CN103755813A - 一种靶向性抗肿瘤融合蛋白及其编码基因与表达质粒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药生物技术领域，本发明提供了一种靶向性抗肿瘤融合蛋白mAnx5-MLT，其编码基因是膜联蛋白5的突变体mAnxA5和蜂毒素基因的融合基因mAnxA5-MLT；本发明还提供了表达质粒pET28a-mAnxA5-MLT以及工程菌DH5α。本发明的融合蛋白能够靶向作用于肿瘤细胞外膜的磷脂腺丝氨酸，从而靶向作用于肿瘤部位，能够显著提高蜂毒素的抗肿瘤作用，而且减小了蜂毒素用药量，从而减轻了蜂毒素的毒副作用。本发明可制备成为靶向抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及一种靶向性抗肿瘤融合蛋白，及其编码基因、表达质粒与在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
近年来随着肿瘤遗传学和分子生物学的深入研究，人们已经找到了一些肿瘤增殖分化、浸润转移的重要分子，在此基础上，靶向药物治疗逐渐成为是目前肿瘤治疗的重要手段。与常规的放化疗药物不同，靶向药物能靶向作用于肿瘤细胞，有针对性的杀伤细胞，从而降低用药量；尤为重要的是，靶向药物能够最大限度的减少对正常细胞或组织的损伤，降低副作用，提高疗效和改善病人的生存质量。因此，靶向抗肿瘤药物的研发成为抗肿瘤药物的热点。目前已经有伊马替尼、厄洛替尼、舒尼替尼、吉非替尼、索拉非尼、达沙替尼、拉帕替尼和尼洛替尼等多种靶向抗肿瘤药物在临床得到广泛应用。
研制肿瘤靶向药物，靶点的选择至关重要。近年来的研究发现，磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）是抗肿瘤治疗的重要靶点之一。磷脂酰丝氨酸是磷脂膜的重要组成成分，约占细胞总脂质的2－10%（Vance JE,Steenbergen R(2005)Metabolism and functions of phosphatidylserine.Prog Lipid Res44(4):207-234引用方式要求是作者，题名，期刊名，期卷页码）。在凝血、细胞吞噬和凋亡等特殊的生理状态下，磷脂酰丝氨酸外翻，从而容易被吞噬细胞发现和吞噬。而越来越多的研究证实，肿瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞的磷脂腺丝氨酸也外翻，从而成为肿瘤显像和靶向治疗的重要靶点（Kristof Schutters,Chris Reutelingsperger(2010)Phosphatidylserine targeting for diagnosis andtreatment of human diseases,Apoptosis15:1072-1082）。
目前已经有一些针对磷脂酰丝氨酸的药物如Diannexin（一种膜联蛋白A5的同源二聚体，能特异性结合PS）和Bavituximab（PS的单克隆抗体）通过了临床试验（http://clinicaltrials.gov）。Diannexin能够显著抑制结直肠癌、肺癌移植瘤的生长和肿瘤新生血管的生成（Khalid Al-Nedawia,Brian Meehana,RobertS et al.(2009)Endothelial expression of autocrine VEGF upon the uptake oftumor-derived microvesicles containing oncogenic EGFR PNAS,1063794-3799）。Bavituximab已经完成了小细胞肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤的临床试验，发现Bavituximab和放疗联合使用，能显著增强放疗的效果（Xianming Huang,Dan Ye,Philip E.Thorpe(2011)Enhancing the potency of awhole-cell breast cancer vaccine in mice with an antibody-IL-2immunocytokinethat targets exposed phosphatidylserine,Vaccine29,4785-4793）。因此，AnnexinA5可以作为一种“生物导弹”研制靶向抗肿瘤药物。但有一个问题不容忽视：AnnexinA5的分子量为34kDa(GenBank No.M18366)，所以和肿瘤药物融合后分子量往往太大，这样不仅不利于融合蛋白的表达，也导致了其半衰期的缩短。
蜂毒肽(melittin，MLT)是蜂毒的主要成分，其质量占蜂毒干物质45～50％。蜂毒肽是由26个氨基酸残基组成的多肽（NM_001011607），具有潜在膜活性，其寡聚体可在细胞膜上形成亲水性小孔，使胞内离子外流，引起渗透性改变，导致细胞溶解，对细胞有极强的杀伤作用（Lazarev VN，Parfenova TM，Gularyan SK，et a1.（2002）Induced expression of melittin，an antimicrobialpeptide，inhibits infection by Chlamydia trachomatis and Mycoplasma hominis inan Hela cell line.Int J Antimicrob Agent，19(2)：133－18）。同时，有大量文献报道，蜂毒肽能够通过多种细胞通路抑制细胞的增殖和促进细胞的凋亡（SonD J，Lee J W，Lee Y H，et a1.（2007）Therapeutic application of anti－arthritis，pain—releasing，and anti—cancer effects of bee venomand its constituentcompounds.Pharmacol Ther，l15(2)：246—70）蜂毒肽抗肿瘤作用在基础研究和临床实践中已受到越来越多的重视。但是，蜂毒肽的药理作用很复杂，除具有抗肿瘤作用外，对人体各大系统都有影响，具有较强的毒副作用：如溶血、呼吸中枢麻痹、心率失常等，大大限制了其在临床上的应用。
目前尚无有关AnnexinA5和其他肿瘤药物制备融合蛋白的相关报道，更无有关AnnexinA5和蜂毒肽构建融合蛋白的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向性抗肿瘤融合蛋白，具体为一种AnnexinA5和蜂毒肽构建的融合蛋白，以及该融合蛋白的编码基因。本发明的另一目的是提供上述融合蛋白的表达载体。本发明的第三目的是提供上述融合蛋白、编码基因、表达载体的应用。
本发明的第一方面，是提供一种靶向性抗肿瘤融合蛋白，具体为一种AnnexinA5和蜂毒肽构建的融合蛋白。
本发明以肿瘤内皮细胞暴露的磷脂酰丝氨酸为治疗靶点，利用mAnxA5作为靶向分子，以蜂毒素为“弹药”，构建mAnxA5-MLT靶向抗肿瘤分子。
针对AnnexinA5的分子量为34kDa，与肿瘤药物融合后分子量过大不利于融合蛋白的表达，也导致了其半衰期的缩短的缺陷；本发明根据AnnexinA5具有四个同源结构域的特点对AnnexinA5进行了基因改造，得到了一个仅包含第一、第二结构域的序列缺失突变体mAnxA5，其分子量仅为原来的一半，但保留了AnnexinA5对磷脂酰丝氨酸的靶向能力。
本发明提供了一种靶向性抗肿瘤融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
MAQVLRGTVTDFPGFDERADAETLRKAMKGLGTDEESILTLLTSRSNAQRQEISAAFKTLFGRDLLDDLKSELTGKFEKLIVALMKPSRLYDAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLEDDVRGDTSGYYQRMLVVLLQLKLIGPAGIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQ ID NO:4)
本发明提供了一种上述靶向性抗肿瘤融合蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
ATGGCACAGGTTCTCAGAGGCACTGTGACTGACTTCCCTGGATTTGATGAGCGGGCTGATGCAGAAACTCTTCGGAAGGCTATGAAAGGCTTGGGCACAGATGAGGAGAGCATCCTGACTCTGTTGACATCCCGAAGTAATGCTCAGCGCCAGGAAATCTCTGCAGCTTTTAAGACTCTGTTTGGCAGGGATCTTCTGGATGACCTGAAATCAGAACTAACTGGAAAATTTGAAAAATTAATTGTGGCTCTGATGAAACCCTCTCGGCTTTATGATGCTTATGAACTGAAACATGCCTTGAAGGGAGCTGGAACAAATGAAAAAGTACTGACAGAAATTATTGCTTCAAGGACACCTGAAGAACTGAGAGCCATCAAACAAGTTTATGAAGAAGAATATGGCTCAAGCCTGGAAGATGACGTGCGTGGGGACACTTCAGGGTACTACCAGCGGATGTTGGTGGTTCTCCTTCAGTTGAAACTCATCGGCCCTGCAGGAATTGGAGCAGTTCTGAAGGTATTAACCACAGGATTGCCCGCCCTCATAAGTTGGATTAAACGTAAGAGGCAACAGTAA(SEQ ID NO:3)
本发明的第二方面，是提供上述靶向性抗肿瘤融合蛋白的表达载体。
所述的表达载体为一种含有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的重组载体。
所述的表达载体，可采用原核表达载体pET28a，也可采用真核表达载体pLKO.1puro等构建。
本发明的重组载体，进一步转化大肠杆菌菌株BL21制备的工程菌BL21（例如pET28a-mAnxA5-MLT），表达上述靶向性抗肿瘤融合蛋白。
具体技术方案如下：
本发明融合蛋白mAnxA5-MLT是通过基因工程的方法制备的，具体制备过程为：
1、基因突变体mAnxA5的构建
mAnxA5基因是以AnnexinA5基因(GenBank No.M18366)为基础，通过定点突变和PCR等方法得到。整个构建过程分两步：
第一步：进行点突变，将AnnexinA5基因第二结构域中“V-G-D”序列突变为“R-G-D”序列
将缬氨酸（V）突变为精氨酸（R）采用重叠区基因扩增法，共需合成四条引物，分别为：
P1:5’GCCCATGGATGGCACAGGTTCTCAG3’(SEQ ID NO:5)
P2:5’GTCCCC 
CACCACGTCATCTTC3’(SEQ ID NO:6)
P3:5’GTG 
GGGGACACTTCAGGGTAC3’(SEQ ID NO:7)
P4:5’TTACAGTAGAAGAGGTGTCGACGC3’(SEQ ID NO:8)
其中：
P1与AnnexinA5基因的5’端相一致，并引入Nco I酶切位点CCATGG。
P2含有精氨酸密码子的互补核苷酸序列ACG（加框部分）。
以含有AnnexinA5基因的质粒pUC119-AnxA5为模板，P1,P2为引物扩增，得到的序列称为P1P2。
P3含有精氨酸密码子序列CGT（加框部分）。
P4同AnnexinA5的3’末端互补。以含有AnnexinA5基因的质粒pUC119-AnxA5为模板，P3,P4为引物扩增，得到的序列称为P3P4。
引物P2,P3具有一段互补的序列（引物中划线的部分），所以P1P2和P3P4的序列中也存在这一互补序列。将P1P2和P3P4变性后退火,可以在这段互补区形成双链。提供PCR反应条件，P1P2和P3P4可以互为引物进行扩增，扩增后的产物为P1P4。通过这种方法，将AnnexinA5第二结构域中“V-G-D”序列突变为“R-G-D”序列。
第二步：PCR扩增P1P4序列中的第一、二结构域，得到突变体基因mAnxA5
以P1P4为模板，以P1,P5为引物进行PCR扩增，得到的产物即为本发明的突变体基因mAnxA5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
P1:5’GCCCATGGATGGCACAGGTTCTCAG3’
P5:5’ACCGCCACCGGATCCGCCACTACCCTGAAGGAGA3’(SEQ IDNO:9)
P1与第一步所用的P1相同，P5与编码AnnexinA5第154-157位氨基酸残基的核苷酸序列互补。
将PCR产物P1P5克隆入质粒Puc19进行测序,证明所获得的序列与SEQID NO:1完全相同。
本发明所述的融合基因mAnxA5-MLT的构建方法采用重叠区延伸法连接，详见图1。
本发明中表达质粒pET28a-mAnxA5-MLT的构建，是利用基因工程手段将融合基因mAnxA5-MLT用EcoR I、Sal I双酶切，然后与EcoR I、Sal I双酶切的载体pET-28a（+）连接。酶切结果证实，插入片段在500和750bp之间有一条带，与预期大小（576bp）相符，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明人构建的mAnxA5和蜂毒素融合表达质粒能够在大肠杆菌表达系统中，通过IPTG诱导表达融合蛋白mAnxA5-MLT，融合蛋白序列如SEQ IDNO:4所示。
本发明的第三方面，是提供上述靶向性抗肿瘤融合蛋白、其编码基因以及表达载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的肿瘤为肝癌等。
本发明经实验结果证明，mAnxA5-MLT保留了mAnxA5对磷脂酰丝氨酸特异性结合能力，同时对SMMC7721和HepG2增殖具有显著的抑制作用。
本发明的融合蛋白保留mAnxA5对磷脂酰丝氨酸的特异性结合和蜂毒素对肿瘤细胞的抑制作用，从而可得到一种靶向性抗肿瘤药物。
由于蜂毒肽除能够通过多种细胞通路抑制细胞的增殖和促进细胞的凋亡，除具有抗肿瘤作用外，对人体各大系统都有影响，具有较强的毒副作用：如溶血、呼吸中枢麻痹、心率失常等，而膜联蛋白mAnxA5因其特异性靶向肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞表面的磷脂酰丝氨酸，所以可将蜂毒素靶向性地结合在肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞表面，从而可以大大提高蜂毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，而且降低蜂毒素用药量，减少对正常细胞或组织的损伤，降低副作用，提高疗效和改善病人的生存质量。
本发明采用诱导型表达载体，可降低大规模培养时的成本，以利于规模化生产。由于蜂毒肽只有26个氨基酸，而mAnxA5也仅有19kDa，分子量较小，因此本发明可采用原核表达系统进行表达和纯化，根据需要也可采用酵母表达系统或哺乳动物细胞表达系统。
附图说明
图1为重叠区延伸法构建质粒pET28a-mAnxA5-MLT示意图，
用PCR的方法分别扩增获得mAnxA5SEQ ID NO:1和蜂毒素基因SEQ IDNO:2，然后采用重叠区延伸法连接，获得mAnxA5和蜂毒素的融合基因SEQ IDNO:3，将mAnxA5和蜂毒素的融合基因mAnxA5-MLT通过EcoR I和Sal I位点插入pET-28a（+）载体的多克隆区域，获得表达mAnxA5-MLT融合基因的载体。
图2为质粒pET28a-mAnxA5-MLT酶切电泳图，
其中：泳道1：质粒pET28a-mAnxA5-MLT经EcoR I和Sal I双酶切
泳道2：质粒pET28a-mAnxA5-MLT经EcoR I和Sal I双酶切
泳道3：DNA标记。
图3为融合蛋白mAnxA5-MLT的表达和纯化，
其中：泳道1：诱导前菌体蛋白
泳道2：诱导后菌体蛋白
泳道3：超声上清
泳道4：超声沉淀
泳道5-9：纯化后蛋白
泳道10：蛋白marker。
图4为融合蛋白mAnxA5-MLT具有对磷脂酰丝氨酸特异性结合的能力，
用CCK8的实验方法验证了融合蛋白mAnxA5-MLT在肝癌细胞系SMMC-7721中对增殖的影响，分别用浓度为4mg/L、8mg/L、16mg/L、32mg/L和不加药组（图中用不同形状和颜色的线表示）进行细胞处理，分别在0h、24h、48h和72h进行细胞活性检测。
图5为融合蛋白mAnxA5-MLT能够抑制肝癌细胞系SMMC-7721（A）和HepG2（B）中的增殖，
用CCK8的实验方法验证了融合蛋白mAnxA5-MLT在肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2中对增殖的影响，分别用浓度为4mg/L、8mg/L、16mg/L、32mg/L和不加药组进行细胞处理，分别在0h、24h、48h和72h进行细胞活性检测。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明中所用的含有mAnxA5全长基因的质粒pUC19-mAnxA5构建详见上述发明内容，或参考本申请人已公布的中国专利CN02136158.4，发明名称为“兼抗凝溶栓双重功能的血栓靶向融合蛋白mA5UKB”，申请公布号为CN1401662，mAnxA5基因序列如SEQ ID NO:1所示；
蜂毒素基因参照蜂毒素cDNA序列（该序列可以在基因数据库（Genbank）得到，序列号：NM_001011607），基因序列如SEQ ID NO:2所示；
原核表达质粒pET28a和宿主菌BL21(DE3)购自Novagen公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶、pfu DNA聚合酶、dNTP均购自TaKaRa公司。引物的合成和核苷酸序列测序均由上海Invitrogen完成。纯化用的层析柱及其购自Promoga公司。诱导用IPTG购自Sigma公司。
实施例1 融合基因mAnxA5-MLT的获得
见图1，将编码膜联蛋白mAnxA5的基因和编码蜂毒素的基因分别用PCR方法扩增；然后采用重叠区延伸法连接，得到融合基因pET28a-mAnxA5-MLT。具体步骤如下：
（1）用引物a和引物b扩增mAnxA5基因的全部编码基因。其中引物a为5’GCGGAATTCATGGCCTACTGTCGCTCCCT3’，该引物与annexin B1编码序列的5’端一致，同时引入EcoR I限制性内切酶位点。引物b：5‘TTGAAACTCATCGGCCCTGCA3’。采用高保真pfu DNA聚合酶进行PCR反应，其中dNTP浓度为20μM，Mg2+浓度为1.5mM，变性、退火、延伸的温度分别为94℃、55℃、72℃，时间分别为45s、45s和75s，共进行30个循环。
（2）用引物c和d扩增蜂毒素（MLT）的序列片断。引物c为：5’CTTTGAGTAGCCGGGACGT3’，该引物的5’端与annexin B1的3’端一致及蜂毒素的5’端的序列一致。引物d为：GGCGTCGAC TTA CTG TTG CCT CTT ACGTTT AA。该引物与蜂毒素的3’端序列互补。同时引入Sal I限制性内切酶位点。PCR反应程序同（1），共进行30个循环。
（3）利用重叠区延伸法获得mAnxA1和蜂毒素的融合基因。上述两步PCR反应得到的产物分别利用1.0%琼脂糖电泳分离，然后作凝胶回收。回收后的产物94℃变性5分钟，将两次PCR的产物混合后于50℃退火。因为引物b和c具有重叠的部分，因而退火后可以使mAnxA5基因的单链和MLT的单链配对。添加DNA聚合酶、MgCl2、10×PCR缓冲液、dNTP后，进行PCR扩增。利用这种方法，使两个基因连接成一个融合基因mAnxA5-MLT SEQ IDNO:3。
为保证高保真的扩增，整个PCR程序均采用TaKaRa公司的pfu DNA聚合酶，50μl反应体系，变性、退火、延伸的温度分别为94℃、50℃、72℃，时间分别为45s、45s和90s，共进行30个循环。
实施例2 表达质粒pET28a-mAnxA5-MLT的构建
利用引物a和d对上述方法扩增得到的融合基因mAnxA5-MLT进行测序（SEQ ID NO:3）。经测序正确后，用EcoR I、Sal I双酶切，与EcoR I、Sal I双酶切的载体pET-28a（+）连接。酶切和连接反应的限制性内切酶和T4连接酶均购自TaKaRa公司，反应采用酶说明书所推荐的体系进行。
本发明所利用的诱导型表达载体pET-28a（+）全长5369bp，含有T7启动子和质粒复制起点(ori)。
具体反应过程如下：利用EcoR I、Sal I对上述PCR产物及载体进行双酶切，反应采用高盐（H）缓冲体系，37℃酶切3小时。然后经1.0%琼脂糖电泳分离后，作凝胶回收。酶切片断和载体按照5：1的摩尔比混合，加入相应的连接缓冲溶液和T4连接酶，16℃连接12小时。
实施例3 工程菌的制备
将上述连接后的产物转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，得到工程菌BL21（pET28a-mAnxA5-MLT）。
具体步骤为：先将宿主菌BL21于50ml LB培养基（含1%的胰蛋白胨，0.5%酵母提取物和1%氯化钠，pH7.0）中，37℃振荡培养至OD600为0.4时，在4℃下，以4000rpm的转速离心，收集宿主菌；去除上清后，用1～2ml冰预冷的100mmol/L的氯化钙溶液重悬，即得感受态细菌。将100ng上述构建的质粒与感受态细菌于冰浴中冷却30分钟,42℃热休克90秒，然后再于冰浴中冷却10分钟。加入0.8ml的LB，于37℃培养1小时后，取0.2ml转化产物涂布于LB琼脂平板上，37℃培养12-15小时后，即获得单克隆的含有重组质粒的宿主菌。抽提宿主菌的质粒，用EcoR I、Sal I双酶切能够切出一条576bp的条带（见图2），该宿主菌即为阳性重组子。
含有质粒pET28a-mAnxA5-MLT的大肠杆菌菌株BL21为工程菌BL21（pET28a-mAnxA5-MLT）。
实施例4 融合蛋白mAnxA5-MLT的表达和纯化
工程菌BL21（pET28a-mAnxA5-MLT）通过诱导的方式，可以表达膜联蛋白mAnxA5和蜂毒素的融合蛋白mAnxA5-MLT。蛋白纯化后，10%SDS-PAGE电泳，经考马氏亮蓝染色，显示为单一条带，分子量为21kDa（见图3泳道5-9）。
（1）融合蛋白诱导表达
分别挑取上述工程菌的单菌落至100ml50mg/L的LB培养基中，37℃振摇培养过夜。次日，取100ml菌液接种至50mg/L的1L LB培养基中，继续在37℃振荡培养，至细菌生长到对数期(分光光度计检测，波长为600nm处吸光值为A600=0.4-0.5)时，加入IPTG浓度至0.3mM于25℃振荡培养4～7小时，最终A600可增至1.0左右。在低温诱导条件下，表达蛋白大部分以可溶性蛋白的形式存在。
（3）融合蛋白纯化
将诱导表达后的培养物离心，收集菌体，按每250ml培养物加入STE溶液12ml的比例重悬菌体。为了便于超声，将重悬菌液分装入8个1.5EP管中，4℃、12000rpm离心3min,弃上清，用预冷的STE溶液重悬（1ml/管），加入10ulPMSF（100umol/L）/管，进行超声破碎。超声条件如下：输出功率50%超声10s停30s，超声25分钟后，4℃、12000rpm离心10min，分别取上清及沉淀加入样品缓冲液制备电泳样品，进行SDS-PAGE电泳。
将超声上清按10ul/ml的浓度加入PMSF，上样于预先用10倍柱体积的STE溶液平衡好的GST-resin纯化柱,样品上样完成后，用10倍柱体积的STE溶液洗柱，用5ml洗脱缓冲液（0.01g还原型谷胱甘肽加入5mlSTE溶液）将样品从纯化柱上洗脱，收集的洗脱液为纯化后的融合蛋白。
（4）浓缩蛋白
将纯化好已测定浓度的蛋白从-80℃冰箱取出，置于冰上融化。融化后，倒入浓缩柱子中，配平，3700rpm15min离心弃下层，将上层蛋白取出，以每1ml一个1.5EP管分装。置于-80℃保存。
采用考马斯亮兰染色法（Bradford法）测定纯化蛋白浓度,计算回收率。将所得蛋白冷冻干燥后分装，置-20℃保存。
实施例5 融合蛋白mAnxA5-MLT生物学活性分析
钙磷脂结合实验分析mAnxA5-MLT对磷脂酰丝氨酸（PS）的特异性结合：首先利用薄膜分散法制备脂质体：分别将0.1g磷脂酰丝氨酸（PS，Sigma，P7769）或磷脂酰胆碱（PC，Sigma，P3834）和0.01g胆固醇（Sigma，C8667）于20ml梨形瓶中，加入2ml乙醚使溶解，在晃动下用氮气吹干乙醚，在梨形瓶的壁上有一层脂质薄膜形成，加入1ml含CaCl2的医用生理盐水，不断晃动，充分水化脂质薄膜；水浴超声5min后，即获得PS和PC为主的脂质体。在Ca离子和EGTA存在的条件下，分别将PS和PC的脂质体和大肠杆菌表达的GST－AnxB1MLT融合蛋白温育30min,以低温超速（16000g）离心20min后分别收集上清和沉淀。10%SDS－PAGE分离,考马氏亮蓝染色，观察结果。
结果如图所示，结果GST-AnxB1MLT与PS脂质体孵育后仅在沉淀中检测到；而与PC脂质体孵育后仅能在上清中检测得到（图4），这个结果充分说明，GST－AnxB1MLT融合蛋白保留的AnxB1的钙依赖性磷脂结合活性。
（2）融合蛋白对肝癌细胞的生长抑制活性通过CCK-8试剂盒来检测融合蛋白对肝癌细胞增殖的影响，实验分为3组：实验组（含有细胞的培养基、融合蛋白、CCK-8），对照组（含有细胞的培养基、CCK-8），空白组（不含有细胞的培养基、CCK-8）。将培养的肝癌细胞系smmc7721按2ⅹ103个细胞/孔接种于96孔培养板，每组设置3个复孔，加100ul含10%胎牛血清的DMEM培养基，实验组按如下的浓度加入融合蛋白：0、4、8、16、32mg/L，分别在0h、24h、48h、72h加入CCK-8溶液（5mg/ml）10ul,37℃、5%CO2孵箱中继续培养1.5h。用全自动酶标仪测定每孔的吸光度（D）值，测定波长450nm。以时间为横轴，D值为纵轴描绘细胞生长曲线。
按下列公式计算细胞生长抑制率：抑制率=(1一A实验／A对照)x100％
结果如图5所示，GST－anxB1MLT能显著抑制smmc7721和HepG2细胞的增殖，且随着融合蛋白的浓度增加，抑制效率显著增加，且具有明显的剂量依赖效应。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (10)
1.一种靶向性抗肿瘤融合蛋白，其特征在于，所述的靶向性抗肿瘤融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.一种如权利要求1所述的靶向性抗肿瘤融合蛋白的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.一种如权利要求1所述的靶向性抗肿瘤融合蛋白的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，该表达载体为含有如SEQID NO:3所示核苷酸序列的重组载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为原核表达载体pET28a。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，该表达载体的构建方法如下：
A、基因突变体mAnxA5的构建
第一步：进行点突变，将AnnexinA5基因第二结构域中“V-G-D”序列突变为“R-G-D”序列
将缬氨酸突变为精氨酸采用重叠区基因扩增法，共需合成四条引物，分别为：
P1:5’GC CCATGGATGGCACAGGTTCTCAG3’(SEQ ID NO:5)
P2:5’GTCCCCACGCACCACGTCATCTTC3’(SEQ ID NO:6)
P3:5’GTGCGTGGGGACACTTCAGGGTAC3’(SEQ ID NO:7)
P4:5’TTACAGTAGAAGAGGTGTCGACGC3’(SEQ ID NO:8)
其中：
P1与AnnexinA5基因的5’端相一致，并引入Nco I酶切位点CCATGG；
P2含有精氨酸密码子的互补核苷酸序列ACG；
以含有AnnexinA5基因的质粒pUC119-AnxA5为模板，P1,P2为引物扩增，得到的序列称为P1P2；
P3含有精氨酸密码子序列CGT；
P4同AnnexinA5的3’末端互补，以含有AnnexinA5基因的质粒pUC119-AnxA5为模板，P3,P4为引物扩增，得到的序列称为P3P4；
引物P2,P3具有一段互补的序列，所以P1P2和P3P4的序列中也存在这一互补序列，将P1P2和P3P4变性后退火，可以在这段互补区形成双链；提供PCR反应条件，P1P2和P3P4可以互为引物进行扩增，扩增后的产物为P1P4；通过这种方法，将AnnexinA5第二结构域中“V-G-D”序列突变为“R-G-D”序列；
第二步：PCR扩增P1P4序列中的第一、二结构域，得到突变体基因mAnxA5
以P1P4为模板，以P1,P5为引物进行PCR扩增，得到的产物即突变体基因mAnxA5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
P1:5’GCCCATGGATGGCACAGGTTCTCAG3’(SEQ ID NO:5)
P5:5’ACCGCCACCGGATCCGCCACTACCCTGAAGGAGA3’(SEQ IDNO:9)
P1与第一步所用的P1相同，P5与编码AnnexinA5第154-157位氨基酸残基的核苷酸序列互补；
将PCR产物P1P5克隆入质粒Puc19进行测序,证明所获得的序列与SEQID NO:1完全相同；
B、融合基因mAnxA5-MLT的构建方法采用重叠区延伸法连接，MLT的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
C、表达质粒pET28a-mAnxA5-MLT的构建
利用基因工程手段将融合基因mAnxA5-MLT用EcoR I、Sal I双酶切，然后与EcoR I、Sal I双酶切的载体pET-28a（+）连接，酶切结果证实，插入片段在500和750bp之间有一条带，与预期大小相符，核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。
7.一种如权利要求1所述的靶向性抗肿瘤融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.一种如权利要求2所述的编码基因在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.一种如权利要求3、4、5或6所述的表达载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.一种如权利要求7所述的靶向性抗肿瘤融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肝癌。
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