JP2009535043A - 新規なフィターゼのクローニング及び発現 - Google Patents
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Abstract
新規なフィターゼ酵素、この酵素をコードする遺伝子及びそれらを生産するための菌株の中間型エルシニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ Ｈ−２７）に関する。このフィターゼ酵素は以下の特性を持つ：理論分子量は４５．５ｋＤａである、比活性は３９６０±２４８（ｂ）Ｕ／ｍｇである、良好な熱の安定性と広いｐＨ作用範囲を持つ、最適なｐＨは４．５である、最適な温度は５５−６０℃である、プロテアーゼへの強い抵抗性。このフィターゼ酵素は単胃動物用添加物として非常に適当である。また、本発明は前記遺伝子を含む組換え型ベクター、この組換え型ベクターを含む宿主細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、および遺伝子研究の方法を利用してフィターゼ酵素を生産する方法に関する。 本発明はさらに飼料添加物の製造におけるフィターゼの用途及びその飼料添加物を提供する。 さらに、本発明はフィターゼ酵素の遺伝子を分離する新しい方法を提供する。
Description
本発明は、新規なフィターゼの遺伝子、この遺伝子にコードされたフィターゼタンパク、このフィターゼを生産する中間型エルシニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、宿主細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてフィターゼを発現させる方法、並びにこのフィターゼを有効成分とする飼料添加物に関する。また、本発明は標的生物体からフィターゼの遺伝子を分離するための簡単で高速な方法を提供する。
フィチン酸の燐酸塩の含有量は動物飼料に含まれたリンのおよそ５０−７０％を占める。 しかしながら、鶏やブタなどの単胃動物はフィチン酸分子から加水分解して無機のリンを分離するための消化酵素を欠いているため、リンの利用率は非常に低いである。消化されていないフィチン酸の燐酸塩は消化管を通り抜けて、排出される。これは土地と水資源に増加する燐の生態の負担に招く。それ以外に、フィチン酸はいくつかの不可欠の鉱物を螯合するため、鉱物の吸収を抑える。要するに、消化管の中で、フィチン酸は食品の栄養価と飼料の利用率を下げる。
明らかに、リン（Ｐ）は成長のための必要な元素であり、無機のリン（例えば、リン酸一水素カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｄｅｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ ｔｒｉｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）或いは動物製品（例えば、肉骨粉、フィッシュミール）は、リンに対する動物の栄養必要量を満たすために加えられるが、それが非常に高価である。
フィチン酸（ＩＰ ６： Ｉｎｏｓｉｔｏｌ Ｈｅｘｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は穀物食物又は飼料の中でのリンの主な貯蓄形式である。フィターゼは燐酸モノエステル（ｍｏｎｏｅｓｔｅｒ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を加水分解する燐酸酵素で、フィターゼから無機燐を加水分解して釈放することができる。フィチン酸は穀類と飼料中にリンＰの主な貯蓄形式である（Ｅ Ｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．１９８７）。フィターゼは植物、動物、および微生物で広く分配される。異なる由来のフィターゼの特性に基づいて分析することにより、微生物のフィターゼはより多く関心を持たれる。そして、飼料添加物として、微生物のフィターゼは典型的な単胃動物の食糧の中添加して、フィチン酸塩の栄養の利用率を高めた（Ｃｒｏｍｗｅｌｌ， ｅｔ ａｌ， １９９３）。その結果、動物飼料の中で無機燐の補充量を下げると同時に排泄物の中の燐の含有量を下げた（Ｋｏｒｎｅｇａｙ， ｅｔ ａｌ，１９９６）。また、一方、遺伝子研究技術の発展に従って、多くなる微生物菌のフィターゼはすでに分離／精製されている。
例えば、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｈｙｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｔｅｒｒｉｇｅｎａ」、 （Ｇｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ． Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． １９９７ Ｍａｙ １５； ３４１（２）：２０１−６），「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｐｈｙｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＤＳ１１」（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ， １９９８ Ｊａｎ， ２２（１）， ２−７），「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｈｙｔａｓｅ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｂｒａａｋｉｉ」（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ． ２００３ Ａｕｇ； ２５（１５）：１２３１−４），「Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｐｈｙｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｏｂｅｓｕｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｔｅｕｓ」（Ｚｉｎｉｎ ｅｔ ａｌ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． ２００４ Ｊｕｌ １５；２３６（２）：２８３−９０）；
一方、通常のフィターゼ酵素の機能の改良は部位指定突然変異誘発又は遺伝子シャフリングによって一定的な進展を得た。 例えば、“フィターゼｐｈｙＡ−ｍ は遺伝子の構造の伸張変異により酵素の耐熱性を改善する”（陳恵など、バイオロジカルエンジニアリング学報、２００５年１１月、２１巻６号、９８３−９８７）、あるいは“Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｈｙｔａｓｅ”（ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ６，８４１，３７０， Ｌｅｉ ＸＧ，２００５）。これらの得た成果により、フィターゼ酵素の製造コストは大幅に削減された。これらの利点のために、知られているフィターゼのいくつかが飼料の工業上で広範な応用を得る。
一方、通常のフィターゼ酵素の機能の改良は部位指定突然変異誘発又は遺伝子シャフリングによって一定的な進展を得た。 例えば、“フィターゼｐｈｙＡ−ｍ は遺伝子の構造の伸張変異により酵素の耐熱性を改善する”（陳恵など、バイオロジカルエンジニアリング学報、２００５年１１月、２１巻６号、９８３−９８７）、あるいは“Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｈｙｔａｓｅ”（ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ６，８４１，３７０， Ｌｅｉ ＸＧ，２００５）。これらの得た成果により、フィターゼ酵素の製造コストは大幅に削減された。これらの利点のために、知られているフィターゼのいくつかが飼料の工業上で広範な応用を得る。
しかしながら、これらの知られているフィターゼはまだ問題は存在している。 これらのフィターゼは飼料添加物として予想的な作用を発揮されない。例えば、大部分のフィターゼ酵素は飼料への加工過程の中ですでに高温によりの変性して、それらの活性を失ってしまったため、腸の中でフィターゼを分解する作用を発揮できない。その原因は酵素によって異なっているが、主に、これらの酵素の安定性が比較的に低い（ｐＨ安定性、熱の安定性、プロティナーゼ分解の安定性及び運送と貯蓄する時の安定性など）と胃腸の環境の中で活性が比較的に低いためである。
従来に使ったフィターゼ酵素は上述欠陥を存在しているため、以下のような特性を持つ新規なフィターゼ酵素を開発できることを望まれる：非常に良い安定性を持つ、動物の胃腸の中で高い活性を有し、しかもこのフィターゼ酵素は発酵技術によって大量に生産することができるべきである。このように、生産コストを大幅に下がることができて、それによってフィターゼ酵素の使用をより一層広めることができる。
また、フィターゼ酵素を分離する従来の手段は限られて、主にゲノムのライブラリを構築し、又は直接的にタンパクを精製することから着手する。しかし、この二つの手段は比較的に労働力と時間を掛かるため、効率が非常に低いと共に、非常に高価である。 そして、異なった種類でのフィターゼの一致性は比較的に低いであるため、１段の配列を得るのは比較的に困難である。よって、従来の手段を利用して１つの種に対する新しい遺伝子を得ることは新たな課題となる。
Ｅ Ｇｒａｆ， ＫＬ Ｅｍｐｓｏｎ ａｎｄ ＪＷ Ｅａｔｏｎ． Ｐｈｙｔｉｃ ａｃｉｄ． Ａ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ． ２６２， Ｉｓｓｕｅ ２４， １１６４７−１１６５０， Ａｕｇ， １９８７ Ｃｒｏｍｗｅｌｌ ＧＬ， Ｓｔａｈｌｙ ＴＳ， Ｃｏｆｆｅｙ ＲＤ， Ｍｏｎｅｇｕｅ ＨＪ， Ｒａｎｄｏｌｐｈ ＪＨ． Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｐｈｙｔａｓｅ ｉｎ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ａｎｄ ｃｏｒｎ−ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ｄｉｅｔｓ ｆｏｒ ｐｉｇｓ．Ｊ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ． １９９３ Ｊｕｌ；７１（７）：１８３１−４０． Ｋｏｒｎｅｇａｙ ＥＴ， Ｑｉａｎ Ｈ． Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｈｙｔａｓｅ ｆｏｒ ｙｏｕｎｇ ｐｉｇｓ ｆｅｄ ｏｎ ａ ｍａｉｚｅ−ｓｏｙａｂｅａｎ−ｍｅａｌ ｄｉｅｔ．Ｂｒ Ｊ Ｎｕｔｒ． １９９６ Ｏｃｔ；７６（４）：５６３−７８． Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｒ， Ｈａｌｌｅｒ Ｅ， Ｋｏｎｉｅｔｚｎｙ Ｕ， Ｊａｎｙ ＫＤ． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｈｙｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｔｅｒｒｉｇｅｎａ． Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． １９９７ Ｍａｙ １５；３４１（２）：２０１−６． Ｋｉｍ Ｙ．−Ｏ．； Ｋｉｍ Ｈ．−Ｋ．； Ｂａｅ Ｋ．−Ｓ．； Ｙｕ Ｊ．−Ｈ．； Ｏｈ Ｔ．−Ｋ． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｐｈｙｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＤＳ１１． Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ， １９９８ Ｊａｎ ，２２（１），．２−７ Ｋｉｍ ＨＷ， Ｋｉｍ ＹＯ， Ｌｅｅ ＪＨ， Ｋｉｍ ＫＫ， Ｋｉｍ ＹＪ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｈｙｔａｓｅ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｂｒａａｋｉｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ． ２００３ Ａｕｇ；２５（１５）：１２３１−４． Ｚｉｎｉｎ ＮＶ， Ｓｅｒｋｉｎａ ＡＶ， Ｇｅｌｆａｎｄ ＭＳ， Ｓｈｅｖｅｌｅｖ ＡＢ， Ｓｉｎｅｏｋｙ ＳＰ． Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｐｈｙｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｏｂｅｓｕｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｔｅｕｓ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． ２００４ Ｊｕｌ １５；２３６（２）：２８３−９０． Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｐｈｙｔａｓｅ ｂｙ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ． Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００５； ２１（６）： ９８３−９８７． Ｌｅｉ ＸＧ． Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｈｙｔａｓｅ． ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ６，８４１，３７０． ２００５ Ｌｉｕ ＹＧ， Ｗｈｉｔｔｉｅｒ ＲＦ． Ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ＰＣＲ： ａｕｔｏｍａｔａｂｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｉｎｓｅｒｔ ｅｎｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｐ１ ａｎｄ ＹＡＣ ｃｌｏｎｅｓ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｗａｌｋｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． １９９５ Ｆｅｂ １０；２５（３）：６７４−８１． ＨＹ Ｌｕｏ， Ｂ Ｙａｏ， ＴＺ Ｙｕａｎ， ＹＲ Ｗａｎｇ， ＸＹ Ｓｈｉ， ＮＦ Ｗｕ， ＹＬ Ｆａｎ． Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｈｙｔａｓｅ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｓｈｅｎｇ Ｗｕ Ｇｏｎｇ Ｃｈｅｎｇ Ｘｕｅ Ｂａｏ． ２００４ Ｊａｎ； ２０（１）：７８−８４． Ｏ． Ｓｉｍｏｎ ， Ｆ． Ｉｇｂａｓａｎ． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｈｙｔａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｖａｒｉｏｕｓ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｒｉｇｉｎｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００２， ３７， ８１３−８２２ Ａ． Ｃａｓｅｙ， Ｇ． Ｗａｌｓｈ． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｙｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＡＴＣＣ ９１４２． Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ． ２００３ Ｊａｎ；８６（２）：１８３−８．
Ｅ Ｇｒａｆ， ＫＬ Ｅｍｐｓｏｎ ａｎｄ ＪＷ Ｅａｔｏｎ． Ｐｈｙｔｉｃ ａｃｉｄ． Ａ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ． ２６２， Ｉｓｓｕｅ ２４， １１６４７−１１６５０， Ａｕｇ， １９８７ Ｃｒｏｍｗｅｌｌ ＧＬ， Ｓｔａｈｌｙ ＴＳ， Ｃｏｆｆｅｙ ＲＤ， Ｍｏｎｅｇｕｅ ＨＪ， Ｒａｎｄｏｌｐｈ ＪＨ． Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｐｈｙｔａｓｅ ｉｎ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ａｎｄ ｃｏｒｎ−ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ｄｉｅｔｓ ｆｏｒ ｐｉｇｓ．Ｊ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ． １９９３ Ｊｕｌ；７１（７）：１８３１−４０． Ｋｏｒｎｅｇａｙ ＥＴ， Ｑｉａｎ Ｈ． Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｈｙｔａｓｅ ｆｏｒ ｙｏｕｎｇ ｐｉｇｓ ｆｅｄ ｏｎ ａ ｍａｉｚｅ−ｓｏｙａｂｅａｎ−ｍｅａｌ ｄｉｅｔ．Ｂｒ Ｊ Ｎｕｔｒ． １９９６ Ｏｃｔ；７６（４）：５６３−７８． Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｒ， Ｈａｌｌｅｒ Ｅ， Ｋｏｎｉｅｔｚｎｙ Ｕ， Ｊａｎｙ ＫＤ． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｈｙｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｔｅｒｒｉｇｅｎａ． Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． １９９７ Ｍａｙ １５；３４１（２）：２０１−６． Ｋｉｍ Ｙ．−Ｏ．； Ｋｉｍ Ｈ．−Ｋ．； Ｂａｅ Ｋ．−Ｓ．； Ｙｕ Ｊ．−Ｈ．； Ｏｈ Ｔ．−Ｋ． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｐｈｙｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＤＳ１１． Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ， １９９８ Ｊａｎ ，２２（１），．２−７ Ｋｉｍ ＨＷ， Ｋｉｍ ＹＯ， Ｌｅｅ ＪＨ， Ｋｉｍ ＫＫ， Ｋｉｍ ＹＪ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｈｙｔａｓｅ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｂｒａａｋｉｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ． ２００３ Ａｕｇ；２５（１５）：１２３１−４． Ｚｉｎｉｎ ＮＶ， Ｓｅｒｋｉｎａ ＡＶ， Ｇｅｌｆａｎｄ ＭＳ， Ｓｈｅｖｅｌｅｖ ＡＢ， Ｓｉｎｅｏｋｙ ＳＰ． Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｐｈｙｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｏｂｅｓｕｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｔｅｕｓ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． ２００４ Ｊｕｌ １５；２３６（２）：２８３−９０． Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｐｈｙｔａｓｅ ｂｙ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ． Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００５； ２１（６）： ９８３−９８７． Ｌｅｉ ＸＧ． Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｈｙｔａｓｅ． ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ６，８４１，３７０． ２００５ Ｌｉｕ ＹＧ， Ｗｈｉｔｔｉｅｒ ＲＦ． Ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ＰＣＲ： ａｕｔｏｍａｔａｂｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｉｎｓｅｒｔ ｅｎｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｐ１ ａｎｄ ＹＡＣ ｃｌｏｎｅｓ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｗａｌｋｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． １９９５ Ｆｅｂ １０；２５（３）：６７４−８１． ＨＹ Ｌｕｏ， Ｂ Ｙａｏ， ＴＺ Ｙｕａｎ， ＹＲ Ｗａｎｇ， ＸＹ Ｓｈｉ， ＮＦ Ｗｕ， ＹＬ Ｆａｎ． Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｈｙｔａｓｅ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｓｈｅｎｇ Ｗｕ Ｇｏｎｇ Ｃｈｅｎｇ Ｘｕｅ Ｂａｏ． ２００４ Ｊａｎ； ２０（１）：７８−８４． Ｏ． Ｓｉｍｏｎ ， Ｆ． Ｉｇｂａｓａｎ． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｈｙｔａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｖａｒｉｏｕｓ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｒｉｇｉｎｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００２， ３７， ８１３−８２２ Ａ． Ｃａｓｅｙ， Ｇ． Ｗａｌｓｈ． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｙｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＡＴＣＣ ９１４２． Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ． ２００３ Ｊａｎ；８６（２）：１８３−８．
従来の技術における問題を解決するために、本発明者たちは中国の１番氷河（新疆）の凍土の中の数千種類の菌株から１本のフィターゼ酵素を生産する微生物を分離された。しかもフィターゼ活性を有するタンパクをコードしたヌクレオチド配列を特定した。例えばＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどの宿主細胞の中で、フィターゼの発現量は比較的に高いレベルに達した。その結果、組換え型のＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ発現システムは工業生産に適することを知られた。 そして、この新しいフィターゼはいくつかの非常に優良な特性を持つため、飼料の利用効率を高めることもできる。
そのため、一方、本発明は新規なフィターゼ酵素を生産する中間型エルシニア菌を提供する。
また、本発明は新規なフィターゼ活性を有するタンパクをコードする新しい遺伝子を提供し、この遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２に開示されたヌクレオチド配列或いはその誘導体配列を含む。
また、本発明は以下の特性を持つフィターゼを提供する： 理論分子量は４６ｋＤａである、最適なｐＨ は４．０−５．０範囲内である、最適な温度は５０−６０℃範囲内である、 理論ｐＩ値は７．７である、比活性は３０００Ｕ／ｍｇ以上である、しかもペプシンとトリプシンへの高い抵抗性を持つこと。 このようなフィターゼはエルシニア属の微生物から分離され、好ましいのは中間型エルシニア菌である。
また、本発明は分離された蛋白に関する。このタンパクは以下のポリペプチドから選ばれた：
ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に開示されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に開示されたポリヌクレオチド又はこのポリヌクレオチドの縮重配列にコードされたポリペプチド、
ｃ） 厳格な条件の下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２に開示されたポリヌクレオチドの補足的なチェーンに交配されるポリヌクレオチドにコード化されるフィターゼ活性を有するポリペプチド、
ｄ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に開示されたポリヌクレオチドの対立遺伝子又は自然な異形にコード化されるフィターゼ活性を有するポリペプチド、
ｅ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に開示されたポリペプチド配列から一つ又は多数のアミノ酸の残基の代替、削除、また／或いは挿入によって誘導されるフィターゼ活性を有するポリペプチド、
ｆ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に開示されたアミノ酸とは少なくとも６０％、最適は６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、あるいは少なくとも９０％、特に好ましいのは９５％の一致率を有するフィターゼ活性を有するポリペプチド。
ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に開示されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に開示されたポリヌクレオチド又はこのポリヌクレオチドの縮重配列にコードされたポリペプチド、
ｃ） 厳格な条件の下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２に開示されたポリヌクレオチドの補足的なチェーンに交配されるポリヌクレオチドにコード化されるフィターゼ活性を有するポリペプチド、
ｄ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に開示されたポリヌクレオチドの対立遺伝子又は自然な異形にコード化されるフィターゼ活性を有するポリペプチド、
ｅ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に開示されたポリペプチド配列から一つ又は多数のアミノ酸の残基の代替、削除、また／或いは挿入によって誘導されるフィターゼ活性を有するポリペプチド、
ｆ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に開示されたアミノ酸とは少なくとも６０％、最適は６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、あるいは少なくとも９０％、特に好ましいのは９５％の一致率を有するフィターゼ活性を有するポリペプチド。
特に、本発明は遺伝子組ＤＮＡからフィターゼの遺伝子を分離する簡単かつ効果的な新しい方法を提供する。この方法は以下のことを含む：
ａ） フィターゼ酵素保守配列のＲＨＧＸＲＸＰとＨＤに基づいて１組の縮重プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ）を設計する；
ｂ） 前記プライマーを用いてＰＣＲによって一部のフィターゼ酵素の配列を増幅する；
ｃ） さらにＴＡＩＬ−ＰＣＲによってフィターゼ酵素の全配列を得ること。
ａ） フィターゼ酵素保守配列のＲＨＧＸＲＸＰとＨＤに基づいて１組の縮重プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ）を設計する；
ｂ） 前記プライマーを用いてＰＣＲによって一部のフィターゼ酵素の配列を増幅する；
ｃ） さらにＴＡＩＬ−ＰＣＲによってフィターゼ酵素の全配列を得ること。
また、本発明は前記フィターゼをコードする核酸分子を含む組換え型ベクターと、この組換え型ベクターまたは核酸分子を導入した組換え型宿主細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、および宿主細胞の中でフィターゼを発現させる方法を提供する。
さらに、本発明は前記フィターゼ酵素又はこの酵素の生産菌株の飼料添加物の製造における使用、および有効成分としたタンパク及び／又は宿主細胞を含む飼料添加物に関する。本発明に記載された飼料添加物はフィチン酸の加水分解を促進するフィターゼを含むため、動物飼料の製造に有効に利用される。
生物材料の保存について
本発明者によって分離された中間型エルシニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉ）Ｈ−２７はすでに２００６年４月２５日に中国の北京市中国科学院微生物研究所内の中国微生物菌種管理保存委員会普通微生物センター（ＣＧＭＣＣ）に保存され、保存番号：ＣＧＭＣＣ １７０２。
配列の簡単な説明
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１：中間型エルシニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）Ｈ−２７の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２：新規なフィターゼの核酸配列；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３：新規なフィターゼのアミノ酸配列；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４：フィターゼの遺伝子をクローンした順方向の縮重プライマー配列；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５：フィターゼの遺伝子をクローンした逆方向の縮重プライマー配列。
（発明の詳細な説明）
上記目的を達成するために、まず、本発明はフィターゼ活性を有する菌株を提供する。 この菌株は中国一番の氷河凍土サンプル（新彊地区）から分離された。この菌株が発生したフィターゼ活性は硫酸第一鉄のモリブデン青法を通って測定される。そして、１６ｓ ｒＲＮＡ配列の分析によってフィターゼ活性を示す菌株を特定された。その結果、１６Ｓ ｒＤＮＡの基本配列はＹｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａと９９．５％の一致率が確認され、及びＹｅｒｓｉｎｉａ ａｌｄｏｖａｅ とＹｅｒｓｉｎｉａ ｍｏｌｌａｒｅｔｉｉ配列との９９％の一致率が確認されたため、本発明の菌株は新規な菌株であることが確定できる。
本発明者によって分離された中間型エルシニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉ）Ｈ−２７はすでに２００６年４月２５日に中国の北京市中国科学院微生物研究所内の中国微生物菌種管理保存委員会普通微生物センター（ＣＧＭＣＣ）に保存され、保存番号：ＣＧＭＣＣ １７０２。
配列の簡単な説明
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１：中間型エルシニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）Ｈ−２７の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２：新規なフィターゼの核酸配列；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３：新規なフィターゼのアミノ酸配列；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４：フィターゼの遺伝子をクローンした順方向の縮重プライマー配列；
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５：フィターゼの遺伝子をクローンした逆方向の縮重プライマー配列。
（発明の詳細な説明）
上記目的を達成するために、まず、本発明はフィターゼ活性を有する菌株を提供する。 この菌株は中国一番の氷河凍土サンプル（新彊地区）から分離された。この菌株が発生したフィターゼ活性は硫酸第一鉄のモリブデン青法を通って測定される。そして、１６ｓ ｒＲＮＡ配列の分析によってフィターゼ活性を示す菌株を特定された。その結果、１６Ｓ ｒＤＮＡの基本配列はＹｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａと９９．５％の一致率が確認され、及びＹｅｒｓｉｎｉａ ａｌｄｏｖａｅ とＹｅｒｓｉｎｉａ ｍｏｌｌａｒｅｔｉｉ配列との９９％の一致率が確認されたため、本発明の菌株は新規な菌株であることが確定できる。
この菌株は大腸菌と同じ位の大きさを持つグラム陰性の桿菌であり、菌株の成長のための最適な温度は３０℃であって、光学顕微鏡の下で確認される。生理の生物化学的な特性の調査から、この菌株は通性嫌気性微生物であると確認され、つまり酸素のあるなしにかかわらず良い成長ができると言える。
この菌株の形態、生物特性及び１６ＳｒＤＮＡの配列に基づき研究した結果として、本発明で分離された菌株は「Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ Ｈ−２７」と命名され、すでに２００６年４月２５日に中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センター（ＣＧＭＣＣ）に保存され、保存番号：ＣＧＭＣＣ １７０２。
本発明は以下の特性を持つフィターゼ酵素を提供する： 理論分子量は４６ｋＤａである；最適なｐＨ は４．０−５．０範囲内である；最適な温度は５０−６０℃範囲内であり、好ましいのは５５℃である； 理論ｐＩ値は７．７である；比活性は３０００Ｕ／ｍｇ以上と高いレベルであり、好ましいのは３３００ Ｕ／ｍｇ以上であり、例えば、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００或いは４５００ Ｕ／ｍｇである。しかもペプシンとトリプシンへの高い抵抗性を持つ。 このようなフィターゼ酵素はエルシニア菌に属す微生物から分離され、好ましいのは中間型エルシニア菌である。
また、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ３に開示されたアミノ酸配列を含む分離されたタンパクを提供する。この酵素はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２に開示されたポリヌクレオチド又はその縮重配列にコードされたことが好ましい。また、他の実施例では、本発明は前記タンパクの誘導体を提供し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ３に開示されたポリペプチド配列から一つ又は多数（例えば、一つ又は数個、或いは例え１ −１０から選択された１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の値、或いはその範囲内の値である）のアミノ酸の残基の代替、削除、また／或いは挿入によって誘導され、かつフィターゼ活性を有する。例えば、一般的な戦略としては保守的なアミノ酸の代替であり、即ち、アミノ酸残基を同様の側鎖を有するアミノ酸残基に取り替える。 同様の側鎖を有するアミノ酸残基の一族は本技術分野ではすでに定義される。 これらの一族は以下のアミノ酸を含む：アルカリ性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電されていない極側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロジン、システイン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β枝の側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。 したがって、１つ以上のアミノ酸残基の同じ側鎖の別のアミノ酸残基との取替えは、実質的に前述のフィターゼ酵素の活性を変えることがない。そのほか、遺伝子のクローニングの中で、通常、酵素認識サイトが設計されていることがよく知られている。これはきっと発現されたタンパクの端で１つあるいは多数の関係がないアミノ酸残基を取り入れるが、ターゲットタンパクの活性には影響しない。また、融合タンパクを組み立てることと、組み換えタンパクの発現を機能することと、宿主細胞の外に自動的に分泌された組み換えタンパクを得ることと、或いは組み換えタンパクの精製への役立ちのために、通常はいくつかのアミノ酸をタンパクのＮ端末、Ｃ端末あるいはこのタンパク内のその他の適当な領域内へ添付させる。例えば、リーダー・ペプチド、信号ペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、リーダーペプチド（ｌｅａｄｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）、端末の拡大、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、麦芽糖のＥ結合タンパク、タンパクＡ、６Ｈｉｓ又はＦｌａｇなどのタグ、或いはＸａ因子（Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ）、トロンビンまたはエンテロキナーゼのタンパク加水分解酵素サイト。
また、他の実施例では、本発明に記載されたフィターゼ活性を有するタンパクは、厳格な条件下で配列リストのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２に開示されたヌクレオチド配列と交雑したヌクレオチド配列にコードされたアミノ酸配列を含む。ここに記載するように、「厳格な条件下で交雑」と言う用語は、互いにおける少なくとも６０％の同じ由来のヌクレオチド配列が互いに交雑できる交雑と洗浄条件である。このような厳格な条件下で、通常、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約７５％以上の同じ由来性の配列は互いに交雑できる。上記厳格な条件は当業者にとっては知られるもので、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６に記載されている。厳格な交雑条件の一最良な実施形態でもあり、非制限性の一実施例としては以下のようである：６×ＳＳＣの中で４５℃で交雑し、そして０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの中で５０−６５℃で一回又は数回を洗浄する。そして、交雑温度を上げることによってさらに厳格な条件を得ることができるとわかった。例えば、５０℃、５５℃、６０℃または６５℃まで上げることによってさらに厳格な条件を実現される。
また、自然な変異による遺伝多型性は群体の中で個別的に存在できることが当業者にとって理解される。そのような自然な変異はフィターゼの遺伝子のヌクレオチド配列の中で、１−５％の相違を招くことが予想される。 もちろん、このフィターゼ酵素における自然な変異による発生するかつフィターゼの機能活性を変更しないいずれか又はすべてのヌクレオチド変異及び得られたアミノ酸ポリモフィズムも本発明の範囲内である。 したがって、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に開示されたポリヌクレオチド分子の対立遺伝子あるいは自然変異体にコードされたフィターゼ活性を有するポリペプチドを提供する。
また、他の実施例では、フィターゼタンパクは、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％；或いは少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％；或いは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％；或いは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％；さらに好ましくは少なくとも約９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％；より好ましくは少なくとも約９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％以上に、本発明が記述したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に開示された全長アミノ酸配列に同じ由来の活性タンパクである。また、上記範囲内の中間値及び一致率を有する値（例えば、６０−９０％の相同由来或いは９８．１−９９．９％の一致率）も本発明に含まれている。例えば、上記数値のいずれかの組み合わせを使用して上限そして／または下限の一致率値の範囲も含まれている。 ２つの配列を比較して、同由来のパーセント率を確定することがよく知られる。数学のアルゴリズムを使用することによって実行され、例えば、市販のソフトウェアや公用のデータベースに統合されたソフトウェアなど：例えば多重整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬ ＷのＢＬＯＣＫＳかＢＬＡＳＴなど。また、分析される特定な配列ための各プログラムのパラメタ（例えば、ブランチ値、字の長さ、ギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）、重みなど）を最適化する方法が当業者に知られるものである。 ＧｅｎＢａｎｋのＢＬＡＳＴのパラメタのデフォルトセットを利用して、以下の整列結果を得た。
一方、本発明は新規なフィターゼの遺伝子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２を提供する。また、本発明はさらに、遺伝情報の縮重性によって本発明のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２に開示されたヌクレオチド配列の一つと異なる核酸分子及びコードされたフィターゼタンパクを提供する。また、ほかの実施例のなかで、本発明の分離された核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ３に開示されたアミノ酸配列を有するタンパクをコードするヌクレオチド配列を有する。また、さらにほかの実施例のなかで、本発明の核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ３に開示されたアミノ酸配列と略一致する全長フィターゼタンパクをコードする。例えば、一つ又は多数（例えば、一つ又は数個、或いは１〜１０からの数値）のアミノ酸の残基の代替、削除、また／或いは挿入によってＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ３に開示されたタンパク、或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ３に開示されたアミノ酸配列と少なくとも９９％同じ由来のタンパク。該核酸分子は、好ましくは少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％；或いは少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％；或いは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％；さらに好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．７％、９７．８％、９７．９％；或いは少なくとも約９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％；特に好ましくは少なくとも約９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％以上に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２に同じ由来するヌクレオチド配列である。また、上記範囲内の中間値及び一致率を有する値（例えば、７６〜９７％の同じ由来或いは９７．８〜９９．９％の一致率）も本発明に含まれている。ＧｅｎＢａｎｋのＢＬＡＳＴのパラメタのデフォルトセットを利用して、以下の整列結果を得た。
また、その一方、本発明は前記フィターゼ酵素の遺伝子を含む組換え型ベクターと、この組換え型ベクター又は前記遺伝子を導入した宿主細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、および宿主細胞の中でフィターゼ酵素を発現させる方法を提供する。用語「ベクター」とは、リンクされた別の核酸を運ぶ核酸分子であり、例えばプラスミド（核外遺伝子）あるいはウィルスベクター（キャリヤー）を指す。本発明の組換え型発現ベクターは、宿主細胞の中で核酸の発現に適したフォームの本発明の核酸を含む。これは、組換え型発現ベクターは、発現させるために利用された宿主細胞に基づいて選択された一つ又は多数の調節配列を含むと意味する。また、発現された核酸に作動的にリンクされる。組換え型発現ベクターの中では、「作動的にリンクされる」とは、目標ヌクレオチド配列が該ヌクレオチド配列の発現を許可する形で調節配列にリンクされることを意味する（例えば、生体外の転写／翻訳システム、または、ベクターが宿主細胞に導入される宿主細胞の中）。「調節配列」という用語がプロモーター、リプレッサー結合部位、活性剤の拘束力があるサイト、エンハンサ、および他の発現制御要素（例えば、ターミネータ、ポリアデニル化信号、またはｍＲＮＡ二次構造の他の要素）を含んでいる。また、発現ベクターのデザインは例えば転化する宿主細胞の選択、必要なタンパクの発現レベルなどにかかることが当業者に知られている。したがって、融合タンパクを含むタンパク又はペプチドを作り出すために、本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入することができる。
本発明の組換え型発現ベクターは原核細胞（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ）又は真核細胞におけるフィターゼタンパクの発現のために設計される場合がある。例えば、大腸菌の細菌性細胞、酵母（例えば、メタノール資化酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、黒麹カビＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒなど）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用するＳｆ９細胞又はカイコの細胞）、または、植物の細胞（アグロバクテリウムツメファシエンスによって調停されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、タバコ、トウモロコシなど）の中で、フィターゼ遺伝子を発現させることができる。したがって、本発明は、本発明の組換え型発現ベクターが導入された宿主細胞に関し、好ましくはメタノール資化酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである。その宿主細胞はいかなる原核細胞又は真核細胞であっでもよく、上述した宿主細胞も含まれるが、それに限らない。メタノール資化酵母細胞Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓであることが好ましい。メタノール資化酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは唯一の炭素源としてメタノールを代謝できるメチロトローフ酵母である。このシステムは高いレベルの異種タンパクを発現させる性能を有するため、よく知られている。有効な発現システムとして、多くのフィターゼ遺伝子はメタノール資化酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの中で発現された。もちろん、本発明が提供した新規なフィターゼ遺伝子もメタノール資化酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの中で発現され、しかも高いレベルの発現を有する。５００ｍｌのフラスコで４８時間を引き起こした後、細胞外のフィターゼ活性は３８９ Ｕ／ｍｌに達する。 それで、発酵をすることによって、フィターゼを大量生産するのが非常に簡単となって、しかもコストはこれまで以上に低くなる。
通常の転化及び移入技術によって原核細胞又は真核細胞にベクターのＤＮＡを導入できる。ここに使用されるように、用語「転化」、「移入」、「接合」、および「トランスダクション」とは、異なる由来の核酸（例えば、線形のＤＮＡあるいはＲＮＡ （例えば、線形性ベクター或いはベクターのない単独な遺伝子構造物）、又はベクター形式の核酸（例えば、プラスミドは、コスミド（ｃｏｓｍｉｄ）、バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）、ｐｈａｇｅｍｉｄ、ＰｈａｓｔＧｅｌ、トランスポゾン（Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）または他のＤＮＡ）を宿主細胞の中へ導入するためのさまざまな技術であり、燐酸カルシウムあるいは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストランの形質移入、リポフェクション、自然感受性、化学形質の転送或いは電気穿孔法変形などが含まれる。宿主細胞を転換又は移入する適当な方法は、《分子のクローン》実験室の手帳の第２版、冷泉港の実験室の出版社、 ＮＹ， １９８９，Ｓａｍｂｒｏｏｋなど研究者、及びその他の実験室の手帳中に記載されている。
本発明の宿主細胞（例えば、培養された原核又は真核宿主細胞）はフィターゼタンパクを製造する（即ち、発現させる）ことができる。従って、本発明はさらに本発明の宿主細胞を利用してフィターゼタンパクを作り出す方法を提供する。１つの実施例の中で、この方法は、フィターゼタンパクが作り出されるまで、適当な培地の中で本発明の宿主細胞を培養する（なお、フィターゼタンパクをコードする組換え型発現ベクターを導入した、或いは、遺伝子組の中で野生型あるいは変更されたフィターゼタンパクをコードする遺伝子を導入した）ことを含む。また、他の実施形態では、この方法は培地あるいは宿主細胞からフィターゼを分離することを含む。
また一方、本発明はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｒｏｉｓで発現されたフィターゼに関する。フィターゼの分析評価を確かめるために、硫酸アンモニウム析出や、透析や、限外濾過やクロマトグラフィーなどの簡単な方法によって、フィターゼを精製された。このような簡単な精製の後に、フィターゼの純度は、酵素の特性を研究するために十分である。精製された組み換え型フィターゼ酵素の分子量は４５ ｋＤａであり、かつ基板としてフィチン酸を使用するときは活性化される。フィターゼ酵素は５０−６０℃の下に高い酵素活性を示す酸性の酵素で、そして、５５℃で最適な活性が観測される。ｐＨ １−１０の間では非常に安定している酵素活性を持つ、ｐＨ４−５の間では最も良い活性が観測され、そして、最適なｐＨは４．５である。Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋、およびＣｕ２＋によって、酵素活性は強く抑制されて、その他の金属イオンはこの酵素に対して明らかな影響がないと見られる。同時に、この酵素は高い温度下で良い安定性を持って、この酵素を８０℃で１時間放置する時に、４０％の酵素活性が保留される。それ以外に、このフィターゼ酵素はペプシン、トリプシンに対してもとても強い抵抗性を示している。
さらに、本発明は前記フィターゼ酵素又はフィターゼを生産する宿主細胞の飼料添加物の製造における用途、および有効成分とした前述タンパク及び／又は宿主細胞を含む飼料添加物に関する。本発明に記載された飼料添加物は飼料穀類の中で燐の利用を高めるフィターゼ酵素を含むため、動物飼料の生産に有効に利用される。
本発明の飼料添加物は、粉状又は液体の調合剤として生産され、さらに１種あるいは多種の追加した酵素の調合剤を含むことができる。この追加した酵素の調合剤も粉状あるいは液体の調合剤の形式であることができて、以下の酵素を含むグループから選ぶことができる：ケラチナーゼ（Ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ）、リパーゼ（ ｌｉｐａｓｅ：脂肪分解酵素）およびブドウ糖を生む酵素。例えば、加水分解でんぷんとグリコーゲンのα−１，４グリコシド鍵のアミラーゼ、有機燐酸を加水分解する燐酸酵素、セルロースを分解するカルボキシメチル・セルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）の酵素、キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）を分解するキシラナーゼ（ｘｙｌａｎａｓｅ）、麦芽糖（マルトース）を２種類のブドウ糖に加水分解するマルターゼ、及び蔗糖をブドウ糖果糖混合物に加水分解する転化酵素。
フィターゼ及び／あるいはフィターゼを生産する微生物に加え、本発明の飼料添加物はさらに他の非病原微生物を含むことができる。これら追加される微生物は、プロティナーゼ、リパーゼ、およびインヴェルターゼを転化する枯草菌から成るグループから選択できる。例えば、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のプロバイオティクス、嫌気性の状態で有機化合物の能力と生理活性を分解する乳酸菌、家畜の体重を増加させ、ミルクの生産を高め、そして飼料の消化と吸収に役立つアスペルギルス属の糸状菌類、及び清酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母。
本発明は、ゲノムのＤＮＡからフィターゼの遺伝子を得る簡単で効果的な方法を提供する。 新しいフィターゼの遺伝子を得る２つの従来の方法がある：その１つは、新しいフィターゼの遺伝子がゲノムライブラリから分離される；もう一つは、タンパクから始まるという。 しかしながら、従来の方法は、非常に時間と労働力をかかると共に困難で、しかも非常に高価である。上記の課題を解決するために、私たちは様々な知られている技術をとかすことによって容易にフィターゼの遺伝子を得ることができる方法を開発しようと努力した。具体的に、主なフィターゼ酵素の主要な種類としてのヒスチジン酸性の燐酸酵素のアミノ酸配列を分析することによって、私たちはＢＬＯＣＫＳ［ｈｔｔｐ：／／ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ．ｏｒｇ／ｂｌｏｃｋｓ／ ｍａｋｅ＿ｂｌｏｃｋｓ．ｈｔｍｌ］を利用して、ヒスチジン酸性の燐酸酵素の中で２つの保守的な配列ＲＨＧＸＲＸＰとＨＤを見つかった。この２つの保守的な配列と異なる生物の中のコドン偏位（ｃｏｄｏｎ ｂｉａｓ）に基づいて、私達は縮重プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ） を設計した：順方向縮重プライマー、ＦＩ （Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ）：５’−ＧＴＫＳＴＫＡＷＷＫＴＳＡＧＹＣＧＣＣＡ−３’ （２０ｍｅｒ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４） 、及び逆方向縮重プライマー、ＲＩ （Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ）：５’−ＴＷＫＧＣＭＡＫＲＴＴＲＧＴＡＴＣＲＴＧ −３’ （２０ｍｅｒ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）。または、ＰＣＲによって染色体のＤＮＡからフィターゼ遺伝子配列（それぞれの略語の意味は以下の表３に示される）の一部を増幅した。この一部の配列は、すでに知っているヒスチジン酸性の燐酸酵素の中でおよそ９００ ｂｐ、そして、この一部の配列のサイズに応じて、アガロースゲルの上で電気泳動により増幅した配列をふるい分ける（ｓｃｒｅｅｎ）ことができる。そして、獲得した９００ ｂｐの配列は序文とＢＬＡＳＴ分析を測ることを行う。ＢＬＡＳＴ分析の結果によって、獲得した９００ ｂｐの配列は新規なフィターゼ遺伝子であるかを判断できる。
上記分析の結果はこの９００ｂｐの配列は一部の新規なフィターゼ遺伝子であれば、次のステップではフィターゼ遺伝子の全配列を得ることに進む。ＴＡＩＬ−ＰＣＲ（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， １９９５）によって、この一部の配列の上下流の領域をそれぞれにクローンして、可能なフィターゼ遺伝子の全配列を得る。
従来の方法と比べ、新規な方法は非常に便利かつ有効で、安価で簡単に新規なフィターゼ遺伝子を得ることができる。この方法によって、私達はすでに２つの新規なフィターゼ遺伝子を得た（一つは、本発明で説明された中間型エルシニア菌Ｈ−２７（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉ Ｈ−２７）、もう一つは、本発明者の別出願に記載されたシトロバクター・ アマロナテカス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ）である）。
以下、具体的な実施例及び図面に基づいて本発明をより詳細的に説明する。なお、あくまでも例示の目的のために提供されるものであり、そして如何なる様式においても本発明の範囲を限定することを意図しない。
フィターゼを生産する菌の分離
フィターゼを生産する菌株は中国一番の氷河（新彊地区）の凍土サンプルから分離された。具体的に、フィターゼを生産する菌株を分離するために、２００５年４月に中国一番の氷河（新彊地区）の凍土サンプルを採集し、そして、それが実験室で操作加工することができるまで、冷凍庫の中に数日間を格納された。凍土は、滅菌水の中で浮遊され、そして希釈された。その後、異なったサンプルの懸濁コロイド溶液は寒天のないＬＢ培地の中に接種され、そしてそれぞれ４℃、１０℃、１５℃と３０℃の下で１−２日間を育成した。さらに、硫酸第一鉄のモリブデン青法（詳しくは下記の実施例４に記載される）によって、異なった温度及び異なったサンプルの培養液とセル分裂溶液におけるフィターゼ活性を測定した。セル分裂溶液におけるフィターゼ活性は測定されるもので、これらの菌株は細胞内のフィターゼ活性を有することが示される。まず、フィターゼ活性を有するサンプルを選択して、適切な育成温度は３０℃であることを判定した。フィターゼ活性を有するサンプルは希釈されて、１．５％寒天を有するＬＢ培地に塗布られ、そして３０℃の培養箱の中で一日育成した。様々な形態のクローンを選択し、５ｍｌのＬＢ培地に接種して、一夜を経って培養した。そして、セル分裂溶液におけるそれぞれのコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）のフィターゼ活性を測定した。最後に、選択されたコロニーの中から最も高いフィターゼ活性を示す菌株を選択し、この菌株にＨ−２７として付番した。
フィターゼを生産する菌株は中国一番の氷河（新彊地区）の凍土サンプルから分離された。具体的に、フィターゼを生産する菌株を分離するために、２００５年４月に中国一番の氷河（新彊地区）の凍土サンプルを採集し、そして、それが実験室で操作加工することができるまで、冷凍庫の中に数日間を格納された。凍土は、滅菌水の中で浮遊され、そして希釈された。その後、異なったサンプルの懸濁コロイド溶液は寒天のないＬＢ培地の中に接種され、そしてそれぞれ４℃、１０℃、１５℃と３０℃の下で１−２日間を育成した。さらに、硫酸第一鉄のモリブデン青法（詳しくは下記の実施例４に記載される）によって、異なった温度及び異なったサンプルの培養液とセル分裂溶液におけるフィターゼ活性を測定した。セル分裂溶液におけるフィターゼ活性は測定されるもので、これらの菌株は細胞内のフィターゼ活性を有することが示される。まず、フィターゼ活性を有するサンプルを選択して、適切な育成温度は３０℃であることを判定した。フィターゼ活性を有するサンプルは希釈されて、１．５％寒天を有するＬＢ培地に塗布られ、そして３０℃の培養箱の中で一日育成した。様々な形態のクローンを選択し、５ｍｌのＬＢ培地に接種して、一夜を経って培養した。そして、セル分裂溶液におけるそれぞれのコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）のフィターゼ活性を測定した。最後に、選択されたコロニーの中から最も高いフィターゼ活性を示す菌株を選択し、この菌株にＨ−２７として付番した。
フィターゼを生産する菌Ｈ−２７の特性の分析
上記実施例１で分離されたＨ−２７菌は、グラム染色 （Ｇｒａｍ ｓｔａｉｎｉｎｇ）によりグラム陰性菌であると確認された。この菌は典型的な桿菌で、光学顕微鏡の下で大腸桿菌に似ているサイズを持つ。さらに、その一部の生理の生化学的な特性を研究した。その結果、この菌はグラム陰性で、通性嫌気性微生物であり、酸素のあるなしにかかわらず成長することができると確認された。そして、成長のための最適な温度は３０℃であることがわかった。また、この菌の１６ｓ ｒＲＮＡ配列についても分析した。Ｐｒｏｍｅｇａ Ｔａｑ精製キット（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使って、ＰＣＲによってこの菌の１６ＳｒＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １）を増幅し、そして、ＢＬＡＳＴと多重整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬ Ｗを使用することによって、この菌の１６ＳｒＤＮＡ配列とＧｅｎＢａｎｋにおける参照配列を整列した。その結果、１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列は、中間型エルシニア菌との９９．５％の一致率を示した；エルシニア・アルドバエ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ａｌｄｏｖａｅ）とＹｅｒｓｉｎｉａ ｍｏｌｌａｒｅｔｉｉの１６ｓ ｒＤＮＡ配列との９９％の一致率を示した。従って、選択された菌株の形態、生理及び１６Ｓ ｒＤＮＡの研究結果に基づいて、この菌は新規な中間型エルシニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）であると確定された。
上記実施例１で分離されたＨ−２７菌は、グラム染色 （Ｇｒａｍ ｓｔａｉｎｉｎｇ）によりグラム陰性菌であると確認された。この菌は典型的な桿菌で、光学顕微鏡の下で大腸桿菌に似ているサイズを持つ。さらに、その一部の生理の生化学的な特性を研究した。その結果、この菌はグラム陰性で、通性嫌気性微生物であり、酸素のあるなしにかかわらず成長することができると確認された。そして、成長のための最適な温度は３０℃であることがわかった。また、この菌の１６ｓ ｒＲＮＡ配列についても分析した。Ｐｒｏｍｅｇａ Ｔａｑ精製キット（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使って、ＰＣＲによってこの菌の１６ＳｒＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １）を増幅し、そして、ＢＬＡＳＴと多重整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬ Ｗを使用することによって、この菌の１６ＳｒＤＮＡ配列とＧｅｎＢａｎｋにおける参照配列を整列した。その結果、１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列は、中間型エルシニア菌との９９．５％の一致率を示した；エルシニア・アルドバエ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ａｌｄｏｖａｅ）とＹｅｒｓｉｎｉａ ｍｏｌｌａｒｅｔｉｉの１６ｓ ｒＤＮＡ配列との９９％の一致率を示した。従って、選択された菌株の形態、生理及び１６Ｓ ｒＤＮＡの研究結果に基づいて、この菌は新規な中間型エルシニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）であると確定された。
以上の結果と研究プロセスの中で使う記録号に基づいて、この菌株は“中間型エルシニア菌Ｈ−２７”と命名され、そして２００６年４月２５日に中国微生物菌種管理委員会の普通微生物センター（ＣＧＭＣＣ）に保存請求を提出し、保存番号はＣＧＭＣＣ １７０２である。
フィターゼ遺伝子のクローニング
タンパクの遺伝子はマルチ遺伝子ファミリーの知られているメンバーであると、同じ由来のクローニングは、非常に有効かつ簡単である。
タンパクの遺伝子はマルチ遺伝子ファミリーの知られているメンバーであると、同じ由来のクローニングは、非常に有効かつ簡単である。
明らかに、フィターゼの分類に基づいて、大部分の細菌由来のフィターゼはヒスチジン酸ホスファターゼ（ＨＡＰ）の一族に属す。多重整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬ ＷとＢＬＯＣＫＳ（ ｈｔｔｐ：／／ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ．ｏｒｇ／ｂｌｏｃｋｓ／ｍａｋｅ＿ｂｌｏｃｋｓ．ｈｔｍｌ ）によって、ＨＡＰ族の様々な配列を分析した結果、ＨＡＰ酵素の中に２つの保守的な領域、すなわち、ＲＨＧＸＲＸＰおよびＨＤがあることがわかった。そして、この２つの保守的な領域に基づいて、１組の縮重プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ）を設計することができて、それによってＰＣＲを通じて中間型エルシニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）のゲノムＤＮＡの中から一部のフィターゼ配列を増幅することができる。
＜３−１＞フィターゼの遺伝子配列の一部を獲得
２つの保守的な領域によって縮重プライマーを設計して、そしてＤＮＡシンセサイザを使って統合した。中間型エルシニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、ＰＣＲの増幅を行った。縮重プライマー及びゲノムＤＮＡテンプレートを除いて、他のＰＣＲ増幅に利用された試薬は全部ＴＩＡＮＧＥＮ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤから購入した。ＰＣＲパラメーターを最適化することによって、私達はＰＣＲ焼きなまし温度が５０℃であり、そしてＰＣＲの反応条件は以下の通りでした： １つのサイクル、９５℃では、２分間；３０のサイクル、９５℃，３０秒／焼戻しの温度、３０秒／ ７２℃，１分間；最後に７２℃で５分延びて、ＰＣＲ産物は４℃で保存した。ＰＣＲ増幅産物はアガロース・ゲルの上で電気泳動によって測定して、縮重プライマーによって増幅された一連のバンドが観測された。適当なＤＮＡラダーを使って、所望サイズ（９００ｂｐ）のバンドを選択することができる。その結果、ＴａＫａＲａのアガロースゲルの回収精製キット（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）によって、約９００ｂｐのＤＮＡバンドサイズが回収され、さらにそれをｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）までクローンし、それから大腸菌ＪＭ１０９を転化した。目標ＤＮＡ断片を有する転化された菌の株を分離して、目標ＤＮＡ断片を含むプラスミドを抽出し、約９００ｂｐのＤＮＡを配列した。その結果、９０１ｂｐのＤＮＡ配列はフィターゼ遺伝子の一部であることが確認された。
＜３−２＞全体のフィターゼ配列のクローニング
全体的なフィターゼ遺伝子配列を獲得するために、サーマル・アシンメトリック・インターレースドＰＣＲ（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， １９９５）によって、上記獲得された９０１ｂｐ断片の上流と下流領域をそれぞれにクローンした。ＴＡＩＬ−ＰＣＲとは、既知の配列に隣接する未知配列を特異的に増幅するツールであり、しかもとても簡単で、高速で、安くて、効き目がある方法である。上記の獲得された９０１ｂｐ断片のＤＮＡ配列によって、ＴＡＩＬ−ＰＣＲに用いる巣状（Ｎｅｓｔ）の特異的なプライマーを設計した。それぞれは以下のとおりである。
ｕｓｐ１ （５’−ＣＴＡＴＴＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＴＧＣＣＴＧＣＣＣＣＧ−３’） （ｕｐ ｓｐｅｃｉａｌ ｐｒｉｍｅｒ），
ｕｓｐ２ （５’−ＣＧＣＧＴＴＣＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＡＴＣＧＧＣＣｔｇ−３’），
ｕｓｐ３ （５’−ＧＧＧＴＴＡＡＧＴＡＴＣＣＴＧＣＧＧＣＧ−３’），
ｄｓｐ１ （５’−ＧＴＴＧＣＣＴＧＧＣＡＴＣＧＧＴＴＡＡＣＧＧＧＡＧ−３） （ｄｏｗｎ ｓｐｅｃｉａｌ ｐｒｉｍｅｒ），
ｄｓｐ２ （５’−ＣＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＡＧＧＧＣＡＣＡＣＣＧＴＴＧＣ−３’），
ｄｓｐ３ （５’−ＣＣＧＴＣＴＣＡＴＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧＧ−３’）。
一方、他端の任意的な縮重プライマー（（ＡＤ，ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒｓ）：ＡＤ６ （５’−ＣＡＷＣＧＩＣＮＧＡＩＡＳＧＡＡ−３’）、とＡＤ９ （５’−ＷＣＡＧＮＴＧＷＴＮＧＴＮＣＴＧ −３’）を含む）は、ＴＡＩＬ−ＰＣＲが増幅できる肝心な点である。巣状（Ｎｅｓｔ）の特異的なプライマーをＡＤプライマーと一緒に使われ、彼らの違いはその焼戻し温度が異なっていることである。ＴＡＩＬ−ＰＣＲにより増幅されたプログラムはＬｉｕ （Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ＰＣＲ： ａｕｔｏｍａｔａｂｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｉｎｓｅｒｔ ｅｎｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｐ１ ａｎｄ ＹＡＣ ｃｌｏｎｅｓ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｗａｌｋｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． １９９５ Ｆｅｂ １０；２５（３）：６７４−８１）と同じであり、また、この部分は引用によってその全部の内容を含まれいる。高温、低温焼なましの温度の循環を切り替えることによって、一端で特異的なプライマーを有し、また別の端でＡＤプライマーを有する特異的な産物を生産した。アガロース・ゲルの上で電気泳動によってＴＡＩＬ−ＰＣＲの産物を分析して、既知の配列の約９００ｂｐの上流ＤＮＡを獲得し、また、ＴＡＩＬ−ＰＣＲパラメーターを最適化することによって、既知の断片の約６５０ｂｐの下流ＤＮＡを獲得した。ＴａＫａＲａのアガロースゲルの回収精製キット（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）によって、それぞれ二つの断片を精製して回収し、そして回収した断片をｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結した。それから大腸菌感受性の細胞ＪＭ１０９を転化した。この二つの断片はそれぞれに配列された。
＜３−１＞フィターゼの遺伝子配列の一部を獲得
２つの保守的な領域によって縮重プライマーを設計して、そしてＤＮＡシンセサイザを使って統合した。中間型エルシニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、ＰＣＲの増幅を行った。縮重プライマー及びゲノムＤＮＡテンプレートを除いて、他のＰＣＲ増幅に利用された試薬は全部ＴＩＡＮＧＥＮ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤから購入した。ＰＣＲパラメーターを最適化することによって、私達はＰＣＲ焼きなまし温度が５０℃であり、そしてＰＣＲの反応条件は以下の通りでした： １つのサイクル、９５℃では、２分間；３０のサイクル、９５℃，３０秒／焼戻しの温度、３０秒／ ７２℃，１分間；最後に７２℃で５分延びて、ＰＣＲ産物は４℃で保存した。ＰＣＲ増幅産物はアガロース・ゲルの上で電気泳動によって測定して、縮重プライマーによって増幅された一連のバンドが観測された。適当なＤＮＡラダーを使って、所望サイズ（９００ｂｐ）のバンドを選択することができる。その結果、ＴａＫａＲａのアガロースゲルの回収精製キット（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）によって、約９００ｂｐのＤＮＡバンドサイズが回収され、さらにそれをｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）までクローンし、それから大腸菌ＪＭ１０９を転化した。目標ＤＮＡ断片を有する転化された菌の株を分離して、目標ＤＮＡ断片を含むプラスミドを抽出し、約９００ｂｐのＤＮＡを配列した。その結果、９０１ｂｐのＤＮＡ配列はフィターゼ遺伝子の一部であることが確認された。
＜３−２＞全体のフィターゼ配列のクローニング
全体的なフィターゼ遺伝子配列を獲得するために、サーマル・アシンメトリック・インターレースドＰＣＲ（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， １９９５）によって、上記獲得された９０１ｂｐ断片の上流と下流領域をそれぞれにクローンした。ＴＡＩＬ−ＰＣＲとは、既知の配列に隣接する未知配列を特異的に増幅するツールであり、しかもとても簡単で、高速で、安くて、効き目がある方法である。上記の獲得された９０１ｂｐ断片のＤＮＡ配列によって、ＴＡＩＬ−ＰＣＲに用いる巣状（Ｎｅｓｔ）の特異的なプライマーを設計した。それぞれは以下のとおりである。
ｕｓｐ１ （５’−ＣＴＡＴＴＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＴＧＣＣＴＧＣＣＣＣＧ−３’） （ｕｐ ｓｐｅｃｉａｌ ｐｒｉｍｅｒ），
ｕｓｐ２ （５’−ＣＧＣＧＴＴＣＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＡＴＣＧＧＣＣｔｇ−３’），
ｕｓｐ３ （５’−ＧＧＧＴＴＡＡＧＴＡＴＣＣＴＧＣＧＧＣＧ−３’），
ｄｓｐ１ （５’−ＧＴＴＧＣＣＴＧＧＣＡＴＣＧＧＴＴＡＡＣＧＧＧＡＧ−３） （ｄｏｗｎ ｓｐｅｃｉａｌ ｐｒｉｍｅｒ），
ｄｓｐ２ （５’−ＣＧＣＴＣＧＴＣＡＴＡＡＧＧＧＣＡＣＡＣＣＧＴＴＧＣ−３’），
ｄｓｐ３ （５’−ＣＣＧＴＣＴＣＡＴＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧＧ−３’）。
一方、他端の任意的な縮重プライマー（（ＡＤ，ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒｓ）：ＡＤ６ （５’−ＣＡＷＣＧＩＣＮＧＡＩＡＳＧＡＡ−３’）、とＡＤ９ （５’−ＷＣＡＧＮＴＧＷＴＮＧＴＮＣＴＧ −３’）を含む）は、ＴＡＩＬ−ＰＣＲが増幅できる肝心な点である。巣状（Ｎｅｓｔ）の特異的なプライマーをＡＤプライマーと一緒に使われ、彼らの違いはその焼戻し温度が異なっていることである。ＴＡＩＬ−ＰＣＲにより増幅されたプログラムはＬｉｕ （Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ＰＣＲ： ａｕｔｏｍａｔａｂｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｉｎｓｅｒｔ ｅｎｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｐ１ ａｎｄ ＹＡＣ ｃｌｏｎｅｓ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｗａｌｋｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． １９９５ Ｆｅｂ １０；２５（３）：６７４−８１）と同じであり、また、この部分は引用によってその全部の内容を含まれいる。高温、低温焼なましの温度の循環を切り替えることによって、一端で特異的なプライマーを有し、また別の端でＡＤプライマーを有する特異的な産物を生産した。アガロース・ゲルの上で電気泳動によってＴＡＩＬ−ＰＣＲの産物を分析して、既知の配列の約９００ｂｐの上流ＤＮＡを獲得し、また、ＴＡＩＬ−ＰＣＲパラメーターを最適化することによって、既知の断片の約６５０ｂｐの下流ＤＮＡを獲得した。ＴａＫａＲａのアガロースゲルの回収精製キット（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）によって、それぞれ二つの断片を精製して回収し、そして回収した断片をｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結した。それから大腸菌感受性の細胞ＪＭ１０９を転化した。この二つの断片はそれぞれに配列された。
３つの配列はすべてＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを入力されて、そして配列の組み立てプログラムによってつなぎ合わせて、これにより開放的な読む枠を確定した。この１３２６ｂｐの読む枠は１段の信号ペプタイド配列と活性のタンパクを含む。
＜３−３＞獲得された全配列の分析
獲得された全断片の長さは２３５４ｂｐであり、ＯＲＦ検索プログラムによってＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩから見つかった１３２６ ｂｐのオープン・リーディング・フレーム（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２）を含む。このリーディング・フレームＯＲＦはシグナル（信号）・ペプチドと熟した活性タンパクをコードした。Ｓｉｇｎａｌ Ｐプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）及び多重整列によって、シグナル・ペプチドのＮ末端の切断可能な部位はＳｅｒ２３−Ａｌａ２であることが確定した。熟した活性タンパクのＮ−終点のローカライズに関するこのデータが、異種システムで活性タンパクを発現させるのに必要である。また、ＰｅｐｔｉｄｅＭａｓｓプログラム （ｈｔｔｐ：／／ｃｎ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍａｓｓ ｈｔｍｌ）を利用して、熟したタンパクの分子量を確定した。熟したタンパクの予測の分子量は４５．５ｋＤａであり、それはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図面１）と略同じである。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴによってこの熟したタンパクの理論上のパイ値はおよそ７．７である。
＜３−３＞獲得された全配列の分析
獲得された全断片の長さは２３５４ｂｐであり、ＯＲＦ検索プログラムによってＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩから見つかった１３２６ ｂｐのオープン・リーディング・フレーム（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２）を含む。このリーディング・フレームＯＲＦはシグナル（信号）・ペプチドと熟した活性タンパクをコードした。Ｓｉｇｎａｌ Ｐプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）及び多重整列によって、シグナル・ペプチドのＮ末端の切断可能な部位はＳｅｒ２３−Ａｌａ２であることが確定した。熟した活性タンパクのＮ−終点のローカライズに関するこのデータが、異種システムで活性タンパクを発現させるのに必要である。また、ＰｅｐｔｉｄｅＭａｓｓプログラム （ｈｔｔｐ：／／ｃｎ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍａｓｓ ｈｔｍｌ）を利用して、熟したタンパクの分子量を確定した。熟したタンパクの予測の分子量は４５．５ｋＤａであり、それはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図面１）と略同じである。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴによってこの熟したタンパクの理論上のパイ値はおよそ７．７である。
ＢＬＡＳＴサーバ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）を利用して、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋの中で相似性分析を行った。その結果、ＯＲＦのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）は、（Ｏｂｅｓｕｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｔｅｕｓ）の既知フィターゼとの低い一致率（５４％）を示すと共に、大腸菌フィターゼとの低い一致率（４５％）を示した。従って、このエルシニア菌由来のオープン・リーディング・フレームは新規なフィターゼをコードしたことが確定された。他のフィターゼと同様に、このオープン・リーディング・フレームのアミノ酸配列はＡｐｐＡと命名された。しかし、それは、中間型エルシニア菌ＡＴＣＣ２９９０９由来の仮定しているタンパクとの高い一致率を示したが、この仮定しているタンパクは自動化されたコンピュータ分析でゲノムの序列（ＮＺ ＡＡＬＦ０１００００５２）を注釈して得られたものであるので、酵素の活性または生理あるいは化学の特性に関する情報をまだ検証していない。
フィターゼＡｐｐＡのＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現
＜４−１＞発現ベクターの構築
熟したタンパクのコーディング領域を得るために、プライマーのｙｅｒｍＦ： ５’−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＧＴＴＧＣＣＡＴＡ−３’（２７ｍｅｒ）、およびｙｅｒｍＲ： ５’−ＧＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＴＴＣ−３’（３２ｍｅｒ）を設計および統合した。熟したタンパクのコーディング領域は、プライマーｙｅｒｍＦとｙｅｒｍＲを使用することによって増幅された。増幅産物はアガロースゲルの電気泳動によって検査され、所定大きさのバンドを切除し、ＴａＫａＲａ アガロースゲルＤＮＡ精製キット（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を利用してＤＮＡを抽出した。メーカーマニュアルに説明されるように、精製されたＤＮＡはｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、 Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、 Ｃａｌｉｆ．） のＥｃｏＲＩとＮｏｔｌサイトに挿入された。構造物は１００μｇ ａｍｐ／ｍＬを含むＬＢ培地に塗布されたＪＭ１０９細胞に転化られた。陽性トランスフォーマント（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）は、配列を測られて成長する。酵母の転化のにＤＮＡの製造に用いられる。
＜４−２＞転化酵素及び発現
メーカの説明に基き、ＹＰＤ培地でＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの菌株ＧＳ１１５ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を育成し、転化させるために用いる。ＤｒａＩを利用して約８μｇの発現プラスミド（核外遺伝子）ｐＰＩＣ９ ＤＮＡが線状化（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ）され、次に、電気穿孔法によってＰｉｃｈｉａの中に転化させた。転化させる細胞は、ＨＩＳ４遺伝子をふるい分け（ｓｃｒｅｅｎ）て宿主の染色体ＤＮＡに統合するためにＲＤＢ培地に塗布られた。これによって、転化したＨＩＳ４の遺伝子を含むトランスフォーマント（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）はＲＤＢプレートで成長することができる。ＲＤＢプレートで３日間育成した後に、トランスフォーマント（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）がグリセロールを含む培地（ＢＭＧＹ培地）で４８時間を育成し、それから回転して（２５００ｇ、５分）細胞を収集し、０．５％のメタノール培地（ＢＭＭＹ） の中で浮遊状態になって、フィターゼの発現を誘導する。
＜４−３＞トランスフォーマント（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）のフィターゼ活性の測定
硫酸第一鉄のモリブデン青法によって合計７２のトランスフォーマント（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）のフィターゼ活性を分析した。その測定は次の通りである：
９５０μＬの基質溶液（４ ｍＭのナトリウムフィターゼを０．２５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液に溶解して、ｐＨは５．０となる。）は５０μＬに希釈された酵素溶液に加えられて、そして混合して平均し、３７℃で３０分間を反応させた。そして、１ｍＬ の１０％のＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を上記反応システムの中に加え、反応を停止させた。比較として、まずに酵素タンパクを不活発にするために、酵素溶液に１ｍＬ の１０％のＴＣＡを加え、そして基質溶液を加え、３７℃で３０分間を放置させた。そして、反応が終わった後に、２ｍＬの発色試薬（０．５７６ Ｍの硫酸、１％のモリブデン酸アンモニウム、７．３２％の７つの結晶水の硫酸第一鉄（Ｆｅｒｒｏｕｓ ｓｕｌｆａｔｅ．７Ｈ２Ｏ））を加え、１０分間を放置させた。そして、７００ｎｍで吸光度の測定を行い、酵素溶液と比較における活性を測定した。ここで、１つの酵素活性測定ユニットとは、３７℃のときに、１分間で１μＭの無機燐を釈放するのに必要な酵素タンパクの量である。二日間のメタノール誘導の後に、合計７２のトランスフォーマントの中から１１のトランスフォーマントのフィターゼ活性を測定され、酵素活性測定ユニットは約４８−２７０ Ｕ／ｍＬの範囲内である。明らかに、上記の獲得したオープン・リーディング・フレームは機能を有する新規なフィターゼ遺伝子であり、それはフィターゼ活性を有するタンパクをコードする。この上記オープン・リーディング・フレームの熟した領域にコードされたフィターゼ活性を有するポリペプチドはｒ−ＡｐｐＡと命名された。
＜４−１＞発現ベクターの構築
熟したタンパクのコーディング領域を得るために、プライマーのｙｅｒｍＦ： ５’−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＧＴＴＧＣＣＡＴＡ−３’（２７ｍｅｒ）、およびｙｅｒｍＲ： ５’−ＧＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＡＴＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＴＴＣ−３’（３２ｍｅｒ）を設計および統合した。熟したタンパクのコーディング領域は、プライマーｙｅｒｍＦとｙｅｒｍＲを使用することによって増幅された。増幅産物はアガロースゲルの電気泳動によって検査され、所定大きさのバンドを切除し、ＴａＫａＲａ アガロースゲルＤＮＡ精製キット（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を利用してＤＮＡを抽出した。メーカーマニュアルに説明されるように、精製されたＤＮＡはｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、 Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、 Ｃａｌｉｆ．） のＥｃｏＲＩとＮｏｔｌサイトに挿入された。構造物は１００μｇ ａｍｐ／ｍＬを含むＬＢ培地に塗布されたＪＭ１０９細胞に転化られた。陽性トランスフォーマント（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）は、配列を測られて成長する。酵母の転化のにＤＮＡの製造に用いられる。
＜４−２＞転化酵素及び発現
メーカの説明に基き、ＹＰＤ培地でＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの菌株ＧＳ１１５ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を育成し、転化させるために用いる。ＤｒａＩを利用して約８μｇの発現プラスミド（核外遺伝子）ｐＰＩＣ９ ＤＮＡが線状化（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ）され、次に、電気穿孔法によってＰｉｃｈｉａの中に転化させた。転化させる細胞は、ＨＩＳ４遺伝子をふるい分け（ｓｃｒｅｅｎ）て宿主の染色体ＤＮＡに統合するためにＲＤＢ培地に塗布られた。これによって、転化したＨＩＳ４の遺伝子を含むトランスフォーマント（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）はＲＤＢプレートで成長することができる。ＲＤＢプレートで３日間育成した後に、トランスフォーマント（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）がグリセロールを含む培地（ＢＭＧＹ培地）で４８時間を育成し、それから回転して（２５００ｇ、５分）細胞を収集し、０．５％のメタノール培地（ＢＭＭＹ） の中で浮遊状態になって、フィターゼの発現を誘導する。
＜４−３＞トランスフォーマント（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）のフィターゼ活性の測定
硫酸第一鉄のモリブデン青法によって合計７２のトランスフォーマント（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）のフィターゼ活性を分析した。その測定は次の通りである：
９５０μＬの基質溶液（４ ｍＭのナトリウムフィターゼを０．２５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液に溶解して、ｐＨは５．０となる。）は５０μＬに希釈された酵素溶液に加えられて、そして混合して平均し、３７℃で３０分間を反応させた。そして、１ｍＬ の１０％のＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を上記反応システムの中に加え、反応を停止させた。比較として、まずに酵素タンパクを不活発にするために、酵素溶液に１ｍＬ の１０％のＴＣＡを加え、そして基質溶液を加え、３７℃で３０分間を放置させた。そして、反応が終わった後に、２ｍＬの発色試薬（０．５７６ Ｍの硫酸、１％のモリブデン酸アンモニウム、７．３２％の７つの結晶水の硫酸第一鉄（Ｆｅｒｒｏｕｓ ｓｕｌｆａｔｅ．７Ｈ２Ｏ））を加え、１０分間を放置させた。そして、７００ｎｍで吸光度の測定を行い、酵素溶液と比較における活性を測定した。ここで、１つの酵素活性測定ユニットとは、３７℃のときに、１分間で１μＭの無機燐を釈放するのに必要な酵素タンパクの量である。二日間のメタノール誘導の後に、合計７２のトランスフォーマントの中から１１のトランスフォーマントのフィターゼ活性を測定され、酵素活性測定ユニットは約４８−２７０ Ｕ／ｍＬの範囲内である。明らかに、上記の獲得したオープン・リーディング・フレームは機能を有する新規なフィターゼ遺伝子であり、それはフィターゼ活性を有するタンパクをコードする。この上記オープン・リーディング・フレームの熟した領域にコードされたフィターゼ活性を有するポリペプチドはｒ−ＡｐｐＡと命名された。
組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡの精製
酵素によって発現された組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡを精製するために、上清液の酵素活性が２７０ Ｕ／ｍＬであるトランスフォーマントを優れた育成と誘導の条件下で培養した。２日間のメタノール誘導の後に、上記の実施例４で使用されるのと同じ方法でフィターゼ活性を測定した結果、上清液の酵素活性は３８９ Ｕ／ｍＬまで達した。１０分間の１２００Ｏｇ遠心を通って、フィターゼタンパクを含む上清液を収集し、酵素の菌体が取り除かれた。
酵素によって発現された組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡを精製するために、上清液の酵素活性が２７０ Ｕ／ｍＬであるトランスフォーマントを優れた育成と誘導の条件下で培養した。２日間のメタノール誘導の後に、上記の実施例４で使用されるのと同じ方法でフィターゼ活性を測定した結果、上清液の酵素活性は３８９ Ｕ／ｍＬまで達した。１０分間の１２００Ｏｇ遠心を通って、フィターゼタンパクを含む上清液を収集し、酵素の菌体が取り除かれた。
８０％の飽和度まで上清液に硫酸アンモニウムの粉末を加え、１０分間の１２０００ｇ遠心で沈殿物を収集した。また、０．１Ｍ、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウム緩衝液によってこの沈殿物を溶解し、１２００Ｏｇで１０分間の遠心を行った。次に、上清液を獲得し、そして同じ緩衝液を使って透析を行った。続いて、１０ ｋＤａの濾過器を有する濾過装置を使って透析物を濃縮した。そして、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって濃縮した溶液を分離して精製した。最後に、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００によって同じ緩衝液にてフィターゼを精製した。
組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡの酵素特性の分析
＜６−１＞組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡの分子量の確定及び脱糖処理
精製した組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡの分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって測定した。電気泳動の結果は図面１に示され：コース１は標準的な分子量；コース２は精製した組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡ；コース３は脱糖されたｒ−ＡｐｐＡである。電気泳動測定の結果によって、精製されたｒ−ＡｐｐＡはその分子量をおよそ４５ ｋＤａと実証された。また、ＮｅｔＮｇｌｙｃ（Ｎ−糖鎖付加サイトを予測するプログラム）プログラムによって、ｒ−ＡｐｐＡのタンパク配列を予測した。このタンパクは潜在するＮ−糖鎖付加サイト（Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を存在しないという結論を出た。これは精製された酵素はエンドグリコシダーゼ（糖鎖切断Ｅｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ）された酵素の分子量とは同じため、同様な結果は図面１からも観測される。
＜６−２＞組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡの温度及びｐＨ特性
様々な温度とｐＨ条件下で、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００によって精製された組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡの酵素活性を研究した。以下の緩衝液を利用して、フィターゼ活性に対するｐＨ値の影響を確定した：グリシン−塩酸ｐＨ １．５−３．５；酢酸ナトリウム−酢酸ｐＨ ３．５−６．０；Ｔｒｉｓ−塩酸 ｐＨ ６．０−８．５；グリシン−水酸化ナトリウムｐＨ ８．５−１０。希釈に使用されるすべての緩衝液が０．０５％のＢＳＡと０．０５％のトリトンＴｒｉｔｏｎを含む。図面２に示すように、フィターゼの活性はｐＨ値の変化により異なる。組み換え型フィターゼの最適なｐＨは４．５であり、ｐＨが２．５ であっても７０％の活性を維持され、またｐＨ が５．５の 時には６５％の活性を有する。明らかに、既知のフィターゼと比較して、組み換え型フィターゼｒ−ＡＰＰＡはｐＨ２．０−６．０の好適な範囲内でもっと高い活性を有する。図面２にはこの酵素は良好な安定性を有することが示され、この酵素を３７℃で放置し、ｐＨ２．５−１０．０で２時間を処理した後に、８５％以上の活性が残っていたことを確認された。ｐＨ１．０−２．０で処理した後でも７０％以上の活性を残っている。
＜６−１＞組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡの分子量の確定及び脱糖処理
精製した組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡの分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって測定した。電気泳動の結果は図面１に示され：コース１は標準的な分子量；コース２は精製した組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡ；コース３は脱糖されたｒ−ＡｐｐＡである。電気泳動測定の結果によって、精製されたｒ−ＡｐｐＡはその分子量をおよそ４５ ｋＤａと実証された。また、ＮｅｔＮｇｌｙｃ（Ｎ−糖鎖付加サイトを予測するプログラム）プログラムによって、ｒ−ＡｐｐＡのタンパク配列を予測した。このタンパクは潜在するＮ−糖鎖付加サイト（Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を存在しないという結論を出た。これは精製された酵素はエンドグリコシダーゼ（糖鎖切断Ｅｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ）された酵素の分子量とは同じため、同様な結果は図面１からも観測される。
＜６−２＞組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡの温度及びｐＨ特性
様々な温度とｐＨ条件下で、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００によって精製された組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡの酵素活性を研究した。以下の緩衝液を利用して、フィターゼ活性に対するｐＨ値の影響を確定した：グリシン−塩酸ｐＨ １．５−３．５；酢酸ナトリウム−酢酸ｐＨ ３．５−６．０；Ｔｒｉｓ−塩酸 ｐＨ ６．０−８．５；グリシン−水酸化ナトリウムｐＨ ８．５−１０。希釈に使用されるすべての緩衝液が０．０５％のＢＳＡと０．０５％のトリトンＴｒｉｔｏｎを含む。図面２に示すように、フィターゼの活性はｐＨ値の変化により異なる。組み換え型フィターゼの最適なｐＨは４．５であり、ｐＨが２．５ であっても７０％の活性を維持され、またｐＨ が５．５の 時には６５％の活性を有する。明らかに、既知のフィターゼと比較して、組み換え型フィターゼｒ−ＡＰＰＡはｐＨ２．０−６．０の好適な範囲内でもっと高い活性を有する。図面２にはこの酵素は良好な安定性を有することが示され、この酵素を３７℃で放置し、ｐＨ２．５−１０．０で２時間を処理した後に、８５％以上の活性が残っていたことを確認された。ｐＨ１．０−２．０で処理した後でも７０％以上の活性を残っている。
図面３Ａには酵素の活性と温度の変化関係を示した。最適なｐＨ ４．５で２０℃〜８０℃範囲内の酵素の活性を測定した結果、最適な温度は５５℃であると明らかにした。図面３Ｂに示すように、酵素液は８０℃で１０分間を処理した時、依然として５０％の酵素の活性を残っていて、そして８０℃で１時間を処理して、依然として４０％の酵素の活性を残っている。飼料工業の中で飼料添加剤として広く用いられる大腸桿菌と比較して、ｒ−ＡｐｐＡは高温の下でより良い熱の安定性を有する。
ｒ−ＡｐｐＡに対する温度とｐＨテストに基づき、又はその他の知られるフィターゼと比較し、本発明のフィターゼｒ−ＡＰＰＡは単胃動物の飼料添加物として非常に適用だと見られる。これは、通常に知られるフィターゼと比較して、本発明が提供されたフィターゼは広いｐＨ安定性と高温の安定性を持っているためである。従って、このフィターゼｒ−ＡＰＰＡはとても良い商業の応用価値の使用する潜在力を持っている。
＜６−３＞金属イオンと抑制剤の組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡの活性への影響
金属イオンと抑制剤の組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡの活性への影響は最適なｐＨ（ｐＨ ４．５）の下で行った。
＜６−３＞金属イオンと抑制剤の組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡの活性への影響
金属イオンと抑制剤の組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡの活性への影響は最適なｐＨ（ｐＨ ４．５）の下で行った。
表４に示すように、各種の金属イオンの中で、酵素の活性は１ｍＭ濃度のたくさんの金属イオンの抑えることによって、比較的に弱くて、Ｆｅ２＋，Ｚｎ２＋とＣｕ２＋は明らかに酵素の活性を抑える。Ｍｎ２＋は酵素の活性を強める弱い作用を有する。抑制剤として、ＳＤＳは酵素の活性に対して強い抑制作用を有するが、ＥＤＴＡは酵素の活性に対する影響が殆どない。
＜６−４＞組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡの活性に対するタンパク酵素の影響
タンパク酵素の抵抗性を確定するために、精製された組み換え型酵素（０．０２５ｍｇ／ｍｌ）と、０．１ｍｇ／ｍｌ のペプシンと、トリプシンとは３７℃で育成した。それから、それぞれに５、１０、２０、３０、６０、と１２０分間の時にサンプルを採集した。図面４に示すように、この組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡはペプシンとトリプシンに対してとても強い抵抗性を示した。この組み換え型フィターゼは従来に報道されたいかなるその他のフィターゼより高いプロティナーゼの抵抗性を示した。この結果から、該フィターゼは胃腸の中で存在のペプシンとトリプシンに対して抵抗性を持つため、単胃動物の体内での加水分解の効率を高めることができるとなる。
＜６−５＞組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡの比活性の測定
該組み換え型フィターゼｒ−ＡｐｐＡの比活性を確定するために、まず、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００によって精製された組み換え型酵素ｒ−ＡｐｐＡの酵素タンパクの濃度をロウリーＬｏｗｒｙ方法にで確定した。また、ｐＨ ４．５の条件下で、硫酸第一鉄のモリブデン青法によって組み換え型酵素ｒ−ＡｐｐＡの酵素活性を確定した。その結果、該組み換え型酵素ｒ−ＡｐｐＡの比活性は３９６０±２４８ Ｕ／ｍｇであり、これは今まで記載されたフィターゼの中で最も高い比活性を持つフィターゼである。
上記の説明に基づいて、本発明の新規なフィターゼは以下のような利点を有する：高い比活性、適当な作用ｐＨ、良好な熱の安定性、強いプロティナーゼ抵抗性、発酵で容易に生産される。これらのすべての利点は、本発明のフィターゼがいかなる従来のフィターゼよりも飼料添加物として更に応用価値があることを意味する。まず第一に、高い比活性とは、同様量の酵素タンパクを生産したが、より多くのフィチン酸を分解することができる。即ち、同様な量のフィチン酸を分解するのに必要な酵素タンパクの量は更に少なくなって、コストも更に低くなる。第二に、適当な作用ｐＨとは、該フィターゼが動物の腸内でより良い効力を発揮できることを意味する。第三に、良好な熱の安定性とは、この酵素が製粒加工で活性を失いにくいことを意味する。四番目に、タンパク酵素に対する高い抵抗とは、該フィターゼが動物の腸内で安定的に存在して、プロティナーゼに分解されないと意味する。最後に、発酵で容易に生産されるとは、簡単な工業発酵により大量なフィターゼを生産することができて、そして飼料業界に用いられる。以上の優良な特性に基づいて、本発明が提供したフィターゼは飼料添加物として重要な役割を果たせることが、当業者にとっては明らかなことである。Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａから分離されたこの新規なフィターゼは、従来技術における欠点を克服して、結果としてかなりの商業価値を持っている。
（配列表）
（配列表）
Claims (15)
- 以下の特性，
ａ）理論分子量は４５．５ ｋＤａ、
ｂ）最適なｐＨは４−５の範囲内、
ｃ）最適な温度は５０−６０℃の範囲内、
ｄ）理論ｐＩ値は７．２、
ｅ）比活性は３０００Ｕ／ｍｇ以上、また
ｆ）ペプシンとトリプシンへの高い抵抗性、
を有する分離されたフィターゼタンパク。 - 以下のポリペプチドから選択された分離されたタンパク：
ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に開示されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に開示されたポリヌクレオチド又はこのポリヌクレオチドの縮重配列にコードされたポリペプチド、
ｃ）厳格な条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２に開示されたポリヌクレオチドの補足的なチェーンに交配される、ポリヌクレオチドによってコードされるフィターゼ活性を有するポリペプチド、
ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に開示されたポリヌクレオチドの対立遺伝子又は自然な異形によってコードされるフィターゼ活性を有するポリペプチド、
ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に開示されたポリペプチド配列から一つ又は多数のアミノ酸の残基の代替、削除、また／或いは挿入によって誘導されるフィターゼ活性を有するポリペプチド、
ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に開示されたアミノ酸とは少なくとも６０％、最適は６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、あるいは少なくとも９０％、特に好ましいのは９５％の一致率を有するフィターゼ活性を有するポリペプチド、
分離されたタンパク。 - エルシニア属の微生物に由来する、好ましくは中間型エルシニア菌に由来する請求項１又は２に記載されたタンパク。
- そのコードは請求項１〜３のいずれに記載されたタンパクに従う分離された核酸分子。
- 請求項４に記載された核酸分子を含む、ＤＮＡ構築物又は組換え型ベクター。
- 請求項５に記載されたＤＮＡ構築物又は組換え型ベクターあるいはすでにゲノム内に統合された請求項４に記載された核酸分子を含む、宿主細胞。
- 宿主細胞は真核生物の細胞である請求項６記載の宿主細胞。
- 宿主細胞はＰｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓである請求項７記載の宿主細胞。
- 保存番号はＣＧＭＣＣ １７０２である中間型エルシニア菌Ｈ−２７。
- フィターゼ酵素の発現に適した条件下で請求項６〜８のいずれに記載された宿主細胞を培養することを含むフィターゼ酵素を生産する方法。
- 以下の有効な成分、
ａ）請求項１〜３のいずれに記載されたタンパク、及び／または、
ｂ）請求項６〜８のいずれに記載された宿主細胞、
を含む飼料添加物。 - さらに下記の成分：ケラチナーゼ（ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ）、リパーゼ（ｌｉｐａｓｅ）、アミラーゼ（ａｍｙｌａｓｅ）、ホスファターゼ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、マルターゼ（ｍａｌｔａｓｅ）、インベルターゼ（ｉｎｖｅｒｔａｓｅ）、キシラナーゼ（ｘｙｌａｎａｓｅ）、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ：ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）から成るグループの中の１つ又は多数を選べる酵素製品を含む、
請求項１１に記載の飼料添加物。 - 請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド／または請求項６〜８のいずれか一項に記載の宿主細胞の飼料添加物の製造における使用。
- 以下の段階、
ａ） フィターゼ酵素の保守的な配列のＲＨＧＸＲＸＰとＨＤに基づいて１組の縮重プライマーを設計する；
ｂ） 前記プライマーを用いてＰＣＲによって一部のフィターゼ酵素の配列を増幅する；
ｃ） さらにＴＡＩＬ−ＰＣＲによってフィターゼ酵素の全配列を得る；
を含む標的生物体の中からフィターゼ酵素の遺伝子を分離する新しい方法。 - 前記縮重プライマー組はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ５に開示されている縮重プライマー組である請求項１４に記載の方法。
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