CN113238056A - 检测囊型包虫病方法 - Google Patents
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Abstract
本申请实施例提供一种检测囊型包虫病方法，将经原核表达系统重组诱导并体外纯化的Ag5抗原包被于ELISA酶标板；将受检者血清按比例进行稀释，与已知的阴、阳性血清加入酶标板的板孔中进行反应；测得各板孔的OD450值，根据公示计算各板孔的样品值。经过临床血清样本的检测，检测的特异性和敏感性均高于商品化试剂盒，并且有效的排除假阳性结果的发生。本申请所建立的间接ELISA方法为包虫病的血清学诊断提供了更准确，有效的检测手段。
Description
技术领域
本申请涉及医学检测技术领域，具体涉及一种检测囊型包虫病方法。
背景技术
棘球蚴病(Cystic echinococcosis,CE)，也称囊型包虫病，是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)幼虫棘球蚴所致的一种人畜共患寄生虫病。患者被感染后，会有几年无症状的潜伏期，由于囊肿的扩散以及定位，会出现不同类型的症状，如：疼痛，黄疸，呕吐胆汁，胸痛以及轻度瘫痪。最新的流行病学研究表明，中亚地区至少有2.7亿人(占人口总数的58％)感染棘球蚴病，每年可造成1.94亿美元直接或间接经济损失。保守估计，全球由于棘球蚴病导致的最低伤残调整寿命年(Health-adjusted lifeexpectancy，HALE)约为28.5年，造成的危害尤为广泛和严。我国的西北地区是该病的重灾区，而这些高原边防地区驻扎着大量部队官兵，属于高风险人群，一旦感染，存在群体性感染的风险，严重影响部队战斗力。因此，加强对棘球蚴病的防控具有重要的现实意义。
对棘球蚴病进行准确诊断是防止该病蔓延的首要措施，常见的诊断方法主要有影像学方法及血清学方法。虽然影像学检测能够对该病进行正确诊断及感染部位的准确定位，但该方法受限于特定仪器难以实现大规模筛查。相对而言，血清学检测具有结果可靠，操作简便，价格低廉等特点，广泛应用于棘球蚴病的筛查和诊断。其中，间接法酶联免疫吸附试验(iELISA)利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过检测外周血中抗棘球绦虫的抗体IgG水平，从而对受检者的感染状态进行可靠的判断。但是，目前商品化试剂盒所采用的包被抗原一般是提取来自棘球绦虫感染部位的包囊液，很难做到检测的标准化。该方法缺乏较高的特异性和灵敏性，同时也增加了假阳性结果的可能性(例如和其他寄生虫的交叉反应)，在实际检测当中往往会出现漏检、错检的结果。
发明内容
本申请实施例提供一种检测囊型包虫病方法，能够降低错检的概率。
本申请实施例的第一方面提供了一种检测囊型包虫病方法，所述方法包括：
合成表达Ag5蛋白的核苷酸序，构建重组蛋白表达载体；
将重组Ag5表达质粒转化至宿主细菌细胞，以得到重组蛋白表达菌株；
在适于表达所需蛋白质的条件下纯化及复性重组蛋白Ag5；
将Ag5抗原按100ng/ml包被于酶标板孔中，37℃恒温孵育后进行封闭处理，得到Ag5抗原包被的酶标板；
将受检者血清按比例进行稀释，与已知的阴、阳性血清加入所述酶标板的板孔中，在37℃条件下孵育后，进行洗涤，向各板孔中分别加入抗人IgG酶标抗体，孵育洗涤后，进行显色反应；
测得所述酶标板中的每个板孔中的OD450读值；
根据所述OD450读值，确定所述每个板孔中的样品值；
根据所述样品值进行阳性判别，得到判别结果。
结合第一方面，在一个可能的实现方式中，所述根据所述样品值进行阳性判别，得到判别结果，包括：
将所述样品值大于预设临界值，确定为阳性，所述预设临界值包括0.285。
结合第一方面，在一个可能的实现方式中，所述将受检者血清按比例进行稀释，包括：
按100μl/孔加入按1:200比例对受检者徐青进行稀释。
实施本申请实施例，至少具有如下有益效果：
合成表达Ag5蛋白的核苷酸序，构建重组蛋白表达载体；将重组Ag5表达质粒转化至宿主细菌细胞，以得到重组蛋白表达菌株；在适于表达所需蛋白质的条件下纯化及复性重组蛋白Ag5；将Ag5抗原按100ng/ml包被于酶标板孔中，37℃恒温孵育后进行封闭处理，得到Ag5抗原包被的酶标板；将受检者血清按比例进行稀释，与已知的阴、阳性血清加入所述酶标板的板孔中，在37℃条件下孵育后，进行洗涤，向各板孔中分别加入抗人IgG酶标抗体，孵育洗涤后，进行显色反应；测得所述酶标板中的每个板孔中的OD450读值；根据所述OD450读值，确定所述每个板孔中的样品值；根据所述样品值进行阳性判别，得到判别结果，从而可以准确的进行包虫病的检测，提升检测的正确率。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供了一种Ag5抗原诱导表达图；
图2为本申请实施例提供了一种检测结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。此外，术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其他步骤或单元。
在本申请中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本申请所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
本申请实施例提供的一种检测囊型包虫病方法，该方法具体包括：
合成表达Ag5蛋白的核苷酸序，构建重组蛋白表达载体；
将重组Ag5表达质粒转化至宿主细菌细胞，以得到重组蛋白表达菌株；
在适于表达所需蛋白质的条件下纯化及复性重组蛋白Ag5；
将Ag5抗原按100ng/ml包被于酶标板孔中，37℃恒温孵育后进行封闭处理，得到Ag5抗原包被的酶标板；
将受检者血清按比例进行稀释，与已知的阴、阳性血清加入所述酶标板的板孔中，在37℃条件下孵育后，进行洗涤，向各板孔中分别加入抗人IgG酶标抗体，孵育洗涤后，进行显色反应；
测得所述酶标板中的每个板孔中的OD450读值；
根据所述OD450读值，确定所述每个板孔中的样品值；
根据所述样品值进行阳性判别，得到判别结果。
在一个可能的实现方式中，所述根据所述样品值进行阳性判别，得到判别结果，包括：
将所述样品值大于预设临界值，确定为阳性，所述预设临界值包括0.285。
在一个可能的实现方式中，所述将受检者血清按比例进行稀释，包括：
按100μl/孔加入按1:200比例对受检者徐青进行稀释。
在一个可能的实现方式中，检测方法具体可以为：
A1、合成表达Ag5蛋白的核苷酸序，构建重组蛋白表达载体PET28a；
A2、将得到的重组Ag5表达质粒转化于宿主细菌细胞，得到重组蛋白表达菌株PET28a-Ag5；在适于表达所需蛋白质的条件下纯化及复性重组蛋白Ag5；
A3、将Ag5抗原按100ng/ml包被于酶标板孔中，37℃恒温孵育后进行封闭处理；将受检者血清按比例进行稀释，与已知的阴、阳性血清加入酶标板的板孔中，37℃水浴后，进行洗涤，再向各板孔中分别加入抗人IgG酶标抗体，孵育洗涤后，进行显色反应；
A4、测得各个孔板中的OD450读值；
A5、由公式样品值＝(OD450受检者-OD450阴性对照)/OD450阳性对照-OD450阴性对照分别计算各个孔板中的样品值；
A6、判定待检血清样品:样品值≥0.285，则判定受检血清样品为阳性。
为了提高本申请方法的检测准确性，分别对Ag5抗原包被量，抗体工作浓度，待检血清稀释浓度，最佳孵育时间和温度等多个方面进行优化和改良，最终实现该方法的规范化操作。具体为：将Ag5抗原按100ng/ml用pH＝9.6的碳酸盐包被缓冲液充分溶解，100μl/每孔包被于酶标板，37℃水浴恒温孵育2小时；用洗涤缓冲液PBST(含0.05％Tween-20的PBS，pH7.2)洗涤酶标板2次，每次约1min，甩净洗涤液，用吸水纸拍干后，每孔加入含有5％BSA的PBST，37℃恒温封闭2小时。接着利用PBST缓冲液进行洗涤，按100μl/孔加入按1:200稀释后的待检血清，室温微振荡片刻，37℃孵育1小时；其中阳性对照血清购自NIBSC的标准化血清，阴性对照血清为健康者血清；利用PBST缓冲液进行洗涤，100ul/孔加入按1:10000稀释的HRP标记的抗人抗体，37℃恒温孵育30分钟。孵育完成后用洗涤缓冲液PBST洗涤酶标板不少于4次，100μl/孔加入TMB底物显色液，室温作用10min；最后加入50ul/孔终止液(2M浓硫酸)，用酶标仪测定波长OD450nm读值。
另外，本申请方法中所包被的Ag5抗原是利用基因工程技术构建体外表达系统并纯化获得，构建的重组表达质粒均在原核表达系统－大肠杆菌中诱导表达；重组蛋白均以可溶形式表达，纯化后的纯度大于80％。与传统所用的粗提包囊液中的蛋白质复合物相比较，更加保证了有效性；其中包被过程中，各条件的选择都采用控制单一变量原则经实验分析得出，保证了最佳反应性。为了确定该发明方法的稳定性，分别进行了批间重复实验和批内重复实验，结果显示变异系数均小于5％，证明该方法具有良好的可重复性。
利用ROC分析得出的最佳临界值PI＝0.285，此时特异性为95.2％，敏感度为93.7％，AUC(Area under curve)为0.987(±0.0091)。经分析，本方法的约登指数(Youdenindex)为0.897，在45份健康者的血清中均未检测到特异性抗体IgG的产生，表明本方法具有真实可靠的检测率。
本申请建立的间接ELISA方法通过检测共计检测45份健康者血清样品以及127份患者血清样品。其中，患者经过影像学方法诊断分为51位潜伏期和76位过渡期-活跃期，包括肝脏等在内的多组织器官的棘球绦虫感染，分批采集外周血，1000rpm离心10分钟，分离血清并妥善冻存。本申请所建立的间接ELISA方法与商品化试剂盒(来自IBLinternational公司)分别对健康者和患者的血清样品进行平行检测，结果来看，本申请方法真实检出率平均为91.7％，而商品化试剂盒真实检出率平均为84.5％。并且，值得注意的是，对于健康者的诊断，商品化试剂盒出现2例假阳性，而本申请方法未检出假阳性。发明所建立的间接ELISA方法具有更高的符合率，其意义在于本方法对棘球蚴病(包虫病)的血清学检测特异性和敏感性更好，防控能力更强。
在另一个可能的实现方式中，检测方法包括：
B1、体外表达纯化Ag5抗原。Ag5抗原属于该病原体的优势抗原，在感染的包囊液中能明显检测到该抗原的富集。首先合成表达Ag5蛋白的核苷酸序，构建重组蛋白表达载体PET28a；接着，将得到的重组Ag5表达质粒转化于宿主细菌细胞，得到重组蛋白表达菌株PET28a-Ag5；在适于表达所需蛋白质的条件下纯化及复性重组蛋白Ag5；图1为Ag5抗原诱导表达图。其中包括Ag5蛋白的对照，诱导后上清和沉淀中的Ag5蛋白含量以及纯化后的蛋白SDS-PAGE图。
B2、制备Ag5抗原包被ELISA酶标板。将Ag5抗原按100ng/ml用pH＝9.6的碳酸盐包被缓冲液充分溶解，100μl/每孔包被于酶标板，37℃水浴恒温孵育2小时；弃去酶标板中的液体后，用洗涤缓冲液PBST(含0.05％Tween-20的PBS，pH7.2)洗涤酶标板2次，每次约1min，甩净洗涤液，用吸水纸拍干后，按100μl/每孔加入含有5％BSA的PBST，封闭后于37℃恒温孵育；2小时后弃去封闭液，再用PBST洗涤2次，即得包被Ag5抗原的ELISA酶标板。
B3、待检者血清的采集。本申请方法共计检测45份健康者血清样品以及127份患者血清样品。其中，经过影像学方法已诊断为51位潜伏期和76位过渡期-活跃期，包括肝脏等在内的多组织器官的棘球绦虫感染。将健康者和患者分批采集外周血，1000rpm离心10分钟，分离血清并冻存于-80℃。
B4、检测试验。以PBST为稀释液，将待检血清按1:200进行稀释；同样的，以PBST为稀释液，将阴阳性血清作同等比例稀释，其中阳性对照血清购自NIBSC的标准化血清，阴性对照血清为健康者血清。按100μl/孔加入到已包被好的酶标板中，室温微振荡片刻，在37℃进行孵育。1小时后，利用PBST缓冲液进行洗涤，100ul/孔加入按1:10000稀释的HRP标记的抗人抗体，在37℃进行孵育30分钟。孵育后用PBST洗涤酶标板，接着100μl/孔加入TMB底物显色液，室温作用10min；最后加入50ul/孔终止液(2M浓硫酸)终止反应，用酶标仪测定波长OD450nm读值。由公式样品值＝(OD450受检者-OD450阴性对照)/OD450阳性对照-OD450阴性对照分别计算各个孔板中的样品值。
B5、诊断分析。利用ROC分析得出的最佳临界值PI＝0.285，此时特异性为95.2％，敏感度为93.7％，AUC为0.987(±0.0091)，表明本方法具有真实可靠的检测率。经分析，当样品值≥0.285，则判定受检血清样品为阳性，反之为阴性。图2提供了一种检测结果示意图。
Claims (3)
1.一种检测囊型包虫病方法，其特征在于，所述方法包括：
合成表达Ag5蛋白的核苷酸序，构建重组蛋白表达载体；
将重组Ag5表达质粒转化至宿主细菌细胞，以得到重组蛋白表达菌株；
在适于表达所需蛋白质的条件下纯化及复性重组蛋白Ag5；
将Ag5抗原按100ng/ml包被于酶标板孔中，37℃恒温孵育后进行封闭处理，得到Ag5抗原包被的酶标板；
将受检者血清按比例进行稀释，与已知的阴、阳性血清加入所述酶标板的板孔中，在37℃条件下孵育后，进行洗涤，向各板孔中分别加入抗人IgG酶标抗体，孵育洗涤后，进行显色反应；
测得所述酶标板中的每个板孔中的OD450读值；
根据所述OD450读值，确定所述每个板孔中的样品值；
根据所述样品值进行阳性判别，得到判别结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述根据所述样品值进行阳性判别，得到判别结果，包括：
将所述样品值大于预设临界值，确定为阳性，所述预设临界值包括0.285。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述将受检者血清按比例进行稀释，包括：
按100μl/孔加入按1:200比例对受检者徐青进行稀释。
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