CN103063593B - 一种人抗凝血酶-ⅲ浓缩物中肝素含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人抗凝血酶-Ⅲ浓缩物中肝素含量的测定方法，其特征是包括待测样品的处理、标准曲线的制作与样品的测定三个部分。待测样品的处理方法为稀释与加热处理，标准曲线的制作与样品的测定采用微量发色底物法。发明有益效果是：利用微量发色底物法进行测定，具有灵敏度高，操作简单、省时，检测所需试剂用量小等优点；通过60~80℃加热处理待检样品抗凝血酶-Ⅲ浓缩物20~50min，能够灭活待检样品中对结果造成很大影响的抗凝血酶-Ⅲ成分，但不会对肝素的活性产生影响，提高了测定结果的准确性；采用绘制标准曲线计算结果，稳定性、准确性高。

Description

一种人抗凝血酶-Ⅲ浓缩物中肝素含量的测定方法

技术领域

本发明属于生物学检测技术领域，具体涉及一种人抗凝血酶-Ⅲ浓缩物中肝素含量的测定方法。

背景技术

人抗凝血酶-Ⅲ（antithrombin-Ⅲ，AT-Ⅲ）浓缩物是从人血浆中分离纯化得到的血浆蛋白制品，主要用于治疗各种原因引起的抗凝血酶-Ⅲ缺乏症及手术造成的血栓等。目前，抗凝血酶-Ⅲ的纯化制备工艺以利用肝素亲和层析为主要步骤，在纯化的过程中，会发生层析填料中的肝素脱落，因此，要对抗凝血酶-Ⅲ浓缩物中的肝素含量进行检测。欧洲药典第7版（European Pharmacopoeia 7.0，EP7.0）和美国药典第32版（United States Pharmacopeia 32，USP32）对抗凝血酶-Ⅲ浓缩物的要求为每国际单位（IU）抗凝血酶-Ⅲ中肝素含量不超过0.1IU。

目前肝素的含量测定多采用凝固法和发色底物法，其检测基本原理均基于肝素与抗凝血酶-Ⅲ结合能够灭活凝血因子或抑制凝血反应。欧洲药典第7版中列出的抗凝血酶-Ⅲ中肝素测定方法有两种，一种为发色底物法，利用肝素-抗凝血酶复合物能够抑制活化的凝血因子Ⅹ水解发色底物的显色反应的基本原理，以已知含量肝素标准品作为参照，检测标准品及待测样品反应结果的吸光值（OD.405），通过绘制标准曲线计算待测样品中肝素的含量；另一种为凝固法，该方法是通过观察在一定条件下样品对血浆与高岭土、脑磷脂混合物复钙化后的抗凝作用（凝固时间），来判断待测样品的肝素含量。美国药典第32版对肝素含量的测定采用发色底物法，其原理与欧洲药典相同，但该法是以已知含量肝素和抗凝血酶-Ⅲ标准品的溶液作为标准溶液，待测样品肝素含量是通过与标准溶液反应结果比对得到。

凝固法操作复杂、耗时，发色底物法具有灵敏度高，操作简单、省时，检测所需试剂用量小等优点。在发色底物法中，绘制标准曲线计算结果的方式较采用的单一对比计算具有更高的稳定性和准确性。由于待测样品的特殊性，与肝素标准品相比，其含大量抗凝血酶-Ⅲ，在测定反应中会促进对凝血因子的灭活反应，进而影响测定结果的准确性。

中国药典（2010版）第三部中采用的肝素含量测定法为凝固法，以血浆与高岭土、脑磷脂混合物复钙化后的凝固反应为检测体系，利用硫酸鱼精蛋白能够中和肝素从而影响检测体系凝固时间为原理进行测定，但该方法并不适用于抗凝血酶-Ⅲ浓缩物。截至目前，还没有相关专门针对抗凝血酶-Ⅲ浓缩物中肝素含量检测方法的研究报道。

发明内容

发明目的：本发明目的在于针对以上所述测定技术中存在的样品抗凝血酶-Ⅲ的干扰大、测定准确性不高等技术问题，提出一种新的抗凝血酶-Ⅲ浓缩物中肝素含量的测定方法。首先根据肝素具有比抗凝血酶-Ⅲ热耐受性高的特点，设计采用高温加热处理的方法使待测样品中抗凝血酶-Ⅲ失活，进而消除其对测定结果的影响；其次，采用微量发色底物法，通过绘制标准曲线，对待测样品肝素含量进行计算。

本发明所采用的技术方案为：

一种人抗凝血酶-Ⅲ浓缩物中肝素含量的测定方法，包括待测样品的处理、标准曲线的制作与样品的测定三个部分。其操作步骤为： 

1、待测样品的处理：

用0.02mol/L Tris缓冲液（pH8.4）将已知效价的抗凝血酶-Ⅲ浓缩物样品稀释至抗凝血酶-Ⅲ浓度为1IU/ml，60~80℃高温水浴处理20~50min。

2、标准曲线的制作与样品的测定：

（1）用Tris缓冲液pH8.4将已知效价的肝素标准品稀释至0~0.1IU/ml的已知浓度，作为标准溶液；

（2）取四种或四种以上不同浓度肝素标准溶液及处理后的待测样品溶液一定体积于微孔板不同孔中；

（3）每孔加入等体积0.5~2.0IU/ml 抗凝血酶-Ⅲ标准溶液，混合均匀，37℃孵育2分钟；

（4）每孔加入等体积活化的牛凝血因子Ⅹ溶液即牛FⅩa溶液，混合均匀，37℃孵育2分钟；

（5）每孔加入等体积发色底物N-α-苄氧羰基- D-精氨酰- L-甘氨酰-L-精氨酸-P-硝基苯胺的盐酸盐溶液即S-2765溶液，混合均匀，37℃孵育2分钟；

（6）每孔加入适量乙酸，混合均匀终止反应；

（7）将微孔板直接在酶标仪上于波长405 nm处读取吸光值；

（8）根据肝素标准溶液浓度与测得的相应吸光值绘制标准曲线；

（9）以待测溶液反应产物吸光值根据标准曲线计算每国际单位人抗凝血酶-Ⅲ溶液中肝素的含量。

Tris：是Tris(Hydroxymethyl)aminomethane的常用缩写；中文品名：三羟甲基氨基甲烷。

IU ：是International unit的常用缩写，是用生物活性来表示某些蛋白质、抗生素、激素、维生素及抗毒素量的药学单位。

IU/ml：是单位体积（ml）中所含的生物活性量。

本发明有益效果是：1、利用微量发色底物法进行测定，具有灵敏度高，操作简单、省时，检测所需试剂用量小等优点；2、采用绘制标准曲线计算结果的方式较单一对比计算，稳定性、准确性更高；3、本发明以60~80℃高温处理待检样品抗凝血酶-Ⅲ浓缩物20~50min，能够灭活待检样品中对结果造成很大影响的抗凝血酶-Ⅲ成分，但不会对肝素的活性产生影响，提高了测定结果的准确性。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明所述的测定法做进一步的描述。

实施例1：测定抗凝血酶-Ⅲ溶液中肝素的含量（采用不同温度加热处理）

1、待测样品的处理：

（1）待测样品准备：取人抗凝血酶-Ⅲ和肝素标准品，配制3种含不同浓度肝素的人抗凝血酶-Ⅲ溶液，其中人抗凝血酶-Ⅲ的浓度均为1IU/ml，肝素含量分别为0.02、0.04和0.05IU/ml；

（2）将配制的3种待测样品分别分为四组：对照组、60℃热处理组、70℃热处理组和80℃热处理组。对照组溶液不经任何处理，三个热处理组溶液分别于60℃、70℃和80℃三种不同温度条件下孵育30min。

2、标准曲线的制作与样品的测定：

（1）用Tris缓冲液（pH8.4）将已知效价的肝素标准品稀释为0.0125、0.025、0.05、0.1IU/ml的作为标准溶液；

（2）取标准溶液及待测样品溶液40μl于微孔板不同孔中；

（3）每孔加入等体积0.5IU/ml 抗凝血酶-Ⅲ标准溶液，混合均匀，37℃孵育2分钟；

（4）每孔加入等体积牛FⅩa溶液，混合均匀，37℃孵育2分钟；

（5）每孔加入等体积发色底物S-2765溶液，混合均匀，37℃孵育2分钟；

（6）每孔加入40μl乙酸，混合均匀终止反应；

（7）将微孔板直接在多功能酶标仪上于波长405nm处读取吸光值；

（8）根据肝素标准溶液浓度与测得的相应吸光值绘制标准曲线；

（9）以待测溶液反应产物吸光值根据标准曲线计算每国际单位人抗凝血酶-Ⅲ溶液中肝素的含量；

（10）重复以上方法，对制备的待测样品进行3次重复试验，结果求均值。

根据对本实施例所制备样品的测定数据，经计算，测定结果见表1。

表1数据表明未经热孵育处理的不同肝素浓度的待测样品，肝素测定结果平均值分别为0.0413、0.0591和0.0671IU/ml，测定值远大于实际含量，而经60℃、70℃和80℃三种不同温度条件下孵育30min后的样品，不同肝素浓度的待测样品测定结果的平均值都接近其肝素含量的实际值，且标准偏差较小。说明本发明提出的对样品进行60~80℃热孵育处理后，通过后续检测步骤，能够更精确测定含有不同浓度肝素的人抗凝血酶-Ⅲ溶液中肝素的含量。

表1. 测定抗凝血酶-Ⅲ溶液中肝素的含量（采用不同温度加热处理）

*n =4 ，mean±SD含义为：平均数±标准差。标准差（Standard Deviation，SD），是各数据偏离平均数的距离的平均数，它是离均差平方和平均后的方根，能反映一个数据集的离散程度。在本实施例中标准差（Standard Deviation，SD）可表示实验重复性的优劣，标准差越大说明重复性越差，标准差越小说明重复性越好。

**IU/IU AT-Ⅲ 表示每国际单位人抗凝血酶-Ⅲ溶液中肝素的含量。

实施例2：测定抗凝血酶-Ⅲ溶液中肝素的含量（采用不同加热处理时间）

1、待测样品的处理：

（1）待测样品准备：取人抗凝血酶-Ⅲ和肝素标准品，配制含肝素的人抗凝血酶-Ⅲ溶液，其中人抗凝血酶-Ⅲ的浓度均为1IU/ml，肝素含量为0.05IU/ml；

（2）将配制的待测样品分为两份，并分别分为A、B、C三组，第一份中的三组分别于60℃（A）、70℃（B）和80℃（C）三种不同温度条件下孵育20min；第二份中的三组分别于60℃（A）、70℃（B）和80℃（C）三种不同温度条件下孵育50min。

2、标准曲线的制作与样品的测定：

（1）用Tris缓冲液（pH8.4）将已知效价的肝素标准品稀释至0、0.025、0.05、0.1IU/ml作为标准溶液；

（2）取肝素标准溶液及待测样品溶液50μl于微孔板不同孔中；

（3）每孔加入等体积2IU/ml 抗凝血酶-Ⅲ标准溶液，混合均匀，37℃孵育2分钟；

（4）每孔加入等体积牛FⅩa溶液，混合均匀，37℃孵育2分钟；

（5）每孔加入等体积发色底物S-2765溶液，混合均匀，37℃孵育2分钟；

（6）每孔加入50μl乙酸，混合均匀终止反应；

（7）将微孔板直接在多功能酶标仪上于波长405 nm处读取吸光值；

（8）根据肝素标准溶液浓度与测得的相应吸光值绘制标准曲线；

（9）以待测溶液反应产物吸光值根据标准曲线计算每国际单位人抗凝血酶-Ⅲ溶液中肝素的含量；

（10）重复以上方法，对制备的待测样品进行3次重复试验，结果求均值。

根据对本实施例所制备样品的测定数据，经计算，测定结果见表2。

表2数据表明，经60℃、70℃和80℃三种不同温度条件下孵育20min或50min后的样品，肝素测定结果的平均值都接近待测样品中肝素的实际含量，且标准偏差较小。说明本发明提出的样品处理条件：60~80℃热孵育处理20~50min，加上后续检测步骤，能够精确测定人抗凝血酶-Ⅲ溶液中肝素的含量。

表2. 测定抗凝血酶-Ⅲ溶液中肝素的含量（采用不同加热处理时间）

*n=4 ，mean±SD含义为：平均数±标准差。

**表示每国际单位人抗凝血酶-Ⅲ溶液中肝素的含量。

实施例3：测定抗凝血酶-Ⅲ浓缩物中肝素的含量

1、待测样品的处理：

待测样品准备：取利用肝素亲和层析法纯化得到的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩物，其浓度按照美国药典第32版方法进行测定，并准确稀释到1IU/ml，稀释后的样品分为三份，分别于60℃、70℃和80℃三种不同温度条件下孵育30min。

2、标准曲线的制作与样品的测定：

（1）用Tris缓冲液（pH8.4）将已知效价的肝素标准品稀释至0、0.0125、0.025、0.05、0.1IU/ml作为标准溶液；

（2）取肝素标准溶液及三种待测样品溶液40μl于微孔板不同孔中；

（3）每孔加入等体积1IU/ml 抗凝血酶-Ⅲ标准溶液，混合均匀，37℃孵育2分钟；

（4）每孔加入等体积牛FⅩa溶液，混合均匀，37℃孵育2分钟；

（5）每孔加入等体积发色底物S-2765溶液，混合均匀，37℃孵育2分钟；

（6）每孔加入40μl乙酸，混合均匀终止反应；

（7）将微孔板直接在多功能酶标仪上于波长405 nm处读取吸光值；

（8）根据肝素标准溶液浓度与测得的相应吸光值绘制标准曲线；

（9）以待测溶液反应产物吸光值根据标准曲线计算每国际单位人抗凝血酶-Ⅲ溶液中肝素的含量。

根据对本实施例样品的测定数据，经统计计算，测定结果见表3。

表3数据表明，待测定样品每国际单位人抗凝血酶-Ⅲ溶液中肝素的含量为0.0276 IU/ml，标准偏差为±0.0026，可见，本发明方法的重复试验精度比较理想。

附表3. 待测样品肝素含量测定

*表示每国际单位人抗凝血酶-Ⅲ溶液中肝素的含量。

Claims (1)

1.一种人抗凝血酶-Ⅲ浓缩物中肝素含量的测定方法，其特征是包括待测样品的处理、标准曲线的制作与样品的测定三个部分;其操作步骤为： 

、待测样品的处理：

用0.02mol/L Tris缓冲液（pH8.4）将已知效价的抗凝血酶-Ⅲ浓缩物样品稀释至抗凝血酶-Ⅲ浓度为1IU/ml，60~80℃高温水浴处理20~50min;

、标准曲线的制作与样品的测定：

a用Tris缓冲液pH8.4将已知效价的肝素标准品稀释至0~0.1IU/ml的已知浓度，作为标准溶液；

b取四种或四种以上不同浓度肝素标准溶液及处理后的待测样品溶液一定体积于微孔板不同孔中；

c每孔加入等体积0.5~2.0IU/ml 抗凝血酶-Ⅲ标准溶液，混合均匀，37℃孵育2分钟；

d每孔加入等体积活化的牛凝血因子Ⅹ溶液即牛FXa溶液，混合均匀，37℃孵育2分钟；

e每孔加入等体积发色底物N-α-苄氧羰基- D-精氨酰- L-甘氨酰-L-精氨酸-P-硝基苯胺的盐酸盐溶液即S-2765溶液，混合均匀，37℃孵育2分钟；

f每孔加入适量乙酸，混合均匀终止反应；

g将微孔板直接在酶标仪上于波长405 nm处读取吸光值；

h根据肝素标准溶液浓度与测得的相应吸光值绘制标准曲线；

i以待测溶液反应产物吸光值根据标准曲线计算每国际单位人抗凝血酶-Ⅲ溶液中肝素的含量。