CN102924603A - 人干扰素与靶向肽的融合蛋白及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明提供了人干扰素与靶向肽的融合蛋白及其制备，本发明的融合蛋白，其结构为：IFN-M-S，其中S代表靶向肽，M代表连接肽，IFN代表干扰素，S氨基酸序列可以是S1、S2、S3、S4中任意一种，M氨基酸序列含有0-10个氨基酸残基，优选4-6个氨基酸残基，IFN可以是I型和II型干扰素中任意一个。

Description

人干扰素与靶向肽的融合蛋白及其制备

技术领域：

本发明涉及一种人干扰素和靶向肽的融合蛋白及其工程菌的构建和融合蛋白的制备。 

背景技术：

干扰素(Interferon，IFN)是由英国科学家Isaacs和Lindeman于1957发现的。IFN是人和动物细胞受到病毒感染，或者核酸、细菌内毒素、促细胞分裂素等作用后，由受体细胞分泌的一种具有高度生物学活性的糖蛋白，是机体防御系统的重要组成部分，分子量为15,000-21,000道尔顿。 

干扰素被发现时，人们以为其抗病毒活性为其唯一特性，随着研究的不断深入，干扰素还表现出极强的抗肿瘤、免疫调节活性。因而，干扰素的研究越来越受到人们的广泛关注。根据其来源、序列、活性等方面的区别，干扰素最初可分为两族：I型和II两类。I型干扰素主要包括人体内发现的α、β、ω、κ。II型干扰素只有一种γ。 

干扰素的主要生物活性： 

抗病毒活性：对于不同的病毒，IFN通过不同的防御机制，在病毒复制的不同阶段发挥作用，如入侵和脱壳(SV40.、逆转录病毒)、转录(感冒病毒、疱疹病毒)、RNA稳定性(小核糖核酸病毒)、翻译的起始(呼肠孤病毒、腺病毒和痘病毒)以及成熟、组装与释放(逆转录病毒，疱疹病毒)。IFN的抗病毒活性主要通过三条途径完成：双链RNA依赖的蛋白激酶途径(PKR，可抑制病毒蛋白的翻译)、2’-5’系统(可分解病毒RNA)和MX蛋白(干扰病毒的复制和转录)。 

抑制细胞分裂与抗肿瘤活性：干扰素可以抑制细胞增长，控制凋亡，抑制肿瘤。对于细胞凋亡的控制主要是在几种死亡相关蛋白(Death associated protein，DAP)参与下完成的，但是和生长抑制无关。 

调节免疫活性：I型干扰素的抗病毒活性显著，而II型干扰素的调节免疫的活性更强。I型和II型干扰素都可以提高MHC I分子表达，促进CD8+T细胞反应的形成。II型干扰素还可以提高MHC II分子的表达，增强CD4+T细胞反应。干扰素还可以调节蛋白酶体成分和TAP1、TAP2的表达，促进抗原的加工与递呈。同时，IFN-γ促进TH1细胞生成，抑制TH2细胞增殖，活化巨噬细胞，促进对病原体的吞噬。此外干扰素还可以直接调节B细胞的发育与增殖、抗体分泌和重链的转换。 

在专利《内皮抑制素小分子多肽及编码该多肽的核苷酸序列和互补链》(申请号：200610010526.3)中描述了具有30个氨基酸残基的内皮抑制素小分子多肽和其氨基酸序列及生产方法，本发明的靶向肽来源于内皮抑制素小分子多肽，但是氨基酸序列不限于此多肽，本发明靶向肽的氨基酸序列如S1、S2、S3、S4所述，共同特征是含有串联RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)结构，本发明的靶向肽具有抑制人内皮细胞增殖，抑制新生血管，对肿瘤具有靶向作用。 

研究表明，很多存在细胞外基质和血液中的粘附蛋白都包含RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)三肽作为细胞识别位点。所有粘附蛋白的RGD序列都能被结构相关的整合素受体家族中的至少一个成员识别并粘附。能被RGD序列识别和结合的整合素包括α₅β₁、α_vβ₁、α_IIbβ₃、α_Vβ₃、α_vβ₅、α_vβ₆等。 

肿瘤的发生发展离不开肿瘤血管的形成，内皮细胞必须相互粘附并与ECM粘附以构建并扩充新生微血管。数种整合素表达于有腔和无腔的内皮细胞的表面，介导内皮细胞的粘附、迁移和毛细血管管腔的形成。迄今为止，已发现8种整合素表达于内皮细胞，包括α₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、α₅β₁、α₆β₁、α₆ β₄、αvβ₃、αvβ₅整合素，几乎所有的β₁亚族整合素在血管内皮细胞均有表达。体外实验表明，α₁、α₂、α₃整合素均影响血管生成。整合素αvβ₃能与多种含RGD的ECM分子结合，在血管生成过程中的作用尤为重要。 

肿瘤转移与整合素家族密切相关，整合素在肿瘤细胞上的表达对肿瘤转移影响很大。 

人们研究发现了与肿瘤细胞粘连有关的ECM受体中主要粘附识别的氨基酸序列-Arg-Gly-Asp(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸，简称RGD)，受此启发人们合成了许多RGD多肽及衍生物，从而竞争、干扰肿瘤细胞与ECM的相互作用，达到抑制肿瘤转移的目的。 

除此之外，RGD序列肽与多酸、抗癌药、PEG、PEU、EAA、CEMA等偶联物偶联后，其抗细胞粘附和抗肿瘤转移能力增强。RGD序列肽及其衍生物具有较强的抗肿瘤侵袭转移的作用。 

本发明利用本领域熟知的分子生物学技术把人干扰素和靶向肽相连，使其具有靶向肿瘤组织，抑制肿瘤新生血管的作用，抑制肿瘤细胞增殖。解决了人干扰素进入血液循环后与其他组织细胞的干扰素受体结合，没有靶向性的问题，同时也解决了临床上干扰素治疗肿瘤大剂量使用而带来的副作用大、患者不能耐受的缺陷。 

发明的内容： 

本发明提供了具有靶向功能的干扰素融合蛋白，以及融合蛋白的制备。 

本发明设计了干扰素与靶向肽的连接形式：IFN-M-S，其中S代表靶向肽，M代表连接肽，IFN代表干扰素，S氨基酸序列可以是S1、S2、S3、S4中任意一种，M氨基酸序列含有0-10个氨基酸残基，优选0-6个氨基酸残基，IFN可以是I型和II型干扰素中任意一个。 

S1、S2、S3、S4分别代表 

SEQ ID NO：1 

His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly MetArg Gly Asp Arg Gly Asp 

SEQ ID NO：2 

His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Asp Arg Gly 

SEQ ID NO：3 

His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Asp Arg 

SEQ ID NO：4 

His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Asp 

M氨基酸残基可以选自： 

GGSGG，GGGGS，GGGGG， 

本发明的融合蛋白具体见序列表SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9. 

其中，SEQ ID NO：5为优选。 

以上氨基酸的具体序列见序列表。 

本发明的序列表说明： 

SEQ ID NO：1本发明融合蛋白中S1氨基酸残基序列。 

SEQ ID NO：2本发明融合蛋白中S2氨基酸残基序列。 

SEQ ID NO：3本发明融合蛋白中S3氨基酸残基序列。 

SEQ ID NO：4本发明融合蛋白中S4氨基酸残基序列。 

SEQ ID NO：5，本发明优选的多肽序列1， 

SEQ ID NO：6本发明优选的多肽序列2， 

SEQ ID NO：7本发明优选的多肽序列3， 

SEQ ID NO：8本发明优选的多肽序列4， 

SEQ ID NO：9本发明优选的多肽序列5， 

SEQ ID NO：10本发明特别优选的多肽序列1的DNA序列。 

本发明的融合蛋白根据氨基酸序列，利用氨基酸密码子的简并性特点，依据不同表达宿主，包括大肠杆菌、酵母、CHO细胞等多种表达宿主的密码子偏嗜性，本领域人员可以编码不同的核苷酸序列，使其在不同宿主内高效表达。 

本发明的融合蛋白是利用基因重组技术制造的。 

利用本领域人员熟知分子生物学技术，根据氨基酸序列设计融合蛋白的DNA序列(本发明所设计的核苷酸序列可以化学合成，也可以采用PCR方法获得)，构建含有融合蛋白的表达载体可以是真核细胞表达载体也可以是原核细胞表达载体。含有融合蛋白的表达载体宿主细胞相应的可以是真核细胞或原核细胞，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母、细菌等，在大肠杆菌内优先选择高效表达的pET系列表达载体，在酵母里表达优选pPIC9k表达载体、在CHO细胞内表达优选pcDNA3.1表达载体。 

本发明优选PET系列载体，宿主细胞优选大肠杆菌。 

本发明同时提供了在大肠杆菌内表达融合蛋白的纯化方法，其蛋白表达方式可以是胞内可溶形式的或者包涵体形式。 

胞内可溶形式的融合蛋白制备方法为：培养工程菌，离心收集菌体，破菌，收集上清液，调节上清液PH4.0，老化30分钟，离心去沉淀，上清使用阳离子层析介质进行分离，盐梯度洗脱，收集目的蛋白，调节PH8.0，使用阴离子层析介质进行纯化，盐梯度洗脱，能够获得纯度为95％以上的样品。 

包涵体形式融合蛋白制备方法为：培养工程菌，离心收集菌体，破菌，收集包涵体，包涵体经洗涤、变性、复性后，分别使用阳离子层析介质和阴离子层析介质进行纯化，获得纯度为95％以上的样品。 

将所获得的纯度较高的融合蛋白分别进行了新生血管抑制试验和抗肿瘤实验，实验结果表明，本发明的融合蛋白具有一定的抑制血管生成，具有明显的抗肿瘤作用，肿瘤抑制率可达到80％以上。 

本发明的优点在于： 

1，具有靶向内皮细胞的功能，抑制内皮细胞的增殖和迁移。 

酶联免疫实验结果表明，本发明的融合蛋白具有比干扰素更高的内皮细胞结合能力。IS1融合蛋白具有较好的HUNEC细胞抑制活性，用IS1处理的细胞展示出了较高的由bFGF所诱导侵袭的抑制率(76％)。 

2，具有制备容易，工艺简单的特点。 

实施例1的制备过程，为本领域技术人员常用的方法，操作简单。实施例2为国内已上市蛋白类产品常用生产方法之一，工艺简单，为本领域人员所熟知。 

3，具有抑制血管生产作用。 

在鸡胚绒毛尿囊膜实验中，S1肽，人IFNα2b和IS1融合蛋白在不影响原有血管的前提下，抑制新生血管的生长。S1肽和抑IS1融合蛋白制新生血管的能力明显强于IFNα2b。从结果可以看出对照组血管生长良好，毛细血管清晰可见， 主血管粗壮，分支适中。IFNα2b组有部分毛细血管减少，但不明显。S1肽组毛细血管数量明显减少，血管变细、变模糊。在IS1融合蛋白组的血管得到较明显抑制，毛细血管大量消失，并且主血管也有部分消失。 

4，具有更好的抗肿瘤作用。 

在抑瘤实验中，IS1融合蛋白对H22和肿瘤细胞荷瘤裸鼠的治疗能使肿瘤重量明显减轻，和对照组比具有显著性差别，对瘤重的抑制率有剂量依赖性。IS1融合蛋白组抑瘤率均高于同剂量的S1肽组，且和同剂量IFNα2b组比较，均有明显差别。 

附图说明：

以多肽序列1(IFNα2b-S1融合蛋白简称IS1)为例，以附图的形式进行说明，但以下说明并不构成对本专利的限制。 

图1为人IFNα-2b和S 1分段PCR产物，其中M是DNA Marker DL2000，1和2为IFNα-2b分段PCR产物；3和4为S1分段PCR产物。 

图2为IS1融合基因全长PCR产物，其中M是DNA Marker DL2000；1和2是IS1融合基因全长PCR产物。 

图3为IS1T载体Nde I和BamH I双酶切鉴定图谱，其中M为DNA MarkerDL2000；1和2分别为IS1-T载体Nde I和BamH I双酶切鉴定。 

图4为pET-IS1表达质粒Nde I和BamH I双酶切鉴定图，其中M为DNA MarkerDL2000，1-6分别是pET-IS1表达质粒Nde I和BamH I双酶切鉴定。 

图5IS1基因示意图 

图6为表达质粒pET-IS1的载体构建图 

图7为IS1融合蛋白工程菌发酵后菌体SDS-PAGE电泳，其中1为蛋白Mark， 2-7分别为发酵后菌体电泳。 

图8为Q Sepharose Fast Flow柱纯化后IS1的融合蛋白的SDS-PAGE电泳，其中3为蛋白Mark，1为经Q Sepharose Fast Flow纯化后IS1的融合蛋白。 

图9为Phenyl Sepharose柱纯化后IS1的融合蛋白的SDS-PAGE电泳，其中1为经Phenyl Sepharose纯化后IS1的融合蛋白，2为蛋白Mark 

图10IS1融合蛋白对新生血管的作用 

图11IS1融合蛋白抑制内皮细胞增殖，其中□：IS1融合蛋白，△：S1肽，○：IFNα2b。 

图12IS1融合蛋白抑制内皮细胞迁移，其中A为对照；B为IFNα2b；C为IS1融合蛋白；D为S1肽。 

具体实施方式

以下通过实施例详细说明本发明的内容，但这些实施例并不构成对本发明的限制。下面以大肠杆菌内pET3a+表达该融合蛋白为例具体叙述该融合蛋白的构建与制备过程。 

实施例1：工程菌构建方法 

基因片段的人工合成： 

根据大肠杆菌密码子使用频率表，选择在大肠杆菌中高效表达的密码子，人为设计IFNα-2b和靶向肽S1的基因序列，委托上海生工生物工程有限公司合成。 

融合基因片段的获得： 

分段设计带有Nde I和BamH I酶切位点的人IFNα-2b的上下游引物和S1的上下游引物，引物序列如下： 

引物序列：阴影为酶切位点。 

IS 1up 1：CATATGTGTGACCTGCCGCAGACCCACTCTC 

IS1 low1： 

GGAAGTCACGGTGGCTGTGTTCTTTAGAACGCAGAGATTCCTGC 

IS1 up2： 

GGAATCTCTGCGTTCTAAAGAACACAGCCACCGTGACTTCCAGCCTGT TC 

IS1 low2：GGATCCTTAGTCACCACGGTCACCACGCATACCACC 

利用PCR方法分别获得这两段基因序列后(见图1)，再利用拼接PCR的方 法获得融合基因片段全长(见图2)。将融合基因连接到pMD18-T载体上，利用Nde I和BamH I双酶切鉴定阳性克隆(见图3)，测序。获得正确序列的阳性克隆后，将融合基因连接到pET-3a+原核表达载体上(见图4)，构建好的工程菌株可以进行诱导表达蛋白。IS1融合蛋白结构示意图见图5。 

IS1肽融合基因表达质粒的构建： 

取IS1融合基因的质粒，使用Nde I和BamH I进行双酶切，回收小片段，同时取pET-3a+原核表达载体，使用Nde I和BamH I进行双酶切回收大片段，将回收的两个片段利用T4连接酶连接，转化进大肠杆菌DH5α中，筛选阳性重组子。经双酶切鉴定和序列测序分析确定后将其命名为pET-IS₁。表达质粒pET-IS1的载体构建图见图6。 

pET-IS₁表达工程菌的构建： 

将pET-IFN-30的表达质粒分别转化进表达菌株BL21(DE3)中，挑取若干菌落，经LB过夜培养，次日提取质粒，经Nde I和BamH I酶切鉴定后，选择若干阳性克隆经LB过夜培养，次日以10％的浓度转接至新的LB培养基中，培养2-4个小时，监测OD值达到0.4-0.6时开始使用1mol/LIPTG诱导表达2到4小时，收集菌体，表达产物经SDS-PAGE分析，筛选高表达的菌株。 

实施例2：IS₁融合蛋白的制备 

取1支pET-IS₁工程菌，制备1级和2级种子，以10％接种量接入发酵罐中，进行大规模培养、诱导表达，收集菌体(菌体电泳见图7)，使用破菌液(20mMTris、1mMgSO₄、50μg/ml溶菌酶)悬浮菌体，室温搅拌60min，，然后使用超声细胞破碎仪冰浴破碎，离心后获得包涵体。 

使用包涵体的洗涤液(0.3％Triton X-100、20mM Tris-HCl、5mM EDTA，pH8.0) 对其进行2-3次的洗涤、确保清洗干净，离心后收集包涵体，使用(30mMTris-HCl、10mM DTT、6M盐酸胍或8M尿素)抽提液以1∶20的体积进行变性抽提，离心后取上清，使用(20mM Tris-HCl、0.3mM GSSG)的复性液以1∶80的体积进行稀释复性。 

然后将所得复性液进行超滤浓缩，随后将所获得的浓缩液上样20mMTris-HCl pH8.0的平衡液平衡的Q Sepharose Fast Flow柱，上样后再次平衡，再使用0～1MNaCl、30mMTris-HClpH8.0的洗脱缓冲液进行梯度洗脱，收集目的蛋白峰(图8)。将目的蛋白溶液调pH至6.5，加入硫酸铵使其终浓度为0.8M，上样Phenyl Sepharose柱(先用0.8M硫酸铵，40mmol/L PB，pH6.5平衡液平衡)，上样后用平衡液平衡，然后使用0～0.8M硫酸铵+40mmol/L PB，pH6.5的洗脱缓冲液梯度洗脱，进行纯化。电泳检测获得的融和蛋白纯度可达到95％以上(见图9)。 

实施例3：IS1融合蛋白抑制新生血管作用和抗肿瘤作用 

(1)抑制新生血管作用： 

首先以定性滤纸为样品载体，用剪成5mm2的纸片，将IS₁融合蛋白以生理盐水稀释，空白对照直接滴加生理盐水。将种蛋先用碘酒进行消毒，再用75％乙醇进一步进行擦拭消毒。在种蛋气室处，用镊子在蛋胚顶端小心戳一小口，然后剥去周围的蛋壳和壳膜，使开口约为1.5cm×1.5cm大小。小心地用尖手术镊子从气室与卵黄囊分隔处挑破气室膜，轻轻去除上层气室薄膜，暴露下层的cAM膜。将微载体加至卵黄囊膜处血管较少的部位，滴加相应剂量的药剂，然后用胶布封口，继续孵育48h。实验结果表明，IS₁融合蛋白具有很好的抑制新生血管作用(图10)。 

(2)抗肿瘤作用： 

IS1融合蛋白、S1肽与IFNα2b(市售)进行肿瘤抑制实验。在实验过程中采用的方法是：取接种有H₂₂肿瘤细胞的小鼠，分别注射不同浓度的IS1融合蛋白(30μg/Kg、80μg/Kg)、干扰素(市售，30μg/Kg)，连续给药16d，停药后两小时杀鼠，观察肿瘤生长情况，称瘤重，计算抑瘤率。结果表明，本发明的IS₁融合蛋白较IFNα2b(市售)相比有明显的抗肿瘤作用，肿瘤抑制率可达到80％以上。 

^*：P＜0.05vs空白对照组；^**：P＜0.01vs空白对照组；^***：P＜0.001vs空白对照组 

表1IS₁融合蛋白对昆明小鼠H22肿瘤生长的影响 

实施列4抗内皮细胞的增殖和迁移 

(1)抗内皮细胞的增殖 

为了检测IS1融合蛋白抑制内皮细胞的生长，在24孔板的每孔内加5×10⁴HUVEC细胞，含10％胎牛血清的DMEM培养基中进行孵育培养。24h以后替换成不含胎牛血清的DMEM培养基。随后在每孔内加IFNα2b，IS1融合蛋白，S1肽。细胞培养72h以后，弃掉培养基细胞计数。可视的细胞数量通过MTT法计算。使用Bio-Rad酶联免疫仪在570nM吸收峰读数。 

在实验中IS1融合蛋白和IFNα2b使用相同的活性单位，S1肽与融合蛋白使用相同的摩尔数。从结果可以看出(见图11)，IS1融合蛋白在72h的时候显示出更显著的抑制HUVEC细胞的生长。将融合蛋白与IFNα2b对比发现，融合蛋白有更强的抑制HUVEC细胞生长的作用。结果说明IS1融合蛋白具有较好的 HUNEC细胞抑制活性。 

(2)抗内皮细胞的迁移 

Transwell小室的制备：将Matrigel依次放在冰上、冰箱内过夜使其解冻，将聚碳酸酯膜用指甲油粘在Transwell细胞培养小室上，慢慢风干，在膜内加入浓度1mg/ml的Matrigel 10μl，置于超净工作台中风干，使其形成一个基质屏障膜。 

细胞悬液的制备：常规方法培养HUVEC细胞，在制备细胞悬液前4～5天，按1∶10比例传代细胞于细胞培养瓶中，避免细胞过度生长而出现不完全融合，每个培养瓶大约接种6～8×10⁶个细胞，实验前一天取对数生长期的HUVEC细胞用无血清DMEM培养基培养过夜，使细胞处于饥饿状态，弃掉培养液，用PBS清洗，加入1ml 0.25％胰酶和0.02％EDTA消化液，放入细胞培养箱，培养1～3min后，轻轻振培养瓶使细胞脱落。加10ml DMEM，用移液管吹打细胞，使细胞充分悬浮，转入50ml聚丙烯离心管。1000rpm离心细胞10min，然后用PBS清洗两遍。用苔盼蓝计数细胞，收集HUVEC细胞以无血清DMEM培养基制成5×10⁵/ml单细胞悬液。 

Matrigel侵袭实验：取24孔板，每孔加入600μl含10％BSA的DMEM细胞培养液，随后将上述细胞悬液加入Transwell小室中，每小室90μl，给药组每室加入10μl药液，对照组加入10μl PBS，每种药物的每个剂量设3个复孔。将小室浸于24孔板的完全培养液中，37℃，5％CO₂培养箱内孵育12h，取出小室，将滤膜用甲醇固定1min，HE染色。HE染色使用试剂盒，过程参照试剂盒说明书进行，染色完成后用棉签擦掉膜上层未穿过的细胞，酯膜放在载玻片上，用二甲苯透化1min，再用中性树脂封片，在400倍显微镜下计数侵袭细胞。每个膜计数上下左右中5个不同视野透过细胞数，计算平均值，每组设3个平行滤膜。侵袭抑制率计算公式： 

侵袭抑制率＝(对照组侵袭细胞数-给药组侵袭细胞数)/对照组侵袭细胞数×100％。 

HUVEC细胞的侵袭是肿瘤生成发展过程中的重要环节，我们通过Transwell小室来模拟细胞侵袭过程。为了评估融合蛋白IS1是否能有效的抑制内皮细胞的侵袭，我们使用基于Transwell小室的细胞侵袭分析方法。基本的FGF在实验中被用作HUVEC细胞的诱导剂。下室加入含有10ng/ml bFGF的M199完全培养基，上室加入含5％血清M199稀释的血管内皮细胞，小室内同时加入IFNα2b，IS1和S1肽，作用20h后计数，发现药物均能一定程度的抑制HUVEC细胞的侵袭。对照组，IFNα2b，IS1和S1肽组的细胞侵袭抑制率分别为100％，24±7.89％，76±6.86％，53±4.16％，图12中可见S1和IS1融合蛋白对HUVEC都有较好的侵袭抑制作用，融合蛋白还使HUVEC数量变的更少。IFNα2b在50nM的处理条件下抑制由bFGF所有诱导的侵袭的24±7.89％。与此相关的IS1融合蛋白则呈现出对于内皮细胞侵袭的抑制具有统计学意义的提高。用IS1处理的细胞展示出了较高的由bFGF所诱导的侵袭抑制率(76％)。 

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其特征在于：结构为：IFN-M-S，其中S代表靶向肽，M代表连接肽，IFN代表干扰素，S氨基酸序列可以是S1、S2、S3、S4中任意一种，M氨基酸序列含有0-10个氨基酸残基，优选0-6个氨基酸残基，IFN可以是I型和II型干扰素中任意一个。

2.权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：

其中S1、S2、S3、S4分别代表：

SEQ ID NO：1

His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu SerGly Gly Met Arg Gly Asp Arg Gly Asp

SEQ ID NO：2

His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu SerGly Gly Met Arg Gly Asp Arg Gly

SEQ ID NO：3

His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu SerGly Gly Met Arg Gly Asp Arg

SEQ ID NO：4

His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu SerGly Gly Met Arg Gly Asp

M氨基酸残基可以选自：

GGSGG，GGGGS，GGGGG

3.权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：选自序列表SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9的序列

4.权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：为序列表SEQ ID NO：5序列。

5.权利要求4所述融合蛋白的DNA，其特征在于：其氨基酸密码子可以是其简并密码子的任意一个。

6.一种表达载体，其特征在于：它含有权利要求6所述DNA中的一种。

7.权利要求6所述表达载体，可以是真核细胞表达载体或原核细胞表达载体，优选PET系列载体。

8.一种宿主细胞，其特征在于：它含有权利要求8的载体。

9.权利要求8所述宿主细胞，可以是动物细胞、昆虫细胞、酵母、大肠杆菌，优选大肠杆菌。

10.一种权利要求1所述融合蛋白的制备方法，其特征是包含以下的步骤：在PH4.5的条件下，使用醋酸-醋酸钠缓冲液，利用阳离子层析介质在低浓度氯化钠条件下上权利要求1所述融合蛋白粗品，高浓度氯化钠条件下洗脱纯化；然后在PH8.2的条件下，使用Tris-HCl缓冲液，利用阴离子层析介质进一步纯化，获得纯度95％以上权利要求1所述融合蛋白。

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