素检查用水稀释成2λ的细菌内毒素标准溶液，作为阳性对照溶液(溶液C)；细菌内毒素检查用水作为阴性对照溶液(溶液D)。

取24支无热原空安瓿，按要求排列在试管架上，各加入100μL鲎试剂溶液。根据表1，按鲎试剂灵敏度复核操作加样，37±1℃培养箱中培养60min，试验结果见下表1。鲎试剂(λ＝0.06EU/mL)：批号：J 3471 X，Charles river Endosafe。

表1

表1结果显示：溶液C均为阳性，溶液D均为阴性，说明试验有效；对比实施例1结果表明至少用细菌内毒素检查用水将DMSO溶液稀释16倍以上才能不干扰细菌内毒素检测。

对比实施例2：

根据上述细菌内毒素限度计算结果，双羟萘酸多奈哌齐长效注射剂细菌内毒素限度为＜0.18EU/mg，采用0.06EU/mL灵敏度的鲎试剂，最小有效稀释浓度为0.33mg/mL。

操作步骤为：称取21.12mg双羟萘酸多奈哌齐长效注射剂粉末，加入4mL DMSO，再加入4mL细菌内毒素检查用水，漩涡3min，12000rpm离心5min，移取上清液0.2mL至1.4mL细菌内毒素检查用水中，混匀30s，即得供试品溶液(即供试品溶液A)。

称取21.12mg双羟萘酸多奈哌齐长效注射剂粉末，加入4mL DMSO，再加入1mL不同浓度的细菌内毒素标准溶液，混匀。加入3mL细菌内毒素检查用水，漩涡3min，12000rpm离心5min，移取上清液0.2mL至1.4mL细菌内毒素检查用水中，即含2λ、λ、0.5λ、0.25λ细菌内毒素标准品的0.33mg/mL干扰试验溶液(即系列溶液B)。取细菌内毒素对照品，用细菌内毒素检查用水稀释成2λ、λ、0.5λ和0.25λ的细菌内毒素标准溶液，作为鲎试剂灵敏度对照系列溶液(溶液C)；细菌内毒素检查用水作为阴性对照溶液(溶液D)。鲎试剂(λ＝0.06EU/mL)：批号：J3471 X，Charles river Endosafe。

对比实施例2操作过程发现，4mL DMSO不能完全溶解21.12mg双羟萘酸多奈哌齐长效注射剂粉末。故将DMSO用量进一步提高，使用了20mL DMSO才使21.12mg双羟萘酸多奈哌齐长效注射剂粉末完全溶解，进一步采用细菌内毒素检查用水稀释3.2倍，即达到最小有效浓度0.33mg/mL。此时DMSO浓度较高，干扰鲎试剂凝集反应，即使采用最灵敏的凝胶法鲎试剂(0.03EU/mL)也不能进行内毒素检测。因此用DMSO溶解供试品进行供试品内毒素检测的方法不可行。

实施例1：

操作步骤为：移取二氯甲烷0.5mL，加入2.0mL细菌内毒素检查用水混匀，漩涡3min，充分萃取二氯甲烷中的内毒素，静置3min使溶液分层，移取水相溶液作为供试品溶液(溶液A)。

移取二氯甲烷0.5mL，分别加入2mL含320λ、80λ和2λ的细菌内毒素标准溶液，混匀，漩涡3min，使细菌内毒素在二氯甲烷和水相中充分分配，静置3min使溶液分层。移取水相溶液分别稀释成含2λ、λ、0.5λ、0.25λ细菌内毒素的供试品溶液(系列溶液B)。移取上述二氯甲烷层溶液适量，加入4倍体积细菌内毒素检查用水混匀，漩涡3min，充分萃取二氯甲烷中的内毒素，静置3min使溶液分层，移取水相溶液作为供试品溶液(溶液C)。

取细菌内毒素对照品，用细菌内毒素检查用水稀释成2λ、λ、0.5λ和0.25λ的细菌内毒素标准溶液，作为鲎试剂灵敏度对照溶液(系列溶液D)；细菌内毒素检查用水作为阴性对照溶液(溶液E)。

取66支无热原空安瓿，按要求排列在试管架上，各加入100μL鲎试剂溶液。根据表2，按鲎试剂灵敏度复核操作加样，37±1℃培养箱中培养60min，试验结果见下表2。鲎试剂(λ＝0.06EU/mL)：批号：J 3471 X，Charles river Endosafe。

表2

+：表示阳性；－：表示阴性；NA：表示不涉及。

如以上表2结果所示，为细菌内毒素分配系数考察的实验结果。溶液A均为阴性，表明二氯甲烷中未检出细菌内毒素，其质量符合要求；系列溶液D的实测灵敏度为0.5λ，表明鲎试剂灵敏度合格；溶液E均为阴性，表明器具和细菌内毒素检查用水合格；上述结果表明实验有效。溶液C均为阴性，系列溶液D与系列溶液B的实测灵敏度均为0.5λ，表明二氯甲烷层溶解的细菌内毒素含量很低，不同浓度的细菌内毒素均主要分配在水相中，回收率约100％。因此，采用二氯甲烷溶解后用细菌内毒素检查用水萃取的方法，可以有效提取水相中的细菌内毒素。

细菌内毒素为脂多糖类化合物，易溶于水，但在二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、乙醚、异丙醚、醋酸甲酯、醋酸乙酯等溶剂中溶解度较低，因此细菌内毒素主要分配在水相中。但方法开发时依然推荐参照本实施例，通过实验评估细菌内毒素在水相和有机相中的分配比例，进而制定符合药典规定的稀释方法。

实施例2：

操作步骤为：称取21.12mg双羟萘酸多奈哌齐长效注射剂粉末，加入1mL二氯甲烷溶解，再加入4mL细菌内毒素检查用水萃取溶液中的内毒素，漩涡3min，充分萃取二氯甲烷中的内毒素，静置3min使溶液分层，移取水相溶液用细菌内毒素检查用水稀释8倍，即得供试品溶液(即供试品溶液A)。

称取21.12mg双羟萘酸多奈哌齐长效注射剂粉末，加入1mL二氯甲烷溶解，再加入0.2mL不同浓度的细菌内毒素标准溶液，混匀。加入3.8mL细菌内毒素检查用水萃取溶液中的内毒素，漩涡3min，充分萃取二氯甲烷中的内毒素，静置3min使溶液分层，移取水相溶液适量，用细菌内毒素检查用水稀释8倍，制成含2λ、λ、0.5λ、0.25λ细菌内毒素标准品的干扰试验溶液(即系列溶液B)。取细菌内毒素对照品，用细菌内毒素检查用水稀释成2λ、λ、0.5λ和0.25λ的细菌内毒素标准溶液，作为鲎试剂灵敏度对照系列溶液(系列溶液C)；细菌内毒素检查用水作为阴性对照溶液(溶液D)。

移取1mL二氯甲烷和0.2mL细菌内毒素检查用水，置漩涡混合器上混匀30s，再加入3.8mL细菌内毒素检查用水，漩涡3min，充分萃取二氯甲烷中的内毒素，静置3min使溶液分层，取水相溶液，即得阴性对照溶液(溶液E)。移取1mL二氯甲烷和0.2mL 320λ细菌内毒素标准品溶液，置漩涡混合器上混匀30s，再加入3.8mL细菌内毒素检查用水，漩涡3min，充分萃取二氯甲烷中的内毒素，静置3min使溶液分层，取水相溶液，用细菌内毒素检查用水稀释8倍，制成2λ阳性对照溶液(溶液F)

取38支无热原空安瓿，按要求排列在试管架上，各加入100μL鲎试剂溶液。根据表3，按鲎试剂灵敏度复核操作加样。37±1℃培养箱中培养60min，试验结果见下表3。鲎试剂(λ＝0.06EU/mL)：批号：J 3471 X，Charles river Endosafe。

表3

+：表示阳性；－：表示阴性；NA：表示不涉及。

如以上表3结果所示，为一组方法验证实验结果。溶液A均为阴性，表明实施例2中所用双羟萘酸多奈哌齐长效注射剂粉末中未检出细菌内毒素，其质量符合要求；系列溶液C的实测灵敏度为0.5λ，表明鲎试剂灵敏度合格；溶液D均为阴性，表明器具和细菌内毒素检查用水等均合格；溶液C的实测灵敏度均为0.5λ，表明鲎试剂灵敏度合格；溶液E均为阴性，表明二氯甲烷中未检出细菌内毒素，其质量符合要求；溶液F均为阳性，表明萃取过程不干扰鲎试剂凝集反应；系列溶液B实测灵敏度为1.7λ，在[0.5λ，2λ]之间，因此判断采用本实施例的方法稀释供试品溶液，干扰较小，可采用本法对此供试品进行细菌内毒素检查。

实施例3：

操作步骤为：取三个不同批次的双羟萘酸多奈哌齐长效注射剂粉末，分别按如下方法配制。配制供试品溶液(溶液A)，含2λ内毒素标准品的供试品阳性对照溶液(溶液B)2支，同时做2支含2λ细菌内毒素标准品的细菌内毒素检查用水溶液作为阳性对照(溶液C)和2支细菌内毒素检查用水作为阴性对照(溶液D)。

称取21.12mg的双羟萘酸多奈哌齐长效注射剂粉末，加入1mL二氯甲烷溶解，再加入4mL细菌内毒素检查用水萃取溶液中的内毒素，漩涡3min，充分萃取二氯甲烷中的内毒素，静置3min使溶液分层，移取水相溶液适量，加7倍体积的细菌内毒素检查用水稀释，即得供试品溶液(即供试品溶液A)。称取21.12mg的双羟萘酸多奈哌齐长效注射剂粉末，加入1mL二氯甲烷溶解，加入0.2mL 320λ细菌内毒素标准品溶液，置漩涡混合器上混匀30s，再加入3.8mL细菌内毒素检查用水，漩涡3min，充分萃取二氯甲烷中的内毒素，静置3min使溶液分层，移取水相溶液适量，加7倍体积的细菌内毒素检查用水稀释，即的含2λ内毒素标准品的供试品阳性对照溶液(即溶液B)。含2λ细菌内毒素标准品的细菌内毒素检查用水溶液作为阳性对照溶液(溶液C)。细菌内毒素检查用水作为阴性对照溶液(溶液D)。

取24支无热原空安瓿，按要求排列在试管架上，各加入100μL鲎试剂溶液。根据表4，按鲎试剂灵敏度复核操作加样。37±1℃培养箱中培养60min，记录结果，见下表4。鲎试剂(λ＝0.06EU/mL)：批号：J 3471 X，Charles river Endosafe。

表4

+：表示阳性；－：表示阴性。

以上表4结果说明：阳性对照及供试品阳性对照溶液都为阳性，阴性对照溶液都为阴性，说明该实验有效；同时，供试品管均为阴性，说明供试品的细菌内毒素检测结果符合规定。

根据表2～4结果可知，采用二氯甲烷将双羟萘酸多奈哌齐长效注射剂粉末溶解，细菌内毒素检查用水进行萃取检测供试品细菌内毒素含量，准确性高，重现性好，表明本法适用于双羟萘酸多奈哌齐长效注射剂粉末中细菌内毒素限度控制。

Claims (10)

1.一种难溶注射剂细菌内毒素的检测方法，其特征在于：将难溶注射剂粉末溶解在有机溶剂中，然后用细菌内毒素检查用水萃取有机相中的细菌内毒素，取水相溶液作为供试品溶液，采用凝胶法进行细菌内毒素检测；所述有机溶剂与水不互溶。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述有机溶剂为卤代烷烃、未取代烷烃、芳香烃、醚、酯或其两种及以上混合溶剂；优选有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、乙醚、异丙醚、醋酸甲酯、醋酸乙酯或其两种及以上混合溶剂。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述细菌内毒素检查用水的体积用量≤V，V＝m/c，m为所述难溶注射剂活性成分的质量，c为所述难溶注射剂活性成分的最小有效稀释浓度。

4.一种难溶注射剂细菌内毒素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)难溶注射剂细菌内毒素限值L和最小有效稀释浓度c的确定；

b)鲎试剂灵敏度复核；

c)有机溶剂干扰实验：取适量有机溶剂，加入不同浓度的细菌内毒素标准溶液，充分混合，静置分层，移取水相溶液，可选择性用细菌内毒素检查用水进一步稀释，制成含2λ、λ、0.5λ、0.25λ细菌内毒素标准品的溶液，进行有机溶剂干扰实验检测；

d)难溶注射剂干扰实验：将难溶注射剂粉末用有机溶剂溶解，加入不同浓度的细菌内毒素标准溶液和细菌内毒素检查用水，充分混合，静置分层，移取水相溶液，可选择性用细菌内毒素检查用水进一步稀释，制成含2λ、λ、0.5λ和0.25λ内毒素标准品的难溶注射剂干扰溶液，进行难溶注射剂粉末干扰实验检测；

e)难溶注射剂粉末细菌内毒素检测：将难溶注射剂粉末溶解在有机溶剂中，然后用细菌内毒素检查用水萃取有机相中的细菌内毒素，取水相溶液，可选择性用细菌内毒素检查用水进一步稀释，制成难溶注射剂供试品溶液进行细菌内毒素检测；

所述步骤c)～e)中的检测采用凝胶法进行；

所述步骤c)～e)中的有机溶剂与水不互溶。

5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述步骤c)～e)中有机溶剂为卤代烷烃、未取代烷烃、芳香烃、醚、酯或其两种及以上混合溶剂；优选为二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、乙醚、异丙醚、醋酸甲酯、醋酸乙酯或其两种及以上混合溶剂。

6.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述步骤e)中细菌内毒素检查用水的总体积用量≤V，V＝m/c，m为所述步骤e)中难溶注射剂粉末中活性成份的质量，c为该活性成分的最小有效稀释浓度。

7.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述步骤d)中难溶注射剂干扰溶液与所述步骤e)中难溶注射剂供试品溶液稀释倍数相同。

8.一种难溶注射剂双羟萘酸多奈哌齐细菌内毒素的检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

a)难溶注射剂双羟萘酸多奈哌齐细菌内毒素限值L和最小有效稀释浓度c的确定；

b)鲎试剂灵敏度复核；

c)有机溶剂干扰实验：取适量有机溶剂，加入不同浓度的细菌内毒素标准溶液，漩涡充分萃取有机溶剂中的细菌内毒素，静置分层，移取水相溶液，可选择性用细菌内毒素检查用水进一步稀释，制成含2λ、λ、0.5λ、0.25λ细菌内毒素的系列溶液进行有机溶剂干扰实验检测；

d)双羟萘酸多奈哌齐干扰实验：将双羟萘酸多奈哌齐用少量有机溶剂溶解，加入不同浓度的细菌内毒素标准溶液和细菌内毒素检查用水，漩涡充分萃取有机溶剂中的内毒素，静置分层，移取水相溶液，可选择性用细菌内毒素检查用水进一步稀释，制成含2λ、λ、0.5λ和0.25λ内毒素标准品的双羟萘酸多奈哌齐干扰溶液，然后进行双羟萘酸多奈哌齐干扰实验检测；

e)双羟萘酸多奈哌齐供试品溶液细菌内毒素检测：将与步骤d)相同质量的双羟萘酸多奈哌齐用与步骤d)相同体积的有机溶剂溶解，再加入细菌内毒素检查用水，漩涡充分萃取有机溶剂中的细菌内毒素，静置分层，移取水相溶液，可选择性用细菌内毒素检查用水进一步稀释，制成双羟萘酸多奈哌齐供试品溶液，然后进行细菌内毒素检测；

所述步骤c)～e)中的检测采用凝胶法进行，

所述步骤c)～e)中的有机溶剂与水不互溶。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述步骤c)～e)中有机溶剂为卤代烷烃、未取代烷烃、芳香烃、醚、酯或其两种及以上混合溶剂；优选有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、乙醚、异丙醚、醋酸甲酯、醋酸乙酯或其两种及以上混合溶剂；更优选有机溶剂为二氯甲烷。

10.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述步骤e)中细菌内毒素检查用水的总体积用量≤V，V＝m/c，m为所述步骤e)中双羟萘酸多奈哌齐的质量，c为双羟萘酸多奈哌齐注射剂最小有效稀释浓度；所述步骤d)中双羟萘酸多奈哌齐干扰溶液与步骤e)中所述双羟萘酸多奈哌齐供试品溶液稀释倍数相同。