CN110724701A - 低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法，其包括如下步骤：分别获得南极磷虾胰蛋白酶的2个亚型和对照组南美白对虾胰蛋白酶；分别构建南极磷虾胰蛋白酶亚型和南美白对虾胰蛋白酶的原核表达载体；将南极磷虾胰蛋白酶亚型的原核表达载体和南美白对虾胰蛋白酶的原核表达载体分别进行提取、纯化和复性；分别对纯化后的南极磷虾胰蛋白酶和南美白对虾胰蛋白酶进行酶活测定；预测南极磷虾胰蛋白酶亚型基因的正选择位点并进行突变，然后进行酶活测定；本发明通过定点突变技术对南极磷虾胰蛋白酶功能位点进行突变，验证了南极磷虾胰蛋白酶在低温下发挥稳定催化活性的位点所在，阐释了南极磷虾胰蛋白酶在低温下发挥较高催化活性的特点。

Description

低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法
技术领域
本发明属于海洋动物源性蛋白酶功能挖掘技术领域，具体涉及一种低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法。
背景技术
胰蛋白酶(Trypsin)是从动物胰脏中提取的一种丝氨酸蛋白水解酶，主要在脊椎动物消化系统中起作用，是人和动物肠道中必不可少的消化性蛋白酶。同时，胰蛋白酶也存在于放线菌、蚕等生物体内。胰蛋白酶对于甲壳动物的蜕皮与提高免疫力方面起重要作用。牛或猪胰腺中的胰蛋白酶一直被用作人类和动物临床试验的治疗药物。迄今为止，蛋白水解酶已经广泛应用在工业、食品、生物医药等领域。医药领域主要用于以下方面：(1)作为一些胃肠疾病的口服药物；(2)作为局部清除或溶解引起疾病的蛋白质物质集合的药物；(3)作为抗炎药物；(4)作为治疗血栓栓塞性疾病的溶栓药物。
当前，胰蛋白酶在工业、医药领域应用广泛，主要以哺乳动物与植物为来源的中温胰蛋白酶制品为主，例如猪、牛、羊胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。这些胰蛋白酶主要在65℃左右活性最稳定。
生活在南极极端寒冷环境下的南极磷虾Antarctic krill和Euphausia superba，生活温度从-1.7℃至-3℃，是南极生态系统中的关键物种。因其庞大的生物量，在南极海域生物链中以细菌、藻类与微型浮游动物为食，同时也是顶级捕食者的猎物，在南极生态系统中占据重要地位。从适温性动物体内分离到的胰蛋白酶，通常在60℃左右水解活性最强。最近的研究发现，适应低温的生物需要专门的酶来维持低温下的功能完整性，而适冷生物体内的酶相较于适温性动物在低温下具有更高的活性和催化效率。
冷适应性胰蛋白酶在生物医药等领域的应用鲜有报道，研究较多的为大西洋鳕鱼胰蛋白酶在生物医学中的研究，但目前还大都处于临床实验阶段。在一项临床试验中发现，大西洋鳕胰蛋白酶被发现可以有效地减少压疮的体积，表明其对生物体创口愈合有一定疗效。另外，大西洋鳕胰蛋白酶可以降解病原菌表面蛋白，其原理为大西洋鳕胰蛋白酶可能分解和消化细菌表面蛋白，这些蛋白对生物膜的形成及维持其完整性至关重要。该胰蛋白酶因此被认为具有抗病原菌的作用。未来的研究主要以天然形式的大西洋鳕胰蛋白酶仍是该酶的重要来源，而重组胰蛋白酶的大规模生产仍将继续。
近年来，以大西洋鳕胰蛋白酶为代表的冷适应蛋白酶的开发和利用得到广泛研究。在4℃(72小时)，25℃(24小时)，37℃(3小时)三个温度下，对大西洋鳕胰蛋白酶和牛胰蛋白酶降解4种底物(溶酶菌、乳铁蛋白、牛血清蛋白、肌红蛋白)的能力进行比较，结果显示大西洋鳕胰蛋白酶降解底物的能力是牛胰蛋白酶的3倍至13倍。大西洋鳕胰蛋白酶的活性在55℃最稳定，相较于中温性酶催化温度更低。
目前，胰蛋白酶的应用主要存在以下缺点：
(1)、现代工业与医疗领域主要以哺乳动物来源的蛋白酶作为酶制剂，这些酶只能在较高温度发挥较大水解酶的作用，最适酶活温度都在55℃以上，而细菌污染在较高的温度下容易发生，若将其应用于低温条件下，酶活性会大幅降低。
(2)、对于生物医药领域，传统应用的胰蛋白酶制剂的抗菌、抗病毒和对伤口的愈合效果一般，且低温要求时，由于酶活力降低导致酶使用量增加，浓度升高，成本较高。
(3)、大西洋鳕胰蛋白酶是目前研究和应用最为广泛的冷适应酶，在低温下其催化能力显著高于牛胰蛋白酶。但是也很难满足一些更低温下水解底物的要求。
(4)、目前，对应用前景很大的南极磷虾胰蛋白酶的研究还不完善，虽然通过测序获得了编码南极磷虾胰蛋白酶基因的6个亚型的序列，但仅限于对其空间结构进行预测和分析，这对于高效冷适应性胰蛋白酶的生产和应用指导意义不足，还需要进一步开发更高效、节约成本的胰蛋白酶。
有研究报道，南极磷虾的冷适应能力部分是由于其体内蛋白酶的分子适应策略，以维持较高的催化效率，而大约40％的催化效率来源于胰蛋白酶的作用，加之南极磷虾生物量庞大，所以具有广阔的医疗和工业前景。欧洲一些国家已经将磷虾酶制品用于医学上伤口愈合、轻工业洗涤剂制造等方面；而对南极磷虾胰蛋白酶适应寒冷环境的具体分子机制还未见报道。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明通过生物信息学分析得到正选择位点，通过实验定点突变技术进行突变，然后与野生型的酶活相比，突变后的正选择位点的活性显著降低，从而验证了这9个正选择位点(也可以说是9个适应性进化位点)确实是南极磷虾胰蛋白酶发挥催化活性的关键位点。
本发明的首要目的是提供一种低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法。
本发明的第二个目的是提供上述的南极磷虾胰蛋白酶的用途。
南极磷虾体内包含多种蛋白水解酶，目前的研究已经证明从南极磷虾体内分离得到的蛋白水解酶对坏死组织有降解作用，可以作为清创剂用于医疗。Zhou等人通过对南极磷虾胰蛋白酶的转录组测序，得到了编码南极磷虾胰蛋白酶基因的6个亚型的cDNA全长序列，通过对基因序列预测得到胰蛋白酶的三级结构，推测了南极磷虾胰蛋白酶在低温下的几种分子适应策略；另有研究证明，Tian等人发现，南极磷虾胰蛋白酶的最适催化温度在40℃左右。
具体地，1、低温下的食品加工可以最大限度地减少不良的化学反应和细菌污染，而细菌污染在较高的温度下确实会升高，寻找低温下高催化活性的胰蛋白酶的意义重大。
2、此外，冷适应蛋白水解酶在大多数情况下更经济，因为它们的催化效率高，与类似作用的适温性蛋白水解酶相比，只需少量的酶即可。例如，鳕鱼胰蛋白酶在降解大型天然蛋白质方面的效率是适温性类似物牛胰蛋白酶的3-12倍。在生物医学方面，在12种不同的蛋白酶中，鳕鱼胰蛋白酶在分解各种细胞因子和病理蛋白方面最为活跃。
3、在生物医学领域，使用低浓度胰蛋白酶制剂更安全。另外，来源于海洋生物的胰蛋白酶，可降低将致病菌传染给人类与哺乳动物的风险。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法，其包括如下步骤：
(1)、分别获取得到南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try1、ES-try2和对照组南美白对虾胰蛋白酶PV-try；
(2)、分别构建南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try1、ES-try2和南美白对虾胰蛋白酶PV-try的原核表达载体；
(3)、将南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try1、ES-try2和南美白对虾胰蛋白酶PV-try的原核表达载体分别进行提取、纯化和复性；
(4)、分别对南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try1、ES-try2南美白对虾胰蛋白酶PV-try进行蛋白酶活测定；
(5)、预测南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try1的正选择位点并进行突变，然后按照步骤(3)和步骤(4)进行酶活测定。
优选地，步骤(2)中，原核表达载体的构建过程为：在PCR过后经过胶回收，T载体16℃过夜连接，菌液PCR检测，送测，T载体质粒双酶切，胶回收，对pet-28a原核表达载体的双酶切，胶回收，表达载体连接，菌液PCR检测步骤后，得到构建的南极磷虾胰蛋白酶亚型pet-ES-try1、pet-ES-try2和南美白对虾pet-PV-try的原核表达载体质粒；利用原核表达载体菌液经过过夜培养后提取质粒，将提取的新质粒转化大肠杆菌DE3，涂布于含有K+抗性的LB培养基，37℃过夜培养，挑菌进行菌液PCR，PCR引物为T7引物。
优选地，步骤(3)中，原核表达载体进行提取、纯化和复性的过程为：将步骤(2)的转化菌液按一定比例接种到无抗性的LB液体培养基中，37℃培养至OD值达到0.6-0.8时加入IPTG，使终浓度达到1mM，并设置对照组，对照组为不加入IPTG诱导；37℃继续培养过夜，取过夜培养的菌液，经离心收集沉淀菌体进行蛋白质的提取。
由于新构建的pet-try质粒含有6个his标签的组蛋白，利用此特性进行融合蛋白的纯化，根据透析原理，由高浓度至低浓度透析液对融合蛋白进行梯度透析，同时在透析过程中加入适量的盐和甘油，促使蛋白复性，将复性的蛋白保存于-80℃的冰箱中，并取适量测蛋白的浓度。
优选地，步骤(4)中，蛋白酶活测定的过程为：
(4-1)、设定6-8个4-70℃下的温度梯度，以1:4比例向tris-Hcl中加入复性后的蛋白，然后在相应的温度梯度中预热2min，对照组预先加入200ul三氯乙酸；
(4-2)、预热后，加入100ul的Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐底物，终浓度为20mM，在不同温度下反应20min；
(4-3)、20min后，在实验管中加200ul的三氯乙酸终止反应；
(4-4)、测两个离心管中溶液的吸光值，再利用以下公式求出相应温度下的胰蛋白酶的酶活；
Figure BDA0002268938980000041
其中，Δ410nm表示样品管和对照管410nm波长时的吸光值差，8800表示吸光系数，1000000、60、20均为单位换算。通过测定吸光值的大小并计算酶活。
步骤(5)中，正选择位点的预测：
利用PAML软件包下的Codeml程序，以甲壳纲中的南美白对虾、斑节对虾、中国对虾、日本对虾、眼斑龙虾、罗氏沼虾、拟穴青蟹7种适温性虾类的胰蛋白酶基因作为背景基因，对南极磷虾胰蛋白酶基因ES-try1在进化过程中所受到的选择压力进行分析，具体步骤如下：
(5.1.1).准备文件和模型选择
<1>8种胰蛋白酶基因的全长核苷酸序列比对文件获得：从NCBI数据库中下载得到南美白对虾(Penaeus vannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)、中国对虾(Penaeuschinensis)、日本对虾(Penaeus japonicas)、眼斑龙虾(Panulirus argus)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、拟穴青蟹(Scylla paramamosain)的胰蛋白酶基因的全长核苷酸序列，并与本发明中通过转录组测序得到的南极磷虾(Euphausia superba)胰蛋白酶基因ES-try1的全长核苷酸序列进行多重比对，构建try.nucl文件；
<2>树文件获得：通过Mrbayes、Phyml、PAUP软件构建9种胰蛋白酶基因的系统发育树，并得到相应的try.tree树书文件，具体的树为：(((((((P.monodon,P.vannamei),P.chinensis),P.japonicas),P.argus),E.superba#1),M.rosenbergii),S.paramamosain)；
<3>模型的选择：通过两两比较零假设模型与备择假设模型M0(零假设模型)和M3(备择假设模型)、M1a(自然模型)和M2a(选择模型)、M7(beta)和M8(beta&ω)的最大似然值对数差的2倍(即2△lnL)，根据改良后的X2分布进行似然比值检验(likelihood ratio test,LRT)，根据p值进而判断备择假设模型是否成立；当似然比检验证明存在ω＞1的位点时，可通过经验贝叶斯法计算该位点的后验概率；那些具有ω＞1的模型及其位点的后验概率>95％时，该位点就被认为是正选择位点。
优选地，步骤(5)中，正选择位点突变时的引物为：
Figure BDA0002268938980000051
一种上述的低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法中的南极磷虾胰蛋白酶作为清创剂在医学中的应用。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
第一、本发明通过定点突变技术对南极磷虾胰蛋白酶的功能位点进行定点突变，从而验证了南极磷虾胰蛋白酶发挥稳定催化活性的关键位点(即正选择位点)所在，阐释了南极磷虾胰蛋白酶在低温下具有较高催化活性的特点，将南极磷虾胰蛋白酶应用于低温要求下的食品加工行业进一步提高食品的安全性；对于生物医药领域，有望将南极磷虾胰蛋白酶用于创伤愈合治疗，需要进一步验证。因此对南极磷虾胰蛋白酶制品工业提供新的理论基础，也为南极磷虾胰蛋白酶潜在的商业应用提供了技术方向。
第二、本发明的冷适应性胰蛋白酶在低温下的催化效率远远高于适温性胰蛋白酶，所以要达到相同的催化效果只需更少量的南极磷虾胰蛋白酶即可完成，可减少成本；另外，其在低温下具有更高的催化活性，与目前工业临床常用的适温性胰蛋白酶和适冷酶大西洋鳕胰蛋白酶相比，最适催化温度更低，更适合在较低温度下工作，不易产生细菌，造成污染。因而对于南极磷虾胰蛋白酶的活性位点进行定点突变或改造有望开发新型适冷性胰蛋白酶从而提高其产量和稳定性等，故在工业与医药领域的应用提供了重要基础。
第三、本发明以海洋生物南极磷虾为来源获得的胰蛋白酶，对人体及其他哺乳动物无害，不存在感染风险，安全性更高。
附图说明
图1为本发明中实施例的2个南极磷虾胰蛋白酶亚型与NCBI中南极磷虾胰蛋白酶氨基酸序列比对。箭头所指的标记的为差异氨基酸序列。KT826552.1-ES-try为NCBI中公布的南极磷虾胰蛋白酶ES-try6氨基酸序列，ES-try1、ES-try2为本发明中两个南极磷虾胰蛋白酶亚型氨基酸序列。
图2为本发明中实施例的SDS-PAGE分析融合蛋白His-trypsin的表达示意图。图2-A中第1泳道为蛋白marker；第2泳道为未经IPTG诱导的pet空载体的总蛋白；第3泳道为经IPTG诱导的pet空载体总蛋白；第4泳道、第5泳道、第6泳道分别为pet-ES-try1，pet-ES-try2，pet-PV-try质粒未经IPTG诱导的总蛋白；第7泳道、第8泳道、第9泳道分别为pet-ES-try1，pet-ES-try2，pet-PV-try质粒经IPTG诱导的总蛋白。图2-B为经过蛋白纯化的蛋白。
图3为本发明中实施例的南极磷虾胰蛋白酶与南美白对虾胰蛋白酶活性检测示意图。
图4为本发明中实施例不同温度下胰蛋白酶活性的比较示意图。图4-A为ES-try1、ES-try2与PV-try最适催化温度检测；图4-B(纵坐标为酶活(410nm波长下的吸光度值))为不同温度下ES-try1与
Figure BDA0002268938980000061
突变体酶活的比较。其中，
Figure BDA0002268938980000062
为南极磷虾胰蛋白酶活性位点(active site)突变体，
Figure BDA0002268938980000063
底物结合位点(substrate site)突变体，为正选择位点(positive selected site)突变体。
具体实施方式
本发明提供了一种低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法。
本发明通过体外表达获得了两种新型南极磷虾胰蛋白酶，经过蛋白的提取、纯化和复性得到了纯度极高的南极磷虾胰蛋白酶，并以适温性南美白对虾胰蛋白酶PV-try作为对照进行酶活性检测。酶活性检测结果为：南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try1、ES-try2的酶活在30℃-40℃之间达到最大，而南美白对虾胰蛋白酶的酶活在50℃-60℃时达到最大。而且，南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try1、ES-try2在4℃、10℃、20℃、30℃时的酶活均为南美白对虾胰蛋白酶的3倍以上，最大时达到13倍(如表1所示)，两种胰蛋白酶酶活差异显著。对南极磷虾胰蛋白酶的正选择位点进行定点突变及酶活性测定，从而验证了南极磷虾胰蛋白酶在低温下发挥催化活性的重要位点。
表1不同温度下南极磷虾和南美白对虾的胰蛋白酶的酶活
Figure BDA0002268938980000071
通过对正选择位点进行突变并检测其酶活验证其对南极磷虾胰蛋白酶在低温下发挥催化作用的关键性。结果显示，野生型南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try1、ES-try2最适催化温度在40℃左右，催化范围为0℃-60℃；南美白对虾胰蛋白酶最适催化温度在60℃左右，催化范围为0-70℃。南极磷虾胰蛋白酶发挥最大催化活性的温度显著低于南美白对虾胰蛋白酶催化温度。经过位点突变的南极磷虾胰蛋白酶
Figure BDA0002268938980000072
突变型酶活显著降低，而已知的胰蛋白酶保守位点，活化位点与底物结合位点突变型
Figure BDA0002268938980000073
与
Figure BDA0002268938980000074
活性接近0。本发明证实南极磷虾胰蛋白酶在不同低温条件下具有高催化活性，并得到了南极磷虾胰蛋白酶低温下发挥催化活性的位点，从而证明其对南极磷虾胰蛋白酶活性的发挥至关重要。
获得的两个南极磷虾胰蛋白酶基因亚型
>ES-try1
ATGAAGGGATTCGTGCTCTGTCTACTGGTCGCTGGGGCATGTGCTGCCCCCAGCAGGAAACCCACTTTCCGCAAGGGCCTCAACAAGATTGTAGGAGGAGATGAGGCCGCCCCTGGTGAGCTTCCCTACCAGCTCAGCTTCCAGGATCTCTCATATGGCTCCCCATGGCATTTCTGTGGTGCCTCCATCTACAATGAGAACTGGGCTATCTGCGCTGGACACTGTGTTGCTGGAGAGGACATGAACAACCCAGATTACTTGCAGGTTGTTGCTGGTGAGCATAACCAGGACATCGTTGAAGGTAATGAACAGGCCATCATCCTGTCCAAGATCATCCAGCATGAGGGTTACAATGCAAACACTGTCTCCAATGACGTATCTGTCCTCCAACTGTCTCAACCCCTGACCTTCAATGACTACGTCCAGCCCATTGCACTGCCCGAAGCTGGCCATACTGCTTCTGGTGATTGTATTGTCTCTGGTTGGGGCACCACATCTGAGGGTGGTAATACCCCAAGTGTCCTCATGAAGGTCGCTGTCCCAATTGTTACTGATGAAGAATGCCGTGATGCCTATGGTGCAGGTGAGATTGAGGACTCCATGATCTGTGCTGGACTACCCGAAGGAGGCAAAGACTCCTGCCAGGGAGATTCTGGTGGACCATTTGCTTGCTCTGATACTGGCTCCCCCTACCTTGCTGGTATTGTATCTTGGGGATACGGATGTGCCAGACCCAACTACCCAGGTGTCTACACTGAAGTTTCCTACTTCGTTGACTGGATCATGACAAACACCGCATAG。
>ES-try2
ATGAAGGGATTCGTGCTCTGTCTACTGGTAGCTGGGGCATGCGCTGCCCCAAGCAGGAAGCCCACCTTCCGCAAGGGCCTCAACAAGATTGTAGGCGGAGATGAGGCCGCCCCCGGTGAGCTTCCCTACCAACTCAGCTTCCAGGATCTCTCATATGGCGACCCATGGCATTTCTGCGGTGCCTCCATCTACAATGAGAACTGGGCCATCTGCGCTGGACACTGTGTTGCTGGAGAGGACATGAACAACCCCGATTACTTACAGGTCGTTGCTGGTGAGCATGACCAGGACATTGTTGAAGGTAATGAGCAGACCATCATCCTGTCCAAGATCATCCAACATGAGGGCTACAATGCATTCACTGTCTCCAATGACATATCTGTCCTCCAACTGTCTCAACCCCTGACTTTTAATGACTTCGTCCAGGCCATTCCTCTGCCCGAAGCTGGCCATACTGCTTCTGGTGATTGTATTGTCTCTGGTTGGGGCACCACATCTGAGGGAGGTAATACCCCAAGTGTCCTCATGAAGGTCGCTGTCCCAGTTGTTACTGATGAAGAATGCACCGCTGCCTATGGTGAGGGTGAGATTCTAGACTCCATGATCTGTGCAGGACTACCCGAAGGAGGCAAAGACTCCTGCCAGGGAGATTCTGGTGGCCCATTCGCTTGCTCTGATACTGGCTCCCCCTACCTTGCTGGTGTTGTATCTTGGGGTTACGGATGTGCCAGACCCAACTACCCAGGTGTCTACACTGAAGTTTCCTACTTCGTTGACTGGATTATGACTAACACCGCATAG。
具体地，本发明的低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法包括如下步骤：
步骤1：两个胰蛋白酶基因亚型的获得
根据RACE技术并结合本实验室南极磷虾的转录组数据，得到了2个南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try1、ES-try2，设计含酶切位点的引物，将这2个亚型体外扩增出来，经过测序得到验证。同时，以NCBI数据库中温带海水南美白对虾胰蛋白酶(GenBank:X86369.1)作为对照组，在NCBI中找到相应的胰蛋白酶基因编码区，然后设计特异的引物进行PCR体外扩增，对PCR产物进行测序，并与NCBI中Zhou等人提交的南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try6(GenBank:KT82655221.1)核酸序列翻译为氨基酸序列进行比对，相似度分别为96％、97％。
步骤2：胰蛋白酶原核表达载体构建
在PCR过后经过胶回收，T载体16℃过夜连接，菌液PCR检测，送测，T载体质粒双酶切，胶回收，对pet-28a原核表达载体的双酶切，胶回收，表达载体连接，菌液PCR检测步骤后，得到构建的南极磷虾胰蛋白酶亚型pet-ES-try1、pet-ES-try2和南美白对虾pet-PV-try的原核表达载体质粒。利用上述的原核表达载体菌液经过过夜培养后提取质粒，将提取的新质粒转化大肠杆菌DE3，涂布于含有K+抗性的LB培养基，37℃过夜培养，挑菌进行菌液PCR，PCR引物为T7引物。
步骤3：目的蛋白的诱导表达和提取、纯化与复性
将上一步骤的转化菌液按一定比例接种到无抗性的LB液体培养基中，37℃培养至OD值达到0.6-0.8时加入IPTG，使终浓度达到1mM，并设置对照组(不加IPTG诱导)。37℃继续培养过夜。取上述过夜培养的菌液，经离心收集沉淀菌体进行蛋白质的提取。由于大肠杆菌表达的蛋白存在于包涵体内，利用包涵体裂解液充分溶解沉淀中的包涵体，获得包涵体蛋白，进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)电泳检测目的蛋白。
由于新构建的pet-try质粒含有6个his标签的组蛋白，利用此特性进行融合蛋白的纯化。根据透析原理，由高浓度至低浓度透析液对融合蛋白进行梯度透析，同时在透析过程中加入适量的盐和甘油，促使蛋白复性，将复性的蛋白保存于-80℃的冰箱中，并取适量测蛋白的浓度。
步骤4：南极磷虾与南美白对虾胰蛋白酶活性比较
(4-1)、设定6-8个温度梯度，以1:4比例向tris-Hcl中加入复性后的蛋白，然后在相应的温度梯度中预热2min，对照组预先加入200ul三氯乙酸。
(4-2)、预热后，加入100ul的BAPna(Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐)底物(终浓度为20mM)，在不同温度下反应20min。
(4-3)、20min后，在实验管中加200ul的三氯乙酸终止反应。
(4-4)、测两个离心管中溶液的吸光值，再利用以下公式求出相应温度下的胰蛋白酶的酶活。
Figure BDA0002268938980000091
其中，Δ410nm表示样品管和对照管410nm波长时的吸光值差，8800表示吸光系数，1000000、60、20均为单位换算。通过测定吸光值的大小并计算酶活。
步骤5：南极磷虾胰蛋白酶正选择位点的预测及酶活性测定
通过PAML程序对南极磷虾胰蛋白酶进行结构预测，设计合适的突变引物，利用基于PCR技术的Q5定点突变试剂盒(NEB，USA)对位点进行突变，提取突变质粒并转化E.coilBL21(DE3)感受态，按照步骤4方法提取、纯化、复性蛋白并测定酶活。
(5.1)正选择位点预测：
利用PAML软件包下的Codeml程序，以甲壳纲中的南美白对虾、斑节对虾、中国对虾、日本对虾、眼斑龙虾、罗氏沼虾、拟穴青蟹7种适温性虾类的胰蛋白酶基因作为背景基因，对南极磷虾胰蛋白酶基因ES-try1在进化过程中所受到的选择压力进行分析。具体步骤如下：
(5.1.1).准备文件和模型选择
<1>8种胰蛋白酶基因的全长核苷酸序列比对文件获得：从NCBI数据库中下载得到南美白对虾(Penaeus vannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)、中国对虾(Penaeuschinensis)、日本对虾(Penaeus japonicas)、眼斑龙虾(Panulirus argus)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、拟穴青蟹(Scylla paramamosain)的胰蛋白酶基因的全长核苷酸序列，并与本文中通过转录组测序得到的南极磷虾(Euphausia superba)胰蛋白酶基因ES-try1的全长核苷酸序列进行多重比对，构建try.nucl文件。
<2>树文件获得：通过Mrbayes,Phyml,PAUP软件构建9种胰蛋白酶基因的系统发育树，并得到相应的try.tree树书文件，具体的树为：(((((((P.monodon,P.vannamei),P.chinensis),P.japonicas),P.argus),E.superba#1),M.rosenbergii),S.paramamosain)。
<3>模型的选择：通过两两比较零假设模型与备择假设模型M0(零假设模型)和M3(备择假设模型)、M1a(自然模型)和M2a(选择模型)、M7(beta)和M8(beta&ω)的最大似然值对数差的2倍(即2△lnL)，根据改良后的X2分布进行似然比值检验(likelihood ratio test,LRT)，根据p值进而判断备择假设模型是否成立。当似然比检验证明存在ω＞1的位点时，可通过经验贝叶斯法计算该位点的后验概率。那些具有ω＞1的模型及其位点的后验概率>95％时，该位点就被认为是正选择位点。
(5.1.2).分析结果
将(1)的序列文件try.nucl与(2)的树文件try.tree导入PAML软件下的Codeml程序中，利用(3)的模型计算得到最终的正选择分析结果(如表2所示)。其中，M0与M3模型的最大似然值对数差的2倍2△lnL为92.64，自由度df＝4，用chi2软件计算得到p值<0.01，则M3成立，但是其ω＝0.12<1，因此并没有出现正选择位点。而在模型M1a与M2a模型比对中，二者似然比之差的两倍2△lnL值为0，p值为1，因此M2a不成立。在模型M7与M8的2△lnL值为8.10，其自由度df＝2，p值<0.01，M8成立，而且ω2＝1.23>1，说明在M8模型中ES-try1基因受到了正选择压力，存在正选择位点，包括37A、54D、55P、56W、111V、133R、149A、198L和235V。
表2参数估计和位点模型似然比结果
注：LRT:最大似然检测；ω2:位点发生正选择的平均比例dN/dS；p0、p1 and p2:密码子发生负选择，中性选择，正选择的比例；2△lnL：两两模型间最大似然值对数差值的2倍。
结果分析：如表2所示，
M0/M3模型，ω2小于1，且P＝0.00，不具有显著性，因此不能接受M0/M3模型提供的结果；
M1a/M2a模型，ω2＝1，且P＝1，不具有显著性；因此不能接受M1a/M2a模型提供的结果；
M7/M8模型ω2＞1，且P值＜0.01，预测得到9个正选择位点，分别为：37A，54D，55P，56W，111V，133R，149A，198L，235V。
(5.2)定点突变流程：
(5.2.1).根据在NEB官方网站NEBaseChanger.neb.com使用NEBaseChanger软件设计替换突变引物，具体地，将南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try1核苷酸序列导入NEBaseChanger软件中，根据生物信息学预测得到的9个突变位点的位置得到特异性的9对上下游引物。
(5.2.2).PCR反应，体系25ul：
Q5热启动超保真预混液(2X)：12.5ul；
上游引物F：1ul
下游引物F：1ul
Pet-ES-try1质粒：1-20ng
H2O:补至25ul
PCR反应程序：98℃30s，98℃10s，58℃30s，72℃5min，72℃5min，共25个循环。PCR产物于1％琼脂糖凝胶验证条带大小在5500bp左右。
(5.2.3).KLD反应:
PCR产物(步骤2的PCR产物)：1ul
2XKLD reaction buffer：5ul
10XKLD Enzyme:1ul
H2O:补至10ul
(5.2.4).转化：
将步骤3得到的KLD反应产物加入到50ul感受态细胞中，冰上放置30min。然后放置42℃水浴锅热激30s，重新放置冰上5min，加入1ml无抗生素的LB培养基，于37℃恒温摇床培养1小时，取出100ul涂布到含卡钠抗生素的固体培养板上，37℃培养14-16h。挑取培养板上5个菌落，加入1ml的LB培养基扩大培养4小时，将菌液送去公司测序。利用MEGA软件将测序结果与野生型pet-ES-try1进行比对，确定9个位点突变成功。
(5.2.5).此步骤即为具体实施方式的步骤3目的蛋白的诱导表达和提取、纯化与复性。
实际上，对南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try1的正选择位点进行突变时，同时也对南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try1的活性位点和底物结合位点分别进行突变并作为对比。
其中，正选择位点突变时的引物为：
Figure BDA0002268938980000111
Figure BDA0002268938980000121
其中，活性位点突变时的引物为：
Figure BDA0002268938980000122
其中，底物结合位点突变时的引物为：
Figure BDA0002268938980000123
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例：
本实施例的低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法包括如下步骤：
步骤1：南极磷虾胰蛋白酶基因亚型获得
根据RACE技术并结合本发明南极磷虾的转录组数据，得到了2个南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try1、ES-try2，设计有酶切位点的引物，将这2个亚型体外扩增出来，经过测序得到验证。同时，以NCBI数据库中温带海水南美白对虾胰蛋白酶(GenBank:X86369.1)作为对照组，在NCBI中找到相应的胰蛋白酶基因编码区，然后设计特异的引物进行PCR体外扩增，PCR条件：95℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min；35个循环，72℃10min，4℃保存。对PCR产物进行测序，并与NCBI中Zhou等人提交的南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try6(GenBank:KT82655221.1)核酸序列翻译为氨基酸序列进行比对，相似度分别为96％、97％，见图1。
步骤2：南极磷虾胰蛋白酶基因亚型原核表达载体构建
在PCR过后经过胶回收，T载体16℃过夜连接，菌液PCR检测，送测，T载体质粒双酶切，胶回收，pet-28a原核表达载体的双酶切(HindⅢand EcoRⅠ)，胶回收，表达载体连接，条件为37℃、4h，菌液PCR检测等步骤后，得到构建的南极磷虾胰蛋白酶亚型pet-ES-try、pet-ES-try2和南美白对虾pet-PV-try的原核表达载体质粒。利用上述的原核表达载体菌液经过过夜培养后，利用生工的质粒小提试剂盒进行质粒提取，提取步骤按试剂盒说明书所示。将提取的新质粒转化大肠杆菌DE3，涂布于含有K+抗性的LA固体培养板，37℃过夜培养，挑菌进行菌液PCR，PCR引物为T7引物。
步骤3：目的蛋白的诱导表达和提取、纯化与复性
将上一步骤的转化菌液按1:50的比例接种到无抗性的LB液体培养基中(50ml)，37℃培养至OD值达到0.6-0.8时加入IPTG，使终浓度达到1mM，并设置对照组(不加IPTG诱导)。37℃继续培养过夜。取上述过夜培养的菌液，5000r/min离心10min，弃上清收集沉淀菌体进行蛋白质的提取。向沉淀中加入2.5ml的溶酶液，100ul的PMSF和2ul的核酸酶，吹打均匀，冰浴1小时，4℃、12000r/min离心10min，留上清做SDS-PAGE(包括对照组)，由于大肠杆菌表达的蛋白存在于包涵体内。对沉淀加入包涵体裂解液(以1ml为例：Tris-HCL 20Mm，Nacl300mM，尿素8M)。为充分溶解沉淀中的包涵体，放冰上冰浴2h达到充分溶解。然后，常温10000r/min离心20min，上清液即为包涵体蛋白。同时，留部分上清做SDS-PAGE凝胶电泳检测目的蛋白，其余用来做蛋白纯化，SDS-PAGE凝胶电泳结果见图2-A。
由于pet-try质粒含有6个his标签的组蛋白，利用这一特性对融合蛋白进行纯化。用于纯化的柱子和相关介质均购于北京天恩泽公司，蛋白纯化步骤参照试剂盒的说明，得到纯化后的蛋白，见图2-B。
为使蛋白复性，利用透析的方法，将纯化的蛋白中的强变性剂逐步去除，透析液分别为浓度为6mol/L，4mol/L，2mol/L，0mol/L的尿素。切忌直接用水透析，否则会使蛋白急剧失活沉淀，同时在透析过程中加入适量的盐和甘油，促使蛋白复性，整个过程历时36h。将复性后的蛋白保存于-80℃的冰箱中，并取适量测蛋白的浓度。
步骤4：南极磷虾胰蛋白酶与南美白对虾胰蛋白酶活性比较
(4-1)、设定8个温度梯度，分别为4℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，对ES-try1、ES-try2、PV-try进行酶活测定。
(4-2)、在1850ul的tris-hcl中加入50ul的复性蛋白，然后在相应的温度梯度中预热2min，对照组预先加入200ul三氯乙酸。
(4-3)、预热后，加入100ul的BAPna(Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐)底物(终浓度为20mM)，再在相应温度下反应20min。
(4-4)、20min后，在实验管中加200ul的三氯乙酸终止反应。
(4-5)、测两个离心管中溶液的吸光值，再利用以下公式求出相应温度下的胰蛋白酶的酶活。
Figure BDA0002268938980000141
其中，Δ410nm表示样品管和对照管410nm波长时的吸光值差，8800表示吸光系数，1000000、60、20均为单位换算。通过测定吸光值的大小并计算酶活。
经测定，在30℃以下的低温环境中，pet-ES-try1的活性最高，pet-ES-try2次之，PV-try活性最低，南极磷虾胰蛋白酶的最适催化温度在30℃左右，南美白对虾胰蛋白酶最适催化温度在50℃左右，证实了南极磷虾胰蛋白酶在低温下催化活性高于中温性胰蛋白酶，酶活检测结果见表1，并绘制曲线图，结果见图3。
步骤5:南极磷虾胰蛋白酶正选择位点的预测及酶活性测定
利用PAML程序对南极磷虾胰蛋白酶进行二级与三级结构预测，根据贝叶斯定理预测到其包含9个正选择位点(positive selected sites)，3个活化位点(active sites)，3个底物结合位点(substrate sites)，并以活化位点和底物结合位点进行对照。对酶活测定中活性最高的pet-ES-try1原核表达质粒的位点进行定点突变，检测南极磷虾胰蛋白酶低温下发挥催化活性的关键位点。具体步骤参照Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit说明书(NEB、USA)。
步骤如下：(1).在NEB官方网站NEBaseChanger.neb.com使用NEBaseChanger软件设计替换突变引物；使用Q5热启动超保真DNA聚合酶进行指数扩增；(2).快速环化DNA产物和去除模板；(3).高效转入化学感受态细胞，最终得到ES-try1的突变质粒
Figure BDA0002268938980000143
与
Figure BDA0002268938980000144
与上述步骤4相同，提取突变质粒，进行胰蛋白酶活性检测，突变后酶活检测结果见图4。
如图4-A所示，ES-Try1和ES-Try2活性温度范围为0-60℃，最适酶活温度为40℃；PV-Try的活性温度范围为0-70℃，最适酶活温度为60℃。如图4-B所示，正选择位点
Figure BDA0002268938980000146
突变体最大酶活性显著降低，并且在所有温度下，活性位点突变体
Figure BDA0002268938980000147
表现为低酶活，底物结合位点突变体
Figure BDA0002268938980000148
酶活性几乎为0。
结果显示，对ES-try1的活性位点进行突变并检测酶活，与野生型ES-try1相比，
Figure BDA0002268938980000149
与
Figure BDA00022689389800001411
活性均显著降低，其中，
Figure BDA00022689389800001412
和
Figure BDA00022689389800001413
最大酶活温度相对于野生型ES-try1提高至40-50℃，而南极磷虾胰蛋白酶
Figure BDA00022689389800001414
突变型催化范围扩大为0-70℃。
其中，正选择位点突变后的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其突变时的引物为：
Figure BDA0002268938980000142
Figure BDA0002268938980000151
其中，活性位点突变后的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，其突变时的引物为：
Figure BDA0002268938980000152
其中，底物结合位点突变后的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其突变时的引物为：
Figure BDA0002268938980000153
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002268938980000161
Figure BDA0002268938980000171
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> 低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法
<141> 2019-11-12
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 257
<212> PRT
<213> 正选择位点突变后序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 1
Met Lys Gly Phe Val Leu Cys Leu Leu Val Ala Gly Ala Cys Ala Ala
1 5 10 15
Pro Ser Arg Lys Pro Thr Phe Arg Lys Gly Leu Asn Lys Ile Val Gly
20 25 30
Gly Asp Glu Ala Pro Gly Glu Leu Pro Tyr Gln Leu Ser Phe Gln Asp
35 40 45
Leu Ser Tyr Gly His Phe Cys Gly Ala Ser Ile Tyr Asn Glu Asn Trp
50 55 60
Ala Ile Cys Ala Gly His Cys Val Ala Gly Glu Asp Met Asn Asn Pro
65 70 75 80
Asp Tyr Leu Gln Val Val Ala Gly Glu His Asn Gln Asp Ile Val Glu
85 90 95
Gly Asn Glu Gln Ala Ile Ile Leu Ser Lys Ile Gln His Glu Gly Tyr
100 105 110
Asn Ala Phe Thr Val Ser Asn Asp Ile Ser Val Leu Gln Leu Ser Pro
115 120 125
Leu Thr Phe Asn Asp Phe Val Gln Ala Ile Pro Leu Pro Glu Gly His
130 135 140
Thr Ala Ser Gly Asp Cys Ile Val Ser Gly Trp Gly Thr Thr Ser Glu
145 150 155 160
Gly Gly Asn Thr Pro Ser Val Leu Met Lys Val Ala Val Pro Val Val
165 170 175
Thr Asp Glu Glu Cys Thr Ala Ala Tyr Gly Glu Gly Glu Ile Asp Ser
180 185 190
Met Ile Cys Ala Gly Leu Pro Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly
195 200 205
Asp Ser Gly Gly Pro Phe Ala Cys Ser Asp Thr Gly Ser Pro Tyr Leu
210 215 220
Ala Gly Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Arg Pro Asn Tyr Pro Gly
225 230 235 240
Val Tyr Thr Glu Val Ser Tyr Phe Val Asp Trp Ile Met Thr Asn Thr
245 250 255
Ala
<210> 2
<211> 246
<212> PRT
<213> 活化位点突变后序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Met Lys Gly Phe Val Leu Cys Leu Leu Val Ala Gly Ala Cys Ala Ala
1 5 10 15
Pro Ser Arg Lys Pro Thr Phe Arg Lys Gly Leu Asn Lys Ile Val Gly
20 25 30
Gly Asp Glu Ala Thr Pro Gly Glu Leu Pro Tyr Gln Leu Ser Phe Gln
35 40 45
Asp Leu Ser Tyr Gly Asp Pro Trp His Phe Cys Gly Ala Ser Ile Tyr
50 55 60
Asn Glu Asn Trp Ala Ile Cys Ala Gly Cys Val Ala Gly Glu Asp Met
65 70 75 80
Asn Asn Pro Asp Tyr Leu Gln Val Val Ala Gly Glu His Asn Gln Asp
85 90 95
Ile Val Glu Gly Asn Glu Gln Ala Ile Ile Leu Ser Lys Ile Ile Gln
100 105 110
His Glu Gly Tyr Asn Ala Phe Thr Val Ser Asn Ile Ser Val Leu Gln
115 120 125
Leu Ser Gln Pro Leu Thr Phe Asn Asp Phe Val Gln Ala Ile Pro Leu
130 135 140
Pro Glu Gln Gly His Thr Ala Ser Gly Asp Cys Ile Val Ser Gly Trp
145 150 155 160
Gly Thr Thr Ser Glu Gly Gly Asn Thr Pro Ser Val Leu Met Lys Val
165 170 175
Ala Val Pro Val Val Thr Asp Glu Glu Cys Thr Ala Ala Tyr Gly Glu
180 185 190
Gly Glu Ile Glu Asp Ser Met Ile Cys Ala Gly Leu Pro Glu Gly Gly
195 200 205
Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Gly Gly Pro Phe Ala Cys Ser Asp Thr
210 215 220
Gly Ser Pro Tyr Leu Ala Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala
225 230 235 240
Arg Pro Asn Tyr Pro Gly
245
<210> 3
<211> 246
<212> PRT
<213> 底物结合位点突变后序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 3
Met Lys Gly Phe Val Leu Cys Leu Leu Val Ala Gly Ala Cys Ala Ala
1 5 10 15
Pro Ser Arg Lys Pro Thr Phe Arg Lys Gly Leu Asn Lys Ile Val Gly
20 25 30
Gly Asp Glu Ala Thr Pro Gly Glu Leu Pro Tyr Gln Leu Ser Phe Gln
35 40 45
Asp Leu Ser Tyr Gly Asp Pro Trp His Phe Cys Gly Ala Ser Ile Tyr
50 55 60
Asn Glu Asn Trp Ala Ile Cys Ala Gly His Cys Val Ala Gly Glu Asp
65 70 75 80
Met Asn Asn Pro Asp Tyr Leu Gln Val Val Ala Gly Glu His Asn Gln
85 90 95
Asp Ile Val Glu Gly Asn Glu Gln Ala Ile Ile Leu Ser Lys Ile Ile
100 105 110
Gln His Glu Gly Tyr Asn Ala Phe Thr Val Ser Asn Asp Ile Ser Val
115 120 125
Leu Gln Leu Ser Gln Pro Leu Thr Phe Asn Asp Phe Val Gln Ala Ile
130 135 140
Pro Leu Pro Glu Gln Gly His Thr Ala Ser Gly Asp Cys Ile Val Ser
145 150 155 160
Gly Trp Gly Thr Thr Ser Glu Gly Gly Asn Thr Pro Ser Val Leu Met
165 170 175
Lys Val Ala Val Pro Val Val Thr Asp Glu Glu Cys Thr Ala Ala Tyr
180 185 190
Gly Glu Gly Glu Ile Glu Asp Ser Met Ile Cys Ala Gly Leu Pro Glu
195 200 205
Gly Gly Lys Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Ala Cys Ser
210 215 220
Asp Thr Gly Ser Pro Tyr Leu Ala Gly Ile Val Trp Tyr Gly Cys Ala
225 230 235 240
Arg Pro Asn Tyr Pro Gly
245

Claims (7)

1.一种低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法，其特征在于：其包括如下步骤：
(1)、分别获取得到南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try1、ES-try2和对照组南美白对虾胰蛋白酶PV-try；
(2)、分别构建所述南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try1、ES-try2和南美白对虾胰蛋白酶PV-try的原核表达载体；
(3)、将所述南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try1的原核表达载体、ES-try2的原核表达载体和南美白对虾胰蛋白酶PV-try的原核表达载体分别进行提取、纯化和复性；
(4)、分别对南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try1、ES-try2和南美白对虾胰蛋白酶进行蛋白酶活测定；
(5)、预测所述南极磷虾胰蛋白酶亚型ES-try1的正选择位点并进行突变，然后按照步骤(3)和步骤(4)进行酶活测定。
2.根据权利要求1所述的低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法，其特征在于：步骤(2)中，所述原核表达载体的构建过程为：在PCR过后经过胶回收，T载体16℃过夜连接，菌液PCR检测，送测，T载体质粒双酶切，胶回收，对pet-28a原核表达载体的双酶切，胶回收，表达载体连接，菌液PCR检测步骤后，得到构建的南极磷虾胰蛋白酶亚型pet-ES-try1、pet-ES-try2和南美白对虾pet-PV-try的原核表达载体质粒；利用原核表达载体菌液经过过夜培养后提取质粒，将提取的新质粒转化大肠杆菌DE3，涂布于含有K+抗性的LB培养板，37℃过夜培养，挑菌进行菌液PCR，PCR引物为T7引物。
3.根据权利要求1所述的低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法，其特征在于：步骤(3)中，所述原核表达载体进行提取、纯化和复性的过程为：将步骤(2)的转化菌液按一定比例接种到无抗性的LB液体培养基中，37℃培养至OD值达到0.6-0.8时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，使终浓度达到1mM，并设置对照组，对照组为不加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导；37℃继续培养过夜，取过夜培养的菌液，经离心收集沉淀菌体进行蛋白质的提取；
由于新构建的pet-try质粒含有6个his标签的组蛋白，利用此特性进行融合蛋白的纯化，根据透析原理，由高浓度至低浓度透析液对融合蛋白进行梯度透析，同时在透析过程中加入适量的盐和甘油，促使蛋白复性，将复性的蛋白保存于-80℃的冰箱中，并取适量测蛋白的浓度。
4.根据权利要求1所述的低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法，其特征在于：步骤(4)中，所述蛋白酶活测定的过程为：
(4-1)、设定6-8个4-70℃下的温度梯度，以1:4比例向三(羟甲基)氨基甲烷中加入复性后的蛋白，然后在相应的温度梯度中预热2min，对照组预先加入200ul三氯乙酸；
(4-2)、预热后，加入100ul的Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐底物，终浓度为20mM，在不同温度下反应20min；
(4-3)、20min后，在实验管中加200ul的三氯乙酸终止反应；
(4-4)、测两个离心管中溶液的吸光值，再利用以下公式求出相应温度下的胰蛋白酶的酶活；
Figure FDA0002268938970000021
其中，Δ410nm表示样品管和对照管410nm波长时的吸光值差，8800表示吸光系数，1000000、60、20均为单位换算，通过测定吸光值的大小并计算酶活。
5.根据权利要求1所述的低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法，其特征在于：步骤(5)中，正选择位点的预测：
利用PAML软件包下的Codeml程序，以甲壳纲中的南美白对虾、斑节对虾、中国对虾、日本对虾、眼斑龙虾、罗氏沼虾、拟穴青蟹7种适温性虾类的胰蛋白酶基因作为背景基因，对南极磷虾胰蛋白酶基因亚型ES-try1在进化过程中所受到的选择压力进行分析，具体步骤如下：
(5.1.1).准备文件和模型选择
<1>8种胰蛋白酶基因的全长核苷酸序列比对文件获得：从NCBI数据库中下载得到南美白对虾(Penaeus vannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)、中国对虾(Penaeuschinensis)、日本对虾(Penaeus japonicas)、眼斑龙虾(Panulirus argus)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、拟穴青蟹(Scylla paramamosain)的胰蛋白酶基因的全长核苷酸序列，并与本发明中通过转录组测序得到的南极磷虾(Euphausia superba)胰蛋白酶基因亚型ES-try1的全长核苷酸序列进行多重比对，构建try.nucl文件；
<2>树文件获得：通过Mrbayes、Phyml、PAUP软件构建9种胰蛋白酶基因的系统发育树，并得到相应的try.tree树书文件，具体的树为：(((((((P.monodon,P.vannamei),P.chinensis),P.japonicas),P.argus),E.superba#1),M.rosenbergii),S.paramamosain)；
<3>模型的选择：通过两两比较零假设模型与备择假设模型M0(零假设模型)和M3(备择假设模型)、M1a(自然模型)和M2a(选择模型)、M7(beta)和M8(beta&ω)的最大似然值对数差的2倍(即2△lnL)，根据改良后的X2分布进行似然比值检验(likelihood ratio test,LRT)，根据p值进而判断备择假设模型是否成立；当似然比检验证明存在ω＞1的位点时，可通过经验贝叶斯法计算该位点的后验概率；那些具有ω＞1的模型及其位点的后验概率>95％时，该位点就被认为是正选择位点。
6.根据权利要求1所述的低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法，其特征在于：步骤(5)中，所述正选择位点突变时的引物为：
Figure FDA0002268938970000031
7.一种根据权利要求1所述的低温下南极磷虾胰蛋白酶的酶活评价方法中的南极磷虾胰蛋白酶作为清创剂在医学中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111662370A (zh) * 2020-07-03 2020-09-15 上海海洋大学 南极鱼hepcidin抗菌肽及其制备方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060020124A1 (en) * 2004-07-22 2006-01-26 Asenjo Juan A Protein and nucleic acid sequence encoding a krill-derived cold adapted trypsin-like activity enzyme
CN101967469A (zh) * 2009-07-28 2011-02-09 上海雅心生物技术有限公司 一种高稳定性的重组胰蛋白酶的生产及应用
CN104726490A (zh) * 2013-12-19 2015-06-24 山东大学 表达人血清白蛋白的靶向载体及其构建方法
CN109312333A (zh) * 2016-04-07 2019-02-05 诺维信公司 选择具有蛋白酶活性的酶的方法
CN110079515A (zh) * 2019-05-16 2019-08-02 南京农业大学 一种棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因的原核表达方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060020124A1 (en) * 2004-07-22 2006-01-26 Asenjo Juan A Protein and nucleic acid sequence encoding a krill-derived cold adapted trypsin-like activity enzyme
CN101967469A (zh) * 2009-07-28 2011-02-09 上海雅心生物技术有限公司 一种高稳定性的重组胰蛋白酶的生产及应用
CN104726490A (zh) * 2013-12-19 2015-06-24 山东大学 表达人血清白蛋白的靶向载体及其构建方法
CN109312333A (zh) * 2016-04-07 2019-02-05 诺维信公司 选择具有蛋白酶活性的酶的方法
CN110079515A (zh) * 2019-05-16 2019-08-02 南京农业大学 一种棉铃虫中肠丝氨酸蛋白酶基因的原核表达方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
产久林等: ""南极磷虾(Euphausia superba)胰蛋白酶冷适应性研究"", 《中国水产学会学术年会论文摘要》 *
李丽莎等: ""酪氨酸相关蛋白酶1基因编码区系统发育分析和正选择位点检测"", 《中国畜牧兽医》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111662370A (zh) * 2020-07-03 2020-09-15 上海海洋大学 南极鱼hepcidin抗菌肽及其制备方法和应用
CN111662370B (zh) * 2020-07-03 2022-07-26 上海海洋大学 南极鱼hepcidin抗菌肽及其制备方法和应用

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