CN104628864A - 一种抗肿瘤融合蛋白EL-defensin、其编码基因和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗肿瘤融合蛋白，所述融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：EGFR特异性靶向寡肽-连接肽1-辅基蛋白LDP-连接肽2-防御素HBD-1；其中，所述EGFR特异性靶向寡肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述辅基蛋白LDP具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述防御素HBD-1具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。该融合蛋白为以辅基蛋白LDP为支架的新型抗肿瘤融合蛋白，其具有EGFR靶向性和防御素HBD-1杀伤肿瘤细胞的功能。本发明还提供了该融合蛋白的编码基因以及制药用途。

Description

一种抗肿瘤融合蛋白EL-defensin、其编码基因和用途

技术领域

本发明属于药用蛋白技术领域。具体而言，本发明涉及一种抗肿瘤融合蛋白、其编码基因、以该融合蛋白为活性成分的药物以及其制药用途。

背景技术

人的防御素（defensin）由粒细胞和上皮细胞产生，从遗传学上分为α-防御素和β-防御素。它们在天然免疫方面主要表现为杀死病原微生物和带有包膜的病毒，而在获得性免疫方面主要表现作为化学诱导剂和激活免疫细胞。α-防御素（HNP1-3）在肿瘤细胞中超表达，而β-防御素（HBD）在肿瘤细胞中极少表达，并且最近研究表明hBD-1可以作为肿瘤的抑制基因。尤其近年来研究表明HBD-1与肿瘤细胞的增殖、分化和转移有重要的联系。例如，诱导前列腺癌细胞中HBD-1的超表达，能够抑制前列腺癌细胞系DU145和PC3的增殖，裂解细胞并且启动caspase蛋白介导的细胞凋亡；HBD-1刺激口腔鳞癌细胞BHY，使BHY细胞中HBD-3表达量增加，并且抑制细胞的增长；小肠基底HIF-1α是DEFB1能够表达所必需的，DEFB1是肠上皮细胞中HIF-1α的靶点，而HIF-1α的超表达会导致肿瘤的转移和肿瘤血管的增生。

辅基蛋白（LDP）是力达霉素LDM的蛋白部分，可以通过基因工程的方法制备。先前报道LDP可以与肿瘤组织特异性结合，其本身在体内也具有中等程度的抗肿瘤作用，并且物理性质和化学性质比较稳定。因此，LDP以其独特的分子结构及抗肿瘤特性，可以作为开发新型抗肿瘤药物的支架载体。

表皮生长因子受体（eipermal growth factor receptor,EGFR）是跨膜受体酪氨酸激酶家族（ErbB）的一员，其配体有EGF、TGF-α、Amphiregulin、HB-EGF等，配体和受体结合，进而活化一系列的胞内信号通络，最终促进细胞的增殖、分化和迁移。EGF是EGFR的天然配体之一，由53个氨基酸组成，含有6个保守的半胱氨酸残基，形成3对二硫键，Cys1-Cys3形成A环，Cys2-Cys4形成B环，Cys5-Cys6形成C环，EGF与受体结合的区段位于C环。

基于上述，本发明研发了以辅基蛋白LDP为支架的新型抗肿瘤融合蛋白，其具有EGFR靶向性和防御素HBD-1杀伤肿瘤细胞的功能。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种以LDP为支架具有靶向EGFR的防御素（HBD-1）的融合蛋白，该融合蛋白为具有抗肿瘤作用的分子量较小的药用蛋白。

本发明的另一个目的是提供该融合蛋白的编码基因。

本发明的还有一个目的是提供以上述融合蛋白为活性成分的药物以及上述融合蛋白的制药用途。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

迄今为止，在国外文献报道的相关防御素（defensin）抗肿瘤的研究中，防御素（defensin）主要是通过真核表达系统获得的。但是，防御素含有三个二硫键，不易可溶性表达，并且表达量极少，难以获得高纯度的防御素分子。可能是因为防御素分子难以表达，关于防御素的融合蛋白的报道极少，目前尚无关于防御素的融合蛋白的报道，更没有将防御素与具有靶向性的部分或分子相融合的报道。本发明人通过基因工程技术构建了以LDP为支架的、具有靶向EGFR特异性的防御素（HBD-1）融合蛋白（本文命名为EL-defensin）重组载体，将其转化到工程菌BL21star^TM(DE3)中表达，并经纯化获得了一种多功能的具有抗肿瘤作用的药用蛋白。其中，除表达的蛋白含量外，关于EGFR靶向性，发明人选取了与EGFR受体结合的EGF重要结构C环，其上22个氨基酸残基作为导向分子，由此形成的较小分子的蛋白也更容易穿透组织的细胞外间隙，到达实体肿瘤的深部。

因此，一方面，本发明提供一种抗肿瘤融合蛋白，所述融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：

EGFR特异性靶向寡肽-连接肽1-辅基蛋白LDP-连接肽2-防御素（HBD-1）；

其中，所述EGFR特异性靶向寡肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，共22个氨基酸；所述辅基蛋白LDP具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，共110个氨基酸；所述防御素HBD-1具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，共36个氨基酸。

在该融合蛋白中，连接EGFR特异性靶向寡肽与辅基蛋白LDP的连接肽1以及连接辅基蛋白LDP与防御素HBD1的连接肽2可以相同或不同。优选地，所述连接肽1为(GGGGS)₂，所述连接肽2为(GGGGS)₂。在选择连接肽时，需考虑如连接肽太短，则刚性大，不利于蛋白分子伸展，容易造成蛋白分子构想相互遮掩，影响蛋白功能；并且考虑到作为支架的辅基蛋白LDP共有110个氨基酸，具有α螺旋和β折叠，结构较复杂，因此，选用(GGGGS)₂。

优选地，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或者，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

进一步优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示或SEQID NO:5。

SEQ ID NO:4为本发明提供的一个具体融合蛋白的氨基酸序列，共188个氨基酸。从氨基端至羧基端，该融合蛋白包括：EGFR特异性靶向寡肽（Ec），共22个氨基酸；连接肽1，为(GGGGS)₂柔性肽，共10个氨基酸；辅基蛋白LDP，共110个氨基酸；连接肽2，为(GGGGS)₂柔性肽，共10个氨基酸；防御素HBD-1（HBD-1），共36个氨基酸。

SEQ ID NO:5为本发明提供的另一个具体融合蛋白的氨基酸序列，共192个氨基酸。相比于SEQ ID NO:4，该融合蛋白在EGFR特异性靶向寡肽之前具有Met和Ala，在防御素的C端具有Leu和Glu。

另一方面，本发明提供上述融合蛋白的编码基因。

优选地，所述编码基因具有SEQ ID NO:6或7所示的核苷酸序列；

进一步优选地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6或7所示。

另一方面，本发明还提供一种抗肿瘤药物，所述药物以本发明提供的上述融合蛋白为活性成分。优选地，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防鳞癌、肺癌或胰腺癌，优选肺癌。

又一方面，本发明还提供上述融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。优选地，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防鳞癌、肺癌或胰腺癌，优选肺癌。

综上，本发明应用基因工程的方法提供了一种新型的具有杀伤性、靶向性的融合蛋白。该融合蛋白为靶向EGFR（表皮生长因子受体）、且含有LDP和defensin的新型蛋白。与现有技术相比，本发明的融合蛋白具有以下实质性区别和效果：

在现有技术中，尚无将防御素与其它部分或分子、特别是具有靶向性的部分或分子相融合形成融合蛋白的报道。其原因可能在于，人的防御素分子HBD-1含有三个二硫键，因此在原核细胞中极其难以表达，且常常以包涵体的形式表达，并且由于其分子空间结构复杂，其不易和其它蛋白融合表达。

而在本发明提供的融合蛋白中，以LDP作为支架，将防御素与EGFR的配体寡肽融合，其中EGFR的配体寡肽为靶向分子，防御素HBD-1为弹头，从而构建了一个靶向EGFR的弹头小分子药物。这样就实现了直接表达获得包含防御素的蛋白分子。实验证明，所得到的融合蛋白不仅保留了defensin杀伤肿瘤细胞的作用，而且能更特异地靶向肿瘤组织，因此具有更好的杀伤肿瘤的优点，在动物体内具有良好的抗肿瘤效果，相比于单独应用各部分，其技术效果更显著。并且，即使本领域已有一些将LDP作为支架构建融合蛋白的报道，但是，现有的此类融合蛋白往往是使LDP起组装弹头分子AE的作用，与本发明提供的融合蛋白具有本质区别，并且往往具有毒性大、无靶向性等缺点。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出了重组表达质粒pET30-el-defensin的构建。

图2示出了重组菌表达产物EL-defensin融合蛋白的检测结果。其中：

图2A为EL-defensin定位分析的电泳图谱，1-蛋白分子量标准，2-未加IPTG诱导全菌组分、3-IPTG诱导全菌组分，4-上清组分，5-周质腔组分，6-细胞质可溶组分，7-包涵体组分；

图2B为EL-defensin融合蛋白纯化和复性后的SDS-PAGE和WesternBlot结果，1-蛋白分子量标准，2-纯化的EL-defensin蛋白，3、4、5、6-复性EL-defensin蛋白，7、8-EL-defensin融合蛋白Western Blot结果；

图2C为HLPC检测EL-defensin融合蛋白的纯度结果。

图3示出了EL-defensin融合蛋白体外结合能力的分析结果。其中：

图3A为不同肿瘤细胞及J774A.1细胞中EGFR表达量的Western Blot检测结果；

图3B为A431细胞中EL-defensin融合蛋白ELISA免疫活性分析结果；

图3C为A549细胞中EL-defensin融合蛋白ELISA免疫活性分析结果；

图3D为H460细胞中EL-defensin融合蛋白ELISA免疫活性分析结果；

图3E为J774.1细胞中EL-defensin融合蛋白ELISA免疫活性分析结果。

图4示出了细胞免疫荧光分析EL-defensin融合蛋白与A431细胞的结合活性结果。其中图4A-4C为融合蛋白EL-defensin作用于A431细胞：4A为细胞核DAPI着色图片；4B为细胞膜着色图片；4C为细胞核和细胞膜着色图片。

图5示出了融合蛋白EL-defensin在体内的靶向A431裸鼠移植瘤的能力。

图6示出了透射电镜观察融合蛋白EL-defensin处理A431细胞的形态变化图片。其中：

图6A和6B为未做任何处理的A431细胞图片；

图6C和6D为EL融合蛋白处理的A431细胞图片；

图6E和6F为EL-defensin融合蛋白处理的A431细胞图片。

图7示出了融合蛋白EL-defensin、LDP、EL和defensin对肿瘤细胞的抑制率比较结果。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1重组表达载体pET30-el-defensin的构建

本实施例中使用的重组质粒pEL含有EGFR寡肽配体Ec基因和LDP基因，构建方法及其图谱参见郭晓芳，“靶向表皮生长因子受体的寡肽与力达霉素强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性”，《癌症》，2009，28（6）：561-568。大肠杆菌感受态DH5α为北京全式金生物科技公司产品，pET30a(+)为Novagen公司(69909-3)的产品，PCR引物由英维杰基上海公司合成。

构建重组载体pET30-el-defensin需要5条引物：

E1（SEQ ID NO:8）：5’-gc cat atg aaa tac ctg ctg ccg acc-3’（下划线为NdeI酶切位点）

P2（SEQ ID NO:9）：5’-gcc gaa ggt cag agc cac gtg-3’

Pb1（SEQ ID NO:10）：5’-ggt gga ggc ggt tca ggt gga ggc ggt tca gat cat tataac tgc gtg tcc tcc ggc ggt cag tgt ctg tat agc gca-3’

Pb2（SEQ ID NO:11）：5’-gc ctc gagctt gca aca ctt cgc ctt gcc acg ata acaggt gcc ctg ggt ctt ggt aaa gat cgg gca tgc gct ata cag aca ctg-3’（下划线为XhoI酶切位点）

Pb4（SEQ ID NO:12）：5’-gc ctc gag ctt gca aca ctt cgc ctt-3’（下划线为XhoI酶切位点）

以重组质粒pEL为模板，采用引物E1和P2进行常规PCR反应：94℃预变性3分钟，然后94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸45秒，进行30个循环的扩增反应，最后72℃延伸10分钟。反应体系含：

产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用Omega公司凝胶回收试剂盒回收501bp的基因片段，该基因片段带有信号肽，命名为ec-ldp（SEQ ID NO:13）。

Pb1为5’端引物，Pb2为3’端引物，互为模板，按照以下条件进行PCR扩增，获得含有一个酶切位点的Human defensinβ-1（hBD-1）基因片段（约108bp）（SEQ ID NO:14）。采用的PCR反应条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性50秒，55℃退火50秒，72℃延伸50秒，进行30个循环的扩增反应，最后72℃延伸8分钟。反应体系含：

Ec-ldp和hBD-1互为模板，引物E1和Pb4进行PCR反应，采用的PCR反应条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性50秒，65℃退火50秒，72℃延伸50秒，进行30个循环的扩增反应，最后72℃延伸10分钟。反应体系含：

将得到的基因片段命名为基因el-defensin（SEQ ID NO:7）。

除连接肽之外，基因el-defensin包括3部分，从5’端到3’端依次为NdeI酶切位点（6bp）、Ec的编码序列（66bp）、柔性肽(GGGGS)₂的编码序列（30bp）、LDP的编码序列（330bp）、柔性肽(GGGGS)₂的编码序列（30bp）、defensin的编码序列（108bp）、XhoI酶切位点（6bp），共576bp。

分别用NdeI和XhoI双酶切基因el-defensin和pET30a（+）载体，然后连接，得到重组表达载体，命名为pET30-el-defensin，并转化至大肠杆菌DH5α，挑选出阳性克隆进行测序，质粒构建流程见图1。结果表明，双酶切结果和测序结果与预期完全一致。

在得到的重组质粒pET30-el-defensin中，在防御素HBD-1编码序列的3’末端有XhoI酶切位点，并且pET30a（+）载体含有组氨酸标签（6个氨基酸，His-tag标签），使得该重组质粒pET30-el-defensin在表达融合蛋白时使蛋白含有His-tag标签，以便于纯化和鉴定。

实施例2融合蛋白EL-defensin在大肠杆菌中的表达和纯化

本发明使用的大肠杆菌菌株BL21star^TM(DE3)是Novagen公司的产品。

将实施例1中构建的重组表达载体pET30-el-defensin转化至大肠杆菌BL21中，挑取阳性单克隆接种LB培养基（卡那霉素50μg/ml），37℃下过夜培养。送去测序，选取测序和双酶切结果正确的阳性菌株-80℃下保存（此菌株为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），已于2013年6月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），菌种保藏号CGMCC No.7676）。

将该阳性单克隆接种5ml LB培养基，37℃下过夜培养，当OD=1.0时，加入1mmol/L IPTG，诱导8h，按照pET系统操作手册（Novagen公司）对培养液上清液、周质腔、细胞质可溶以及不可溶组分进行分析。融合蛋白EL-defensin分子量大小为19.8KD。发现，经12%SDS-PAGE电泳分析，EL-defensin蛋白主要定位于包涵体中（图2A），分子量大小与预期相符。对影响蛋白表达产量的各个条件进行了优化，最终确定表达条件为：温度37℃、菌体起始密度A₆₀₀=1.0、IPTG浓度为1mmol/L、诱导时间为4h。

融合蛋白是不可溶性的，需经过复性，可经过超声裂解处理后将包涵体蛋白组分释放出来，并且EL-defensin融合蛋白在碳末端带有His-tag标签，因此采用GE公司的His-tag5ml的镍柱，按试剂盒说明书进行Ni2+亲和色谱纯化。用不同浓度的咪唑将蛋白提纯，咪唑的浓度分别为5mM、20mM、50mM、和250mM，250mM咪唑洗下的蛋白经12%SDS-PAGE电泳分析鉴定为目的蛋白EL-defensin（图2B），分子量大小与预期相符。

得到的融合蛋白EL-defensin的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

实施例3融合蛋白EL-defensin的复性

将可溶和纯化的EL-defensin蛋白用含6M尿素的1×结合缓冲液稀释至15-50μM，加入2-巯基乙醇至终浓度为10mM，室温放臵30min。将还原后的蛋白用至少50倍样品体积的复性液I(50mM Tris-HCl pH8.0,1mMEDTA,200mM NaCl,6M尿素)透析过夜，以除去还原剂。用尿素浓度依次递减且与透析液I同样组分的缓冲液将样品进行分步透析，尿素浓度依次为3M、2M、1M、0.5M、0M。在尿素浓度为1M的阶段加入750μM的氧化型谷胱甘肽(GSSG)和400mM的L-精氨酸。每次均于4℃透析过夜。将最后一步透析所得样品再用50倍体积PBS进行透析，每8-12h更换一次透析液，共三次。将透析后的样品0.45μm滤膜过滤，收集过滤液。将复性的样品加入超滤离心管Ultrafree-MC membranes(Millipore公司，截留分子量为3kDa)中，以3,500g离心浓缩蛋白至适宜浓度，经12%SDS-PAGE电泳分析鉴定为目的蛋白EL-defensin（图2B），分子量大小与预期相符。HPLC检测其纯度达到了85.4%（图2C），产量为每升发酵液大概获得30mg的未复性的融合蛋白。

实施例4融合蛋白EL-defensin体外细胞结合活性测定

实验（一）：

将对数生长期的人皮肤鳞癌细胞A431、人肺癌细胞A549、人肺癌细胞H460、人肺癌细胞PG-BE1和小鼠巨噬细胞J774A.1用预冷的PBS洗涤2次，用胰酶消化细胞，再用PBS洗涤2次，加入适量细胞裂解液（北京宝赛生物技术公司），冰上裂解10分钟。之后于4℃，10,000rpm下离心30分钟，收集上清液。

用BCA试剂盒进行融合蛋白EL-defensin定量，取50μg蛋白与适量5×上样缓冲液混合，沸水浴中变性5分钟，-80℃保存备用。

Western Blot检测肿瘤细胞EGFR的表达水平，结果显示A431为EGFR高表达细胞株，而A549和PG-BE1中表达EGFR，H460表达EGFR较少，J774A.1不表达EGFR（图3A）。

以酶联免疫吸附分析方法（ELISA）检测融合蛋白的免疫原性。将A431、A549、H460和J774A.1细胞于96孔板每孔接种1×10⁴个细胞，37℃下培养24小时后用PBS洗3次，加入4℃预冷的0.05%戊二醛（100μl/孔），于4℃固定细胞30分钟。固定好的细胞用PBS洗3次后，用3%BSA溶液于4℃下封闭过夜，然后用PBST缓冲液（PBS中含有0.05%的Tween-20）洗3次。将EL-defensin融合蛋白（SEQ ID NO:5）、EL融合蛋白（采用常规方法获得的Ec与LDP的融合蛋白，序列为SEQ ID NO:15）、LDP蛋白和HBD-1蛋白（Abcam公司购买）倍比稀释加入到96孔板中，每个浓度设3个平行孔，37℃下温育2小时。用PBST洗3次后，加入抗His-tag单克隆抗体（1：2500稀释），37℃下温育2小时。用PBST洗板3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体（1：2500稀释），37℃下温育2小时。用PBST洗板5次，加入TMB底物反应液（北京天根公司）（100μl/孔），室温避光反应10-30分钟。以2mol/L的硫酸每孔100μl终止反应，立即在酶标仪上测定450nm处的吸光值。结果表明，融合蛋白EL-defensin和EL对表达EGFR受体的A431、A549和H460细胞的反应均呈阳性（图3B-D），J774A.1细胞表面不具有EGFR受体，EL-defensin对其的反应呈阴性（图3E）。而不含Ec配体寡肽的LDP和HBD-1蛋白无论是表达EGFR受体的肿瘤细胞还是不表达EGFR受体的肿瘤细胞均呈阴性反应（图3B-3E）。

实验（二）：

采用细胞免疫荧光法分析融合蛋白EL-defensin与EGFR高表达的A431细胞的结合活性。

将A431肿瘤细胞以5×10⁴个细胞/孔的密度接种到六孔板中，37℃下培养24小时后用PBS洗3次，加入70%甲醇于臵于0℃下固定20分钟，PBS洗3次。加入融合蛋白EL-defensin（100μM/孔），于室温下孵育2小时或于4℃下过夜，然后PBS洗3次。加入1:1000稀释的抗His-tag抗体，室温下反应2小时，PBS洗3次。加入1:50稀释的TRITC标记羊抗鼠IgG（中杉金桥公司），室温下避光反应1小时，PBS洗3次。加入1:100稀释的DAPI（1mg/ml），室温下避光反应15分钟。PBS洗3次后于荧光显微镜下观察并照相。结果如图所示，在A431细胞细胞膜上可观察到红色荧光，表明EL-defensin融合蛋白可以与表达EGFR受体的肿瘤细胞的细胞膜结合（图4）。

实施例5小动物活体成像分析融合蛋白EL-defensin在体内的靶向效果

将待交联的蛋白（浓度5mg/mL）对交联反应液（硼砂缓冲液）4℃下透析3次，至pH＝8.5。交联反应液配制方法：19.08g Na₂B₄O₇10H₂O，9.01g NaCl，HCl调整pH到8.5，加水定容至1升。将DyLight680（Thermo Scientific公司，DyLight680，目录号：22859）溶于DMF中，浓度为10mg/mL。每次交联使用的DyLight680均应新鲜配制，避光。

按照所提供的说明书，将DyLight680缓慢加入于蛋白溶液中，边加边轻轻晃动，使其与蛋白混合均匀，至平面小摇床暗处室温轻轻摇动反应4小时。将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。

通过静脉接种裸鼠异位移植瘤A431，当肿瘤体积生长至大约200mm³的时候，通过尾静脉注射FITC标记的融合蛋白给药剂量为250μg/只。通过观测不同的时间，发现融合蛋白EL-defensin在A431肿瘤细胞中有明显的靶向效果，4小时在肿瘤部位达到最大富集，12小时后肿瘤部位融合蛋白的荧光几乎检测不到，显示药物已经体内代谢（图5）。

实施例6融合蛋白EL-defensin体外裂解肿瘤细胞电镜分析结果

培养细胞，收集细胞；0.1M PBS,pH7.2－7.4快速清洗2遍，5min/次，室温；吸干净PBS，加入～100-500ul2.5%戊二醛，4℃或室温，2h；0.1M PBS,pH7.2－7.4清洗3遍，5－10min/次；吸出PBS，适量4%明胶，混匀，离心，3000rpm，10min；吸出上清，静臵10min，室温；4度冰箱30min，使明胶冷却凝固；加入～100-500ul2.5%戊二醛，固定30min－1h，PBS3次，5－10min/次；在显微镜下切除没有样品的明胶，有样品部分切成1mm³小块，2.5%戊二醛保存（以上培养细胞前处理方法，如果细胞能够离心成团可以不用明胶包埋）；PBS3次，5－10min/次，1-2%锇酸于4℃或室温，固定2h；0.1M PBS或水洗3次，5－10min/次；30%乙醇，10min，4℃；50%乙醇，10min，4℃；70%乙醇，10min室温；90%乙醇，10min，室温；95%乙醇，10min，室温；100%乙醇，10min×3，室温；PO10min×3；渗透；包埋；聚合；切片制好上镜观察。如图6所示，A431细胞对照组细胞膜完整，细胞质中细胞器和线粒体形态都正常，但是EL-defensin和EL蛋白处理后，A431细胞的形态发生了变化，EL-defensin改变最明显，细胞膜内陷，细胞质中产生空泡，肿瘤细胞开始裂解，线粒体结构也发生变化，双分子膜结构几乎无法观察到，有的线粒体嵴之间的空隙变大，并且有的线粒体中间也产生空泡。

实施例7CCK-8试剂盒检测EL-defensin融合蛋白体外对肿瘤细胞的杀伤活性

取对数生长期的皮肤鳞癌细胞A431和肺癌细胞H460细胞，以每孔3000个细胞的密度接种于96孔板，37℃下培养24h后加入不同浓度的融合蛋白EL-defensin或EL或LDP或defensin（Abcam），每浓度设臵3个平行孔。孵育24h后，每孔加入20μL CCK-8溶液继续培养1h。酶标仪测定450nm处的吸光度(A₄₅₀)。实验设臵无药对照组和无细胞空白组，按下面公式计算细胞的存活率并计算出IC50值：

细胞抑制率=100-(加药组A₄₅₀值－空白组A₄₅₀值)/(对照组A₄₅₀值－空白组A₄₅₀值)×100%。

结果表明，与EL、LDP和defensin相比，EL-defensin蛋白对A431肿瘤细胞抗增殖作用最明显，10μM EL-defensin蛋白对鳞癌A431细胞的抑制率为67%，EL为48%，而LDP蛋白只有22%（图7A）；EL-defensin蛋白对H460肿瘤细胞抑制率为65%，EL蛋白只有45%（图7B）。因此EL-defensin蛋白对EGFR高表达A431细胞株抗增殖作用与H460差不多；EL-defensin蛋白又比EL高。因此，表明防御素HBD-1增强了融合蛋白的体外抗肿瘤活性。

实施例8融合蛋白EL-defensin对人鳞癌A431裸鼠移植瘤的生长抑制作用

取体重为18-22g的雌性BALB/c裸鼠5只，将人鳞癌A431细胞接种于裸鼠腋窝皮下，每只接种1×10⁷个细胞。待瘤块长至足够大小时，将其在无菌生理盐水中剪成2×2×2mm³的小块，用套管针将瘤块分别移植到裸鼠右腋窝皮下，用火胶棉将切口粘住。待瘤块长至100mm³大小时，将裸鼠按照瘤块大小和体重进行分组，使每组瘤块大小平均值为100mm³，且各组体重平均值接近，每组6只裸鼠。当肿瘤体积为100mm³时，将融合蛋白Ec-LDP-Hr（参见郭晓芳，Clin Cancer Res2010;16:2085-2094.）、EL-defensin、EL和LDP分别通过尾静脉给药，每只裸鼠注射200μl，对照组不做任何处理。第一次给药后的第8天，按照相同的剂量再次给药一次。实验期间每3天测量一次肿瘤直径和体重，根据公式V=ab²/2计算肿瘤体积（a：肿瘤长径，b：肿瘤短径），绘制肿瘤生长曲线，观察体重变化。实验第33天处死动物，分别称量肿瘤的重量，计算抑瘤率。结果见表1。

表1融合蛋白EL-defensin对人鳞癌A431的肿瘤生长抑制作用

裸鼠A431动物实验结果表明，融合蛋白EL-defensin对鳞癌A431有生长抑制作用。如表1所示，33天时，融合蛋白EL-defensin的剂量在10mg/kg时，抑瘤率为88.1%。相比之下，Ec-LDP-Hr融合蛋白只有74.2%，单独的力达霉素辅基蛋白LDP在10mg/kg的情况下抑制率为52.4%，这说明融合蛋白EL-defensin提高了对鳞癌A431瘤的治疗效果（与LDP组相比，p<0.05）。

动物实验结果显示，与本实验室构建的双靶点融合蛋白Ec-LDP-Hr相比，EL-defensin的抑瘤效果更好，推测防御素融合蛋白中的防御素组分充分发挥其杀伤肿瘤细胞弹头的作用，增加了融合蛋白的免疫毒性，更好地抑制了肿瘤的生长。

实施例9融合蛋白EL-defensin对人肺癌H460裸鼠移植瘤的生长抑制作用

试验方法、给药次数与实施例8基本相同，不同的是当肿瘤为人的肺癌细胞H460，而裸鼠第27天处死，结果见表2。

表2融合蛋白EL-defensin对人肺癌H460的肿瘤生长抑制作用

裸鼠H460动物实验结果表明，融合蛋白EL-defensin对肺癌H460有生长抑制作用。如表2所示，27天时，融合蛋白EL-defensin的剂量在10mg/kg时，抑瘤率为80.9%。相比之下，Ec-LDP-Hr融合蛋白只有59.6%，单独的力达霉素辅基蛋白LDP在10mg/kg的情况下抑制率为41.2%，这说明融合蛋白EL-defensin提高了对肺癌H460瘤的治疗效果（与LDP组和Ec-LDP-Hr组相比，p<0.05）。

上述动物实验结果显示，与本实验室构建的双靶点融合蛋白Ec-LDP-Hr相比，EL-defensin的抑瘤效果更好。融合蛋白Ec-LDP-Hr只有在高表达EGFR和Her2受体的动物移植瘤中才发挥作用。如A431高表达EGFR受体，Ec-LDP-Hr抑制率为74.2%，但是在低表达EGFR受体和Her2受体的肿瘤H460中抑制率只有59.6%，而EL-defensin对无论表达EGFR受体还是不表达EGFR受体的肿瘤都有很好的抑制作用，说明防御素HBD-1很好地发挥了弹头作用。

而且融合蛋白EL-defensin不仅对A431移植瘤有良好的疗效，对其他的肿瘤如肺癌H460也具有较好的效果，这说明该融合蛋白在动物体内对肿瘤细胞有普遍的抑制作用。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (9)

1.一种抗肿瘤融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一级氨基酸序列结构：

EGFR特异性靶向寡肽-连接肽1-辅基蛋白LDP-连接肽2-防御素HBD-1；

其中，所述EGFR特异性靶向寡肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述辅基蛋白LDP具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述防御素HBD-1具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽1为(GGGGS)₂；所述连接肽2为(GGGGS)₂。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或者，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白的编码基因。

5.根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；或者，所述编码基因具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；

优选地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示。

6.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述药物以根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白为活性成分。

7.根据权利要求6所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防鳞癌、肺癌或乳腺癌，优选鳞癌。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防鳞癌、肺癌或乳腺癌，优选肺癌。