CN1746184A - 天花粉蛋白突变体及其编码基因 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种天花粉蛋白突变体及其编码基因。本发明的天花粉蛋白突变体，是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸和自N端的第78位天冬氨酸的两个氨基酸残基中至少一个突变，且所述自氨基端的第55位的酪氨酸突变为脂肪族氨基酸，所述自氨基端的第78位的天冬氨酸突变为亲水性较低的氨基酸的蛋白质。本发明的TCS突变体将在治疗恶性肿瘤、AIDS等疾病的临床应用中发挥重要作用。

Description

天花粉蛋白突变体及其编码基因
技术领域
本发明涉及基因工程领域中一种天花粉蛋白突变体及其编码基因。
背景技术
天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是中药天花粉的有效成分，提取自多年生宿根草质藤本植物栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim)的块根，具有引产、调节免疫、抗肿瘤、抗病毒等多种生物学活性。临床上很早就发现TCS用于治疗滋养层细胞的异常增殖，如葡萄胎、恶性葡萄胎和绒毛膜上皮癌等，都具有显著疗效。特别是1989年发现TCS具有抗HIV活性，引起了人们广泛的关注。
天花粉蛋白(GeneBank Accession number AY669811)由247个氨基酸残基组成，分子量27kD，等电点9.4，是一个简单蛋白，没有糖基或其它基团修饰。天花粉蛋白属于I型核糖体灭活蛋白(ribosome-inactivating proteins，RIPs)，能够专一水解真核细胞核糖体28S rRNA 4324位的腺苷酸与核糖环间的N-C糖苷键，阻止蛋自质翻译。在体外条件下能够切割超螺旋DNA、通过caspase途径诱导癌细胞凋亡等。其中，核糖体灭活活性和诱导癌细胞凋亡的活性是天花粉蛋白抑制肿瘤细胞的主要原因。
天花粉蛋白需要进入细胞才能发挥对细胞的杀伤作用，但是I型核糖体灭活蛋白进入细胞的途径尚不十分清楚。近来有文献指出，低密度脂蛋白受体家族在介导TCS入胞中起重要作用，但TCS分子中与受体蛋白的相互作用区域的研究仍为空白。
由于天花粉蛋白具有重要的药用价值，因此临床应用前景广阔。但由于天花粉蛋白是一种植物源蛋白，对人体的免疫反应和毒副作用较强，在临床应用时会产生不良反应，包括发热、风疹、水肿、肌肉疼痛等，严重的还会影响中枢神经系统。这种反应限制了天花粉蛋白在临床上的应用。
天花粉蛋白的这种毒副作用，主要来自两方面：一是天花粉蛋白引起的全身免疫反应，主要与TCS分子表面的抗原决定簇有关；二是天花粉蛋白进入组织细胞发挥细胞毒性作用而导致的对机体组织器官的损伤作用。为了降低TCS在临床应用中的毒副反应，可从以下两个有效途径对其进行分子改造：一是去除TCS分子表面的抗原决定簇；二是限定TCS分子专一性入胞的途径，即从阻止TCS分子自行进入细胞入手，对TCS分子中与入胞相关的关键位点进行改变。由于天花粉蛋白含有多个抗原决定簇，在分子表面分布较广，因此依靠去除全部的抗原决定簇来消除毒副反应的难度较大；而从TCS分子进入细胞的相关位点或区域入手，通过消除TCS分子的自行入胞功能，使之听从于靶细胞特异性的导向分子而专一性地进入肿瘤细胞，不仅可以减小TCS对正常细胞或机体其他组织器官的细胞毒性，而且能够影响抗原呈递细胞对TCS分子的摄取，从而降低了TCS引发的免疫反应，具有双重功效。
目前国内外对TCS的研究大多集中在功能活性相关的结构特点及其改造，而对TCS的免疫原性及毒副作用相关的研究较少，特别是对TCS分子的细胞识别与入胞作用等功能相关的研究仍处于空白。
2002年，Wang JH等将天花粉蛋白Lys120-Ile121-Arg122-Glu123突变成为Ser120-Ala121-Gly122-Gly123，以及得到一个双突变体TCSE160A/E189A，上述两个突变体的核糖体灭活(RI)活性大大降低，并且丧失了抗HIV的活性。将122位的Arg突变为Gly，保留了抗HIV的活性，但RI活性降低了160倍。2003年，Zhang F等将TCS的C末端7个氨基酸残基删除，使TCS的体内细胞毒性和体外RI活性同时降低，但RI活性降低的程度更大。
目前，在恶性肿瘤等疾病的临床治疗中，导向药物显示出广泛的应用潜力。导向药物治疗是以针对不同肿瘤细胞或病毒感染细胞的特异性单抗或单抗片段(如ScFv)等作为导向剂，将具有杀伤肿瘤细胞或抗病毒作用的免疫毒素等蛋白作为效应剂(弹头)，用化学偶联或基因融合的方法将导向剂与效应剂组成导向药物，特异性地杀伤或抑制导向剂所识别的肿瘤细胞或感染细胞中的病毒。
发明内容
本发明的目的是提供一种天花粉蛋白突变体及其编码基因。
本发明所提供的天花粉蛋白突变体，是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸和自N端的第78位天冬氨酸的两个氨基酸残基中至少一个突变，且所述自氨基端的第55位的酪氨酸突变为脂肪族氨基酸，所述自氨基端的第78位的天冬氨酸突变为亲水性较低的氨基酸的蛋白质。
其中，酪氨酸为芳香族氨基酸，天冬氨酸为强亲水性氨基酸。
所述脂肪族氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等，优选为甘氨酸。所述亲水性较低的氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸、半胱氨酸等，优选为丝氨酸。
上述天花粉蛋白突变体的编码基因也属于本发明的保护范围。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸突变为甘氨酸的蛋白质(名称为TCSY55G)时，其编码基因(名称为tcsY55G)具有序列表中序列1的核苷酸序列；自N端的第55位甘氨酸的密码子除序列1中的自5′端第163位-165位的GGC外，还可为其它简并密码子，如GGA、GGT、GGG。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸突变为丙氨酸的蛋白质(名称为TCSY55A)时，其编码基因(名称为tcsY55A)具有序列表中序列1的自5′端第163位-165位为GCA、GCT、GCC或GCG(代表丙氨酸)的核苷酸序列。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸突变为缬氨酸的蛋白质(名称为TCSY55V)时，其编码基因(名称为tcsY55V)具有序列表中序列1的自5′端第163位-165位为GTA、GTT、GTC或GTG(代表缬氨酸)的核苷酸序列。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸突变为亮氨酸的蛋白质(名称为TCSY55L)时，其编码基因(名称为tcsY55L)具有序列表中序列1的自5′端第163位-165位为CTA、CTT、CTC、CTG、TTA或TTG(代表亮氨酸)的核苷酸序列。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸突变为异亮氨酸的蛋白质(名称为TCSY55I)时，其编码基因(名称为tcsY55I)具有序列表中序列1的自5′端第163位-165位为ATT、ATC或ATA(代表异亮氨酸)的核苷酸序列。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自N端的第78位天冬氨酸突变为丝氨酸的蛋白质(名称为TCSD78S)时，其编码基因(名称为tcsD78S)具有序列表中序列2的核苷酸序列；自N端的第78位丝氨酸的密码子除序列2中的自5′端第232位-234位的TCC外，还可为其它简并密码子，如TCA、TCT、TCG、AGT、AGC。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自N端的第78位天冬氨酸突变为苏氨酸的蛋白质(名称为TCSD78T)时，其编码基因(名称为tcsD78T)具有序列表中序列2的自5′端第232位-234位为ACA、ACT、ACC或ACG(代表苏氨酸)的核苷酸序列。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自N端的第78位天冬氨酸突变为天冬酰胺的蛋白质(名称为TCSD78N)时，其编码基因(名称为tcsD78N)具有序列表中序列2的自5′端第232位-234位为AAT或AAC(代表天冬酰胺)的核苷酸序列。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自N端的第78位天冬氨酸突变为谷氨酰胺的蛋白质(名称为TCSD78Q)时，其编码基因(名称为tcsD78Q)具有序列表中序列2的自5′端第232位-234位为CAA或CAG(代表谷氨酰胺)的核苷酸序列。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自N端的第78位天冬氨酸突变为丙氨酸的蛋白质(名称为TCSD78A)时，其编码基因(名称为tcsD78A)具有序列表中序列2的自5′端第232位-234位为GCA、GCT、GCC或GCG(代表丙氨酸)的核苷酸序列。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自N端的第78位天冬氨酸突变为半胱氨酸的蛋白质(名称为TCSD78C)时，其编码基因(名称为tcsD78C)具有序列表中序列2的自5′端第232位-234位为TGT或TGC(代表半胱氨酸)的核苷酸序列。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自N端的第55位的酪氨酸突变为甘氨酸，和自N端的第78位天冬氨酸突变为丝氨酸的蛋白质(名称为TCSY55G/D78S)时，其编码基因(名称为tcsY55G/D78S)具有序列表中序列3的核苷酸序列。自N端的第55位甘氨酸的密码子除序列3中的自5′端第163位-165位的GGC外，还可为其它简并密码子，如GGA、GGT、GGG；而且，自N端的第78位丝氨酸的密码子除序列3中的自5′端第232位-234位的TCC外，还可为其它简并密码子，如TCA、TCT、TCG、AGT、AGC。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，并且自N端的第78位天冬氨酸突变为苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸或半胱氨酸的蛋白质时，其编码基因具有下述核苷酸序列之一：
1)序列3中的自5′端第163位-165位选自如下密码子之一：GCA、GCT、GCC、GCG(代表丙氨酸)；GTA、GTT、GTC、GTG(代表缬氨酸)；CTA、CTT、CTC、CTG、TTA、TTG(代表亮氨酸)；ATT、ATC、ATA(代表异亮氨酸)；
2)序列3中的自5′端第232位-234位选自如下密码子之一：ACA、ACT、ACC、ACG(代表苏氨酸)；AAT、AAC(代表天冬酰胺)；CAA、CAG(代表谷氨酰胺)；GCA、GCT、GCC、GCG(代表丙氨酸)；TGT、TGC(代表半胱氨酸)；
3)序列3中的自5′端第163位-165位选自如下密码子之一：GGA、GGT、GGG或GCA、GCT、GCC、GCG(代表丙氨酸)；GTA、GTT、GTC、GTG(代表缬氨酸)；CTA、CTT、CTC、CTG、TTA、TTG(代表亮氨酸)；ATT、ATC、ATA(代表异亮氨酸)；且序列3中的自5′端第232位-234位为TCA、TCT、TCG、AGT、AGC或ACA、ACT、ACC、ACG(代表苏氨酸)；AAT、AAC(代表天冬酰胺)；CAA、CAG(代表谷氨酰胺)；GCA、GCT、GCC、GCG(代表丙氨酸)；TGT、TGC(代表半胱氨酸)。
本发明利用TCS的靶细胞--人绒毛膜上皮癌细胞(JAR)，确定了55和78位氨基酸为TCS识别与入胞相关的氨基酸位点，利用基因工程定点突变法对该位点进行改造，得到了丧失入胞功能、毒副作用下降，而抗肿瘤等其他药物学活性保留的突变体天花粉蛋白，其中TCSY55G，TCSD78S和TCSY55G/D78S为优选。
实验证明TCSY55G，TCSD78S和TCSY55G/D78S等几种天花粉蛋白突变体在非细胞体系中仍保留有TCS的核糖体失活活性、蛋白质翻译抑制活性等，保留了诱导细胞内caspase-3活性升高从而导致细胞凋亡等生物学功能，而消除了TCS自身的细胞识别与入胞功能，特别是TCS引起的免疫原性及毒副作用显著下降，具有优良的免疫毒素蛋白的性状。该位点的改变不影响TCS的药物学功能，只消除了TCS自行进入细胞的能力，从而不能直接杀伤肿瘤细胞，同时也消除了对正常组织细胞的非选择性杀伤作用，极大的降低了TCS的免疫原性和细胞毒性，具备了导向药物弹头的优良特性。
本发明的TCS突变体蛋白TCSY55G、TCSD78S和TCSY55G/D78S等具有制备方法简单、产量高、纯化简便，表达产物为可溶性蛋白等特点。突变体均保留原有核糖体失活活性、细胞凋亡活性等，保留了抗病毒和抗肿瘤的功能，而极大地降低了TCS自行入胞引起的全身性毒副作用。本发明所产生的天花粉蛋白突变体已丧失自行入胞的功能，对正常细胞的毒性减弱，引起免疫反应的能力降低等，是极好的效应物，即“弹头”，对患者全身性毒副作用小，用药更加安全有效，可以长期反复使用。本发明的TCS突变体将在治疗恶性肿瘤、AIDS等疾病的临床应用中发挥重要作用。
附图说明
图1为天花粉蛋白突变体tcsY55G、tcsD78S和tcsY55G/D78S的核糖体灭活活性曲线
图2为天花粉蛋白突变体tcsY55G、tcsD78S和tcsY55G/D78S抑制JAR细胞活性的柱状图
图3为天花粉蛋白突变体tcsY55G、tcsD78S和tcsY55G/D78S诱导JAR细胞凋亡活性的柱状图
图4a为PBS处理的小鼠肝脏照片
图4b为nTCS处理的小鼠肝脏照片
图4c为TCSY55G处理的小鼠肝脏照片
图4d为TCSD78S处理的小鼠肝脏照片
图4e为TCSY55G/D78S处理的小鼠肝脏照片
图5为天花粉蛋白突变体进入JAR细胞内部能力的荧光分析照片
具体实施方式
实施例1、天花粉蛋白突变体的表达与纯化
根据天花粉蛋白成熟肽基因、氨基酸序列及其肽链走向、以及三维结构的模拟分析，利用软件分析预测了可突变位点55位和78位。利用TCS的靶细胞——人绒毛膜上皮癌细胞(JAR)，确定了55和78位氨基酸为TCS识别与入胞相关的氨基酸位点。
利用定点突变技术将TCS成熟肽基因55位的酪氨酸突变成甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，将78位天冬氨酸突变为丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸、半胱氨酸，以及将两个位点同时突变，得到tcsY55G、tcsD78S、tcsY55G/D78S等突变体基因。其中，定点突变的PCR模板为野生型tcs(序列表中的序列4)；各PCR反应体系中所采用的反应体系和循环程序如下：
反应体系：去离子水                              39μl
          dNTP                                  2μl
          正向引物                    1μl
          反向引物                    1μl
          模板                        1μl
          10×Taq酶反应缓冲液         5μl
          Taq酶                       1μl
          总体积                      50μl
循环程序：预变性          94℃    60秒
          变性            94℃    50秒
          退火            58℃    70秒
          延伸            72℃    60秒
          循环次数        35次
          终末延伸        72℃    600秒
再利用常规分子克隆方法，将上述突变体基因分别克隆到高效原核表达载体pT7-7(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)的NdeI和HindIII酶切位点之间，通过CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。取单菌落在LB培养基内37℃培养12小时后，1∶100转接至新鲜培养基放大培养，当菌液在600nm下0D值为0.6-0.8时，加IPTG至终浓度0.5mM诱导蛋白表达，继续培养6-8小时，收集菌体，经超声波破碎后离心取上清液，经CM-Sepharose Fast Flow柱层析分离纯化，分别收集主峰得到天花粉蛋白突变体。天花粉蛋白突变体分别表达纯化后，经SDS-PAGE以及westernblot检测正确，蛋白纯度可达99％。蛋白产率高，每升培养物可达13-14mg。
其中，为将突变体基因的5’端插入pT7-7载体的NdeI位点，在PCR的引物设计时引入NdeI酶切位点序列CATATG；为将突变体基因的3’端插入pT7-7载体的HindIII位点，在PCR的引物设计时引HindIII酶切位点序列AAGCTT，同时引入终止密码子TAA。引物设计具体如下：
引物1：5’-GGCATCATATGGATGTTAGCTTCCGGTTA-3’；
引物2：5’-GGGAAGCTTATGCCATATTGTTTCGATT-3’；
引物3：5’-CATCGGCGCCATTTGTGAG-3’(斜体碱基代表甘氨酸)；
(其他的第55位突变的一端引物分别为将上述引物3的斜体碱基替换成为CCT、CCA、CCC(代表甘氨酸的简并碱基)；CGT、CGA、CGG、CGC(代表丙氨酸)；CAT、CAA、CAG、CAC(代表缬氨酸)；GAT、GAA、GAG、GAC、AAT、AAC(代表亮氨酸)；TAA、TAG、TAT(代表异亮氨酸))
引物4：5’-CTCACAAATGGCGCCGATG-3’(斜体碱基代表甘氨酸)；
(其他的第55位突变的另一端引物分别为将上述引物4的斜体部分替换成为GGA、GGT、GGG(代表甘氨酸的简并碱基)；GCA、GCT、GCC、GCG(代表丙氨酸)；GTA、GTT、GTC、GTG(代表缬氨酸)；CTA、CTT、CTC、CTG、TTA、TTG(代表亮氨酸)；ATT、ATC、ATA(代表异亮氨酸))
引物5：5’-AGGATGTGGAGCCAGCGCG-3’(斜体碱基代表丝氨酸)；
(其他的第78位突变的一端引物分别为将上述引物5的斜体部分替换成为AGT、AGA、AGC、TCA、TCG(代表丝氨酸的简并碱基)；TGT、TGA、TGG、TGC(代表苏氨酸)；TTA、TTG(代表天冬酰胺)；GTT、GTC(代表谷氨酰胺)；CGT、CGA、CGG、CGC(代表丙氨酸)；ACA、ACG(代表半胱氨酸))
引物6：5’-CGCGCTGGC TCCACATCCT-3’(斜体碱基代表丝氨酸)；
(其他的第78位突变的另一端引物分别为将上述引物6的斜体部分替换成为TCA、TCT、TCG、AGT、AGC(代表丝氨酸的简并碱基)；ACA、ACT、ACC、ACG(代表苏氨酸)；AAT、AAC(代表天冬酰胺)；CAA、CAG(代表谷氨酰胺)；GCA、GCT、GCC、GCG(代表丙氨酸)；TGT、TGC(代表半胱氨酸))
下面以制备tcsY55G、tcsD78S和tcsY55G/D78S为例：
制备tcsY55G：第一阶段PCR：模板序列为序列表中的序列4，引物为引物1和引物3，按上述PCR体系和循环程序得到产物tcs55-a片断；第二阶段PCR：模板序列为序列表中的序列4，引物为引物2和引物4，按上述PCR体系和循环程序得到产物tcs55-b片断；第三阶段PCR：模板为tcs55-a片断和tcs55-b片断的1∶1混合溶液，引物为引物1和引物2，按上述PCR体系和循环程序得到产物tcsY55G。
制备tcsD78S：第一阶段PCR：模板序列为序列表中的序列4，引物为引物1和引物5，按上述PCR体系和循环程序得到产物tcs78-a片断；第二阶段PCR：模板序列为序列表中的序列4，引物为引物2和引物6，按上述PCR体系和循环程序得到产物tcs78-b片断；第三阶段PCR：模板为tcs78-a片断和tcs78-b片断的1∶1混合溶液，引物为引物1和引物2，按上述PCR体系和循环程序得到产物tcsY55G。
制备tcsY55G/D78S：第一阶段PCR：模板序列为序列表中的序列1，引物为引物1和引物5，按上述PCR体系和循环程序得到产物tcs55/78-a片断；第二阶段PCR：模板序列为序列表中的序列1，引物为引物2和引物6，按上述PCR体系和循环程序得到产物tcs55/78-b片断；第三阶段PCR：模板为tcs55/78-a片断和tcs55/78-b片断的1∶1混合溶液，引物为引物1和引物2，按上述PCR体系和循环程序得到产物tcsY55G/D78S。(或者采取另一方法：第一阶段PCR：模板序列为序列表中的序列2，引物为引物1和引物3，按上述PCR体系和循环程序得到产物tcs78/55-a片断；第二阶段PCR：模板序列为序列表中的序列2，引物为引物2和引物4，按上述PCR体系和循环程序得到产物tcs78/55-b片断；第三阶段PCR：模板为tcs78/55-a片断和tcs78/55-b片断的1∶1混合溶液，引物为引物1和引物2，按上述PCR体系和循环程序得到产物tcsY55G/D78S)。
其它天花粉蛋白突变体编码基因的制备方法除引物3、4、5和6为其相对应的引物序列外，其它同tcsY55G、tcsD78S和tcsY55G/D78S的制备方法。
实施例2、天花粉蛋白突变体的生物学活性
a)TCS突变体的蛋白质合成抑制活性的测定
利用promega公司生产的兔网织红细胞体外翻译系统试剂盒，检测突变体作为核糖体灭活蛋白抑制蛋白质合成的能力，方法按说明书进行，[35S]甲硫氨酸为PerkinElmer Life Sciences公司产品。天花粉蛋白突变体的IC50值如表1所示，表明除TCSD78C的IC50值为20nM＜IC50≤50nM，TCSD78A和TCSD78T的IC50值均为10nM＜IC50≤20nM外，其它突变体与天然提取的TCS(nTCS)正对照(1.31×10-9M)的IC50均在1nM＜IC50≤10nM之间。
b)TCS突变体抑制JAR细胞的活性测定
在96孔细胞培养板中，以1×104个细胞/孔的接种量接入体外培养的人绒毛膜上皮癌细胞(JAR)，分别加入25μg/ml的天花粉蛋白突变体和作为正对照的nTCS，37℃培养48小时，用MTT法检测JAR细胞存活率。另将上述天花粉蛋白突变体和nTCS分别用脂质体转染试剂lipofectAMINE转入JAR细胞内部(方法参考Invitrogen公司lipofectAMINE转染试剂的说明书)，48小时后用MTT法检测JAR细胞存活率。测定结果如表1所示，表明直接外加突变体蛋白，细胞相对存活率≥90％，不能抑制JAR细胞生长；分别经转染试剂转入细胞内部以后，除TCSY55G、TCSY55A、TCSY55L、TCSD78S和TCSD78N的细胞存活率为40％＜细胞相对存活率≤50％外，其它突变体的细胞存活率为50％＜细胞相对存活率≤60％，能够抑制JAR细胞生长。
c)TCS突变体蛋白诱导JAR细胞凋亡活性的测定
利用ApoAlert Caspase-3 Colorimetric Assay Kit(Clontech公司)，按说明进行。细胞培养和蛋白浓度设置同b)，转染方法也同b)，测定时间为给药后12小时。测定结果如表1所示，表明外加突变体蛋白时不能诱导JAR细胞的caspase-3活性(caspase-3酶活力单位≤1.0)，但转染后均可以诱导caspase-3活性。
            表1.天花粉蛋白突变体的生物学活性
  天花粉蛋白及其突变体   体外抑制蛋白翻译能力*   未经转染抑制JAR细胞增值能力   经脂质体转染进入细胞后对JAR细胞增值的抑制能力  未经转染诱导JAR细胞caspase-3酶活性的能力   经脂质体转染进入细胞后对JAR细胞caspase-3酶活性的诱导能力
  nTCS   +++   ++   +++  +++   +++
  TCSY55G   +++   -   ++  -   ++
  TCSY55A   +++   -   ++  -   ++
  TCSY55V   +++   -   +  -   +
  TCSY55L   +++   -   ++  -   +
  TCSY55I   +++   -   +  -   +
  TCSD78S   +++   -   ++  -   ++
  TCSD78T   ++   -   +  -   +
  TCSD78N   ++   -   ++  -   ++
  TCSD78Q   +++   -   +  -   ++
  TCSD78A   ++   -   +  -   ++
  TCSD78C   +   -   +  -   +
  TCSY55G/D78S   +++   -   +  -   ++
注：
*体外抑制蛋白翻译能力：+++：1nM＜IC50≤10nM；++：10nM＜IC50≤20nM；+：20nM＜IC50≤50nM。
抑制JAR细胞增值能力：+++：细胞相对存活率≤40％；++：40％＜细胞相对存活率≤50％；+：50％＜细胞相对存活率≤60％；-：细胞相对存活率≥90％。
诱导JAR细胞caspase-3酶活性的能力：+++：caspase-3酶活力单位≥5.0；++：3.5≤caspase-3酶活力单位＜5.0；+：2.0≤caspase-3酶活力单位＜3.5；-：caspase-3酶活力单位≤1.0。
本实施例表明TCS经过上述单个位点或双位点突变之后，仍保留有核糖体灭活活性，而未表现出对肿瘤细胞的抑制作用，但经脂质体转染至肿瘤细胞内部后，可恢复对肿瘤细胞的抑制活性和以caspase-3为特征的诱导凋亡活性。
进一步分析表明：为消除酪氨酸的苯环基团影响而将55位酪氨酸突变为其他5种脂肪族氨基酸，为消除78位天冬氨酸的强亲水性而将78位突变为疏水性标度在正负1.0之间的6种氨基酸(Asp：-2.5，Ser：-0.3，Thr：0.4，Asn：-0.2，Gln：-0.2，Gly：0，Cys：1.0，疏水性标度数据来自Nozaki-Tanford和Levitt)，其中55位突变成甘氨酸、78位突变成丝氨酸后对蛋白体外翻译抑制活性和转染后抑制肿瘤细胞能力影响最小，因此Y55G和D78S以及双突变体Y55G/D78S为天花粉蛋白优选突变体，具有良好的研究与应用前景。
实施例3、天花粉蛋白TCSY55G、TCSD78S和TCSY55G/D78S的性质
测定天花粉蛋白优选突变体的蛋白质合成抑制活性、经脂质体转染前后对JAR细胞的抑制能力、以及转染前后诱导JAR细胞caspase-3酶活性的能力，方法如上所述。突变体对蛋白质合成抑制活性如图1所示，TCSY55G、TCS078S和TCSY55G/D78S的IC50值分别为4.67×10-9M、3.88×10-9M和6.62×10-9M，与天然提取的TCS(nTCS)正对照(1.31×10-9M)相比，均具有很强的抑制蛋白质体外翻译的能力。突变体抑制JAR细胞的活性如图2所示，表明直接外加nTCS正对照的细胞存活率下降到43.1％，而突变体TCSY55G、TCSD78S和TCSY55G/D78S不能抑制JAR细胞生长，细胞存活率分别为90.0％、94.6％、91.2％；但是，突变体蛋白TCSY55G、TCSD78S和TCSY55G/D78S分别经转染试剂转入细胞内部以后，能够抑制JAR细胞生长，细胞存活率下降到43.5％、41.9％、53.4％。突变体诱导JAR细胞凋亡活性如图3所示，表明外加突变体蛋白TCSY55G、TCSD78S和TCSY55G/D78S(未经转染)时不能诱导JAR细胞的caspase-3活性，但转染后均可以诱导caspase-3活性，且活性相对于用脂质体单独处理的对照组显著升高。同时，用相差显微镜观察，转染TCSY55G、TCSD78S和TCSY55G/D78S后，JAR细胞出现凋亡小体等典型的细胞凋亡现象，与正对照nTCS一致。
实施例4、天花粉蛋白突变体对动物体毒副作用的降低
取15只20g左右的C57BL/6J小鼠，随机分成3组，分别用天花粉蛋白突变体、nTCS或PBS加铝钒佐剂进行腹腔注射，每隔2周注射一次，每次10μg蛋白/小鼠。初次给药后的第35天处死小鼠，取全血，用常规ELISA法测定血清IgG和IgE水平。同时解剖小鼠，观察TCS对内脏的损伤。结果表明TCSY55G、TCSD78S和TCSY55G/D78S三种突变体组的IgG和IgE水平较正对照nTCS组均下降了近50％；TCSY55A、TCSD78T、TCSD78N、TCSD78C四种突变体组的IgG和IgE水平较正对照nTCS组均下降了近40％；TCSY55V、TCSY55L、TCSY55I、TCSD78Q、TCSD78A五种突变体组的IgG和IgE水平较正对照nTCS组均下降了近30％。在内脏形态上，nTCS组小鼠肝脏萎缩、边缘钝化、分叶不明显，肠粘连严重；而在天花粉蛋白突变体组中这种毒性损伤均不明显，其中TCSY55G、TCSD78S和TCSY55G/D78S三种突变体处理的小鼠内脏形态接近正常的负对照PBS组(图4a-图4e)。
实施例5、天花粉蛋白突变体中氨基酸的改变消除了其进入细胞的能力
经荧光标记物FITC偶联的nTCS和天花粉蛋白突变体，按照实施例2中b)所述方法，分别加入培养的JAR细胞中，4-12小时内在荧光显微镜下观察分析，发现TCSY55G、TCSD78S和TCSY55G/D78S等各种突变体蛋白在直接添加处理的情况下，只能在JAR表面的局部出现微弱的绿色荧光，而nTCS对照组可以使JAR细胞全部呈现明亮的绿色荧光。表明突变体失去了进入JAR细胞内部的能力(图5)。图5中，1 为未处理的细胞；2为FITC-BSA处理的细胞；3 为FITC-nTCS处理的细胞；4 为FITC-TCSY55G处理的细胞；5 为FITC-TCSD78S处理的细胞；6 为FITC-TCSY55G/D78S处理的细胞。说明所选择的突变位点Y55和D78对TCS进入靶细胞起决定性的作用，而它们所在的TCS蛋白表面的凹形区域与TCS经由受体介导进入细胞重要相关。
                           序列表
<160>4
<210>1
<211>741
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
gatgttagct tccggttatc aggtgcaaca agcagttcct atggagtttt catttcaaat    60
ctgagaaaag ctcttccaaa tgaaaggaga ctatacgata tccctctgtt acgttccact    120
cttcaaggtt ctcaacgcta cgcattgatc catctcacaa atggcgccga tgaaaccatt    180
tcagtggcca tagacgtaac gaacgtctat attatgggat atcgcgctgg cgatacatcc    240
tattttttca acgaggcttc tgcaacagaa gctgcaaaat atgtattcaa agacgctatg    300
cgaaaagtta cgcttccata ttctggcaat tacgaaaggc ttcaaactgc tgcgggcaaa    360
ataagggaaa atattccgct tggactccca gctttggaca gtgccattac cactttgttt    420
tactacaacg ccaattctgc tgcgtcggca cttatggtac tcattcagtc gacgtctgag    480
gctgcgaggt ataaatttat tgagcaacaa attgggaagc gcgctgacaa aaccttccta    540
ccaagtttag caattataag tttggaaaat agttggtctg ctctctccaa gcaaattcag    600
atagcgagta ctaataatgg acagtttgaa actcctgttg tgcttataaa tgctcaaaac    660
caacgagtcg cgataaccaa tgttgatgct ggagttgtaa cctccaacat cgcgttgctg    720
ctgaatcgaa acaatatggc a                                              741
<210>2
<211>741
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
gatgttagct tccggttatc aggtgcaaca agcagttcct atggagtttt catttcaaat    60
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ctgaatcgaa acaatatggc a                                              741
<210>3
<211>741
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
gatgttagct tccggttatc aggtgcaaca agcagttcct atggagtttt catttcaaat    60
ctgagaaaag ctcttccaaa tgaaaggaga ctatacgata tccctctgtt acgttccact    120
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<210>4
<211>741
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
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Claims (12)

1、一种天花粉蛋白突变体，是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸和自N端的第78位天冬氨酸的两个氨基酸残基中至少一个突变，且所述自氨基端的第55位的酪氨酸突变为脂肪族氨基酸，所述自氨基端的第78位的天冬氨酸突变为亲水性较低的氨基酸的蛋白质。
2、根据权利要求1所述的天花粉蛋白突变体，其特征在于：所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自N端的第55位酪氨酸突变为脂肪族氨基酸的蛋白质。
3、根据权利要求1所述的天花粉蛋白突变体，其特征在于：所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自N端的第78位天冬氨酸突变为亲水性较低的氨基酸。
4、根据权利要求1所述的天花粉蛋白突变体，其特征在于：所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自N端第55位酪氨酸突变为脂肪族氨基酸，且自N端的第78位天冬氨酸突变为亲水性较低的氨基酸的蛋白质。
5、根据权利要求1或2或4所述的天花粉蛋白突变体，其特征在于：所述脂肪族氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；优选为甘氨酸
6、根据权利要求1或3或4所述的天花粉蛋白突变体，其特征在于：所述亲水性较低的氨基酸为丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸或半胱氨酸；优选为丝氨酸。
7、编码权利要求1-6中任一所述的天花粉蛋白突变体的基因。
8、根据权利要求7所述的基因，其特征在于：所述天花粉蛋白突变体的编码基因具有下列核苷酸序列之一：
1)序列1的核苷酸序列；
2)序列1中的自5′端第163位-165位为GGA、GGT或GGG的核苷酸序列；
3)序列1中的自5′端第163位-165位为GCA、GCT、GCC或GCG的核苷酸序列；
4)序列1中的自5′端第163位-165位为GTA、GTT、GTC或GTG的核苷酸序列；
5)序列1中的自5′端第163位-165位为CTA、CTT、CTC、CTG、TTA或TTG的核苷酸序列；
6)序列1中的自5′端第163位-165位为ATT、ATC或ATA的核苷酸序列。
9、根据权利要求7所述的基因，其特征在于：所述天花粉蛋白突变体的编码基因具有下列核苷酸序列之一：
1)序列2的核苷酸序列；
2)序列2中的自5′端第232位-234位为TCA、TCT、TCG、AGT或AGC的核苷酸序列；
3)序列2中的自5′端第232位-234位为ACA、ACT、ACC或ACG的核苷酸序列；
4)序列2中的自5′端第232位-234位为AAT或AAC的核苷酸序列；
5)序列2中的自5′端第232位-234位为CAA或CAG的核苷酸序列；
6)序列2中的自5′端第232位-234位为GCA、GCT、GCC或GCG的核苷酸序列；
7)序列2中的自5′端第232位-234位为TGT或TGC的核苷酸序列。
10、根据权利要求7所述的基因，其特征在于：所述天花粉蛋白突变体的编码基因具有下列核苷酸序列之一：
1)序列3的核苷酸序列；
2)序列3中的自5′端第163位-165位为GGA、GGT、GGG、GCA、GCT、GCC、GCG、GTA、GTT、GTC、GTG、CTA、CTT、CTC、CTG、TTA、TTG、ATT、ATC或ATA的核苷酸序列；
3)序列3中的自5′端第232位-234位为TCA、TCT、TCG、AGT、AGC、ACA、ACT、ACC、ACG、AAT、AAC、CAA、CAG、GCA、GCT、GCC、GCG、TGT或TGC的核苷酸序列；
4)序列3中的自5′端第163位-165位为GGA、GGT、GGG、GCA、GCT、GCC、GCG、GTA、GTT、GTC、GTG、CTA、CTT、CTC、CTG、TTA、TTG、ATT、ATC或ATA；且序列3中的自5′端第232位-234位为TCA、TCT、TCG、AGT、AGC、ACA、ACT、ACC、ACG、AAT、AAC、CAA、CAG、GCA、GCT、GCC、GCG、TGT或TGC的核苷酸序列。
11、权利要求1-6中任一所述的天花粉蛋白突变体在制备治疗恶性肿瘤药物和AIDS药物中的应用。
12、权利要求7-10中任一所述的天花粉蛋白突变体编码基因在制备治疗恶性肿瘤药物和AIDS药物中的应用。
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