CN105087626A

CN105087626A - 表达和分泌人干扰素α2b的乳杆菌菌株及其用途

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Publication number: CN105087626A
Application number: CN201510319519.0A
Authority: CN
Inventors: 刘阳; 张智清; 李皮特
Original assignee: SUZHOU OUSAI WEIKE BIOMEDICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SUZHOU OUSAI WEIKE BIOMEDICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-05-21
Filing date: 2015-06-11
Publication date: 2015-11-25

Abstract

育龄健康妇女的阴道粘膜分布着通常以产H₂O₂的乳杆菌为主的共生细菌，所述乳杆菌在预防泌尿和生殖系统感染中起防护作用。已使多种乳杆菌通过生物工程产生例如抗HIV病毒来预防泌尿和生殖系统感染。在本发明中，我们对产H₂O₂的詹氏乳杆菌——阴道微生物菌群的主要成员——进行生物工程改造，使其产生和分泌强效广谱抗病毒分子——人IFNα-2b。

Description

表达和分泌人干扰素α2b的乳杆菌菌株及其用途

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更具体地涉及人干扰素α2b的表达质粒及表达该蛋白的遗传工程菌株。

背景技术

大部分病毒，包括人乳头瘤病毒(HPV)和人单纯疱疹病毒(HSV)，通常在粘膜表面处侵入宿主。HPV感染已经成为世界范围内的流行病，仅在美国每年就有超过600万起新病例。世界上每年有数百万妇女被发现与HPV感染有关的可能是癌症前期的、异常的宫颈涂片。对于与HPV感染有关的宫颈病变，尚无可行的药物治疗手段。作为替代，人们努力实行外科或其他切除技术来破坏被感染组织并预防疾病进一步发展。由于不希望的副作用，这些做法通常只限于较晚期患者。宫颈糜烂是另一种因HPV宫颈感染引起的常见病症。临床上，宫颈糜烂与鳞状上皮细胞的部分或完全丧失有关。尽管已有新疫苗可预防HPV的初始感染，但是仍有数百万妇女被预期会感染HPV并发生癌症前期的宫颈病变，另外全世界已有数百万妇女被感染。

目前预防宫颈HPV感染的主要方法是预防性HPV疫苗。例如Merck&Co.公司以及GlaxoSmithKlineInc.公司已经开发出旨在防护HPV数种特异性亚型的感染的疫苗，分别称为和Cervarix。尽管这些疫苗具有带来显著医疗进步的可能性，然而它们主要是为了提供一种手段来预防青少年初始感染，而不是治疗已经发生感染的患者。这些疫苗主要意在预防而非治疗，从而限制了其应用范围。此外，它们的有效范围和持续时间具有明显的限制。例如，Merck成功地开发了用于9-26的女孩/妇女对HPV的防护，但只针对HPV的6型、11型、16型和18型。HPV-16引起约50％的宫颈癌，而16型、18型、31型和45型一共引起80％的癌症。因此，或其他疫苗并非对所有可能导致癌症的HPV亚型有效。

生殖器疱疹是由单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和单纯疱疹病毒2型(HSV-2)引起的，全球发病率较高。虽然大多数感染者无症状，但也有感染者出现严重的临床表现，尤其是免疫缺陷患者。生殖器溃疡在世界范围内都很普遍，其中50％-80％可分离到HSV。在许多国家，HSV-1血清型阳性率超过80％-90％，15岁-49岁的全球人口中有16％以上感染HSV-2。在美国，HSV-1的感染率为约58％，HSV-2为16％。HSV的复发，定义为HSV再活化并导致明显的临床症状。原发性生殖器HSV-1的复发率为57％，HSV-2为89％。生殖器HSV-1感染的患者平均每年有1.3次复发，而HSV-2感染每年的中位复发次数为4次。HSV-2的较高复发率再次反映了特异性。

鉴于该疾病的严重性，生殖器疱疹的预防和治疗十分关键。HSV疗法在过去十几年的中流砥柱是三个抗病毒药物：阿昔洛韦、泛昔洛韦和伐昔洛韦。这些核苷类似物，其抑制病毒DNA聚合酶，可以在症状初现(即7-10天)和复发(即1-5天)时服用，以及每日服用抑制病毒。虽然该方案可减轻病变的严重程度和降低脱落率，但并不能消除脱落和传播风险。治疗性疫苗是另一个潜在的治疗措施。事实上，许多早期的HSV疫苗试验研究基本上是不成功的。因此，需要新的治疗方法。

干扰素是一组人体天然存在的抗病毒感染的细胞因子。干扰素已被用于治疗许多病症，包括病毒或细菌感染。人干扰素(IFN)α2b是I型IFNα家族的一员，具有许多生物学作用，包括广谱抗病毒效应、抑制肿瘤细胞增殖和增强免疫功能。基于IFNα2b的疗法已用于治疗宫颈上皮内瘤变{Chakalova2004}和皮肤鳞状细胞癌{Edwards,1992}。对于这些治疗，重组IFN-α2b通过全身给药患者。这些治疗经常需要较高的药物剂量、严格的药物保存条件和高昂的生产费用。

由于健康个体的粘膜密布着以乳杆菌属(Lactobacillus)(每克液体10⁷-10⁹CFU)为主的共生细菌{Sobel,1996}，因此可利用这些细菌来递送小蛋白或肽以防止粘膜传播病毒在这些位置处的传播。

发明内容

本发明的第一方面提供了一种表达IFN-α2b蛋白的质粒，其通过将SEQIDNo:1的人成熟IFN-α2b编码区(编码C-末端24-188位氨基酸残基)克隆到pOSEL144中的NheI和MfeI位点而获得，所述质粒中的基因表达盒包括P₂₃启动子、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)S-layer基因从核糖体结合位点到信号肽酶切割位点的信号序列以及在3’末端带有TAA终止密码子的IFN-α2b蛋白编码区，所述基因表达盒的序列如SEQIDNo:2所示。

本发明的第二方面提供包含本发明第一方面的表达质粒的宿主细胞。

在一个实施方案中，所述宿主细胞的亲代细胞是乳杆菌细胞。

在一个优选实施方案中，所述宿主细胞的亲代细胞是詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)阴道分离株1153。

本发明的第三方面提供一种pUC18erm衍生质粒，其通过将SEQIDNo:2的人IFN-α2b基因表达盒克隆到pUC18erm衍生载体的XbaI位点而获得，所述衍生载体包含詹氏乳杆菌1153的pox1DNA的片段(～2.8kb)，并在中点通过定点突变引入防止形成融合蛋白的框内终止密码子和唯一的XbaI限制酶切位点。

本发明的第四方面提供一种乳杆菌，其染色体中整合有SEQIDNo:2的人IFN-α2b基因表达盒，所述乳杆菌(分类命名为詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii))已于2014年10月30日以保藏号CGMCCNo.9872保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC)，该保藏单位位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

在一个实施方案中，所述第四方面乳杆菌通过将本发明第三方面的质粒转化到亲代乳杆菌中与亲代宿主细胞的染色体DNA发生同源重组及分离而获得。

在一个优选实施方案中，所述亲代乳杆菌是詹氏乳杆菌阴道分离株1153。

本发明的第五方面提供包含本发明第四方面的乳杆菌的药物。

在一个实施方案中，所述药物是阴道栓剂、阴道活菌胶襄或预充式推进器。

本发明的第六方面提供本发明第四方面的乳杆菌用于制备预防或治疗HPV、HSV感染或相关癌症的药物的用途。

本发明的第七方面提供包含本发明第四方面的乳杆菌作为佐剂的疫苗。

本发明的第八方面提供本发明第四方面的乳杆菌作为疫苗佐剂的用途。

附图说明

图1.(A)pOSEL5651表达质粒的结构示意图。人成熟IFN-α2b编码区DNA片段，经内切酶NheI和MfeI消化后，替换掉pOSEL144{Chang,2003}中的2DCD4DNA片段，所得质粒被命名为pOSEL5651。表达盒含有乳酸乳球菌的P₂₃启动子、卷曲乳杆菌CbsAss和干拢素基因；(B)通过DNA同源重组将干扰素基因表达盒插入詹氏乳杆菌菌株1153染色体中pox1基因的过程图；(C)野生型詹氏乳杆菌1153菌株(第2泳道)及其IFNα2b重组菌株(第3泳道)的基因组DNA的pox1基因PCR扩增片段的琼脂糖凝胶电泳。第1泳道代表1kbDNA梯度分子量标准(Invitrogen)。

图2是詹氏乳杆菌1153中人IFN-α2b的表达。将包含表达质粒pOSEL5651的詹氏乳杆菌1153菌株，以及包含空质粒的詹氏乳杆菌1153菌株在Rogosa肉汤培养基(Difco、Detroit、MI)中培养。将收集的分泌到200μl无细胞Rogosa培养基中的蛋白用TCA沉淀、热变性并在还原性SDS-PAGE中分离(分别点样5、10和20μl)。将分离的蛋白电转染至聚偏氟乙稀(PVDF)膜上，然后参照人IFN-α2b标准品(InSight)通过抗IFN的mAb检测詹氏乳杆菌产生的人IFN-α2b。在独立试验中使用多种浓度的人IFN-α2b参照标准品确认乳杆菌产生的人IFN-α2b的表达水平。

图3是含染色体单拷贝IFN-α2b基因表达盒的重组詹氏乳杆菌1153菌株的生产速度的评估。将重组菌株1153-IFN(pox1::IFN-α2b)和野生型詹氏乳杆菌1153分别接种于100mlMRS，并于37℃培养。在多个时间点测定每毫升菌液中活菌数以确定生长曲线。

图4是含染色体单拷贝IFN-α2b基因表达盒的重组詹氏乳杆菌1153菌株的乳酸生产的评估。将重组菌株1153-IFN(pox1::IFN-α2b)和野生型詹氏乳杆菌1153分别接种于100mlMRS，并于37℃培养。在多个时间点测定D-乳酸生产量(克/升，g/L)。

具体实施方式

人IFN-α2b是较小并且对酸稳定的蛋白，表达IFN-α2b的詹氏乳杆菌可以生长在或定殖到人阴道粘膜上，用作干扰HPV、HSV病毒侵入和感染的可自我更新的治疗剂。将IFN-α2b局部递送至宫颈阴道粘膜对于治疗HPV相关的宫颈上皮内瘤变和皮肤鳞状细胞癌和原发性和复发性生殖器疱疹也是理想的。这种新治疗剂还打开了局部递送某些抗病毒或癌症治疗药物以治疗病毒感染或相关癌症(例如HPV感染和宫颈癌前病变)的可能性。在本发明中，我们构建了产生人IFN-α2b的人阴道分离的詹氏乳杆菌的生物工程菌株。本领域技术人员知晓如何将所述IFN-α2b表达细菌制剂成药物，从而治疗或预防HPV,HSV感染或相关癌症。例如，所述IFN-α2b表达细菌制成的阴道栓剂可为妇女提供持续的对HPV、HSV感染的防护。

I型干扰素(包括α干扰素)作为疫苗佐剂已被证明对流感病毒的全身和粘膜接种均有效。以IFN为佐剂的疫苗的单一鼻内给药对接种病毒的小鼠产生100％的防护，而疫苗自身仅部分有效(40％)。此外，最近的研究表明α干扰素是猪口足病病毒的重组蛋白疫苗的强效佐剂，并且是体外免疫反应的有效刺激物。IFN被认为是非消化道给药和粘膜给药的疫苗(包括DNA疫苗)中的强效佐剂。乳杆菌是人和动物中最常用的预防或治疗胃肠疾病的益生菌。乳杆菌已被证明帮助维持肠道菌丛的健康，并促进细菌和病毒疫苗(例如流感疫苗和脊髓灰质炎疫苗)引起的抗原特异性免疫反应。越来越多的证据表明乳杆菌菌株及其诱导的细胞活素谱之间的关系。例如，嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)NCFM是科学文献广泛记载的市售菌株。NCFM已被证明耐受胃酸并且粘附和定殖于肠道。其还具有其他有益效果，包括增强对轮状病毒的免疫反应并可在减活轮状病毒接种的且喂以乳杆菌的定菌猪中用作轮状病毒疫苗的佐剂。在本发明中，我们构建了产生人IFN-α2b的人阴道分离的詹氏乳杆菌的生物工程菌株。本领域技术人员知晓如何将所述IFN-α2b表达细菌制成疫苗佐剂，从而增强通过粘膜接种的免疫应答。

在本发明中，IFN表示干扰素；CbsA表示卷曲乳杆菌的S-layer蛋白。

以下通过具体实施例来说明本发明的内容。应理解，所述具体实施例仅为说明目的，并不意味着本发明的内容仅限于具体实施例。

实施例

菌株和培养

将詹氏乳杆菌的人阴道分离株1153在MRS肉汤培养基(Difco、Detroit、MI)中于37℃(5％CO₂)下培养。对于蛋白表达分析，使用RogosaSL肉汤培养基(Difco、Detroit、MI)。按文献所述通过电穿孔将质粒引入詹氏乳杆菌1153[Changetal,2003]。为保持质粒，将转化的大肠杆菌(E.coli)Novablue(invitrogen)在补充有红霉素(200μg/ml)的LB肉汤培养基(Difco)于37℃进行培养。

人IFN-α2b表达质粒的构建。

为在詹氏乳杆菌菌株1153中生产分泌型的IFN-α2b蛋白，以pSC/IFN-α2b(陈辉，等，2004，人干拢素α2b基因在德氏乳杆菌的表达与鉴定。中国微生态学杂志,16:128-31)为模板，使用引物INF5'(ATGCTAGCTGTGACCTGCCGCAGACCCACT(SeqIDNo:3),下划线为NheI位点)和INF3'-2(ATCAATTGTTATTCTTTAGAACGCAGAGA(SeqIDNo:4),下划线为MfeI位点)，通过PCR扩增成熟IFN-α2b编码区(缺失N末端23个氨基酸残基的信号肽)DNA片段。将所获得的PCR片段克隆到pGEM-T-Easy载体(PromegaCorporation,USA)中并通过DNA测序确认，所述片段的序列为SeqIDNo:1。将确认序列正确的IFN-α2b编码区的重组质粒DNA用限制酶NheI和MfeI消化后，亚克隆到经限制酶NheI和MfeI消化和纯化后的pOSEL144大片段[Changetal,2003，其以引用的方式全文纳入本文]得到质粒pOSEL5651(p23-cbsA-IFN-α2b)。所得质粒中的基因表达盒的DNA序列为SeqIDNo:2，包含P₂₃启动子、卷曲乳杆菌(L.crispatus)S-layer基因从核糖体结合位点到信号肽酶切割位点的信号序列(cbsAss)以及在3’末端带有TAA终止密码子的成熟IFN-α2b蛋白编码区(C-末端165个氨基酸残基)(图1A)。

詹氏乳杆菌中人IFN-α2b的生产和分泌

为使IFN-α2b在乳杆菌中作为分泌蛋白表达，选择人阴道分离株詹氏乳杆菌1153作为宿主细胞。将包含pOSEL5651(P₂₃启动子驱动)的詹氏乳杆菌1153接种于MRS肉汤培养基，然后在用100mMHEPES(pH7.4)缓冲的RogosaSL肉汤培养基中传代培养并使其在厌氧条件下生长至早期稳定期。通过离心(3,800xg,10分钟)收集培养上清液，然后用TCA(20％f.c.)沉淀上清液中的蛋白以进行蛋白质印迹测定。

詹氏乳杆菌中人IFN-α2b表达的蛋白质印迹分析

将无细胞培养基上清液中的蛋白用TCA沉淀、用乙醇洗涤、空气干燥并在加有10mMDTT的SDS上样缓冲液(50mMTris-HCl、pH6.8、0.4％SDS、6％蔗糖、0.01％溴酚蓝)中加热变性，然后使用4-12％NuPAGE系统(Invitrogen)通过SDS-PAGE分离。然后将分离的蛋白用考马斯亮蓝染色或者电转染至聚偏氟乙稀(PVDF)膜上。用单克隆IFN抗体(BD)作为探针检测转染得到的印迹。然后使用辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG和显色检测试剂(GEhealthcare)显现所述抗原-抗体反应。图2显示从包含pOSEL5651(P23启动子驱动)表达质粒的菌株中均检测到了人IFN-α2b蛋白。与标准IFN比较，詹氏乳杆菌产生的人IFN-α2b蛋白为全长分子。

使用WISH-VSV生物测定检测的乳杆菌产生的人IFN-α2b的生物活性

乳杆菌产生的IFN-α2b的生物活性通过在WISH细胞(人羊膜细胞)中对水疱性口炎病毒(VSV)引起的细胞病变效应(CPE)的防护得以确定。将WISH细胞在培养烧瓶中用胰蛋白酶处理并重悬于MEM+10％FCS至浓度为1x10⁵/ml。然后将其接种至96孔组织培养板(0.1ml/孔)，并在CO₂培养箱中于37℃培养过夜。将从培养的包含IFN-α2b表达质粒的乳杆菌中获得的无细胞上清液以1:10稀释于MEM+2％FCS，然后在无菌96孔板上进行2倍和4倍连续稀释。移出所述WISH细胞过夜培养物的培养基，替换为所述稀释样品和作为阳性对照的市售IFN-α2b(IU/ml)。将所述微孔板在CO₂培养箱中于37℃孵育过夜。第二天，移出培养基并加入VSV病毒(100TCID50/孔，稀释于MEM+2％FCS)，在CO₂培养箱中于37℃孵育直至病毒对照显示>75％的CPE。在显微镜下读出结果。将提供50％保护的稀释度作为终点。根据IFN对照的滴度计算出样品的生物活性。

如表1所示，詹氏乳杆菌产生的人IFN-α2b在WISH细胞中对水疱性口炎病毒(VSV)引起的细胞病变效应(CPE)有防护作用。参照包含空载体的乳杆菌通过4个独立测定确定了所述抗病毒活性。将对照菌株和表达重组人IFN-α2b的菌株均在RogosaSL培养基中发酵至对数期。将无细胞培养基在20mMTris、pH5.7中透析，并在离子交换SP柱(Amersham)中富集。参照IFN标准品的滴度计算样品的生物活性。这些结果表明乳杆菌可表达生物活性的IFN-α2b。

表1.詹氏乳杆菌1153产生的人IFN-α2b的生物活性

产生人IFN-α2b的乳杆菌的发酵

为分析乳杆菌产生的人IFN-α2b的生物活性，使用BioFlo110微生物发酵罐(NewBrunswickScientific)在RogosaSL培养基中发酵表达IFN-α2b的詹氏乳杆菌。通过喷射氮气使发酵过程保持在厌氧条件下，并使用NH₄OH将pH保持在6.5-7.0。在发酵到达稳定期后收集细胞和用过的培养基用于进一步分析。

乳杆菌产生的人干扰素α2b的制备分离和表征

将表达IFN-α2b的詹氏乳杆菌在RogosaSL肉汤培养基(Difco)中发酵至早期稳定期。首先将无细胞的含有人IFN-α2b的上清液对20mMBis-Tris、pH7.0透析。然后使经透析的上清液通过SP柱(Amersham)，再通过QSepharoseFastFlow树脂(Amersham)。将含有人IFN-α2b的穿透液用截留分子量为3.5kDa的透析膜在4℃下对20mMTris、pH8.8再次透析。之后，先使经透析的上清液通过SPFastFlow树脂柱(Amersham)。将存在于穿透液中的人IFN-α2b结合到QSepharoseFastFlow树脂(Amersham)上并在含150mMNaCl的缓冲液中洗脱。所得部分纯化的人IFN-α2b在抗病毒测定中分析，或者在CNBr活化的sephorose4亲和柱上进一步纯化。使用已知蛋白浓度的IFN参照标准(InsightBio)，通过考马斯亮蓝染色定量洗脱的人IFN-α2b的量。

重组分离的表达人IFN-α2b的詹氏乳杆菌菌株的构建

为实现用于治疗的人IFN-α2b在乳杆菌中的稳定表达并防止抗生素抗性基因的增殖，适用临床使用的重组詹氏乳杆菌中不能携带染色体外复制的质粒，如pOSEL5651。所以，我们通过同源重组{Liu,2006}将人IFN-α2b基因表达盒以单拷贝整合到詹氏乳杆菌染色体上的pox1位点中(图1B)。所构建的用于詹氏乳杆菌整合的质粒pUC18erm(不能在乳杆菌中复制，Liuetal.,2006)衍生载体包含詹氏乳杆菌1153的pox1DNA的片段(～2.8kb)，并在中点通过定点突变引入防止形成融合蛋白的框内终止密码子和唯一的XbaI限制酶切位点。使用含有XbaI位点的下述PCR引物(p23XbaIF5:5’-GAGTCTAGAGCCCTGACAACCCTCGTTCCT-3’(SeqIDNo:5)和XbaIP59M:5’-CCGTCTAGACCCGTTGTTTAGTTTGTGACCT-3’(SeqIDNo:6)，其中下划线部分为XbaI位点)来PCR扩增pOSEL5651中的含p23-cbsA-IFN-α2b的DNA片段。所得PCR产物的DNA序列为SEQIDNo:2。将经XbaI消化的PCR产物连接到经XbaI消化的上述pUC18erm的pox1位点中，由此得到了衍生质粒(Liuetal.,2006)。故最后所得的pUC18erm衍生整合质粒含有两侧具有pox1DNA的且DNA序列为SEQIDNo:2的人IFN-α2b基因表达盒(图1B)。通过电穿孔将该整合质粒转化到詹氏乳杆菌1153中。将所转化的细菌铺板于含有3μg/ml红霉素的MRS平板上。选择抗红霉素克隆——其在所述质粒通过Campbell型整合插入染色体后出现——用于进一步筛选(图1B)。用人IFN-α2b蛋白表达的蛋白质印迹筛选所得转化体为IFN生产株。下一步再通过重组分离单交叉事件，从而去除质粒骨架(包括ermB红霉素抗性基因)但保留人IFN-α2b基因表达盒。首先将上一步所得1153转化体在无红霉素的液体MRS中培养，然后铺板于无红霉素的MRS平板上，然后将克隆再原位复制到含有红霉素的MRS平板，比较二种MRS平板，选出丢失红霉素抗性的克隆。然后用引物pox1-int-L(5’-TTGGCAATTAGCTGGTGATG-3’)(SeqIDNo:7)和pox1-int-R(5’-ACCTTTGCCCAGTCATTGTC-3’)(SeqIDNo:8)来PCR扩增这些菌株的染色体DNA，以确定人IFN-α2b基因表达盒保留在pox1位点(图1C,第3列)。另外，还对IFN-α2b表达盒进行PCR扩增并进行测序以确认其核苷酸序列不变，再通过如上所述的蛋白质印迹分析，证明重组工程菌株(CGMCCNo.9872)表达和分泌IFN-α2b蛋白。

单拷贝整合到詹氏乳杆菌染色体后的人IFN-α2b表达的稳定性

为评估整合并分离的表达盒的功能和遗传稳定性，将分离体的8个单个克隆在无抗生素的MRS培养基中传代培养过夜。8个克隆中的2个以3天的间隔传代培养两周，总共6代。从8个初始克隆和随后多代培养物中收集无细胞培养基和细胞沉淀进行分析。

为评估异源蛋白表达的稳定性，如上所述使用蛋白质印迹来分析无细胞培养基中的人IFN-α2b蛋白。为评估遗传稳定性，从用于蛋白稳定性评估的相同细胞沉淀中分离基因组DNA。使用引物pox1-int-L5’-TTGGCAATTAGCTGGTGATG-3’和pox1-int-R5’-ACCTTTGCCCAGTCATTGTC-3’以及Pfu聚合酶通过PCR得到含有部分pox1基因和完整人IFN-α2b基因表达盒的片段(图1C,第3列)。对所得PCR片段进行DNA测序以确认所述表达盒的完整性和稳定性。

表达人干扰素α2b的詹氏乳杆菌的表型评定

为确定细菌生长的速度，将单个克隆接种于100mlMRS肉汤培养基并在37℃下培养。在多个时间点测量600nm下的培养物的吸收值。如图3所示，当在MRS肉汤培养基中于37℃培养时，重组菌株(pox1::IFN-α2b)的生长速度基本等于亲代詹氏乳杆菌1153。使用标准D-乳酸脱氢酶基测定(R-Biopharm,Darmstadt,Germany)确定了重组菌株和亲代詹氏乳杆菌1153产生的D-乳酸的量无差异(图4)。这些结果表明IFN-α2b表达盒插入到pox1基因中对詹氏乳杆菌1153的生长特征没有影响。

此外，詹氏乳杆菌的IFN-α2b表达在超过2周的液体培养连续生长中保持稳定。通过PCR和测序分析，从在此期间测试的培养物中未检测出IFN-α2b表达盒发生突变或其他改变。这些结果表明，通过遗传工程得到的所述詹氏乳杆菌(CGMCCNo.9872)可在较长的时间中在酸性pH下稳定表达全长IFN-α2b。

参考文献

陈辉，等，(2004)人干拢素α2b基因在德氏乳杆菌的表达与鉴定。中国微生态学杂志,16:128-31

Chang,TL.,etal.(2003)InhibitionofHIVinfectivitybyanaturalhumanisolateofLactobacillusjenseniiengineeredtoexpressfunctionaltwo-domainCD4.PNASUSA,100:11672–11677.

Liu,X.,etal.,(2006)EngineeredVaginalLactobacillusStrainforMucosalDeliveryoftheHumanImmunodeficiencyVirusInhibitorCyanovirin-N.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,50:3250–3259.

SobelJD,ChaimW.(1996)Vaginalmicrobiologyofwomenwithacuterecurrentvulvovaginalcandidiasis.JClinMicrobiol.34:2497-9。

Claims

1.一种表达IFN-α2b蛋白的质粒，其通过将SEQIDNo:1的人IFN-α2b编码区克隆到pOSEL144中的NheI和MfeI位点而获得，所述质粒中的表达盒包括P₂₃启动子、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)S-layer基因从核糖体结合位点到信号肽酶切割位点的信号序列以及在3’末端带有TAA终止密码子的IFN-α2b成熟蛋白编码区，所述基因表达盒的序列如SEQIDNo:2所示。

2.包含权利要求1的表达质粒的宿主细胞。

3.权利要求2的宿主细胞，所述宿主细胞的亲代细胞是乳杆菌细胞，优选是是詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)阴道分离株1153。

4.一种pUC18erm衍生质粒，其通过将SEQIDNo:2的人IFN-α2b基因表达盒克隆到pUC18erm衍生载体的XbaI位点而获得，所述衍生载体包含詹氏乳杆菌1153的pox1DNA的片段(～2.8kb)，并在中点通过定点突变引入防止形成融合蛋白的框内终止密码子和唯一的XbaI限制酶切位点。

5.一种乳杆菌，其染色体中整合有SEQIDNo:2的人IFN-α2b基因表达盒，优选是通过将权利要求4的质粒转化到亲代宿主细胞中发生同源重组及分离而获得。

6.权利要求5的乳杆菌，其亲代细胞是詹氏乳杆菌阴道分离株1153。

7.包含权利要求5或6的乳杆菌的药物，优选是阴道栓剂、阴道胶囊、阴道预充式推进器的形式。

8.权利要求5或6的乳杆菌用于制备预防或治疗人乳头瘤病毒(HPV)和人单纯疱疹病毒(HSV)感染或相关癌症的药物的用途。

9.包含权利要求5或6的乳杆菌作为佐剂的疫苗。

10.权利要求5或6的乳杆菌作为疫苗佐剂的用途。