WO2006026906A1 - Trichosanthine mutante et gene codant pour celle-ci - Google Patents

Trichosanthine mutante et gene codant pour celle-ci Download PDF

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WO2006026906A1
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trichosanthin
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mutant
tcs
nucleotide sequence
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Chengcai An
Shuangli Mi
Ye Wang
Yin Gao
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Peking University
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to the field of genetic engineering, and more particularly, to a trichosanthin mutant and a coding gene thereof.
  • the present invention also relates to the use of the trichosanthin protein mutant and its coding gene for the preparation of a medicament for treating malignant tumors and AIDS. Background technique
  • Trichosanthin is an effective component of traditional Chinese medicine Tianhua powder. It is extracted from the roots of perennial Trichosanthes ki lowii Maxim. It has many biological activities such as induction, regulation, anti-tumor and anti-virus. It has long been clinically found that TCS is used to treat abnormal proliferation of trophoblast cells, such as hydatidiform mole, malignant mole, and chorionic epithelial cancer. In particular, in 1989, TCS was found to have anti-HIV activity, which caused widespread concern.
  • Trichosanthin protein (GeneBank Accession number AY669811) consists of 247 amino acid residues with a molecular weight of 27kD and an isoelectric point of 9.4. It is a simple protein with no glycosyl or other group modifications. Trichosanthin belongs to the ribosome-inactivating proteins (RIPs), which can specifically hydrolyze the N-C glycosidic bond between adenylate and ribose ring of eukaryotic cell ribosomal 28S rRNA at position 4324, preventing protein translation. . It can cleave supercoiled DNA under in vitro conditions, induce apoptosis of cancer cells through caspase pathway, and the like. Among them, ribosome inactivating activity and activity of inducing apoptosis of cancer cells are the main reasons for the inhibition of tumor cells by trichosanthin.
  • RIPs ribosome-inactivating proteins
  • Trichosanthin protein needs to enter the cell to exert its killing effect on cells, but the pathway of type I ribosome inactivating protein into cells is not fully understood. Recently, it has been pointed out that the low-density lipoprotein receptor family plays an important role in mediating TCS entry, but the study of the interaction region of TCS with receptor proteins remains blank.
  • trichosanthin Because trichosanthin has important medicinal value, it has broad clinical application prospects. However, because trichosanthin is a plant-derived protein, it has strong immune response and toxic side effects. It can cause adverse reactions in clinical applications, including fever, rubella, edema, muscle pain, etc., and severely affect the central nervous system. . This response limits the clinical application of trichosanthin.
  • the toxic side effects of trichosanthin are mainly from two aspects: one is the systemic immune response caused by trichosanthin protein, which is mainly related to the antigenic determinant on the surface of TCS molecule; the other is the body toxic effect caused by trichosanthin protein entering tissue cells. Damage to tissues and organs.
  • the reaction can be molecularly modified from two effective ways: one is to remove the antigenic determinant on the surface of the TCS molecule; the other is to limit the specific pathway of TCS molecule entry, that is, to prevent the TCS molecule from entering the cell by itself, Changes in key sites associated with entry into the TCS molecule.
  • TCS molecules Since trichosanthin contains multiple antigenic determinants and is widely distributed on the surface of the molecule, it is difficult to eliminate all the antigenic determinants to eliminate toxic and side reactions. Starting from the relevant sites or regions where TCS molecules enter the cells, Eliminating the self-introduction function of TCS molecules, allowing them to specifically target tumor-specific targeting molecules and specifically enter tumor cells, not only can be reduced
  • the cytotoxicity of TCS on normal cells or other tissues and organs of the body can affect the uptake of TCS molecules by antigen presenting cells, thereby reducing the immune response elicited by TCS, and has a dual effect.
  • Targeted drug therapy uses a specific monoclonal antibody or a monoclonal antibody fragment (such as ScFv) targeting different tumor cells or virus-infected cells as a guiding agent, and uses a protein such as an immunotoxin that kills tumor cells or antiviral action as an effector (warhead).
  • the chemical agent or the gene fusion method is used to direct the targeting agent and the effector composition to the drug, specifically killing or inhibiting the virus in the tumor cell or the infected cell recognized by the directing agent.
  • Another object of the present invention is the use of the trichosanthin mutant and its coding gene for the preparation of a medicament for treating diseases such as malignant tumors and AIDS.
  • the malignancy is a chorionic epithelial cancer.
  • the trichosanthin mutant provided by the present invention is a tyrosine at the N-terminus of the trichosanthin (i.e., a protein having the amino acid sequence of SEQ ID No. 8) and an aspartic acid at the 78-position from the N-terminus.
  • Two At least one mutation in the amino acid residue, and the tyrosine at position 55 of the amino terminus is mutated to an aliphatic amino acid, and the aspartic acid at position 78 from the amino terminus is changed to a less hydrophilic amino acid. protein.
  • tyrosine is an aromatic amino acid
  • aspartic acid is a strong hydrophilic amino acid
  • the aliphatic amino acid includes glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine or the like, preferably 5 glycine.
  • the less hydrophilic amino acid includes serine, threonine, asparagine, glutamine, alanine, cysteine, etc., preferably serine.
  • the gene encoding the above-mentioned trichosanthin mutant is also within the scope of the present invention.
  • the trichosanthin mutant is a protein of the trichosanthin protein mutated from the N-terminus at position 55 tyrosine to glycine (named TCS Y55Q ) (ie, a protein having the amino acid sequence of SEQ ID No. 5), 10 coding gene (named t CSY55(J ) has the nucleotide sequence of sequence 1 in the sequence listing ; codon of the 55th glycine from the N-terminus, except for the GGC from the 5' end of the 163th to the 165th position in the sequence 1
  • other degenerate codons such as GGA, GGT, GGG can also be used.
  • the coding gene (named te SY55A ) has the sequence 1 in the sequence listing .
  • the nucleotide sequence of 15 from position 165 to position 165 of the 5' end is GCA, GCT, GCC or GCG (representing alanine).
  • the coding gene (named tos Y55V ) has the sequence 1 in the sequence listing . From position 163 to position 165 of the 5' end, the nucleotide sequence of GTA, GTT, GTC or GTG (representing proline) is 20 columns.
  • the trichosanthin mutant is a protein in which the tyrosine at position 55 of the trichosanthin is mutated to leucine (named TCS Y55Ij )
  • the coding gene (named tcs Y55L ) has the sequence 1 in the sequence listing . From the 5' end of position 163-165 is the nucleotide sequence of CTA, CTT, CTC, CTG, TTA or TTG (representing leucine).
  • the coding gene (named tcs Y55I ) has a sequence listing Sequence 1 from position 163 to position 165 of the 5' end is the nucleotide sequence of ATT, ATC or ATA (representing isoleucine).
  • the trichosanthin mutant is a protein in which the aspartate of the trichosanthin is mutated from the N-terminus at position 78 to serine (named TCS D78S ) (ie, a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 6), -: 30 its coding gene (named tcs D78S ) has the nucleotide sequence of sequence 2 in the sequence listing ; from position 78 of the N-terminus
  • the codon for serine can be other degenerate codons such as TCA, TCT, TCG, AGT, AGC in addition to the TCC from position 232 to position 234 of the 5' end.
  • the coding gene (named tcs D78T ) has the sequence in the sequence listing .
  • the nucleotide sequence of 2 from position 232 to position 234 of the 5' end is ACA, ACT, ACC or ACG (representing threonine).
  • the coding gene (named tcs D78N ) has a sequence listing
  • the nucleotide sequence of sequence 2 from position 232 to position 234 of the 5' end is AAT or AAC (representing asparagine).
  • the coding gene (named tcs D78Q ) has the sequence in the sequence listing .
  • the nucleotide sequence of 2 from position 232 to position 234 of the 5' end is CAA or CAG (representing glutamine).
  • the coding gene (named tes D78A ) has the sequence in the sequence listing .
  • the nucleotide sequence of 2, from position 232 to position 234 of the 5' end is GCA, GCT, GCC or GCG (representing alanine).
  • the coding gene (named tos D78C ) has a sequence listing .
  • the nucleotide sequence of sequence 2 from position 232 to position 234 of the 5' end is TGT or TGC (representing cysteine).
  • the trichosanthin mutant is a tyrosine at position 55 from the N-terminus of the trichosanthin protein, and a protein (named TCS Y55G/D78S ) which is mutated from the N-terminal 78th aspartic acid to serine ( That is, when the protein having the amino acid sequence of SEQ ID No. 7), the coding gene (named tcs Y55G/D7SS ) has the nucleotide sequence of SEQ ID NO:3 in the Sequence Listing.
  • the codon of the 55th glycine from the N-terminus may be other degenerate codons such as GGA, GGT, GGG, in addition to the GGC from the 5' end to the 165th to the 165th position in the sequence 3;
  • the codon of the 78th serine at the end may be other degenerate codons such as TCA, TCT, TCG, AGT, AGC in addition to the TCC from the 5' end to the 232th to the 234th position in the sequence 3.
  • the trichosanthin mutant is a tyrosine at position 55 from the N-terminus of the trichosanthin, alanine, valine, leucine or isoleucine, and the 78th aspartic acid from the N-terminus
  • the coding gene has one of the following nucleotide sequences: ⁇ : 1 ) from 5 ' in sequence 3
  • the 163th to 165th positions are selected from one of the following codons: GCA, GCT, GCC, - GCG ' (for alanine); GTA, GTT, GTC, GTG (for proline); CTA, CTT, CTC, CTG, TTA, TTG (for leucine); ATT, ATC, ATA (for different light Acid)
  • the 232th to 234th positions from the 5' end in sequence 3 are selected from one of the following codons: ACA, ACT, ACC, ACG (representing threonine); AAT, AAC (representing asparagine); CAA, CAG (for glutamine); GCA, GCT, GCC, GCG (for alanine); TGT, TGC (for cysteine);
  • the 163th to 165th positions in the sequence 3 from the 5' end are selected from one of the following codons: GGA, GGT, GGG or GCA, GCT, GCC, GCG (representing alanine); GTA, GTT, GTC, GTG (for valine); CTA, CTT, CTC, CTG, TTA, TTG (for leucine); ATT, ATC, ATA (for isoleucine); and from the 5' end of sequence 3 Bit-234 is TCA, TCT, TCG, AGT, AGC or ACA, ACT, ACC, ACG (representing threonine); AAT, AAC (for asparagine); CAA, CAG (for glutamine); GCA , GCT, GCC, GCG (representing alanine); TGT, TGC (representing cysteine).
  • codons GGA, GGT, GGG or GCA, GCT, GCC, GCG (representing alanine); GTA, GTT, G
  • the present invention utilizes TCS target cell human chorionic epithelial cancer cells (JAR) to identify amino acid sites at positions 55 and 78 for TCS recognition and entry into cells, and the site is modified by genetic engineering site-directed mutagenesis.
  • JAR human chorionic epithelial cancer cells
  • a mutant trichosanthin protein which has lost cell-inducing function, decreased toxic side effects, and other pharmacological activities such as anti-tumor, wherein TCS Y55G , TCS D78 ⁇ CI TCS Y55G/ D 7 8S is preferred.
  • TCS Y55( ⁇ , TCS D78S and TCSY55CJ/D7SS retain TCS ribosome inactivating activity, protein translation inhibitory activity, etc. in the non-cellular system, and retain the induction of intracellular caspase-3 Increased activity leads to biological functions such as apoptosis, and eliminates the cell recognition and entry function of TCS itself, especially the immunogenicity and side effects caused by TCS, and has excellent traits of immunotoxin protein.
  • the change of locus does not affect the pharmacological function of TCS, only eliminates the ability of TCS to enter the cell itself, thus not directly killing the tumor cells, and also eliminates the non-selective killing effect on normal tissue cells, greatly reducing TCS. Its immunogenicity and cytotoxicity have excellent properties for guiding drug warheads.
  • the TCS mutant proteins of the present invention have the advantages of simple preparation method, high yield, simple purification, and soluble protein expression, such as TCS Y55G/D78S .
  • the mutants retain the original ribosome inactivating activity, apoptotic activity, etc., retaining the antiviral and anti-tumor functions, and greatly reducing the systemic side effects caused by TCS self-introduction.
  • the trichosanthin mutant 3 produced by the invention loses the function of self-introduction, has weak toxicity to normal cells, and has reduced ability to elicit an immune response, etc., and is an excellent effector, that is, a "warhead", which is systemic to a patient. The toxic and side effects are small, the medication is safer and more effective, and can be used repeatedly for a long time.
  • the TCS mutant of the present invention will play an important role in the clinical application of treating malignant tumors and AIDS diseases.
  • Figure 1 shows the ribosome inactivation activity curves of the trichosanthin mutants tes Y55G , tes D78S and tc SY55G/D78s .
  • Figure 2 is a histogram of the inhibition of JAR cell activity by the trichosanthin mutants tes Y55G , tcs D78 s and tc SY55G/D78S .
  • Figure 3 is a histogram of the apoptosis activity of JAR cells induced by trichosanthin mutants tcs Y55G , tes D78S and t CSY55G/D78S .
  • Figure 4a is a photo of PBS-treated mouse liver
  • Figure 4b is a photo of the mouse liver treated with nTCS
  • Figure 4c shows photo of mouse liver treated with TCS Y55G
  • FIG. 4d shows photo of mouse liver treated with TCS D78S
  • Figure 4e is a photo of mouse liver treated with TCS Y55G/D78S
  • Figure 5 is a fluorescence analysis of the ability of trichosanthin mutant to enter JAR cells.
  • Figure 6 shows the three-dimensional structure of trichosanthin and the recessed domains in which Y55 and D78 are located. detailed description
  • the 55 and 78 positions of the mutated sites were predicted by software analysis.
  • TCS target cells-human chorionic epithelial cancer cells JAR, ATCC HTB-144
  • amino acids 55 and 78 were identified as TCS recognition and entry-related amino acid sites.
  • TCS mature peptides were determined by site-directed mutagenesis.
  • the tyrosine at position 55 is mutated to glycine, alanine, valine, leucine or isoleucine, and the aspartic acid at position 78 is mutated to serine, threonine, asparagine, glutamine.
  • the amide, alanine or cysteine, and the two sites are simultaneously mutated to obtain mutant genes such as tcs Y55G , tes D78S , te SY55G/D78S .
  • the PCR template for site-directed mutagenesis is wild-type tcs (sequence 4 in the sequence listing); the reaction system and cycle procedure used in each PCR reaction system are as follows:
  • Terminal extension 72 °C 600 seconds
  • the mutant gene was cloned into the high-efficiency prokaryotic expression vector pT7-7 (purchased from Shanghai Shenggong Bioengineering Technology Service Co., Ltd.) and the H «dIII restriction site by conventional molecular cloning method, and passed through CaCl 2 .
  • the E. coli BL21 (DE3) strain was transformed. The single colonies were cultured in LB medium for 12 hours at 37 ° C, and then transferred to fresh medium for amplification at 1:100. When the OD value of the bacterial solution was 0.6-0.8 at 600 nm, IPTG was added to a final concentration of 0.5 mM.
  • Protein expression continued to culture for 6-8 hours, the cells were collected, and the supernatant was centrifuged, and the supernatant was centrifuged, purified by CM-Sepharose Fast Flow column chromatography, and the main peaks were collected to obtain the trichosanthin mutant. After being expressed and purified, the trichosanthin mutant was detected by SDS-PAGE and western blot, and the protein purity was 99%. The protein yield is high and can reach 13-14 mg per liter of culture.
  • the CAT3 ⁇ 4 ⁇ cleavage site sequence CATATG was introduced at the primer design of the PCR; the 3' end of the mutant gene was inserted into the ⁇ 7-7 vector.
  • the H dlll site introduces the H dlll restriction site sequence AAGCTT during PCR primer design, and introduces the stop codon TAA.
  • Primer design is as follows - Primer 1 : 5, -GGCATCATATGGATGTTAGCTTCCGGTTA-3';
  • Primer 2 5,-GGGAAGCTTATGCCATATTGTTTCGATT-3,;
  • Primer 3 5'-CATCGGCGCCATTTGTGAG-3' (the italic base represents glycine); ⁇ (The other one primer of the 55th mutation is to replace the italic base of the above primer 3 with CCT:, CCA, CCC (degenerate base representing glycine); CGT, CGA, CGG, CGC (representing alanine) CAT.
  • CAA, CAG, CAC for proline
  • GAT, GAA, GAG, GAC, AAT, AAC for leucine
  • TAA, TAG, TAT for isoleucine
  • Primer 4 5'-CTCACAAATGGCGCCGATG -3' (the italic base represents glycine);
  • Primer 5 5 ' -AGGATGTGG i GCCAGCGCG-3 ' (the italic base represents serine);
  • the other one end primer of the 78th mutation is to replace the italic part of the above primer 5 with AGT, AGA, AGC, TCA, TCG (degenerate base representing serine); TGT, TGA, TGG, TGC (representing Su TTA, TTG (for asparagine); GTT, GTC (for glutamine); CGT, CGA, CGG, CGC (for alanine); ACA, ACG (for cysteine)
  • Primer 6 5 ' -CGCGCTGGCrCCACATCCT-3 ' (the italic base represents serine);
  • Preparation of tos Y55 ( ⁇ : first-stage PCR: template sequence is sequence 4 in the sequence listing , primer 1 is primer 1 and primer 3, product tes55-a fragment is obtained according to the above PCR system and cycle program; second stage PCR: The template sequence is sequence 4 in the sequence listing, the primers are primer 2 and primer 4, and the product tcs55-b fragment is obtained according to the above PCR system and cycle program; the third stage PCR: template is tcs55-a fragment and tcs55-b fragment 1 : 1 mixed solution, the primer 1 was primer 1 and primer 2, and the product tcs Y55G was obtained according to the above PCR system and cycle procedure.
  • tcs D78S First-stage PCR: The template sequence is sequence 4 in the sequence listing , the primers are primer 1 and primer 5, and the product tes78-a fragment is obtained according to the above PCR system and cycle program; second stage PCR: template sequence Sequence 4 in the sequence listing, primers are primer 2 and primer 6, and the product tcs78-b fragment is obtained according to the above PCR system and cycle program; the third stage PCR: template is tcs78-a fragment and tcs78-b fragment of 1:1 Mixed solution: liquid, the primer I was primer 1 and primer 2, and the product tes Y55G was obtained according to the above PCR system and cycle procedure.
  • First-stage PCR The template sequence is sequence 1 in the sequence listing, the primers are primer 1 and primer 5, and the product tes55/78-a fragment is obtained according to the above PCR system and cycle program;
  • second stage PCR The template sequence is sequence 1 in the sequence listing, the primers are primer 2 and primer 6, and the product tcs55/78-b fragment is obtained according to the above PCR system and cycle program;
  • Trichosanthin protein mutant IC 5 The values are shown in Table 1, indicating that IC 5Q values other than TCS D78C are 20 nM ⁇ IC 5Q 50 nM, IC 5 of TCS D7SA and TCS D78T . Value of 10nM ⁇ IC 50 ⁇ 20nM, other naturally derived mutant TCS (nTCS) positive control (1.31 X 10 _9 M) between the IC 50 are lnM ⁇ IC 5 o 10nM.
  • JAR human chorionic epithelial carcinoma cells
  • ATCC HTB-144 In vitro cultured human chorionic epithelial carcinoma cells
  • the body and nTCS as a positive control were cultured at 37 ° C for 48 hours, and the survival rate of JAR cells was measured by MTT assay.
  • the above-mentioned trichosanthin mutant and nTCS were transferred into JAR cells by lipofectamine transfection reagent lipofectAMINE® (for details, refer to the instructions of Invitrogen lipofectAMINE® transfection reagent), and the survival rate of JAR cells was measured by MTT assay 48 hours later.
  • the results of the assay are shown in Table 1. It indicates that the mutant protein is directly added, and the relative cell survival rate is 90%, which can not inhibit the growth of JAR cells; after being transfected into the cell by transfection reagent, respectively, 'except TCS Y55G , TCS Y55A , TCS Y55 L TCS D78S and TCS D78V have a cell viability of 40% ⁇ cell relative survival rate of 50%, and other mutants have a cell survival rate of 50% ⁇ cell relative survival rate of 60%, which can inhibit JAR cell growth.
  • ⁇ inhibits JAR cell proliferation: +++: cell relative survival ⁇ 40%; ++: 40% ⁇ cell relative survival ⁇ 50%; +: 50% ⁇ cell relative survival ⁇ 60%; Survival rate ⁇ 90%.
  • TCS retains ribosome inactivation after a single site or double site mutation.
  • the activity does not exhibit inhibition of tumor cells, but after transfection into the interior of tumor cells by liposome, the inhibitory activity against tumor cells and the apoptosis-inducing activity characterized by caspase-3 can be restored.
  • TCS Y55G , TCS D78S , TCS Y55G/D78S Determine the protein synthesis inhibitory activity of Trichosanthin-preferred mutants, the ability to inhibit JAR cells before and after lipofection, and the induction of JAR before and after transfection
  • the ability of the cell caspase-3 enzyme activity is as described above.
  • Mutant protein synthesis inhibiting activity shown in Figure 1 IC 50 values TCS Y55G, TCS D78S and TCS Y55G / D78S were 4.67X 10- 9 M, 3.88 X 10 ⁇ 9 M and 6.62X 10- 9 M, and naturally derived TCS (nTCS) positive control (1.31 X 10- 9 M) compared has strong ability to inhibit protein translation in vitro.
  • the activity of the mutant inhibiting JAR cells is shown in Figure 2, indicating that the cell survival rate of the direct plus nTCS positive control decreased to 43.1%, while the mutants TCS Y55C ⁇ , TCS D78S and TCS Y55G/D78S did not inhibit JAR cell growth, cell survival.
  • the mutant proteins TCS Y55G , TCS D78S, and TCS Y55G/D78S were able to inhibit JAR cell growth after transfection into the cells, respectively, and the cell survival rate decreased to 43.5. %, 41.9%, 53.4%.
  • mice purchased from the Experimental Animal Center of Chinese Academy of Medical Sciences
  • trichosanthin mutants Intraperitoneal injection of nTCS or PBS plus aluminum vanadium adjuvant was given every 2 weeks for 10 ⁇ ⁇ protein/mouse.
  • the mice were sacrificed on the 35th day after the initial administration, and the whole blood was taken.
  • the serum IgG and IgE zR levels were determined by ELISA.
  • the mice were dissected and the damage of the internal organs by TCS was observed.
  • TCS Y55G , TCS D78S and TCS Y55 3 D78S three mutants decreased by nearly 50% compared with the positive control nTCS group; TCS Y55A , TCS D78T , TCS D78N , TCS D78C four mutants IgG and IgE levels than positive control group nTCS group decreased by nearly 40%; IgG and IgE levels TCS Y55V, TCS Y55L, TCS Y55I , TCS D78Q, TCS D7SA other five mutants group than the positive control group decreased nTCS Nearly 30%.

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Description

天花粉蛋白突变体及其编码基因
技术领域
本发明涉及基因工程领域， 更具体地， 本发明涉及一种天花粉蛋白突变体及其编 码基因。 另外， 本发明还涉及该天花粉蛋白突变体及其编码基因在制备治疗恶性肿瘤 药物和 AIDS药物中的应用。 背景技术
天花粉蛋白 （Trichosanthin, TCS )是中药天花粉的有效成分， 提取自多年生宿根 草质藤本植物栝楼 Trichosanthes ki lowii Maxim)的块根， 具有引产、调节免疫、 抗 肿瘤、 抗病毒等多种生物学活性。临床上很早就发现 TCS用于治疗滋养层细胞的异常 增殖， 如葡萄胎、 恶性葡萄胎和绒毛膜上皮癌等， 都具有显著疗效。 特别是 1989年 发现 TCS具有抗 HIV活性， 引起了人们广泛的关注。
天花粉蛋白 （ GeneBank Accession number AY669811 ) 由 247个氨基酸残基组成， 分子量 27kD, 等电点 9.4， 是一个简单蛋白， 没有糖基或其它基团修饰。 天花粉蛋白 属于 I型核糖体灭活蛋白（ ribosome-inactivating proteins, RIPs), 能够专一水解真核细 胞核糖体 28S rRNA 4324位的腺苷酸与核糖环间的 N— C糖苷键， 阻止蛋白质翻译。 在体外条件下能够切割超螺旋 DNA、 通过 caspase途径诱导癌细胞凋亡等。 其中， 核 糖体灭活活性和诱导癌细胞凋亡的活性是天花粉蛋白抑制肿瘤细胞的主要原因。
天花粉蛋白需要进入细胞才能发挥对细胞的杀伤作用， 但是 I型核糖体灭活蛋白 进入细胞的途径尚不十分清楚。近来有文献指出， 低密度脂蛋白受体家族在介导 TCS 入胞中起重要作用， 但 TCS分子中与受体蛋白的相互作用区域的研究仍为空白。
由于天花粉蛋白具有重要的药用价值， 因此临床应用前景广阔。但由于天花粉蛋 白是一种植物源蛋白， 对人体的免疫反应和毒副作用较强， 在临床应用时会产生不良 反应， 包括发热、 风疹、 水肿、 肌肉疼痛等， 严重的还会影响中枢神经系统。 这种反 应限制了天花粉蛋白在临床上的应用。
天花粉蛋白的这种毒副作用， 主要来自两方面： 一是天花粉蛋白引起的全身免疫 反应，主要与 TCS分子表面的抗原决定簇有关；二是天花粉蛋白进入组织细胞发挥细 胞毒性作用而导致的对机体组织器官的损伤作用。为了降低 TCS在临床应用中的毒副 反应，可从以下两个有效途径对其进行分子改造：一是去除 TCS分子表面的抗原决定 簇； 二是限定 TCS分子专一性入胞的途径， 即从阻止 TCS分子自行进入细胞入手， 对 TCS分子中与入胞相关的关键位点进行改变。 由于天花粉蛋白含有多个抗原决定 簇， 在分子表面分布较广， 因此依靠去除全部的抗原决定鏡来消除毒副反应的难度较 大； 而从 TCS分子进入细胞的相关位点或区域入手， 通过消除 TCS分子的自行入胞 功能， 使之听从于靶细胞特异性的导向分子而专一性地进入肿瘤细胞， 不仅可以减小
TCS对正常细胞或机体其他组织器官的细胞毒性，而且能够影响抗原呈递细胞对 TCS 分子的摄取， 从而降低了 TCS引发的免疫反应， 具有双重功效。
目前国内外对 TCS 的研究大多集中在功能活性相关的结构特点及其改造， 而对 TCS的免疫原性及毒副作用相关的研究较少，特别是对 TCS分子的细胞识别与入胞作 用等功能相关的研究仍处于空白。
2002 年， Wang JH 等将天花粉蛋白 Lysl20-Ilel21-Argl22-Glul23 突变成为 Serl20-Alal21-Glyl22-Glyl23, 以及得到一个双突变体 TCSE160A/E189A, 上述两个 突变体的核糖体灭活（RI)活性大大降低， 并且丧失了抗 HIV的活性。 将 122位的 Arg突变为 Gly， 保留了抗 HIV的活性， 但 RI活性降低了 160倍。 2003年， Zhang F 等将 TCS的 C末端 7个氨基酸残基删除，使 TCS的体内细胞毒性和体外 RI活性同时 降低， 但 RI活性降低的程度更大。
目前， 在恶性肿瘤等疾病的临床治疗中， 导向药物显示出广泛的应用潜力。 导向 药物治疗是以针对不同肿瘤细胞或病毒感染细胞的特异性单抗或单抗片段（如 ScFv) 等作为导向剂， 将具有杀伤肿瘤细胞或抗病毒作用的免疫毒素等蛋白作为效应剂（弹 头）， 用化学偶联或基因融合的方法将导向剂与效应剂组成导向药物， 特异性地杀伤 或抑制导向剂所识别的肿瘤细胞或感染细胞中的病毒。 发明内容
本发明的一个目的是提供一种天花粉蛋白突变体及其编码基因。
本发明的另一个目的是所述天花粉蛋白突变体及其编码基因在制备治疗恶性肿 瘤、 AIDS等疾病的药物中的应用。 在一个实施方案中， 所述恶性肿瘤是绒毛膜上皮 癌。
本发明所提供的天花粉蛋白突变体，是天花粉蛋白（即具有 SEQ ID No. 8所示氨 基酸序列的蛋白质） 的自 N端的第 55位酪氨酸和自 N端的第 78位天冬氨酸的两个 氨基酸残基中至少一个突变， 且所述自氨基端的第 55位的酪氨酸突变为脂肪族氨基 酸， 所述自氨基端的第 78位的天冬氨酸 变为亲水性较低的氨基酸的蛋白质。
其中， 酪氨酸为芳香族氨基酸， 天冬氨酸为强亲水性氨基酸。
所述脂肪族氨基酸包括甘氨酸、 丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸等， 优选为 5 甘氨酸。 所述亲水性较低的氨基酸包括丝氨酸、 苏氨酸、 天冬酰胺、 谷氨酰胺、 丙氨 酸、 半胱氨酸等， 优选为丝氨酸。
上述天花粉蛋白突变体的编码基因也属于本发明的保护范围。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自 N端的第 55位酪氨酸突变为甘氨酸 的蛋白质' (名称为 TCSY55Q) (即具有 SEQ ID No. 5所示氨基酸序列的蛋白质）时，其 10 编码基因 （名称为 tCSY55(J) 具有序列表中序列 1的核苷酸序列； 自 N端的第 55位甘 氨酸的密码子除序列 1中的自 5 ' 端第 163位 -165位的 GGC外， 还可为其它简并密 码子， 如 GGA、 GGT、 GGG。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自 N端的第 55位酪氨酸突变为丙氨酸 的蛋白质（名称为 TCSY55A) 时， 其编码基因 （名称为 teSY55A)具有序列表中序列 1 15 的自 5 ' 端第 163位 -165位为 GCA、 GCT、 GCC或 GCG (代表丙氨酸） 的核苷酸序 列。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自 N端的第 55位酪氨酸突变为缬氨酸 的蛋白质 （名称为 TCSY55V) 时， 其编码基因 （名称为 tosY55V)具有序列表中序列 1 的自 5 ' 端第 163位 -165位为 GTA、 GTT、 GTC或 GTG (代表缬氨酸） 的核苷酸序 20 列。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自 N端的第 55位酪氨酸突变为亮氨酸 的蛋白质 （名称为 TCSY55Ij) 时， 其编码基因 （名称为 tcsY55L)具有序列表中序列 1 的自 5 ' 端第 163位 -165位为 CTA、 CTT、 CTC、 CTG、 TTA或 TTG (代表亮氨酸） 的核苷酸序列。
25 当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自 N端的第 55位酪氨酸突变为异亮氨 酸的蛋白质 （名称为 TCSY55I) 时， 其编码基因 （名称为 tcsY55I)具有序列表中序列 1 的自 5 ' 端第 163位 -165位为 ATT、 ATC或 ATA (代表异亮氨酸） 的核苷酸序列。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自 N端的第 78位天冬氨酸突变为丝氨 酸的蛋白质（名称为 TCSD78S) (即具有 SEQ ID No. 6所示氨基酸序列的蛋白质） 时， •-: 30 其编码基因 （名称为 tcsD78S) 具有序列表中序列 2的核苷酸序列； 自 N端的第 78位 丝氨酸的密码子除序列 2中的自 5 ' 端第 232位 -234位的 TCC外，还可为其它简并密 码子， 如 TCA、 TCT、 TCG、 AGT、 AGC。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自 N端的第 78位天冬氨酸突变为苏氨 酸的蛋白质（名称为 TCSD78T)时， 其编码基因（名称为 tcsD78T)具有序列表中序列 2 的自 5 ' 端第 232位 -234位为 ACA、 ACT、 ACC或 ACG (代表苏氨酸） 的核苷酸序 列。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自 N端的第 78位天冬氨酸突变为天冬 酰胺的蛋白质 （名称为 TCSD78N) 时， .其编码基因 （名称为 tcsD78N) 具有序列表中序 列 2的自 5 ' 端第 232位 -234位为 AAT或 AAC (代表天冬酰胺） 的核苷酸序列。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自 N端的第 78位天冬氨酸突变为谷氨 酰胺的蛋白质（名称为 TCSD78Q) 时， 其编码基因 （名称为 tcsD78Q)具有序列表中序 列 2的自 5 ' 端第 232位 -234位为 CAA或 CAG (代表谷氨酰胺） 的核苷酸序列。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自 N端的第 78位天冬氨酸突变为丙氨 酸的蛋白质（名称为 TCSD78A) 时， 其编码基因 （名称为 tesD78A) 具有序列表中序列 2的自 5 ' 端第 232位 -234位为 GCA、 GCT、 GCC或 GCG (代表丙氨酸） 的核苷酸 序列。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自 N端的第 78位天冬氨酸突变为半胱 氨酸的蛋白质 （名称为 TCSD78C) 时， 其编码基因 （名称为 tosD78C)具有序列表中序 列 2的自 5 ' 端第 232位 -234位为 TGT或 TGC (代表半胱氨酸） 的核苷酸序列。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自 N端的第 55位的酪氨酸突变为甘氨 酸， 和自 N端的第 78位天冬氨酸突变为丝氨酸的蛋白质（名称为 TCSY55G/D78S) (即 具有 SEQ ID No. 7所示氨基酸序列的蛋白质） 时， 其编码基因 （名称为 tcsY55G/D7SS) 具有序列表中序列 3的核苷酸序列。 自 N端的第 55位甘氨酸的密码子除序列 3中的 自 5 ' 端第 163位 -165位的 GGC夕卜，还可为其它简并密码子，如 GGA、 GGT、 GGG; 而且，自 N端的第 78位丝氨酸的密码子除序列 3中的自 5 ' 端第 232位 -234位的 TCC 外， 还可为其它简并密码子， 如 TCA、 TCT、 TCG、 AGT、 AGC。
当所述天花粉蛋白突变体是天花粉蛋白的自 N端的第 55位酪氨酸突变为丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸或异亮氨酸， 并且自 N端的第 78位天冬氨酸突变为苏氨酸、 天冬酰 胺、谷氨酰胺、丙氨酸或半胱氨酸的蛋白质时，其编码基因具有下述核苷酸序列之一： Ϊ ： 1 )序列 3中的自 5 ' 端第 163位 -165位选自如下密码子之一： GCA、 GCT、 GCC、 - GCG ' (代表丙氨酸）； GTA、 GTT、 GTC、 GTG (代表缬氨酸）； CTA、 CTT、 CTC、 CTG、 TTA、 TTG (代表亮氨酸）； ATT、 ATC、 ATA (代表异亮氨酸）；
2)序列 3中的自 5 ' 端第 232位 -234位选自如下密码子之一： ACA、 ACT, ACC、 ACG (代表苏氨酸）； AAT、 AAC (代表天冬酰胺）； CAA、 CAG (代表谷氨酰胺）； GCA、 GCT、 GCC、 GCG (代表丙氨酸）； TGT、 TGC (代表半胱氨酸）；
3)序列 3中的自 5 ' 端第 163位 -165位选自如下密码子之一： GGA、 GGT、 GGG 或 GCA、 GCT、 GCC、 GCG (代表丙氨酸）； GTA、 GTT、 GTC、 GTG (代表缬氨酸）； CTA、 CTT、 CTC、 CTG、 TTA、 TTG (代表亮氨酸）； ATT、 ATC、 ATA (代表异亮 氨酸）； 且序列 3中的自 5 ' 端第 232位 -234位为 TCA、 TCT、 TCG、 AGT、 AGC或 ACA、 ACT, ACC、 ACG (代表苏氨酸）； AAT、 AAC (代表天冬酰胺）； CAA、 CAG (代表谷氨酰胺）； GCA、 GCT、 GCC、 GCG (代表丙氨酸）； TGT、 TGC (代表半胱 氨酸）。
本发明利用 TCS的靶细胞 人绒毛膜上皮癌细胞（JAR)，确定了 55和 78位氨基 酸为 TCS识别与入胞相关的氨基酸位点， 利用基因工程定点突变法对该位点进行改 造， 得到了丧失入胞功能、 毒副作用下降， 而抗肿瘤等其他药物学活性保留的突变体 天花粉蛋白， 其中 TCSY55G, TCSD78^CI TCSY55G/D78S为优选。
实验证明 TCSY55(}， TCSD78S和 TCSY55CJ/D7SS等几种天花粉蛋白突变体在非细胞体 系中仍保留有 TCS 的核糖体失活活性、 蛋白质翻译抑制活性等， 保留了诱导细胞内 caspase—3活性升高从而导致细胞凋亡等生物学功能，而消除了 TCS自身的细胞识别 与入胞功能，特别是 TCS引起的免疫原性及毒副作用显著下降，具有优良的免疫毒素 蛋白的性状。 该位点的改变不影响 TCS的药物学功能， 只消除了 TCS自行进入细胞 的能力， 从而不能直接杀伤肿瘤细胞， 同时也消除了对正常组织细胞的非选择性杀伤 作用， 极大的降低了 TCS的免疫原性和细胞毒性， 具备了导向药物弹头的优良特性。
本发明的 TCS突变体蛋白 ^^^^、^^：^^和 TCSY55G/D78S等具有制备方法简单、 产量高、 纯化简便， 表达产物为可溶性蛋白等特点。 突变体均保留原有核糖体失活活 性、细胞凋亡活性等， 保留了抗病毒和抗肿瘤的功能，而极大地降低了 TCS自行入胞 引起的全身性毒副作用。 本发明所产生的天花粉蛋白突变体 3丧失自行入胞的功能， 对正常细胞的毒性减弱， 弓 I起免疫反应的能力降低等， 是极好的效应物， 即 "弹头"， 对患者全身性毒副作用小， 用药更加安全有效， 可以长期反复使用。 本发明的 TCS 突变体将在治疗恶性肿瘤、 AIDS 疾病的临床应用中发挥重要作用。 附图说明
' 图 1为天花粉蛋白突变体 tesY55G、 tesD78S和 tcSY55G/D78s的核糖体灭活活性曲线 图 2为天花粉蛋白突变体 tesY55G、 tcsD78s和 tcSY55G/D78S抑制 JAR细胞活性的柱状 图
图 3为天花粉蛋白突变体 tcsY55G、 tesD78S和 tCSY55G/D78S诱导 JAR细胞凋亡活性的 柱状图
图 4a为 PBS处理的小鼠肝脏照片
图 4b为 nTCS处理的小鼠肝脏照片
图 4c为 TCSY55G处理的小鼠肝脏照片
图 4d为 TCSD78S处理的小鼠肝脏照片
图 4e为 TCSY55G/D78S处理的小鼠肝脏照片
图 5为天花粉蛋白突变体进入 JAR细胞内部能力的荧光分析照片
图 6为天花粉蛋白的三维结构以及 Y55和 D78所在的凹陷结构域。 具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的详细描述， 但并非对本发明进行限定。
实施例 1.天花粉蛋白突变体的表达与纯化
根据天花粉蛋白成熟肽基因、氨基酸序列及其肽链走向、 以及三维结构的模拟分 析，利用软件分析预测了可突变位点 55位和 78位。利用 TCS的靶细胞一一人絨毛膜 上皮癌细胞（JAR, ATCC HTB-144), 确定了 55和 78位氨基酸为 TCS识别与入胞相 关的氨基酸位点。
根据受体-配体和抗原-抗体相互作用的机理， 基于降低氨基酸免疫原性、 亲水性 和亲溶液性、 以及简化氨基酸结构以消除相互作用基团的原则， 利用定点突变技术将 TCS成熟肽基因 55位的酪氨酸突变成甘氨酸、 丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸或异亮氨酸， 将 78位天冬氨酸突变为丝氨酸、 苏氨酸、 天冬酰胺、 谷氨酰胺、 丙氨酸或半胱氨酸， 以及将两个位点同时突变， 得到 tcsY55G、 tesD78S、 teSY55G/D78S等突变体基因。其中， 定 点突变的 PCR模板为野生型 tcs (序列表中的序列 4);各 PCR反应体系中所采用的反 应体系和循环程序如下：
' ·¾-· . 反应体系： 去离子水 39 μΐ
dNTP 2 μΐ
正向引物 Ι μΐ
反向引物 Ι μΐ
模板 Ι μΐ
lOXTaq酶反应缓冲液 5 μΐ
Taq酶 1 μΐ
总体积 50 μΐ 循环程序： 预变性 94 °C 60秒
变性 94 °C 50秒
退火 58 °C 70秒
延伸 72 °C 60秒
循环次数 35次
终末延伸 72 °C 600秒
再利用常规分子克隆方法， 将上述突变体基因分别克隆到高效原核表达载体 pT7-7 (购自上海生工生物工程技术服务有限公司） 的 和 H«dIII酶切位点之间， 通过 CaCl2法转化大肠杆菌 BL21 (DE3 )菌株。 取单菌落在 LB培养基内 37°C培养 12小时后， 1 : 100转接至新鲜培养基放大培养， 当菌液在 600nm下 OD值为 0.6-0.8 时， 加 IPTG至终浓度 0.5mM诱导蛋白表达， 继续培养 6-8小时， 收集菌体， 经超声 波破碎后离心取上清液， 经 CM-Sepharose Fast Flow柱层析分离纯化， 分别收集主峰 得到天花粉蛋白突变体。 天花粉蛋白突变体分别表达纯化后， 经 SDS-PAGE 以及 western blot检测正确， 蛋白纯度可达 99%。 蛋白产率高， 每升培养物可达 13-14mg。
其中， 为将突变体基因的 5'端插入 pT7-7载体的 位点， 在 PCR的引物设计 时引入 Λ¾Ι酶切位点序列 CATATG;为将突变体基因的 3'端插入 ρΤ7-7载体的 H dlll 位点， 在 PCR的引物设计时引入 H dlll酶切位点序列 AAGCTT, 同时引入终止密码 子 TAA。 引物设计具体如下- 引物 1 : 5，-GGCATCATATGGATGTTAGCTTCCGGTTA-3' ;
引物 2: 5，-GGGAAGCTTATGCCATATTGTTTCGATT-3，；
引物 3: 5'-CATCGGCGCCATTTGTGAG-3' (斜体碱基代表甘氨酸）； ·· · (其他的第 55位突变的一端引物分别为将上述引物 3的斜体碱基替换成为 CCT：、 CCA、 CCC (代表甘氨酸的简并碱基）； CGT、 CGA、 CGG、 CGC (代表丙氨酸）； CAT. CAA、 CAG、 CAC (代表缬氨酸）； GAT、 GAA、 GAG、 GAC、 AAT、 AAC (代 表亮氨酸）； TAA、 TAG, TAT (代表异亮氨酸））
引物 4: 5'-CTCACAAATGGCGCCGATG -3' (斜体碱基代表甘氨酸）；
(其他的第 55位突变的另一端引物分别为将上述引物 4 的斜体部分替换成为 GGA、 GGT、 GGG (代表甘氨酸的简并碱基）； GCA、 GCT、 GCC、 GCG (代表丙氨 酸）； GTA、 GTT、 GTC、 GTG (代表缬氨酸）； CTA、 CTT、 CTC、 CTG、 TTA、 TTG (代表亮氨酸）； ATT、 ATC、 ATA (代表异亮氨酸））
引物 5: 5 ' -AGGATGTGG i GCCAGCGCG-3 ' (斜体碱基代表丝氨酸）；
(其他的第 78位突变的一端引物分别为将上述引物 5的斜体部分替换成为 AGT、 AGA、 AGC、 TCA、 TCG (代表丝氨酸的简并碱基）； TGT、 TGA、 TGG、 TGC (代 表苏氨酸）； TTA、 TTG (代表天冬酰胺）； GTT、 GTC (代表谷氨酰胺）； CGT、 CGA、 CGG、 CGC (代表丙氨酸）； ACA、 ACG (代表半胱氨酸））
引物 6: 5 ' -CGCGCTGGCrCCACATCCT-3 ' (斜体碱基代表丝氨酸）；
(其他的第 78位突变的另一端引物分别为将上述引物 6 的斜体部分替换成为 TCA、 TCT、 TCG、 AGT、 AGC (代表丝氨酸的简并碱基）； ACA、 ACT, ACC、 ACG (代表苏氨酸）； AAT、 AAC (代表天冬酰胺）； CAA、 CAG (代表谷氨酰胺）； GCA、 GCT、 GCC、 GCG (代表丙氨酸）； TGT、 TGC (代表半胱氨酸））
下面以制备 tCSY55G、 tCSD78S和 tCSY G/D^s为例：
制备 tosY55(}: 第一阶段 PCR: 模板序列为序列表中的序列 4， 弓 1物为引物 1和引 物 3，按上述 PCR体系和循环程序得到产物 tes55— a片断； 第二阶段 PCR:模板序列 为序列表中的序列 4， 引物为引物 2和引物 4， 按上述 PCR体系和循环程序得到产物 tcs55— b片断； 第三阶段 PCR: 模板为 tcs55—a片断和 tcs55—b片断的 1 : 1混合溶 液， 弓 1物为引物 1和引物 2， 按上述 PCR体系和循环程序得到产物 tcsY55G。
制备 tcsD78S : 第一阶段 PCR: 模板序列为序列表中的序列 4， 弓 I物为引物 1和引 物 5，按上述 PCR体系和循环程序得到产物 tes78—a片断； 第二阶段 PCR:模板序列 ¾序列表中的序列 4， 引物为引物 2和引物 6， 按上述 PCR体系和循环程序得到产物 tcs78—b片断； 第三阶段 PCR: 模板为 tcs78— a片断和 tcs78—b片断的 1 : 1混合溶 ：..液， 弓 I物为引物 1和引物 2， 按上述 PCR体系和循环程序得到产物 tesY55G。 制备 tcsYs^/i s: 第一阶段 PCR: 模板序列为序列表中的序列 1， 引物为引物 1 和引物 5， 按上述 PCR体系和循环程序得到产物 tes55/78— a片断； 第二阶段 PCR: 模板序列为序列表中的序列 1， 引物为引物 2和引物 6， 按上述 PCR体系和循环程序 得到产物 tcs55/78—b片断；第三阶段 PCR:模板为 tcs55/78—a片断和 tcs55/78—b片 断的 1 : 1混合溶液， 引物为引物 1和引物 2， 按上述 PCR体系和循环程序得到产物 tCSY55G/D78S c (或者采取另一方法： 第一阶段 PCR: 模板序列为序列表中的序列 2， 引 物为引物 1和引物 3， 按上述 PCR体系和循环程序得到产物 tcs78/55— a片断； 第二 阶段 PCR: 模板序列为序列表中的序列 2， 引物为引物 2和引物 4, 按上述 PCR体系 和循环程序得到产物 tcs78/55—b片断； 第三阶段 PCR: 模板为 tos78/55— a片断和 tcs78/55-b片断的 1 : 1混合溶液， 引物为引物 1和引物 2， 按上述 PCR体系和循环 程序得到产物 tcsY55G/D78s )。
其它天花粉蛋白突变体编码基因的制备方法除引物 3、 4、 5和 6为其相对应的引 物序列外， 其它同 tcsY55G、 tesD78^B tesY55G D78S的制备方法。 实施例 2.天花粉蛋白突变体的生物学活性
TCS突变体的蛋白质合成抑制活性的测定
利用 promega公司生产的兔网织红细胞体外翻译系统试剂盒，检测突变体作为核 糖体灭活蛋白抑制蛋白质合成的能力， 方法按说明书进行， [35 S]甲硫氨酸为 PerkinElmer Life Sciences公司产品。天花粉蛋白突变体的 IC5。值如表 1所示， 表明除 TCSD78C的 IC5Q值为 20nM<IC5Q 50nM， TCSD7SA和 TCSD78T的 IC5。值为 10nM<IC50 ^20nM外， 其他突变体与天然提取的 TCS (nTCS)正对照 （1.31 X 10_9M) 的 IC50 均在 lnM<IC5o 10nM之间。
TCS突变体抑制 JAR细胞的活性测定
在 96孔细胞培养板中， 以 1 X 104个细胞 /孔的接种量接入体外培养的人绒毛膜上 皮癌细胞 （JAR, ATCC HTB-144), 分别加入 25 g/ml的天花粉蛋白突变体和作为正 对照的 nTCS， 37°C培养 48小时， 用 MTT法检测 JAR细胞存活率。另将上述天花粉 蛋白突变体和 nTCS分别用脂质体转染试剂 lipofectAMINE®转入 JAR细胞内部（方法 参考 Invitrogen公司 lipofectAMINE®转染试剂的说明书）， 48小时后用 MTT法检测 JAR 细胞存活率。测定结果如表 1所示，表明直接外加突变体蛋白，细胞相对存活率 90%， 不能抑制 JAR细胞生长； 分别经转染试剂转入细胞内部以后， '除 TCSY55G、 TCSY55A、 TCSY55L TCSD78S和 TCSD78V的细胞存活率为 40%<细胞相对存活率 50%夕卜，其他突 变体的细胞存活率为 50%<细胞相对存活率 60%， 能够抑制 JAR细胞生长。
TCS突变体蛋白诱导 JAR细胞凋亡活性的测定
利用 ApoAlert® Caspase-3 Colorimetric Assay Kit (Clontech公司， 按说明进行。 细胞培养和蛋白浓度设置同 b)， 转染方法也同 b)， 测定时间为给药后 12小时。 测定 结果如表 1所示，表明外加突变体蛋白时不能诱导 JAR细胞的 caspase-3活性 (caspase-3 酶活力单位 1.0)， 但转染后均可诱导 caspase-3活性。
表 1.天花粉蛋白突变体的生物学活性
Figure imgf000012_0001
*体外抑制蛋白翻译能力： +++: lnM<IC50≤10nM; ++： 10nM<IC50<20nM; +:
20nM< IC50≤50nM。
†抑制 JAR细胞增值能力： +++: 细胞相对存活率≤40%； ++： 40%<细胞相对存 活率≤50%； +: 50%<细胞相对存活率≤60%； -: 细胞相对存活率≥90%。
J诱导 JAR细胞 caspase-3酶活性的能力： +++: caspase-3酶活力单位≥5.0； ++： 3.5≤ caspase-3酶活力单位 <5.0； +: 2.0≤ caspase-3酶活力单位 <3.5; —： caspase-3酶 活力单位≤1.0。
本实施例表明 TCS经过上述单个位点或双位点突变之后， 仍保留有核糖体灭活 活性， 而未表现出对肿瘤细胞的抑制作用， 但经脂质体转染至肿瘤细胞内部后， 可恢 复对肿瘤细胞的抑制活性和以 caspase-3为特征的诱导凋亡活性。
进一步分析表明： 为消除酪氨酸的苯环基团影响而将 55位酪氨酸突变为其他 5 种脂肪族氨基酸， 为消除 78位天冬氨酸的强亲水性而将 78位突变为疏水性标度在正 负 1.0之间的 6种氨基酸（Asp:-2.5, Ser:-0.3, Thr:0.4, Asn:-0.2, Gln:-0.2, Gly:0, Cys:1.0, 疏水性标度数据来自 Nozaki-Tanford和 Levitt), 其中 55位突变成甘氨酸、 78位突变 成丝氨酸后对蛋白体外翻译抑制活性和转染后抑制肿瘤细胞能力影响最小， 因此 Y55G和 D78S以及双突变体 Y55G/D78S为天花粉蛋白优选突变体， 具有良好的研究 与应用前景。 实施例 3.天花粉蛋白 TCSY55G、 TCSD78S、 TCSY55G/D78S的性质 测定天花粉蛋白优选突变体的蛋白质合成抑制活性、 经脂质体转染前后对 JAR 细胞的抑制能力、 以及转染前后诱导 JAR细胞 caspase-3酶活性的能力， 方法如上所 述。 突变体对蛋白质合成抑制活性如图 1所示， TCSY55G、 TCSD78S和 TCSY55G/D78S的 IC50值分别为 4.67X 10—9M、 3.88 X 10~9M和 6.62X 10—9M，与天然提取的 TCS (nTCS) 正对照 （1.31 X 10— 9M)相比， 均具有很强的抑制蛋白质体外翻译的能力。 突变体抑 制 JAR细胞的活性如图 2所示，表明直接外加 nTCS正对照的细胞存活率下降到 43.1 %, 而突变体 TCSY55C}、 TCSD78S和 TCSY55G/D78S不能抑制 JAR细胞生长， 细胞存活率 分别为 90.0%、 94.6%、 91.2%； 但是， 突变体蛋白 TCSY55G、 TCSD78S和 TCSY55G/D78S 分别经转染试剂转入细胞内部以后， 能够抑制 JAR细胞生长， 细胞存活率下降到 43.5%、 41.9%、 53.4%。 突变体诱导 JAR细胞凋亡活性如图 3所示， 表明外加突变体 蛋白 TCSY55G、 TCSD78s和 TCSY55G/D78S (未经转染）时不能诱导 JAR细胞的 caspase-3 活性，但转染后均可以诱导 caspase-3活性，且活性相对于用脂质体单独处理的对照组 显著升高。 同时， 用相差显微镜观察， 转染 TCSY55G、 TCSD78S和 TCSY55G/D78S后， JAR 细胞出现凋亡小体等典型的细胞凋亡现象， 与正对照 nTCS—致。 实施例 4.天花粉蛋白突变体对动物体毒副作用的降低 取 15只 20g左右的 C57BL/6 J小鼠（购自中国医学科学院实验动物中心）， 随机 分成 3组， 分别用天花粉蛋白突变体、 nTCS或 PBS加铝钒佐剂进行腹腔注射， 每隔 2周注射一次， 每次 10μ§蛋白 /小鼠。 初次给药后的第 35天处死小鼠， 取'全血， 用常 规 ELISA法测定血清 IgG和 IgE zR平。 同时解剖小鼠， 观察 TCS对内脏的损伤。 结 果表明 TCSY55G、TCSD78S和 TCSY55(3 D78S三种突变体组的 IgG和 IgE水平较正对照 nTCS 组均下降了近 50% ; TCSY55A、 TCSD78T、 TCSD78N、 TCSD78C四种突变体组的 IgG和 IgE水平较正对照 nTCS组均下降了近 40% ; TCSY55V、 TCSY55L、 TCSY55I、 TCSD78Q、 TCSD7SA等五种突变体组的 IgG和 IgE水平较正对照 nTCS组均下降了近 30%。 在内 脏形态上， nTCS组小鼠肝脏萎缩、 边缘钝化、 分叶不明显， 肠粘连严重； 而在天花 粉蛋白突变体组中这种毒性损伤均不明显， 其中 TCSY55G、 TCSD78S和 TCSY55G/D78S三 种突变体处理的小鼠内脏形态接近正常的负对照 PBS组（图 4a-图 4e)。 实施例 5.天花粉蛋白突变体中氨基酸的改变消除了其进入细胞的能力 经荧光标记物 FITC偶联的 nTCS和天花粉蛋白突变体，按照实施例 2中 b)所述 方法， 分别加入培养的 JAR细胞中， 4-12 小时内在荧光显微镜下观察分析， 发现 TCSY55G TCSD78S和 TCSY55G/D78S等各种突变体蛋白在直接添加处理的情况下， 只能 在 JA 表面的局部出现微弱的绿色荧光，而 nTCS对照组可以使 JAR细胞全部呈现明 亮的绿色荧光。表明突变体失去了进入 JAR细胞内部的能力（图 5)。 图 5中， 1为未 处理的细胞； 2 为 FITC-BSA处理的细胞； 3 为 FITC-nTCS 处理的细胞； 4 为 FITC-TCSY55G处理的细胞； 5为 FITC-TCSD78S处理的细胞； 6为 FITC-TCSY55G/D78S处 理的细胞。 说明所选择的突变位点 Y55和 D78对 TCS进入靶细胞起决定性的作用， 而它们所在的 TCS蛋白表面的凹形区域（图 6)与细胞表面受体的相互作用区域重要 相关， 该区域的改变将导致 TCS无法经由受体介导进入细胞。
尽管已经通过参考特定和优选的实施方案举例说明本发明，本领域技术人员应当 理解各种改变和修饰都可以通过本发明的常规实验和实践而进行。 因此，本发明不限 于前面的说明书，而由后附权利要求书和其等同替换来限定。

Claims

权 利 要 求 书
1.一种天花粉蛋白突变体，是天花粉蛋白的自 N端的第 55位酪氨酸和自 N端的 第 78位天冬氨酸的两个氨基酸残基中至少一个突变， 且所述自氨基端的第 55位的酪 氨酸突变为脂肪族氨基酸， 所述自氨基端的第 78位的天冬氨酸突变为亲水性较低的 氨基酸的蛋白质。
2.根据权利要求 1所述的天花粉蛋白突变体，其特征在于：所述天花粉蛋白突变 体是天花粉蛋白的自 N端的第 55位酪氨酸突变为脂肪族氨基酸的蛋白质。
3.根据权利要求 1所述的天花粉蛋白突变体，其特征在于：所述天花粉蛋白突变 体是天花粉蛋白的自 N端的第 78位天冬氨酸突变为亲水性较低的氨基酸。
4.根据权利要求 1所述的天花粉蛋白突变体，其特征在于：所述天花粉蛋白突变 体是天花粉蛋白的自 N端第 55位酪氨酸突变为脂肪族氨基酸， 且自 N端的第 78位 天冬氨酸突变为亲水性较低的氨基酸的蛋白质。
5.根据权利要求 1或 2或 4所述的天花粉蛋白突变体，其特征在于：所述脂肪族 氨基酸为甘氨酸、 丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸或异亮氨酸； 优选为甘氨酸。
6.根据权利要求 1或 3或 4所述的天花粉蛋白突变体，其特征在于：所述亲水性 较低的氨基酸为丝氨酸、 苏氨酸、 天冬酰胺、 谷氨酰胺、 丙氨酸或半胱氨酸； 优选为 丝氨酸。
7. 编码权利要求 1-6中所述的天花粉蛋白突变体的基因。
8.根据权利要求 7所述的基因，其特征在于：所述天花粉蛋白突变体的编码基因 具有下列核苷酸序列之一-
1 )序列 1的核苷酸序列；
2) 序列 1中的自 5 ' 端第 163位 -165位为 GGA、 GGT或 GGG的核苷酸序列；
3 )序列 1中的自 5 ' 端第 163位 -165位为 GCA、 GCT、 GCC或 GCG的核苷酸 序列；
4)序列 1中的自 5 ' 端第 163位 -165位为 GTA、 GTT、 GTC或 GTG的核苷酸 序列；
5)序列 1中的自 5 ' 端第 163位 -165位为 CTA、 CTT、 CTC、 CTG、 TTA或 TTG 的核苷酸序列； 6)序列 1中的自 5 ' 端第 163位 -165位为 ATT、 ATC或 ATA的核苷酸序列。
9.根据权利要求 7所述的基因，其特征在于：所述天花粉蛋白突变体的编码基因 具有下列核苷酸序列之一：
1 )序列 2的核苷酸序列；
2)序列 2中的自 5 ' 端第 232位 -234位为 TCA、 TCT、 TCG、 AGT或 AGC的 核苷酸序列；
3 )序列 2中的自 5 ' 端第 232位 -234位为 ACA、 ACT, ACC或 ACG的核苷酸 序列；
4)序列 2中的自 5 ' 端第 232位 -234位为 AAT或 AAC的核苷酸序列；
5 )序列 2中的自 5 ' 端第 232位 -234位为 CAA或 CAG的核苷酸序列；
6)序列 2中的自 5 ' 端第 232位 -234位为 GCA、 GCT、 GCC或 GCG的核苷酸 序列； .
7)序列 2中的自 5 ' 端第 232位 -234位为 TGT或 TGC的核苷酸序列。
10.根据权利要求 7所述的基因， 其特征在于： 所述天花粉蛋白突变体的编码基 因具有下列核苷酸序列之一：
1 )序列 3的核苷酸序列；
2)序列 3中的自 5 ' 端第 163位 -165位为 GGA、 GGT、 GGG、 GCA、 GCT、 GCC、 GCG、 GTA、 GTT、 GTC、 GTG、 CTA、 CTT、 CTC、 CTG、 TTA、 TTG、 ATT、 ATC或 ATA的核苷酸序列；
3)序列 3中的自 5 ' 端第 232位 -234位为 TCA、 TCT、 TCG、 AGT、 AGC、 ACA、
ACT、 ACC、 ACG、 AAT、 AAC、 CAA、 CAG、 GCA、 GCT、 GCC、 GCG、 TGT或 TGC的核苷酸序列；
4)序列 3中的自 5 ' 端第 163位 -165位为 GGA、 GGT、 GGG、 GCA、 GCT、 GCC、 GCG、 GTA、 GTT、 GTC、 GTG、 CTA、 CTT、 CTC、 CTG、 TTA、 TTG、 ATT、 ATC 或 ATA; 且序列 3中的自 5 ' 端第 232位 -234位为 TCA、 TCT、 TCG、 AGT、 AGC、 ACA、 ACT、 ACC、 ACG、 AAT, AAC、 CAA、 CAG、 GCA、 GCT、 GCC、 GCG、 TGT或 TGC的核苷酸序列。
11.权利要求 1-6 中任一所述的天花粉蛋白突变体在制备治疗恶性肿瘤药物和 AIDS药物中的应用。
12.权利要求 7-10 中任一所述的天花粉蛋白突变体编码基因在制备治疗恶性肿 瘤药物和 AIDS药物中的应用。
13.根据权利要求 11或 12的应用， 其中所述恶性肿瘤是絨毛膜上皮癌。
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