CN1594568A - 一种重组鸡α干扰素的生产方法及其重组载体 - Google Patents

Abstract

本发明一种重组鸡α干扰素的生产方法及其重组载体属于用分子生物学方法获得的基因工程生物制品。将鸡α干扰素的基因序列通过电转化方式整合到酵母上的特定位置。采用毕赤酵母表达系统表达外源基因，表达外源蛋白的纯度高于70％，经过65636倍稀释发现能完全抑制100－1000TCID₅₀的水疱性口炎病毒的攻击。鸡α干扰素对VSV和禽流感病毒的转录、翻译阶段抑制能力尤其明显，对新城疫病毒、传染性法氏囊病毒等也都有较强的抑制作用，而且还有强大抗肿瘤、抗增殖作用，对鸡的马立克氏病毒也具有较强的抑制作用。

Description

一种重组鸡α干扰素的生产方法及其重组载体

一、技术领域

本发明一种重组鸡α干扰素的生产方法及其重组载体属于用分子生物学方法获得的基因工程生物制品，可针对性的用于鸡的各种病毒性疾病的防制和早期治疗。

三，背景技术：

鸡α干扰素(Interferonalpha，IFN-α)是一类具有抗病毒、抗肿瘤、抗增殖作用等功能。1994年，Sekellick等首先克隆得到鸡胚成纤维细胞IFN-基α因，并进行了结构分析。1996年Sick等，Scultz等对鸡α干扰素进行了克隆与表达，并对表达产物进行了抗病毒活性进行了研究。研究表明鸡α干扰素是无内含子的多拷贝基因，编码162个氨基酸的成熟蛋白，有4个糖基化位点，推测其大小为19000Da。现已证明重组鸡α干扰素对新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)等都有抵抗作用。2001年华南农业大学的曹永长等对鸡的α干扰素基因进行了克隆，2000年夏春对惠阳胡须鸡IFN-α基因克隆和序列分析，2000年汪明、吴志光等对肉鸡IFN-alpha基因进行了克隆、序列分析以及在大肠杆菌中的表达发现有较好的抗病毒活性。目前国内还没有商品化的重组鸡α干扰素用于鸡群病毒性疾病的防制。

由诱生剂诱导产生鸡IFN-α，因来源少、成本高、纯化工艺复杂等诸多限制而价格昂贵，极大限制了临床和科研的应用。原核表达存在着表达蛋白的产量低，不易于纯化以及菌株不稳定等问题，限制了向规模化生产的转化。而且大肠杆菌表达的鸡干扰素主要以包涵体的形式存在，包涵体在变性、复性上对人员技术及设备的要求都很高，且工序繁琐，损失得较多，这些增加了重组鸡干扰素工业产品的成本及生产难度。

三 发明内容

技术问题  本发明的目的在于克服现有技术中由诱生剂诱导产生鸡IFN-α的来源少、成本高、纯化工艺复杂等诸多限制临床和科研应用的缺陷，提供一种重组鸡α干扰素的生产方法及其重组载体，达到高表达、高稳定、高分泌的生产，使得其基因表达的外源蛋白的纯度达到70％以上，可广泛用于包括禽流感在内的鸡的各种病毒性疾病的防制和早期治疗，以及增强鸡群的整体免疫力。

技术问题  一种重组鸡α干扰素的生产方法，包括：

(一)重组到毕赤酵母上的鸡α干扰素的基因序列的扩增

A)引物的设计：

引物1：5‘AATTCAATTCTGCAACCACCTTCGCCCC’3

引物2：5‘CCGATCTAGAGTTTGGGGATTA’3

B)鸡全血淋巴细胞总RNA的提取

取500μL培养以ConA刺激4～10h的鸡全血分离的淋巴细胞的悬液，向其中加入800μL Tripure细胞裂解液，振荡混匀后，置于室温下10min，然后向其中加入200μL氯仿，混匀后于室温下静置5min分钟，再于12000g 4℃下离心15min；吸取上清，向其中加入0.5倍体积的异丙醇，充分混匀后于室温下静置15min，随后在12000g 4℃下离心10min；排尽管内液体，向管内加入1mL70％乙醇进行洗涤，混匀后，7500g 4℃离心5min；弃去液体，待管壁稍干燥后加入20μLDEPC处理的超纯水溶解，即得到鸡淋巴细胞总RNA；

C)含有鸡α干扰素基因序列cDNA第一条链的合成

用新鲜提取的淋巴细胞的总RNA进行RT-PCR，具体加样如下：

细胞总RNA               9.2μL

5×反转录Buffer         4.0μL

10mM dNTP               2.0μL

25mM MgCI₂             0.8μL

Rnasin                  1.0μL

引物1                   1.0μL

引物2                   1.0μL

将上述反应混合物于掌式离心机上稍作离心，然后于在PCR仪；上65℃15min后加入反转录酶M-MLV1.0μL，后42℃1h，94℃5min后结束反应；

D)PCR反应体系如下：

ddH₂O                  34μL

10×PCR Buffer          4.0μL

25mmol/L Mg²⁺          1.4μL

RT产物                  10μL

rTaq                    0.6μL

总体积                  50μL

在PCR仪上设置94℃5min，随后94℃1min，56℃1min，72℃1min，共30个循环，结束循环后72℃10min；对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定获得的鸡α干扰素基因大小为488bp；

(二)含有鸡α干扰素成熟蛋白基因酵母表达载体的构建与鉴定

利用通过RT-PCR扩增的鸡α干扰素成熟蛋白基因有ECORI和XbaI两个酶切位点，把鸡α干扰素成熟蛋白基因切下后与已经同样两种限制性内切酶酶切的pPICZa-A酵母载体相连，再经ECORI和XbaI酶切，切下大小为488bp的条带则可以鉴定为阳性；

(三)感受态酵母菌的制备：

挑取毕赤酵母X-33平板上的一个单菌落转接于2mlYPD试管中，28℃250rpm恒温摇过夜活化12h后，取500ul的活化后的酵母菌液转接于50ml的含有无菌5mlYPD培养基的三角瓶中，瓶口用三层灭菌纱布扎紧，28℃恒温摇床250rpm摇荡培养20h左右。待菌液OD₆₀₀＝1.3-1.5时，4℃1500g离心4min收获细胞。细胞依次用1000ml冰预冷水和1000ml冰预冷的1M山梨醇洗涤，4℃1500g离心5min，最后用0.8ml冰预冷的1M山梨醇悬浮菌体，分装不同的ep管后，置4℃待用；

(四)含有鸡α干扰素成熟蛋白基因的酵母表达载体电转化入酵母菌

1)取SacI酶线性化重组载体10ul分别与80ul X-33感受态毕赤酵母细胞混匀，然后转移到冰预冷的0.2cm的电转移杯中，冰上放置5min；

2)将电转移杯放在电穿孔仪上用脉冲电流电击一次，电击条件：电压1500V，电容25uF，电阻200Ω，时间5ms，温度0℃；

3)电击结束，立即加入1ml冰预冷的1M山梨醇，混匀，取250ul转化物涂含有100ug/mlZeocin抗生素的YPDS培养基平皿上，置28℃恒温培养2-4天，能在YPDS培养基上生长的菌落为阳性转化子；

(五)用来鉴定阳性重组酵母菌的鉴定的PCR引物

根据酵母表达载体pPICZa-A上的一部分基因序列分别在目的基因插入的两端设计一对引物，它们分别为：

5′AOX1引物5‘gactggttccaattgagaagc’3

3′AOX1引物5‘gcaaatggcattctgacatcc’3

(六)含鸡α干扰素基因的重组酵母菌株的鉴定

将筛选得到的重组高拷贝菌株，取单菌落中少量菌放入Eppendof管中，加100ul的灭菌水，100℃煮10分钟，消解酵母菌细胞壁，然后放入液氮冻30分钟，100℃煮10分钟，120000rpm/min离心取上清液，以其中少量基因组DNA作模板，进行PCR；

(七)PCR扩增鉴定：以基因组DNA为模板，对整合到毕赤酵母X-33染色体DNA中的鸡α干扰素成熟蛋白基因进行PCR扩增，PCR扩增体系为：

10×PCRbuffer                          5ul

20pmol/ul 5′AOX1引物                  0.5ul

20pmol/ul 3′AOX1引物                  0.5ul

Taq酶                                  0.5ul

10mM dNTPs                             1ul

基因组DNA模板                          5ul

灭菌水补体积至50ul

扩增程序：94℃5mi，94℃1min、55℃1.5min、72℃2.5min、30个循环，72℃7min，扩增结束，取5ul反应液做琼脂糖凝胶电泳观察阳性重组酵母表达菌株通过以上的一对引物扩增的片段总长度为1068bp左右；

(八)含鸡α干扰素成熟蛋白基因高表达酵母菌株的筛选

将YPDS培养基平皿中长出的最初转化子，影印法依次接种到含Zeocin抗生素浓度梯度为250，500，1000ug/ml的YPDS培养基中，逐级筛选Zeocin抗性菌株即含目的基因的高拷贝菌株；

(九)含鸡α干扰素成熟蛋白基因高表达酵母菌株的诱导表达

从含有高拷贝目的基因的酵母菌株的YPDS培养基平皿上分别挑取两株菌株与25ml的BMGY中，经28℃摇床培养至OD₆₀₀＝2-6时，室温1500g离心5min收获细胞，将收获的细胞用100ml的BMMY培养液悬浮与1000mld的三角瓶中28℃诱导表达，每24h向培养基中补加0.5％的甲醇，以保持诱导的持续表达，在诱导72h时收集培养上清备用；

(十)含鸡α干扰素成熟蛋白基因高表达酵母菌株的表达产物的初步纯化

培养上清的处理：将诱导表达培养液离心，收集上清液留样后，用50mM含1mMPMSF的Tris-HCl缓冲液溶解，装入透析袋用50mM的Tris-HCl透析除去杂质，然后用PEG20000浓缩获得鸡α干扰素成熟蛋白。

上述重组鸡α干扰素的生产方法所构建的重组载体，为含有鸡α干扰素成熟蛋白基因酵母表达载体。

本发明鸡α干扰素成熟蛋白的基因序列及氨基酸序列(附录)为去掉了全阅读框的信号肽序列后的碱基到阅读框后的序列。信号肽序列去掉后，鸡α干扰素的分泌主要靠酵母表达载体上的分泌信号。而且去除了阅读框后的终止密码子，为了能和酵母载体上的序列相对应在原终止密码子的位置上另外添加了两个碱基，这样保持了鸡α干扰素的基因序列能正确的被翻译出相应的蛋白质，这样还可以是载体上的一个组氨酸的序列能被正确的翻译，便于纯化重组鸡α干扰素。

本发明所用巴氏德毕赤酵母表达系统即巴氏德毕赤酵母X-33单菌已被国内外广泛用来表达外源蛋白质的一种公知菌株(齐连权，人ω干扰素在巴士德毕赤酵母中的表达，2003年军事医学科学院院刊：Cereghino等，Heterogous protein expression in themethylotrophic yeast Pichia pastris)它能能利用甲醇作为唯一碳源大量合成蛋白质，主要有以下几个生物特性：a利用甲醇作为唯一碳源快速生长。B，毕赤酵母中存在许多微体细胞器，它们可以大量储存蛋白质，该特点对表达外源蛋白质非常有利，可以使其面受蛋白酶的降解。C：可以对表达的外源蛋白进行适度的糖基化等修饰，使外源蛋白能够最大程度上保持其天然结构。

利用巴氏德毕赤酵母表达载体表达外源蛋白的优点：a，高表达：含有醇氧化酶的强启动子，细胞生长速度快，能够较高的表达外源蛋白。B高稳定：该载体不是以自主复制的形式存在而是整合在酵母菌的染色体上，所以构建的重组菌株很稳定。C：高分泌：1995年Romanos M.等报道含有α交配因子的分泌和先导序列，可以使外源蛋白分泌到培养上清，而且表达的外源蛋白的纯度达到75％以上。

本发明将鸡α干扰素的基因序列通过电转化方式整合到酵母上的特定位置。这株重组菌表达的干扰素经抗病毒活性测定具有很高的抗病毒活性和增强鸡群整体抵抗力的作用。采用毕赤酵母表达系统表达外源基因，酵母本身蛋白分泌到上清中的很少，这样就增加了所表达外源蛋白的纯度，一般纯度高于75％。

毕赤氏酵母基因工程菌表达的鸡α干扰素被分泌到培养基中，纯度较高，且其在转录后可以受到一些真核修饰如糖基化、适当剪切与折叠等，因此最大程度上保证了天然蛋白结构和生物活性的发挥。鸡α干扰素的抗病毒活性以及抗肿瘤、抗增殖的功能国内外均有报道，只是鸡α干扰素的获得比较困难，起初，人们是通过干扰素诱生剂来诱导鸡体细胞来获得干扰素，但是这种方法获得的干扰素量很少，且一些诱生剂的运用对动物机体有许多不利的方面。而重组大肠杆菌表达的鸡α干扰素产量低，其生产工序烦琐，生产成本高。而本研究采用的毕赤氏酵母基因工程菌生产的鸡α干扰素只需收集表达的上清进行透析除盐处理后即可投入临床使用，且酵母不会分泌向大肠杆菌那样对鸡体细胞有毒害的一些内毒素。因此重组酵母鸡α干扰素的纯度在70％以上便可以保证对鸡群的使用。

3有益效果

而研究采用的毕赤氏酵母基因工程菌生产的鸡α干扰素与传统的用诱导剂生产的鸡α干扰素和用大肠杆菌表达的α干扰素相比有以下几个优点：

A获得具有生物活性的重组鸡α干扰素方法和程序都简单：只需收集表达的上清进行透析除盐处理后即可投入临床使用。

B无毒害物质：酵母不会分泌向大肠杆菌表达的外源蛋白那样附带一些对鸡体细胞有毒害的毒素。

C纯度高：酵母表达的鸡α干扰素的SDS-PAGE结果经薄层扫描显示，重组酵母鸡α干扰素的目的条带占总表达蛋白量的75％。

D广谱抗病毒作用：现国外资料表明鸡干扰素对鸡的各种病毒性疾病的病毒(劳氏肉瘤病毒等等)均有较好的抑制作用，尤其对一些烈性传染性病毒性疾病如禽流感、新城疫、马立克氏病、法氏囊病的早期治疗和防制有很好的作用，能在很大程度上遏制各种鸡传染性的病毒性疾病的流行和爆发。

E抗病毒作用强：本研究中研制的含有酵母鸡α干扰素的培养基经过65636倍稀释发现能完全抑制100-1000TCID50的水疱性口炎病毒(VSV)的攻击；256倍稀释后可以完全抑制1000TCID50的新城疫病毒的增殖；64倍稀释后能完全抑制1000TCID50的MDV的增殖。而鸡干扰素抑制禽流感病毒的能力与抑制水疱性口炎病毒的能力是相当的，因此重组酵母鸡α干扰素对禽流感病毒也必将有很高的抑制力。

F重组酵母菌表达的鸡α干扰素的临床使用效果好

重组酵母菌表达的鸡α干扰素在山东潍坊进行的初步小规模的临床实验表明：10-90U的重组鸡α干扰素对发生新城疫及传支混合感染的鸡群有明显的治疗作用，采用注射，口服，滴鼻、滴眼等不同的给予重组鸡α干扰素，其中采用注射方式给予途径的鸡群病情好转的最快，治愈率达到85％左右。

G有强大的免疫调节作用  医学临床把干扰素用于SARS、肝炎以及各种病毒性疾病治疗和预防的成功例子为重组鸡α干扰素用于鸡群各种病毒性疾病的治疗和防制提供了可靠的依据。近年我国鸡群因爆发的流行性的病毒性疾病给养殖业带来的损失数以亿计，而且诸如禽流感等病毒性传染病的局部地区的流行给养鸡业和人群的安全带来很大的威胁，这种损失是难以用金钱来衡量的。重组酵母鸡α干扰素的研制成功以及它所具有的一些列的便于工业化生产的优点，必将给我国鸡病毒性疾病的防制带来新的局面。

四、附图说明

图1：鸡α干扰素成熟蛋白基因PCR产物电泳分析

1，DNA分子量标准；2 阴性对照；3 PCR产物

图2PICZa-A-chIFNα阳性克隆载体的酶切鉴定

1，2000DNA分子量标准；2，3 ECORI和PSTI酶切的重组表达载体

图3：转化酵母的PCR鉴定

1，阴性对照；2，未重组上的酵母3，2000DNA分子量标准；4，，，阳性重组酵母

图4阳性对照孔中的水疱性口炎病毒的严重病变

图5干扰素稀释浓度高于48处理的鸡胚成纤维细胞

图6阴性对照孔中的鸡胚成纤维细胞

图7阳性对照孔中的NDV的严重病变

图8干扰素稀释浓度为4-4处理的鸡胚成纤维细胞

图9阴性对照孔中的鸡胚成纤维细胞

图10阳性对照孔中的MDV的严重病变

图11干扰素稀释浓度为4-3处理的鸡胚成纤维细胞

图12阴性对照孔中的鸡胚成纤维细胞

五、具体实施方式

1重组到毕赤酵母上的鸡α干扰素的基因序列的扩增

A引物的设计：

引物1：5‘AATTCAATTCTGCAACCACCTTCGCCCC’3

引物2：5‘CCGATCTAGAGTTTGGGGATTA’3

B鸡全血淋巴细胞总RNA的提取

取500μL培养以ConA刺激的不同时间段(4、5、6、7、8、9、10h)的鸡全血分离的淋巴细胞的悬液，向其中加入800μL Tripure细胞裂解液，振荡混匀后，置于室温下10min，然后向其中加入200μL氯仿，混匀后于室温下静置5min分钟，再于12000g 4℃下离心15min。吸取上清，向其中加入0.5倍体积的异丙醇，充分混匀后于室温下静置15min，随后在12000g4℃下离心10min。排尽管内液体，向管内加入1mL70％乙醇进行洗涤，混匀后，7500g4℃离心5min。弃去液体，待管壁稍干燥后加入20μLDEPC处理的超纯水溶解，即得到鸡淋巴细胞总RNA。

C含有鸡α干扰素基因序列cDNA第一条链的合成

用新鲜提取的淋巴细胞的总RNA进行RT-PCR，具体加样如下：

细胞总RNA                    9.2μL

5×反转录Buffer            4.0μL

10mM dNTP                  2.0μL

25mM MgCI₂                0.8μL

Rnasin                     1.0μL

引物1                      1.0μL

引物2                      1.0μL

将上述反应混合物于掌式离心机上稍作离心，然后于在PCR仪(Ampgene公司)上65℃15min后加入反转录酶M-MLV1.0μL(总体系为20μL)，后42℃1h，94℃5min后结束反应。

D PCR反应体系如下：

ddH₂O                     34μL

10×PCR Buffer             4.0μL

25mmol/L Mg²⁺             1.4μL

RT产物                     10μL

rTaq                       0.6μL

总体积                     50μL

在PCR仪(Ampgene公司)上设置94℃5min，随后94℃1min，56℃1min，72℃1min，共30个循环，结束循环后72℃10min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定获得的鸡α干扰素基因大小为488bp，见图1。

2含有鸡α干扰素成熟蛋白基因酵母表达载体的构建与鉴定

利用通过RT-PCR扩增的鸡α干扰素成熟蛋白基因有ECORI和XbaI两个酶切位点，把鸡α干扰素成熟蛋白基因切下后与已经同样两种限制性内切酶酶切的pPICZa-A酵母载体相连，再经ECORI和XbaI酶切，如能切下大小为488bp的条带则可以鉴定为阳性，见图2。

3感受态酵母菌的制备：

挑取毕赤酵母X-33平板上的一个单菌落转接于2mlYPD试管中，28℃250rpm恒温摇过夜活化12h后，取500ul的活化后的酵母菌液转接于50ml的含有无菌5mlYPD培养基的三角瓶中，瓶口用三层灭菌纱布扎紧，28℃恒温摇床250rpm摇荡培养20h左右。待菌液OD₆₀₀＝1.3-1.5时，4℃1500g离心4min收获细胞。细胞依次用1000ml冰预冷水和1000ml冰预冷的1M山梨醇洗涤，4℃1500g离心5min，最后用0.8ml冰预冷的1M山梨醇悬浮菌体，分装不同的ep管后，置4℃待用。

4含有鸡α干扰素成熟蛋白基因的酵母表达载体电转化入酵母菌

1)取BstXI酶线性化重组载体10ul(10ug)分别与80ul X-33感受态毕赤酵母细胞混匀，然后转移到冰预冷的0.2cm的电转移杯中，冰上放置5min。

2)将电转移杯放在电穿孔仪上用脉冲电流电击一次，电击条件：电压1500V，电容25uF，电阻200Ω，时间5ms，温度0℃。

3)电击结束，立即加入1ml冰预冷的1M山梨醇，混匀，取250ul转化物涂含有100ug/mlZeocin抗生素的YPDS(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖，1M山梨醇)培养基平皿上，置28℃恒温培养2-4天，能在YPDS培养基上生长的菌落为阳性转化子。

5用来鉴定阳性重组酵母菌的鉴定的PCR引物

根据酵母表达载体pPICZa-A上的一部分基因序列分别在目的基因插入的两端设计一对引物，它们分别为：

5′AOX1引物5‘gactggttccaattgagaagc’3

3′AOX1引物5‘gcaaatggcattctgacatcc’3

6含鸡α干扰素基因的重组酵母菌株的鉴定

将筛选得到的重组高拷贝菌株，取单菌落中少量菌放入Eppendof管中，加100ul的灭菌水，100℃煮10分钟，消解酵母菌细胞壁，然后放入液氮冻30分钟，100℃煮10分钟，12000rpm/min离心取上清液，以其中少量基因组DNA作模板，进行PCR。

7PCR扩增鉴定：以基因组DNA为模板，对整合到毕赤酵母X-33染色体DNA中的鸡α干扰素成熟蛋白基因进行PCR扩增，PCR扩增体系为：

10×PCRbuffer                       5ul

5′AOX1引物(20pmol/ul)              0.5ul

3′AOX1引物(20pmol/ul)              0.5ul

Taq酶                               0.5ul

dNTPs(10mM)                         1ul

模板(基因组DNA)                     5ul

灭菌水补体积至50ul

扩增程序：94℃5mi，94℃1min、55℃1.5min、72℃2.5min、30个循环，72℃7min。扩增结束，取5ul反应液做琼脂糖凝胶电泳观察未重组任何目的基因的PPICZa-A酵母的染色体通过以上一对引物可扩增出大小为580bp左右的片段，如果是阳性重组酵母表达菌株通过以上的一对引物扩增的片段应包含鸡α干扰素成熟蛋白基因(约488bp)，那么总长度应为1068bp左右。见图3。

8含鸡α干扰素成熟蛋白基因高表达酵母菌株的筛选

将YPDS培养基平皿中长出的最初转化子，影印法依次接种到含Zeocin抗生素浓度梯度为250，500，1000ug/ml的YPDS培养基中，逐级筛选Zeocin抗性菌株即含目的基因的高拷贝菌株。

9含鸡α干扰素成熟蛋白基因高表达酵母菌株的诱导表达

从含有高拷贝目的基因的酵母菌株的YPDS培养基平皿上分别挑取两株菌株与25ml的BMGY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、4×10^-5％生物素、1％甘油、100mM磷酸钾缓冲液，PH6.0)中，经28℃摇床培养至OD₆₀₀＝2-6时，室温1500g离心5min收获细胞，将收获的细胞用100ml的BMMY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、4×10^-5％生物素、0.5％甲醇、100mM磷酸钾缓冲液，PH6.0)培养液悬浮与1000mld的三角瓶中28℃诱导表达，每24h向培养基中补加0.5％的甲醇，以保持诱导的持续表达。在诱导72h时收集培养上清备用。

10含鸡α干扰素成熟蛋白基因高表达酵母菌株的表达产物的初步纯化

培养上清的处理：将诱导表达培养液离心，收集上清液留样后，用50mM的Tris-HCl(含1mMPMSF)缓冲液溶解，装入透析袋用50mM的Tris-HCl透析除去一些杂质，获得用PEG20000浓缩获得α干扰素蛋白。

上述重组酵母鸡α干扰素的SDS-PAGE结果经薄层扫描显示，重组酵母鸡γ干扰素的目的条带占总表达蛋白量的75％，即纯度达到了70％以上。

同时通过不同时段取样的电泳分析，发现在诱导了72h时的上清浓缩10倍后的电泳图上在14千道尔顿与20千道尔顿之间有一条大约16千道尔顿的明显的蛋白电泳条带。

11酵母表达的鸡α干扰素的生物活性的测定

取孵化9-10d的SPF鸡胚，去头、四肢及内脏，无菌状态下用PBS洗三遍后，剪碎。吹打成单个细胞后上96孔板，生长约12h使细胞全部贴壁生长后，去除生长液，每孔加入4倍倍比稀释的干扰素，用1000TCID₅₀的剂量的口泡炎病毒(VSV)进行攻毒，细胞对照则加无病毒的营养液，同时设立阴性对照(只加4¹稀释的干扰素，不加病毒)、阳性对照(不加干扰素，只加病毒)，空白对照(不加干扰素，不加病毒)，在倒置显微镜下观察待对照孔出现50％以上病变的时候，在倒置显微镜下观察待对照孔出现50％以上病变的时候，判断结果。

A重组酵母菌表达的鸡α干扰素抗水疱性口炎病毒的结果

24小时后观察可见阳性对照孔完全出现100％严重病变(图4)，而酵母表达的干扰素进行4¹⁰，4⁹，4⁸稀释后所加入的细胞孔分别有70％，40％，0％的病变，在加入高于4^-8浓度干扰素的细胞孔，细胞状态良好(图5)。阴性对照孔中是正常的鸡胚成纤维细胞(图6)。从上述结果得出重组酵母鸡α干扰素的生物学活性为4⁸U/ml。

B重组酵母表达的鸡α干扰素抗MDV和NDV的结果

接MDV毒后，大约2天阳性对照孔开始出现病变，到第四天，阳性对照孔已出现完全病变见图7，而在4⁴稀释的重组鸡α干扰素孔中细胞没有任何病变图8。阴性对照孔中细胞正常图9。

接NDV病毒后，大约50h天阳性对照孔开始出现病变，到第72-96h，阳性对照孔已出现明显病变见图10，而在4³稀释的重组鸡α干扰素孔中细胞没有任何病变图11。阴性对照孔中细胞正常图12。

根据以上实验可以说明重组酵母鸡α干扰素已被成功研制出来，其256倍稀释便可完全抑制住1000 TCID₅₀水疱性口炎病毒的增殖。阴性对照孔中的细胞生长良好，说明酵母干扰素上清对鸡体细胞没有明显毒害。而且重组酵母鸡α干扰素对MDV和NDV等都具有较强的抑制能力。

12重组酵母菌表达的鸡α干扰素的临床使用效果

重组酵母菌表达的鸡α干扰素在山东潍坊进行的小规模(50只鸡)应用，结果表明：10-50U的重组鸡α干扰素对发生新城疫、传支及大肠杆菌混合感染的鸡群有明显的辅助治疗作用，采用注射，口服，滴鼻、滴眼等不同的给予重组鸡γ干扰素，发病鸡群病情明显好转，其中以注射方式给予途径的鸡群，在给予重组酵母菌干扰素后的20-96小时，鸡群病情改善最快，且采食量恢复正常，逐渐恢复健康，治愈率达到85％；而对照组鸡群仍维持病状，食欲不振、精神萎靡、对照组鸡群体重在4天内平均下降了20％，死亡率达到了30％。

附录：鸡α干扰素成熟蛋白的基因序列及氨基酸序列

TGC AAC CAC CTT CGC CCC CAG GAT GCC ACC TTC TCT CAC GAC AGC CTC CAG

  C  N   H   L   R   P   Q   D   A   T   F   S   H   D   S   L   Q

CTC CTC CGG GAC ATG GCT CCC ACA CTA CCC CAG CTG TGC CCA CAG CAC AAC

  L  L   R   D   M   A   P   T   L   P   Q   L   C   P   Q   H   N

GCG TCT TGC TCC TTC AAC GAC ACC ATC CTG GAC ACC AGC AAC ACC CGG CAA

  A  S   C   S   F   N   D   T   I   L   D   T   S   N   T   R   Q

GCC GAC AAA ACC ACC CAC GAC ATC CTT CAG CAC CTC TTC AAA ATC CTC AGC

  A  D   K   T   T   H   D   I   L   Q   H   L   F   K   I   L   S

AGC CCC AGC ACT CCA GCC CAC TGG AAC GAC AGC CAA CGC CAA AGC CTC CTC

  S  P   S   T   P   A   H   W   N   D   S   Q   R   Q   S   L   L

AAC CGG ATC CAC CGC TAC ACC CAG CAC CTC GAG CAA TGC TTG GAC AGC AGC

  N  R   I   H   R   Y   T   Q   H   L   E   Q   C   L   D   S   S

GAC ACG CGC TCC CGG ACG CGA TGG CCT CGC AAC CTT CAC CTC ACC ATC AAA

  D  T   R   S   R   T   R   W   P   R   N   L   H   L   T   I   K

AAA CAC TTC AGC TGC CTC CAC ACC TTC CTC CAA GAC AAC GAT TAC AGC GCC

  K  H   F   S   C   L   H   T   F   L   Q   D   N   D   Y   S   A

TGC GCC TGG GAA CAC GTC CGC CTG CAA GCT CGT GCC TGG TTC CTG CAC ATC

  C  A   W   E   H   V   R   L   Q   A   R   A   W   F   L   H   I

CAC AAC CTC ACA GGC AAC ACG CGC ACT

  H  N   L   T   G   N   T   R   T

Claims (2)

1、一种重组鸡α干扰素的生产方法，包括：(一)重组到毕赤酵母上的鸡α干扰素的基因序列的扩增

A)引物的设计：

引物1：5‘AATTCAATTCTGCAACCACCTTCGCCCC’3

引物2：5‘CCGATCTAGAGTTTGGGGATTA’3

B)鸡全血淋巴细胞总RNA的提取取500μL培养以ConA刺激4～10h的鸡全血分离的淋巴细胞的悬液，向其中加入800μL Tripure细胞裂解液，振荡混匀后，置于室温下10min，然后向其中加入200μL氯仿，混匀后于室温下静置5min分钟，再于12000g 4℃下离心15min；吸取上清，向其中加入0.5倍体积的异丙醇，充分混匀后于室温下静置15min，随后在12000g 4℃下离心10min；排尽管内液体，向管内加入1mL70％乙醇进行洗涤，混匀后，7500g 4℃离心5min；弃去液体，待管壁稍干燥后加入20μLDEPC处理的超纯水溶解，即得到鸡淋巴细胞总RNA；

C)含有鸡α干扰素基因序列cDNA第一条链的合成

用新鲜提取的淋巴细胞的总RNA进行RT-PCR，具体加样如下：

细胞总RNA               9.2μL

5×反转录Buffer         4.0μL

10mM dNTP               2.0μL

25mM MgCI₂             0.8μL

Rnasin                  1.0μL

引物1                   1.0μL

引物2                   1.0μL

将上述反应混合物于掌式离心机上稍作离心，然后于在PCR仪；上65℃ 15min后加入反转录酶M-MLV1.0μL，后42℃ 1h，94℃ 5min后结束反应；D)PCR反应体系如下：

ddH₂O                  34μL

10×PCR Buffer          4.0μL

25mmol/L Mg²⁺          1.4μL

RT产物                  10μL

rTaq                    0.6μL

总体积                  50μL

在PCR仪上设置94℃ 5min，随后94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环，结束循环后72℃ 10min；对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定获得的鸡α干扰素基因大小为488bp；

(二)含有鸡α干扰素成熟蛋白基因酵母表达载体的构建与鉴定

利用通过RT-PCR扩增的鸡α干扰素成熟蛋白基因有ECOR I和XbaI两个酶切位点，把鸡α干扰素成熟蛋白基因切下后与已经同样两种限制性内切酶酶切的pPICZa-A酵母载体相连，再经ECOR I和XbaI酶切，切下大小为488bp的条带则可以鉴定为阳性；

(三)感受态酵母菌的制备：

挑取毕赤酵母X-33平板上的一个单菌落转接于2mlYPD试管中，28℃250rpm恒温摇过夜活化12h后，取500ul的活化后的酵母菌液转接于50ml的含有无菌5mlYPD培养基的三角瓶中，瓶口用三层灭菌纱布扎紧，28℃恒温摇床250rpm摇荡培养20h左右。待菌液OD₆₀₀＝1.3-1.5时，4℃1500g离心4min收获细胞。细胞依次用1000ml冰预冷水和1000ml冰预冷的1M山梨醇洗涤，4℃1500g离心5min，最后用0.8ml冰预冷的1M山梨醇悬浮菌体，分装不同的ep管后，置4℃待用；

(四)含有鸡α干扰素成熟蛋白基因的酵母表达载体电转化入酵母菌

1)取SacI酶线性化重组载体10ul分别与80ul X-33感受态毕赤酵母细胞混匀，然后转移到冰预冷的0.2cm的电转移杯中，冰上放置5min；

2)将电转移杯放在电穿孔仪上用脉冲电流电击一次，电击条件：电压1500V，电容25uF，电阻200Ω，时间5ms，温度0℃；

3)电击结束，立即加入1ml冰预冷的1M山梨醇，混匀，取250ul转化物涂含有100ug/mlZeocin抗生素的YPDS培养基平皿上，置28℃恒温培养2-4天，能在YPDS培养基上生长的菌落为阳性转化子；

(五)用来鉴定阳性重组酵母菌的鉴定的PCR引物

根据酵母表达载体pPICZa-A上的一部分基因序列分别在目的基因插入的两端设计一对引物，它们分别为：

5′AOX1引物5‘gactggttccaattgagaagc’3

3′AOX1引物5‘gcaaatggcattctgacatcc’3

(六)含鸡α干扰素基因的重组酵母菌株的鉴定

将筛选得到的重组高拷贝菌株，取单菌落中少量菌放入Eppendof管中，加100ul的灭菌水，100℃煮10分钟，消解酵母菌细胞壁，然后放入液氮冻30分钟，100℃煮10分钟，120000rpm/min离心取上清液，以其中少量基因组DNA作模板，进行PCR；

(七)PCR扩增鉴定：以基因组DNA为模板，对整合到毕赤酵母X-33染色体DNA中的鸡α干扰素成熟蛋白基因进行PCR扩增，PCR扩增体系为：

10×PCRbuffer                         5ul

  20pmol/ul 5′AOX1引物      0.5ul

  20pmol/ul 3′AOX1引物      0.5ul

  Taq酶                      0.5ul

  10mM dNTPs                   1ul

  基因组DNA模板                5ul

  灭菌水补体积至  50ul扩增程序：94℃ 5mi，94℃ 1min、55℃ 1.5min、72℃ 2.5min、30个循环，72℃ 7min，扩增结束，取5ul反应液做琼脂糖凝胶电泳观察阳性重组酵母表达菌株通过以上的一对引物扩增的片段总长度为1068bp左右；

(八)含鸡α干扰素成熟蛋白基因高表达酵母菌株的筛选

将YPDS培养基平皿中长出的最初转化子，影印法依次接种到含Zeocin抗生素浓度梯度为250，500，1000ug/ml的YPDS培养基中，逐级筛选Zeocin抗性菌株即含目的基因的高拷贝菌株；

(九)含鸡α干扰素成熟蛋白基因高表达酵母菌株的诱导表达

从含有高拷贝目的基因的酵母菌株的YPDS培养基平皿上分别挑取两株菌株与25ml的BMGY中，经28℃摇床培养至OD₆₀₀＝2-6时，室温1500g离心5min收获细胞，将收获的细胞用100ml的BMMY培养液悬浮与1000mld的三角瓶中28℃诱导表达，每24h向培养基中补加0.5％的甲醇，以保持诱导的持续表达，在诱导72h时收集培养上清备用；

(十)含鸡α干扰素成熟蛋白基因高表达酵母菌株的表达产物的初步纯化培养上清的处理：将诱导表达培养液离心，收集上清液留样后，用50mM含1mMPMSF的Tris-HCl缓冲液溶解，装入透析袋用50mM的Tris-HCl透析除去杂质，然后用PEG20000浓缩获得鸡α干扰素成熟蛋白。

2、权利要求1所述重组鸡α干扰素的生产方法所构建的重组载体，为含有鸡α干扰素成熟蛋白基因的酵母表达载体。

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