CN114088937A - 基于化学发光免疫分析技术的检测包虫病抗体的试剂盒及其制备方法、使用方法 - Google Patents
基于化学发光免疫分析技术的检测包虫病抗体的试剂盒及其制备方法、使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114088937A CN114088937A CN202111289647.7A CN202111289647A CN114088937A CN 114088937 A CN114088937 A CN 114088937A CN 202111289647 A CN202111289647 A CN 202111289647A CN 114088937 A CN114088937 A CN 114088937A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- buffer
- solution
- luminescent
- sample
- preservative
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/43504—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates
- G01N2333/43526—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates from worms
- G01N2333/43539—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates from worms from cestodes
- G01N2333/43543—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates from worms from cestodes from Taenia
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了基于化学发光免疫分析技术用于检测包虫病抗体的试剂盒及其制备方法、使用方法，属于免疫诊断技术领域。所述试剂盒包括包虫特异性抗原包被的化学发光微孔板；所述包虫特异性抗原包括天然提取纯化的包虫囊液抗原和包虫重组抗原中的至少一种。本发明试剂盒结合了化学发光测定技术的高灵敏性及免疫反应的高特异性，具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、方法稳定快速、操作简单、检测通量高等优点。
Description
技术领域
本发明属于免疫诊断技术领域，具体涉及基于化学发光免疫分析技术的检测包虫病抗体的试剂盒及其制备方法、使用方法。
背景技术
包虫病是一种人畜(兽)共患的慢性寄生虫病，是由棘球属绦虫的幼虫所引起的，全世界几乎所有的国家都有人感染细粒棘球蚴的病例报告，全球所有的牧区都是此病的流行病区，我国的流行区主是新疆、西藏、青海、甘肃、内蒙、宁夏和四川等中西部地区，流行区占国土面积近44％，受威胁人口数约5000多万。
棘球绦虫属扁形动物门，绦虫纲，圆叶目带绦虫科，棘球属。能够引起包虫病的虫种主要有4种，分别是细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、少节棘球绦虫和福氏棘球绦虫，其形态、宿主和分布地区略有不同。少节棘球绦虫和福氏棘球绦虫主要分布在中美洲和南美洲，我国主要为细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，Eg)和多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularus，Em)这两种寄生虫，分别导致囊型包虫病和泡型包虫病。其中以囊型包虫病较为常见，还有部分患者情况较为复杂，综合感染了两种包虫病，属囊泡型包虫病。泡型包虫病分布区域虽然相对较窄，但其引起的病症要严重的多，致死率与癌症相当，甚至被称为“虫癌”。
棘球蚴或称为包虫即为棘球绦虫幼虫，它是一种圆形囊状体，直径可由不足1厘米至数十厘米。囊内充满着棘球蚴液，具有很强的抗原性。棘球蚴囊内长出许多原头蚴和生发囊(育囊)，生发囊又可以向内再长出许多原头蚴，或进一步发育成为与母囊一样的子囊，子囊还可长出孙囊。一个直径10cm的棘球蚴含有原头蚴数量达10万个，每个原头蚴进入终宿主体内都可发育成一条成虫。人体几乎所有器官都可能成为包虫幼虫的温床，其中尤以肝为主，肝包虫占包虫病的七成左右，另外还有肺包虫病、脑包虫病、骨包虫病等。
棘球绦虫必须要依赖两种哺乳动物宿主才能完成其生活史。犬是最主要的终宿主，狼、豺和狐等野生食肉动物亦可为其终宿主；中间宿主主要是羊、牛、马等偶蹄类家畜动物，也可感染野生食草动物、袋鼠和啮齿类动物。人虽然是棘球绦虫的良好中间宿主，但通常仅仅是受害者，并不参与其生活史的循环。棘球绦虫生活史如图1所示。
当人误食或吸入棘球绦虫的虫卵后，虫卵在人体内发育成为包虫，可引起人体多个组织受损，导致囊型或泡型包虫病。包虫病可致使人精神萎靡，食欲不振，身体消瘦、乏力，寿命减短，严重可致使死亡。牲畜等被绦虫感染后可导致生长缓慢、消瘦、丧失繁殖能力等，致使农牧区经济效益受损严重。
包虫的原头蚴、生发囊及囊液中均含有大量包虫特异性抗原，尤其是囊液具有强免疫原性，可引发机体的免疫应答，产生包虫的抗体。检测包虫抗体可有效监测和评价包虫病的感染情况。
目前对于包虫病的诊断方法主要以影像学诊断和血清学诊断为主，其中影像学方法无法做到早期诊断。免疫学检测是血清学诊断的主要手段之一，对于一些非典型影像病例具有很高的应用价值，同时免疫学检测对包虫病的初筛、两型包虫病(囊型、泡型)的早期诊断和流行病学调查都具有现实意义，早期介入并及时对症治疗对于包虫病患者的康复和预后有重要的意义。
化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay,CLIA)技术，该技术结合了化学发光测定技术的高灵敏性及免疫反应的高特异性，可应用于各种抗原、半抗原、抗体等的检测。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。主要具有灵敏度高、特异性强、检测范围宽、试剂价格低廉、方法稳定快速、操作简单、自动化程度高等优点。目前已发展成为一种成熟的、先进的超微量物质检测技术，成为国内外体外诊断行业优先选择的检测方法。
目前已获得产品注册证的检测包虫病抗体试剂仅有4个，其中有3个为试纸条快速检测方法，1个为ELISA检测方法，还没有化学发光检测方法检测包虫病抗体的相关试剂产品。试剂条快速检测方法在检测单个样本上虽然可以实现快速检测的目的，但该方法灵敏度相对较低且需要人肉眼去观察判定，增加了检测结果的不确定性；同时此方法不适宜高通量检测，包括包虫病的流行性调查和包虫病的筛查。ELISA检测方法可实现高通量的检测，但灵敏度和特异性等方面仍不能达到令人满意的程度，且容易受到样本中复杂成分的影响，致使背景升高，影响检测结果的判定。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种基于化学发光免疫分析技术用于包虫病抗体检测的试剂盒。该检测试剂盒灵敏度高，特异性强，稳定性好，检测通量高，快速便捷。
本发明的检测试剂盒的检测原理：
本发明采用间接法为基础的化学发光免疫分析方法对包虫病抗体可实现定性检测。本发明将包虫特异性抗原通过静电作用和疏水相互作用包被于化学发光微孔板中，样本中的人包虫抗体可与包被于发光微孔板上的包虫抗原特异性结合，再加入酶结合物(主要成分为HRP标记的抗人IgG)，在化学发光板表面形成了“包虫抗原---包虫抗体---HRP-抗人IgG”的免疫复合物。清洗除去未结合的反应物质，加入发光底物液，HRP(即辣根过氧化物酶)催化过氧化物产生氢氧根自由基，与底物液中的鲁米诺反应将其转变为一种激发态中间体，该中间体不稳定，当其返回至基态时电子从高能级跃迁至低能级，同时释放能量(表现为光子形式)，所释放的光子与样本中包虫抗体成正相关，通过检测光子信号，确定样本中包虫抗体的量。
本发明的第一方面在于公开一种基于化学发光免疫分析技术用于检测包虫病抗体的试剂盒，包括包虫特异性抗原包被的化学发光微孔板；所述包虫特异性抗原包括天然提取纯化的包虫囊液抗原和包虫重组抗原中的至少一种；
优选地，所述天然抗原提取自牧区被棘球绦虫感染的牛或羊的肝或肺包虫囊液；进一步优所述牧区为新疆、西藏、四川；
优选地，所述包虫重组抗原为大肠杆菌原核表达系统所表达的重组抗原，进一步优选包括细粒棘球绦虫抗原和多房棘球绦虫抗原中的至少一种；更进一步优选地，所述的细粒棘球绦虫表达抗原上下游引物序列分别为：
上游引物：5’-TGGCTCATGCTGATGATGATG-3’
下游引物：5’-AACTTTCTGACATACTCCTTC-3’
所述的多房棘球绦虫表达抗原上下游引物序列分别为：
上游引物：5’-CCGGAATTCAAGGAGTCTGACTTAGCGGAT-3’
下游引物：5’-CCGCTCGAGTTTAGGTTGGCCAGCTTCG-3’；
优选地，所述包虫特异性抗原包括质量比1：1：1的天然提取抗原、细粒棘球绦虫重组表达抗原和多房棘球绦虫重组表达抗原。天然提取抗原、细粒棘球绦虫重组表达抗原和多房棘球绦虫重组表达抗原的质量单位可以为ug。
与采用单独的天然提取抗原、细粒棘球绦虫重组表达抗原和多房棘球绦虫重组表达抗原相比，采用质量比1：1：1的天然提取抗原、细粒棘球绦虫重组表达抗原和多房棘球绦虫重组表达抗原的试剂盒灵敏度更高，特异性更强。既可以检测囊型包虫病，同时也可检测泡型包虫病，是具备两型包虫病同时检出的能力，可满足我国包虫病高发区实际检测的需求。
在本发明的一些优选的实施方式中，还包括所述酶结合物；
优选地，所述酶结合物包括HRP-抗人IgG。
HRP即为辣根过氧化物酶。
在本发明的一些优选的实施方式中，还包括校准品、阴性对照品、阳性对照品、发光底物液和样本稀释液；
优选地，所述校准品包由人抗包虫IgG按照0.01-5μg/mL浓度稀释至含防腐剂的缓冲液中；
优选地，所述阴性对照品为含防腐剂的缓冲液；
优选地，所述阳性对照品为含包虫抗体的抗血清和加入防腐剂的缓冲液配制而成；
优选地，所述发光底物液包括发光底物液A液和发光底物液B液。其中发光液底物液A液为包含发光剂和发光增强剂的缓冲液；发光液底物液B液为包含过氧化物的缓冲液；
优选地，所述样本稀释液为含血清的缓冲液。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述包虫特异性抗原包被的化学发光微孔板的制备原料包括化学发光微孔板、包虫特异性抗原、包被缓冲液、包被保护剂和封闭缓冲液；
优选地，所述化学发光微孔板为硬质材料，材质为白色不透明，不可变形，进一步优选材质为聚苯乙烯和脲醛树脂中的一种；
优选地，所述化学发光微孔板布局有96个微孔，由12个微孔板条和发光板基座组成；每个微孔板条包含8个微孔，12个微孔板条竖列于发光板基座拼装而成一个完整的化学发光微孔板，每个板条可单独拆分组装于发光板基座中；
优选地，所述化学发光微孔内表面经过喷镀利于结合蛋白质的特殊材料或是加载电荷处理，或是二者结合处理；
优选地，所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和HEPES缓冲液中的至少一种，进一步优选所述包被缓冲液的浓度为0.01-0.05mol/L和所述包被缓冲液的pH为7.0-9.6，更进一步优选为0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液；
优选地，所述包被保护剂为葡萄糖、海藻糖和蔗糖中的至少一种；
优选地，所述封闭缓冲液包括封闭剂和封闭液缓冲体系，所述封闭剂为牛血清白蛋白、小牛血清、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和吐温-20中的至少一种，所述封闭液缓冲体系为磷酸盐缓冲液，进一步优选为0.02M，pH值为7.2-7.4的磷酸盐缓冲液。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述酶结合物包括下述浓度的组分：
优选地，所述HRP-抗人IgG由HRP通过改进的高碘酸盐氧化法与抗人IgG进行共价偶联所得；进一步优选所述HRP为从辣根中提取的辣根过氧化物酶，酶活为50-250units/mg，吸光度比值为RZ 2.5-4.0，和所述抗人IgG为鼠抗人IgG、兔抗人IgG和羊抗人IgG中的至少一种；
优选地，所述稳定剂为牛血清白蛋白、小牛血清、酪蛋白、甘油、酶稳定剂和吐温-20中的至少一种；
优选地，所述防腐剂为ProClin300、叠氮钠和KY-100生物防腐剂中的至少一种；
优选地，所述缓冲液pH为7.0-9.0，所述缓冲液为碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和HEPES缓冲液中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，
所述校准品包括下述浓度的组分：
人抗包虫IgG 0.01-5μg/mL
防腐剂 0.01-0.5w/v％
缓冲液 0.01-0.5mol/L；
优选地，所述人抗包虫IgG为从收集的包虫病患者抗血清中提取所得，纯度为80％-95％；
优选地，所述防腐剂为ProClin300、叠氮钠和KY-100生物防腐剂中的至少一种；
优选地，所述缓冲液pH为6.5-8.0，所述缓冲液为小牛血清缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和HEPES缓冲液中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述阴性对照品包括下述浓度的组分：
防腐剂 0.01-0.5w/v％
缓冲液 0.01-0.5mol/L；
优选地，所述防腐剂为ProClin300、叠氮钠和KY-100生物防腐剂中的至少一种；
优选地，所述缓冲液pH为7.0-8.5，所述缓冲液为基质血清缓冲液、小牛血清缓冲液、马血清缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述阳性对照品包括下述浓度的组分：
包虫病抗体 S/CO>10
防腐剂 0.01-0.5w/v％
缓冲液 0.01-0.5mol/L；
优选地，所述包虫病抗体为收集的包虫病患者抗血清配制而成，抗血清为包虫抗体检测阳性的样本；
优选地，所述防腐剂为ProClin300、叠氮钠和KY-100生物防腐剂中的至少一种；
优选地，所述缓冲液pH为7.0-8.5，所述缓冲液为基质血清缓冲液、小牛血清缓冲液、马血清缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述发光底物液包括下述浓度的组分：
优选地，所述发光剂为鲁米诺、异鲁米诺和鲁米诺衍生物中的至少一种；
优选地，所述过氧化物为过氧化氢、过氧化脲和过氧化苯甲酸中的至少一种；
优选地，所述发光增强剂为对苯二酚、邻苯二酚、4-咪唑苯酚、3,5-二叔丁基水杨酸和四苯硼钠中的至少一种；
优选地，所述缓冲液pH值为5.5-9.5，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和Tris缓冲液中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述样本稀释液包括下述浓度的组分：
血清 10-50v/v％
缓冲液 0.01-0.5mol/L；
优选地，所述血清为基质血清、牛血清和马血清中的至少一种；
优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和HEPES缓冲液中的字少一种，pH值为7.0-7.5。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述包被缓冲液为0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液。
本发明的第二方面在于公开第一方面所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S01，包虫特异性抗原包被的化学发光微孔板的制备；
S02，酶结合物的制备；
S03，校准品的配制；
S04，阴性对照品的配制；
S05，阳性对照品的配制；
S06，发光底物液的配制；
S07，样本稀释液的配制；
优选地，所述包虫特异性抗原包被的化学发光微孔板的制备，包括以下步骤：
(1)将天然提取的包虫抗原和大肠杆菌重组表达的两种抗原，加入到包被缓冲液中；
(2)将步骤(1)中所配制好的抗原包被溶液，加入至化学发光微孔板的微孔内，在微孔上盖上盖板膜，反应；
(3)取出步骤(2)包被完成后的化学发光微孔板，将微孔板内的液体快速倾倒出，微孔板倒扣在吸水纸或吸水布上用力将微孔残余液体拍干，加入清洗液，静置或震动，再次将微孔板内液体倾倒后拍干，如此3-5次；
(4)向步骤(3)最后拍干后的微孔板内加入包被封闭液，包被封闭液中加入包被保护剂；将包被封闭液加入微孔中，封闭；
(5)取出步骤(4)封闭完成后的化学发光微孔板，将微孔板内的液体快速倾倒出，微孔板倒扣在吸水纸或吸水布上用力将微孔残余液体拍干。将拍干后的微孔板干燥；
(6)取出步骤(5)干燥以正常视力观察微孔板上所有微孔内已无液体残留后，将干燥剂和封闭完成后的化学发光微孔板一同放入铝箔袋中，干燥剂放在微孔板面的反面，抽真空封装，储存；
优选地，所述酶结合物的制备包括以下步骤：
(1)准确称取辣根过氧化物酶，磷酸盐缓冲液溶解成酶溶液，应用高碘酸盐氧化法进行活化；
(2)取与步骤(1)辣根过氧化物酶等量的鼠抗人IgG，与已活化的辣根过氧化物酶混合，反应；
(3)将步骤(2)反应结束后的混合物采用饱和硫酸铵沉淀法沉淀，去除未结合的辣根过氧化物酶，再将沉淀使用磷酸盐缓冲液复溶后充分透析，完成纯化；
(4)将步骤(3)纯化完成后回收的HRP-鼠抗人IgG，加入至缓冲液中，同时将防腐剂与稳定剂一并加入，配制成酶结合物；
(5)根据每个试剂盒的使用量，分装，储存；
优选地，所述校准品的配制包括以下步骤：
(1)所述的校准品包括2个校准品，校准品1CaL1和校准品2CaL2；
(2)上述(1)中的描述的校准品1，使用含防腐剂的缓冲液配制而成，分装，储存；
(3)上述(2)中描述的校准品2，将纯化后的人抗包虫IgG，使用含防腐剂的缓冲液，配制成浓度为的校准品2，分装，储存；
优选地，所述阴性对照品的配制包括以下步骤：
(1)使用含防腐剂的缓冲液配制而成，分装，储存；
优选地，所述阳性对照品的配制包括以下步骤：
(1)将S/CO>10的抗包虫病抗体，使用含防腐剂的缓冲液，配制成S/CO>1的阳性对照品，分装，储存；
S/CO，其中S即为样本检测的相对发光强度值，CO即为cut-off值的缩写，cut-off即为截断值，是作为判定待检样本阴/阳性的决定值，使用包虫病抗体检测试剂盒检测大量临床样本后分析得出的结果；
优选地，所述发光底物液的配制包括以下步骤：
(1)所述发光底物液包括2个底物溶液，发光底物液A和发光底物液B；
(2)上述(1)中描述的发光底物液A，分别称取发光剂和发光增强剂，使用二甲基亚砜溶解，再加入到碱性缓冲液中配制成发光底物A溶液；
(3)上述(1)中描述的发光底物液B，向缓冲液中加入过氧化物，配制成发光底物液；
优选地，所述样本稀释液的配制包括以下步骤：
(1)将血清与等体积缓冲液混合，分装，储存。
在本发明的一些优选的实施方式中，包括以下步骤：
S01，包虫特异性抗原包被的化学发光微孔板的制备；
S02，酶结合物的制备；
S03，校准品的配制；
S04，阴性对照品的配制；
S05，阳性对照品的配制；
S06，发光底物液的配制；
S07，样本稀释液的配制；
优选地，所述包虫特异性抗原包被的化学发光微孔板的制备，包括以下步骤：
(1)将天然提取的包虫抗原和大肠杆菌重组表达的两种抗原，按照1：1：1的使用比例加入到包被缓冲液中充分混匀，最终所配制的包被抗原总浓度在1.0-5.0μg/mL之间；
(2)将步骤(1)中所配制好的抗原包被溶液，按照50-150μL/孔的加样量，使用多道移液器加入至化学发光微孔板的微孔内，在微孔上盖上盖板膜，置于2-8℃中包被反应18-24h；
(3)取出步骤(2)包被完成后的化学发光微孔板，将微孔板内的液体快速倾倒出，微孔板倒扣在吸水纸或吸水布上用力将微孔残余液体拍干，按照200-300μL/孔加入PBST清洗液，静置或震动1-3min，再次将微孔板内液体倾倒后拍干，如此3-5次；
(4)向步骤(3)最后拍干后的微孔板内加入包被封闭液，包被封闭液中加入包被保护剂，使其终浓度为5-10mg/mL。将包被封闭液按照200-300μL/孔的量加入微孔中，置于37℃中封闭2-4h或于2-8℃中封闭18-24h；
(5)取出步骤(4)封闭完成后的化学发光微孔板，将微孔板内的液体快速倾倒出，微孔板倒扣在吸水纸或吸水布上用力将微孔残余液体拍干。将拍干后的微孔板置于干燥间干燥10-15h；
(6)取出步骤(5)干燥以正常视力观察微孔板上所有微孔内已无液体残留后，将干燥剂和封闭完成后的化学发光微孔板一同放入铝箔袋中，干燥剂放在微孔板面的反面，抽真空封装，封装后于2-8℃中储存；
优选地，所述酶结合物的制备包括以下步骤：
(1)准确称取1-2mg的辣根过氧化物酶(HRP)，磷酸盐缓冲液溶解成5-10mg/mL酶溶液，应用高碘酸盐氧化法进行活化；
(2)取与步骤(1)辣根过氧化物酶等量的鼠抗人IgG，与已活化的辣根过氧化物酶混合，10-30℃反应10min后，转入2-8℃中继续反应1-2h；
(3)将步骤(2)反应结束后的混合物采用饱和硫酸铵沉淀法沉淀，去除未结合的辣根过氧化物酶，再将沉淀使用磷酸盐缓冲液复溶后充分透析，完成纯化；
(4)将步骤(3)纯化完成后回收的HRP-鼠抗人IgG，根据具体回收量按1/1000～1/10000的稀释比例加入至缓冲液中，优选为1：5000的稀释比例，优选所述缓冲液(即稀释液)为1％牛血清白蛋白和0.05％Proclin-300的0.02M pH7.4磷酸盐缓冲液，同时将防腐剂与稳定剂一并加入，配制成酶结合物；
(5)根据每个试剂盒的使用量，将酶结合物按10-12mL/瓶进行分装，分装后于2-8℃中储存；
优选地，所述校准品的配制包括以下步骤：
(1)所述的校准品包括2个校准品，校准品1(CaL1)和校准品2(CaL2)；
(2)上述(1)中的描述的校准品1，使用含防腐剂的缓冲液配制而成，按照1-1.2mL/瓶的分装量进行分装，分装后于2-8℃中储存。
(4)上述(2)中描述的校准品2，将纯化后的人抗包虫IgG，使用含防腐剂的缓冲液，配制成浓度为0.01-5μg/mL的校准品2，按照1-1.2mL/瓶的分装量进行分装，分装后于2-8℃中储存；
优选地，所述阴性对照品的配制包括以下步骤：
(1)使用含防腐剂的缓冲液配制而成，按照1-1.2mL/瓶的分装量进行分装，分装后于2-8℃中储存；
优选地，所述阳性对照品的配制包括以下步骤：
(1)将S/CO>10的抗包虫病抗体，使用含防腐剂的缓冲液，配制成S/CO>1的阳性对照品，按照1-1.2mL/瓶的分装量进行分装，分装后于2-8℃中储存；
S/CO，其中S即为样本检测的相对发光强度值，CO即为cut-off值的缩写，cut-off即为截断值，是作为判定待检样本阴/阳性的决定值，使用包虫病抗体检测试剂盒检测大量临床样本后分析得出的结果；
优选地，所述发光底物液的配制包括以下步骤：
(1)所述发光底物液包括2个底物溶液，发光底物液A和发光底物液B；
(2)上述(1)中描述的发光底物液A，分别称取10g发光剂和10g发光增强剂，使用20-50mL二甲基亚砜溶解，再加入到1000-2000mL碱性缓冲液中配制成发光底物A溶液；
(3)上述(1)中描述的发光底物液B，向缓冲液中加入过氧化物，使其最终浓度为3-5mmol/L，配制成发光底物液；
优选地，所述样本稀释液的配制包括以下步骤：
(1)将血清与等体积缓冲液混合，充分混匀后按照10-15mL/瓶进行分装，分装后样本稀释液于2-8℃中储存。
在一些优选的实施方式中，将制备好的酶标记物(即为HRP-鼠抗人IgG)按照1：5000比例，使用含1％牛血清白蛋白和0.05％Proclin-300的0.02M pH7.4磷酸盐缓冲液进行稀释，配制成酶结合物。
在一些优选的实施方式中，酶结合物所使用的稀释液为1％牛血清白蛋白和0.05％Proclin-300的0.02M pH7.4磷酸盐缓冲液。
本发明的第三方面在于公开第一方面所述试剂盒在检测人血清/血浆中包虫病抗体含量的应用。
本发明的第四方面在于公开第一方面所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)待测样本、试剂盒使用前必须平衡至10℃～30℃；
(2)预留出校准品1和校准品2及阴性对照品和阳性对照品的加样孔，根据待测样本量设计好实验，选择合适数量的化学发光包被板板条，其余未使用的发光板板条放回铝箔袋中以便下次检测使用。每个检测设置双孔平行测定；
(3)将校准品、对照品使用移液器加入至化学发光包被板微孔内，加入量为50-150μL/孔；将样本稀释液加入至预先设计好的微孔板孔位中，加入量为85-95μL/孔，将样本加入至上步已加入样本稀释液的微孔板微孔内，加入量为5-15μL/孔，同时用移液器头吹打3-5次混匀。25-37℃条件下孵育15-30min；
(4)取出步骤(3)孵育完成后的发光板，将发光板微孔内的反应液体用力倾倒出，将发光板倒扣于吸水纸或吸水布上用力拍干；
(5)向步骤(4)拍干后的化学发光微孔板中按照200-300μL/孔加入PBST清洗液，静置或震动1-3min，再次将微孔板内液体倾倒后拍干，如此3-5次；
(6)向步骤(5)拍干后的微孔板中按照50-100μL/孔加入酶结合物，25-37℃条件下孵育15-30min；
(7)将步骤(6)孵育完成后的微孔板，按照步骤(4)和(5)进行清洗；
(8)向步骤(7)完成后的微孔板中按50-100μL/孔分别加入底物液A和底物液B，避光反应5min；
(9)将步骤(8)反应完成后的微孔板放入发光仪中检测，获得检测数据；
(10)将样本的检测发光强度与校准品标定的cut-off值进行比较，从而确定待检样本的阴/阳性。
本发明的有益效果：
(1)本发明运用间接法原理，所述检测试剂盒包括包虫特异性抗原包被的化学发光微孔板、酶结合物、校准品、阴性对照品、阳性对照品、化学发光底物液及清洗剂等。用于定性检测人血清或血浆样本中包虫病抗体，本发明将包虫特异性抗原通过静电作用和疏水相互作用包被于化学发光微孔板中，样本中的人包虫抗体可与包被于发光微孔板上的包虫抗原特异性结合，再加入酶结合物(主要成分为HRP标记的抗人IgG)，在化学发光板表面形成了“包虫抗原---包虫抗体---HRP-抗人IgG”的免疫复合物。清洗除去未结合的反应物质，加入发光底物液，HRP(即辣根过氧化物酶)催化过氧化物产生氢氧根自由基，与底物液中的鲁米诺反应将其转变为一种激发态中间体，该中间体不稳定，当其返回至基态时电子从高能级跃迁至低能级，同时释放能量(表现为光子形式)，所释放的光子与样本中包虫抗体成正相关，通过检测光子信号，确定样本中包虫抗体的量。
(2)本发明试剂盒结合了化学发光测定技术的高灵敏性及免疫反应的高特异性，具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、方法稳定快速、操作简单、检测通量高等优点。
附图说明
图1为棘球绦虫生活史。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
若非特别指出，实施例和对比例为组分、组分含量、制备步骤、制备参数相同的平行试验。
实施例1
包虫特异性抗原包被的化学发光微孔板的制备：
1)包虫特异性抗原包被的化学发光微孔板的制备可分为抗原包被、包被微孔板清洗、包被微孔板封闭及抽真实封装几个具体步骤。
2)根据包虫天然提取抗原、细粒棘球绦虫重组抗原及多房棘球绦虫重组抗原的浓度，计算出上述3种抗原20μg量所对应的体积，使用移液器分别量取上述3种抗原计算出的体积量，加入至10mL包被缓冲液中，包被缓冲液为0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，充分混匀。
3)使用8道移液器将步骤2)配制好的包被溶液按照100μL/孔的量加入至96孔化学发光微孔板中，盖上盖板膜，置于2-8℃中包被20h。
4)取出步骤3)包被反应后的微孔板，用力将微孔中的液体倾倒出，将微孔板倒扣于吸水纸上用力拍打，尽量将孔中残余液体拍出。
5)使用8道移液器向步骤4)处理后的微孔板中按300μL/孔加入清洗液，静置清洗1min。用力将微孔中的清洗液倾倒出，将微孔板倒扣于吸水纸上用力拍打，尽量将孔中残余液体拍出，如此反复清洗3次。其中清洗液为含0.5％Tween-20的0.02M pH7.4磷酸盐缓冲液。
6)使用8道移液器向步骤5)处理后的微孔板中按200μL/孔加入封闭液，盖上盖板膜，37℃中静置反应2h。反应结束后，用力将微孔中的液体倾倒出，将微孔板倒扣于吸水纸上用力拍打，尽量将孔中残余液体拍出。
7)将上述步骤6)处理后的微孔板置于干燥间中干燥20h，干燥间保持相对湿度为10-15％，温度控制在23±2℃。
8)将上述步骤7)干燥后的包被微孔板放入铝箔袋中，同时加入2g/包的干燥剂一个，使用抽气封口机将铝箔袋封装好，置于2-8℃中储存备用。
酶结合物的制备：
1)酶结合的制备可分为酶标记物的制备和酶结合物的配制2个具体步骤。
2)将1mg鼠抗人IgG使用0.02M pH7.4磷酸盐缓冲液透析20h，再使用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液透析4h。
3)称取1mg辣根过氧化物酶(HRP)，用0.3mL的0.06M pH5.6醋酸盐缓冲液溶解。
4)用0.06M pH5.6醋酸盐缓冲液配制0.05M NaIO4溶液，加0.3mL该溶液至上述步骤3)的HRP溶液中，充分混匀后于2-8℃中反应30min。
5)用HACB配制0.16M乙二醇溶液，加入0.3mL该溶液至上述步骤4)反应后溶液中，室温反应20min。
6)将步骤2)透析后的鼠抗人IgG加至上述步骤5)反应后的溶液中，置0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液体系中透析反应20h。
7)将步骤6)透析结束后的试剂取出，存放于试剂管中。使用纯水配制5mg/mL的硼氢化钠溶液，加入40μL该溶液至上述试剂管中，2-8℃反应20min。
8)量取上步反应完成后溶液体积，加入等体积2-8℃饱和硫酸铵溶液，2-8℃反应30min。5000rpm离心30min。
9)弃上清，沉淀用约2.0mL 0.02M pH7.4磷酸盐缓冲液溶解，加入2.0mL甘油于-20℃中保存备用。
10)将上述步骤9)制备好的酶标记物(即为HRP-鼠抗人IgG)按照1：5000比例，使用含1％牛血清白蛋白和0.05％Proclin-300的0.02M pH7.4磷酸盐缓冲液进行稀释，配制成酶结合物，按照12.0mL/瓶的分装量分装后于2-8℃中储存。
校准品的制备：
1)收集包虫病患者血清样本，取1.0mL该样本，缓慢加入1.0mL预冷饱和硫酸铵，静置30min。
2)将上述步骤1)处理后的样本于2-8℃中10000g离心15min，弃上清。沉淀使用1.0mL的0.02M pH7.4磷酸盐缓冲液复溶。
3)向上述步骤2)处理后的复溶物中缓冲加入0.6mL预冷饱和硫酸铵，静置30min。
4)将上述步骤3)处理后的样本于2-8℃中10000g离心15min，弃上清。沉淀使用1.0mL的0.02M pH7.4磷酸盐缓冲液复溶，得人抗包虫IgG抗体。
5)将上述步骤4)所制备的人抗包虫IgG抗体使用校准品稀释液稀释至0.02μg/mL浓度，校准品稀释液为50％的小牛血清和50％的0.02M pH7.2磷酸盐缓冲液配制而成，加入0.05％ProClin-300作为防腐剂。配制完成后的校准品按0.5mL/瓶的分装量分装后于2-8℃中储存备用。
阴性对照品和阳性对照品的制备：
1)直接使用基质血清配制成阴性对照品，按1.0mL/瓶的分装量分装后于2-8℃中储存备用。
2)根据校准品检测所得cut-off值，将收集的包虫病阳性血清样本，使用基质血清按照倍比稀释方式稀释至一系列梯度，检测其发光值(S)与cut-off值的比较(即S/CO)，选择S/CO＝2附近的稀释比例，将包虫阳性血清样本与基质血清混合，充分混匀后再次检测确定阳性对照品的S/CO值，确定S/CO>1后将阳性对照品按1.0mL/瓶的分装量分装后置于2-8℃中储存备用。
发光底物液的制备：
1)发光底物液的制备包括发光底物液A液的制备和发光底物液B液的制备。
2)发光底物液A液，准确称取10g固体鲁米诺，置于100mL的1M氢氧化钠溶液中室温(10-30℃)搅拌反应2h。
3)将上述步骤2)反应完成后的溶液于2-8℃中6000g离心30min，弃上清。
4)将上述步骤3)处理后的溶液使用0.05M pH8.6的Tris缓冲液复溶。向其中加入0.5g对苯二酚和0.5g 4-咪唑苯酚，充分搅拌混匀。
5)将上述步骤4)处理后的溶液使用0.45μm滤膜过滤，再加入0.05M pH8.6的Tris缓冲液定容至500mL。使用避光的黑色瓶按照6.0mL/瓶的分装量分装后于2-8℃中储存备用。
6)发光底物液B液，向500mL 0.06M pH6.0的醋酸盐缓冲液中加入3.0μL的30％过氧化氢，充分混匀后使用避光的棕色瓶按照6.0mL/瓶的分装量分装后于2-8℃中储存备用。
样本稀释液的配制：
1)量取50mL的牛血清与50mL的0.02M pH7.2磷酸盐缓冲液混合，充分混匀后，按15.0mL/瓶的分装量分装后于2-8℃中储存备用。
将上述实施例1-5各制备的半成品，经检验合格后组装成包虫病抗体检测试剂盒。
实施例2
与实施例1的区别在于，包被缓冲液选择0.02M，pH7.6的磷酸缓冲液(PB)。由于包被工艺对于试剂盒的性能影响较大，而其中包被缓冲液是至关重要的因素，因此考察不同包被缓冲液的影响，优先出最佳包被缓冲液。
1)根据包虫天然提取抗原、细粒棘球绦虫重组抗原及多房棘球绦虫重组抗原的浓度，计算出上述3种抗原20μg量所对应的体积，使用移液器分别量取上述3种抗原计算出的体积量，加入至10mL包被缓冲液中，包被缓冲液为0.02M，pH7.6的磷酸缓冲液(PB)，充分混匀。
2)使用8道移液器将步骤1)配制好的包被溶液按照100μL/孔的量加入至96孔化学发光微孔板中，盖上盖板膜，置于2-8℃中包被20h。
3)取出步骤2)包被反应后的微孔板，用力将微孔中的液体倾倒出，将微孔板倒扣于吸水纸上用力拍打，尽量将孔中残余液体拍出。
4)使用8道移液器向步骤3)处理后的微孔板中按300μL/孔加入清洗液，静置清洗1min。用力将微孔中的清洗液倾倒出，将微孔板倒扣于吸水纸上用力拍打，尽量将孔中残余液体拍出，如此反复清洗3次。其中清洗液为含0.5％Tween-20的0.02M pH7.4磷酸盐缓冲液。
5)使用8道移液器向步骤4)处理后的微孔板中按200μL/孔加入封闭液，盖上盖板膜，37℃中静置反应2h。反应结束后，用力将微孔中的液体倾倒出，将微孔板倒扣于吸水纸上用力拍打，尽量将孔中残余液体拍出。
6)将上述步骤5)处理后的微孔板置于干燥间中干燥20h，干燥间保持相对湿度为10-15％，温度控制在23±2℃。
7)将上述步骤6)干燥后的包被微孔板放入铝箔袋中，同时加入2g/包的干燥剂一个，使用抽真空封口机将铝箔袋封装好，置于2-8℃中储存备用。
试剂盒的其余组分制备，包括：酶结合物的制备、校准品的制备、阴性对照品和阳性对照品的制备、发光底物液的制备及样本稀释液的配制均与实施例1完全相同。
与实施1同时进行检测，分别检测10个阴性样本和10个阳性样本，结果对比如下：
从实施例1和实施例2检测的阴性样本和阳性样本结果可以看出，实施例1检测的阴性样本符合率和阳性样本符合率均为100％，而实施例2中，阴性样本和阳性样本在接近临界值附近各出现了1个检测不符的情况，分别是阴性样本9和阳性样本4，阴性样本符合率和阳性样本符合率均为90％。同时从实施例1和实施例2检测样本的S/CO值也可以看出，实施例1对于阴性样本和阳性样本可以更好区分，阴性的S/CO值更低而阳性的S/CO值更高些，综合以上分析实施例1要优于实施例2。
实施例3
与实施例1的区别在于酶结合物浓度不同，实施例1是将制备好的酶标记物(即为HRP-鼠抗人IgG)按照1：5000比例，使用含1％牛血清白蛋白和0.05％Proclin-300的0.02MpH7.4磷酸盐缓冲液进行稀释，配制成酶结合物，按照12.0mL/瓶的分装量分装后于2-8℃中储存。而本实施例中是将酶标记物按1：1000比例进行稀释配制成酶结合物，所使用的稀释液和分装量及储存环境均与实施例1相同。
试剂盒的其余组分制备，包括：包虫特异性抗原包被的化学发光微孔板的制备、校准品的制备、阴性对照品和阳性对照品的制备、发光底物液的制备及样本稀释液的配制均与实施例1完全相同。
与实施例1同时进行检测，分别检测10个阴性样本和10个阳性样本，结果对比如下：
从实施例1和实施例3检测的阴性样本和阳性样本结果可以看出，实施例1检测的阴性样本符合率和阳性样本符合率均为100％，而实施例3中，阴性样本在接近临界值附近有2个样本检测不符的情况，分别为阴性样本6号和9，阴性样本符合率和阳性样本符合率分别为80％和100％，容易检出假阳。同时从实施例1和实施例3检测样本的S/CO值也可以看出，实施例3相较实施例1，其总体阴性样本的S/CO值偏高，对于阴性样本的检测灵敏度不够高。虽然实施例3阳性样本的S/CO值与实施例1的较为接近，但其阳性样本发光值过高，对于仪器的光敏结构存在一定的损坏风险，且原料的使用量也较多，综合以上分析实施例1要优于实施例3。
实施例4
与实施1的区别在于配制酶结合物所使用的稀释液不同，酶结合物试剂的稳定性对于试剂盒性能影响较大，若稀释液所提供的环境不利于酶标记物的保存，则酶标记物很容易失活，对于样本的检测准确性大大降低。因此酶结合物中稀释液对酶标记物的稳定性也是作为考察试剂盒质量的重要因素。本实施例中使用含1％牛血清白蛋白和0.05％Proclin-300的0.05MpH7.4 Tris缓冲液，将制备好的酶标记物(即为HRP-鼠抗人IgG)按照1：5000比例进行稀释，配制成酶结合物，按照12.0mL/瓶的分装量分装后于2-8℃中储存。
试剂盒的其余组分制备，包括：包虫特异性抗原包被的化学发光微孔板的制备、校准品的制备、阴性对照品和阳性对照品的制备、发光底物液的制备及样本稀释液的配制均与实施例1完全相同。
本实施例与实施例1同时按照相同的实验方案进行进行检测，将本实施例所配制的酶结合物分成两组，分别放置于4℃和37℃环境中，除此之外的试剂盒其它试剂组分仍于4℃中储存。放置7天后同时检测10个阴性样本和10个阳性样本；实施例1也按此实验方案进行，检测结果如下：
(1)实施例1检测结果
(2)实施例4检测结果
将实施例1所述的酶结合物分别放置于4℃和37℃7天后检测样本，从对比结果可以看出，试剂放置于2个环境条件下的校准品发光值和检测的样本发光值总体均下降了约15％左右，因此S/CO值基本保持不变，阴性样本和阳性样本的符合率均为100％，由此说明实施例1所配制的酶结合物在37℃条件下的热稳定性良好，总体发光值少量的下降不会影响到检测结果。实施例4中使用不同稀释液所配制的酶结合物分别放置于4℃和37℃7天后检测样本，从对比结果可以看出，试剂放置于2个环境条件下校准品的发光值下降了约50％左右，检测样本时，阴性样本检测的发光值总体上略有下降，部分样本检测的发光值反而升高，导致阴性样本总体S/CO值总体偏高，出现了阴性样本9检测为阳性。阳性样本检测的发光值总体下降幅度更大，超过50％，导致阳性样本检测的S/CO值总体下降了一半多，其中阳性样本3检测为阴性。因此实施例4中的阴性样本和阳性样本的符合率均为90％，由此说明实施例1要优于实施例4。
检测方法：
1)本发明包虫病抗体检测试剂盒为二步法，具体步骤见表1。
表1
2)待检的血清样本或血浆样本按常规方法采集和收集，血浆样本推荐使用含肝素、EDTA-2K或柠檬酸钠抗凝管收集。
3)根据待测样本数量设计好包被微孔板的布孔，设置校准品、阴性对照品、阳性对照品及待测样本，其中校准品设置平行检测孔，其余样本设置单孔检测。
4)在步骤3)预先设计好的布孔位预先加入100μL样本稀释液，再向各微孔中加入10μL的校准品、阴性对照品、阳性对照品和待测样本，使用移液器轻轻吹打混匀，置37℃中孵育30min。
5)上述步骤4)反应结束后，将微孔板中反应液倾倒出，微孔板倒扣在吸水纸上用力拍打数次，尽量将反应微孔中的液体拍出。按照300μL/孔加入清洗液，静置1min后将清洗液倾倒出，再次在吸水纸上用力拍打数次，如此重复3次清洗。
6)按照100μL/孔向上述步骤5)清洗后的发光微孔板中加入酶结合物，置37℃中孵育30min。
7)按照上述步骤5)清洗方法清洗微孔板，向微孔板中分别加入50μL发光底物液A液和发光底物液B液，闭光静置5min后在发光仪中读取检测信号。
8)校准品检测的发光信号均值为cut-off值，其它各类型样本检测发光信号值S与cut-off值进行对比(即S/CO值)，所检测的阴性对照品S/CO≦1，阳性对照品S/CO>1，若其中一项不合格则实验需重新进行检测。包虫病抗体检测判定标准为：待测样本S/CO≦1，判定为阴性；待测样本S/CO>1，判定为阳性。
试剂盒性能评估
1)试剂盒的性能评估选择“包虫病IgG抗体检测试剂用冻干血清国家参考品”进行评价。国家参考品具体组成见表2。
表2
| 类别 | 编号 | 规格 | 支数 |
| 阴性参考品 | N1～N8 | 0.5mL/支 | 8 |
| 阳性参考品 | P1～P8 | 0.5mL/支 | 8 |
| 灵敏度参考品 | P9 | 0.5mL/支 | 1 |
| 精密度参考品 | P10 | 0.5mL/支 | 1 |
2)阴性参考品符合率
将国家参考品中的8支阴性参考品作为样本，按照实施例6的步骤进行操作，检测结果为：其中8支阴性参考品检测结果均为阴性，阴性参考品符合率为100％，阴性参考品符合率应为100％，满足要求。
3)阳性参考品符合率
将国家参考品中的8支阳性参考品作为样本，按照实施例6的步骤进行操作，检测结果为：其中8支阳性参考品检测结果均为阳性，阳性参考品符合率为100％，阳性参考品符合率应为100％，满足要求。
4)最低检出限
将国家参考品中的1支灵敏度参考品使用样本稀释液按照1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64进行稀释处理，将稀释后的样品作为样本，按照实施例6的步骤进行操作，检测结果为：1：2(阳性)、1：4(阳性)、1：8(阳性)、1：16(阳性)、1：32(阳性)、1：64(阴性)，最低检出限应不高于1：16，满足要求。
5)批内精密性
使用同一批试剂盒，将国家参考品中的1支精密度参考品作为样本重复检测10次，按照实施例6的步骤进行操作，检测结果见表3。
表3
| 检测次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 检测数值 | 142323 | 136223 | 131823 | 128792 | 126628 |
| 检测次数 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 检测数值 | 125322 | 129832 | 132322 | 128021 | 131123 |
| 均值 | SD | CV | / | / | / |
| 131240.9 | 4987.8 | 3.8％ | / | / | / |
由表3检测结果可知，试剂盒重复检测10次的变异系数(CV)为3.8％，CV≦10％(n＝10)，精密性较好，满足要求。
6)批间精密度
采用3个批次试剂盒，分别将国家参考品中的1支精密度参考品作为样本重复检测10次，按照实施例6的步骤进行操作，检测结果见表4。
表4
由表4检测结果可知，使用3个不同批次检测共计30次重复结果的批间变异系数(CV)为5.6％，CV≦15％(n＝10)，精密性较好，满足要求。
对比例
比对实验
采用美国DRG公司生产的“Echinococcus granulosus IgG(EIA-3472)”包虫IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)作为对照试剂与本发明试剂盒对150份新疆医科大学收集的样本进行检测对比，其中阳性样本56例，阴性样本94例，检测结果见表5。
表5(把各个实施例的数据补充进去)
阳性符合率：55/56×100％＝98.2％
阴性符合率：92/94×100％＝97.9％
总符合率：(55+92)/150×100％＝98％
通过对两种试剂检测结果的对比，阳性符合率达98.2％，阴性符合率达97.9％，总符合率达到98％，说明两种试剂检测结果具有高度一致性。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。
序列表
<110> 新疆医科大学
<120> 基于化学发光免疫分析技术的检测包虫病抗体的试剂盒及其制备方法、使用方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
tggctcatgc tgatgatgat g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
aactttctga catactcctt c 21
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ccggaattca aggagtctga cttagcggat 30
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
ccgctcgagt ttaggttggc cagcttcg 28
Claims (10)
1.基于化学发光免疫分析技术的检测包虫病抗体的试剂盒，其特征在于，包括包虫特异性抗原包被的化学发光微孔板；所述包虫特异性抗原包括天然提取纯化的包虫囊液抗原和包虫重组抗原中的至少一种；
优选地，所述天然抗原提取自牧区被棘球绦虫感染的牛或羊的肝或肺包虫囊液，进一步优所述牧区为新疆、西藏、四川；
优选地，所述包虫重组抗原为大肠杆菌原核表达系统所表达的重组抗原，进一步优选包括细粒棘球绦虫抗原和多房棘球绦虫抗原中的至少一种；更进一步优选地，所述的细粒棘球绦虫表达抗原上下游引物序列分别为：
上游引物：5’-TGGCTCATGCTGATGATGATG-3’
下游引物：5’-AACTTTCTGACATACTCCTTC-3’
所述的多房棘球绦虫表达抗原上下游引物序列分别为：
上游引物：5’-CCGGAATTCA AGGAGTCTGACTTAGCGGAT-3’
下游引物：5’-CCGCTCGAGTTTAGGTTGGCCAGCTTCG-3’；
优选地，所述包虫特异性抗原包括质量比1：1：1的天然提取抗原、细粒棘球绦虫重组表达抗原和多房棘球绦虫重组表达抗原。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括所述酶结合物；
优选地，所述酶结合物包括HRP-抗人IgG。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，还包括校准品、阴性对照品、阳性对照品、发光底物液和样本稀释液；
优选地，所述校准品包由人抗包虫IgG按照0.01-5μg/mL浓度稀释至含防腐剂的缓冲液中；
优选地，所述阴性对照品为含防腐剂的缓冲液；
优选地，所述阳性对照品为含包虫抗体的抗血清和加入防腐剂的缓冲液配制而成；
优选地，所述发光底物液包括发光底物液A液和发光底物液B液；其中发光液底物液A液为包含发光剂和发光增强剂的缓冲液；发光液底物液B液为包含过氧化物的缓冲液；
优选地，所述样本稀释液为含血清的缓冲液。
4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述包虫特异性抗原包被的化学发光微孔板的制备原料包括化学发光微孔板、包虫特异性抗原、包被缓冲液、包被保护剂和封闭缓冲液；
优选地，所述化学发光微孔板为硬质材料，材质为白色不透明，不可变形，进一步优选材质为聚苯乙烯和脲醛树脂中的一种；
优选地，所述化学发光微孔板布局有96个微孔，由12个微孔板条和发光板基座组成；每个微孔板条包含8个微孔，12个微孔板条竖列于发光板基座拼装而成一个完整的化学发光微孔板，每个板条可单独拆分组装于发光板基座中；
优选地，所述化学发光微孔内表面经过喷镀利于结合蛋白质的特殊材料或是加载电荷处理，或是二者结合处理；
优选地，所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和HEPES缓冲液中的至少一种，进一步优选所述包被缓冲液的浓度为0.01-0.05mol/L和所述包被缓冲液的pH为7.0-9.6，更进一步优选为0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液；
优选地，所述包被保护剂为葡萄糖、海藻糖和蔗糖中的至少一种；
优选地，所述封闭缓冲液包括封闭剂和封闭液缓冲体系，所述封闭剂为牛血清白蛋白、小牛血清、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和吐温-20中的至少一种，所述封闭液缓冲体系为磷酸盐缓冲液，进一步优选为0.02M，pH值为7.2-7.4的磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述酶结合物包括下述浓度的组分：
优选地，所述HRP-抗人IgG由HRP通过改进的高碘酸盐氧化法与抗人IgG进行共价偶联所得；进一步优选所述HRP为从辣根中提取的辣根过氧化物酶，酶活为50-250units/mg，吸光度比值为RZ 2.5-4.0，和所述抗人IgG为鼠抗人IgG、兔抗人IgG和羊抗人IgG中的至少一种；
优选地，所述稳定剂为牛血清白蛋白、小牛血清、酪蛋白、甘油、酶稳定剂和吐温-20中的至少一种；
优选地，所述防腐剂为ProClin300、叠氮钠和KY-100生物防腐剂中的至少一种；
优选地，所述缓冲液pH为7.0-9.0，所述缓冲液为碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和HEPES缓冲液中的至少一种。
6.根据权利要求1-5任一所述的试剂盒，其特征在于，所述校准品包括下述浓度的组分：
人抗包虫IgG 0.01-5μg/mL
防腐剂 0.01-0.5w/v％
缓冲液 0.01-0.5mol/L；
优选地，所述人抗包虫IgG为从收集的包虫病患者抗血清中提取所得，纯度为80％-95％；
优选地，所述防腐剂为ProClin300、叠氮钠和KY-100生物防腐剂中的至少一种；
优选地，所述缓冲液pH为6.5-8.0，所述缓冲液为小牛血清缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和HEPES缓冲液中的至少一种。
7.根据权利要求1-6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品包括下述浓度的组分：
防腐剂 0.01-0.5w/v％
缓冲液 0.01-0.5mol/L；
优选地，所述防腐剂为ProClin300、叠氮钠和KY-100生物防腐剂中的至少一种；
优选地，所述缓冲液pH为7.0-8.5，所述缓冲液为基质血清缓冲液、小牛血清缓冲液、马血清缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液中的至少一种；
和/或，所述阳性对照品包括下述浓度的组分：
包虫病抗体 S/CO>10
防腐剂 0.01-0.5w/v％
缓冲液 0.01-0.5mol/L；
优选地，所述包虫病抗体为收集的包虫病患者抗血清配制而成，抗血清为包虫抗体检测阳性的样本；
优选地，所述防腐剂为ProClin300、叠氮钠和KY-100生物防腐剂中的至少一种；
优选地，所述缓冲液pH为7.0-8.5，所述缓冲液为基质血清缓冲液、小牛血清缓冲液、马血清缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液中的至少一种；
和/或，所述发光底物液包括下述浓度的组分：
优选地，所述发光剂为鲁米诺、异鲁米诺和鲁米诺衍生物中的至少一种；
优选地，所述过氧化物为过氧化氢、过氧化脲和过氧化苯甲酸中的至少一种；
优选地，所述发光增强剂为对苯二酚、邻苯二酚、4-咪唑苯酚、3,5-二叔丁基水杨酸和四苯硼钠中的至少一种；
优选地，所述缓冲液为5.5-9.5，磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和Tris缓冲液中的至少一种；
和/或，所述样本稀释液包括下述浓度的组分：
血清 10-50v/v％
缓冲液 0.01-0.5mol/L；
优选地，所述血清为基质血清、牛血清和马血清中的至少一种；
优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和HEPES缓冲液中的字少一种，pH值为7.0-7.5。
8.一种根据权利要求1-7任一所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S01，包虫特异性抗原包被的化学发光微孔板的制备；
S02，酶结合物的制备；
S03，校准品的配制；
S04，阴性对照品的配制；
S05，阳性对照品的配制；
S06，发光底物液的配制；
S07，样本稀释液的配制；
优选地，所述包虫特异性抗原包被的化学发光微孔板的制备，包括以下步骤：
(1)将天然提取的包虫抗原和大肠杆菌重组表达的两种抗原，加入到包被缓冲液中；
(2)将步骤(1)中所配制好的抗原包被溶液，加入至化学发光微孔板的微孔内，在微孔上盖上盖板膜，反应；
(3)取出步骤(2)包被完成后的化学发光微孔板，将微孔板内的液体快速倾倒出，微孔板倒扣在吸水纸或吸水布上用力将微孔残余液体拍干，加入清洗液，静置或震动，再次将微孔板内液体倾倒后拍干，如此3-5次；
(4)向步骤(3)最后拍干后的微孔板内加入包被封闭液，包被封闭液中加入包被保护剂；将包被封闭液加入微孔中，封闭；
(5)取出步骤(4)封闭完成后的化学发光微孔板，将微孔板内的液体快速倾倒出，微孔板倒扣在吸水纸或吸水布上用力将微孔残余液体拍干。将拍干后的微孔板干燥；
(6)取出步骤(5)干燥以正常视力观察微孔板上所有微孔内已无液体残留后，将干燥剂和封闭完成后的化学发光微孔板一同放入铝箔袋中，干燥剂放在微孔板面的反面，抽真空封装，储存；
优选地，所述酶结合物的制备包括以下步骤：
(1)准确称取辣根过氧化物酶，磷酸盐缓冲液溶解成酶溶液，应用高碘酸盐氧化法进行活化；
(2)取与步骤(1)辣根过氧化物酶等量的鼠抗人IgG，与已活化的辣根过氧化物酶混合，反应；
(3)将步骤(2)反应结束后的混合物采用饱和硫酸铵沉淀法沉淀，去除未结合的辣根过氧化物酶，再将沉淀使用磷酸盐缓冲液复溶后充分透析，完成纯化；
(4)将步骤(3)纯化完成后回收的HRP-鼠抗人IgG，加入至缓冲液中，同时将防腐剂与稳定剂一并加入，配制成酶结合物；
(5)根据每个试剂盒的使用量，分装，储存；
优选地，所述校准品的配制包括以下步骤：
(1)所述的校准品包括2个校准品，校准品1CaL1和校准品2CaL2；
(2)上述(1)中的描述的校准品1，使用含防腐剂的缓冲液配制而成，分装，储存；
(3)上述(2)中描述的校准品2，将纯化后的人抗包虫IgG，使用含防腐剂的缓冲液，配制成浓度为的校准品2，分装，储存；
优选地，所述阴性对照品的配制包括以下步骤：
(1)使用含防腐剂的缓冲液配制而成，分装，储存；
优选地，所述阳性对照品的配制包括以下步骤：
(1)将S/CO>10的抗包虫病抗体，使用含防腐剂的缓冲液，配制成S/CO>1的阳性对照品，分装，储存；
S/CO，其中S即为样本检测的相对发光强度值，CO即为cut-off值的缩写，cut-off即为截断值，是作为判定待检样本阴/阳性的决定值，使用包虫病抗体检测试剂盒检测大量临床样本后分析得出的结果；
优选地，所述发光底物液的配制包括以下步骤：
(1)所述发光底物液包括2个底物溶液，发光底物液A和发光底物液B；
(2)上述(1)中描述的发光底物液A，分别称取发光剂和发光增强剂，使用二甲基亚砜溶解，再加入到碱性缓冲液中配制成发光底物A溶液；
(3)上述(1)中描述的发光底物液B，向缓冲液中加入过氧化物，配制成发光底物液；
优选地，所述样本稀释液的配制包括以下步骤：
(1)将血清与等体积缓冲液混合，分装，储存。
9.根据权利要求1-7任一所述的试剂盒在检测人血清/血浆中包虫病抗体含量的应用。
10.根据权利要求1-7任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)待测样本、试剂盒使用前必须平衡至10℃～30℃；
(2)预留出校准品1和校准品2及阴性对照品和阳性对照品的加样孔，根据待测样本量设计好实验，选择合适数量的化学发光包被板板条，其余未使用的发光板板条放回铝箔袋中以便下次检测使用。每个检测设置双孔平行测定；
(3)将校准品、对照品使用移液器加入至化学发光包被板微孔内，加入量为50-150μL/孔；将样本稀释液加入至预先设计好的微孔板孔位中，加入量为85-95μL/孔，将样本加入至上步已加入样本稀释液的微孔板微孔内，加入量为5-15μL/孔，同时用移液器头吹打3-5次混匀。25-37℃条件下孵育15-30min；
(4)取出步骤(3)孵育完成后的发光板，将发光板微孔内的反应液体用力倾倒出，将发光板倒扣于吸水纸或吸水布上用力拍干；
(5)向步骤(4)拍干后的化学发光微孔板中按照200-300μL/孔加入PBST清洗液，静置或震动1-3min，再次将微孔板内液体倾倒后拍干，如此3-5次；
(6)向步骤(5)拍干后的微孔板中按照50-100μL/孔加入酶结合物，25-37℃条件下孵育15-30min；
(7)将步骤(6)孵育完成后的微孔板，按照步骤(4)和(5)进行清洗；
(8)向步骤(7)完成后的微孔板中按50-100μL/孔分别加入底物液A和底物液B，避光反应5min；
(9)将步骤(8)反应完成后的微孔板放入发光仪中检测，获得检测数据；
(10)将样本的检测发光强度与校准品标定的cut-off值进行比较，从而确定待检样本的阴/阳性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111289647.7A CN114088937B (zh) | 2021-11-02 | 2021-11-02 | 基于化学发光免疫分析技术的检测包虫病抗体的试剂盒及其制备方法、使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111289647.7A CN114088937B (zh) | 2021-11-02 | 2021-11-02 | 基于化学发光免疫分析技术的检测包虫病抗体的试剂盒及其制备方法、使用方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114088937A true CN114088937A (zh) | 2022-02-25 |
| CN114088937B CN114088937B (zh) | 2023-08-29 |
Family
ID=80298623
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111289647.7A Active CN114088937B (zh) | 2021-11-02 | 2021-11-02 | 基于化学发光免疫分析技术的检测包虫病抗体的试剂盒及其制备方法、使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114088937B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102539782A (zh) * | 2011-10-09 | 2012-07-04 | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 | 检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条及制备方法 |
| CN103217524A (zh) * | 2012-12-28 | 2013-07-24 | 新疆维吾尔自治区实验动物研究中心 | 适用于检测泡型包虫病抗体的囊型包虫病囊液脱酯抗原及其制备方法 |
| CN107860914A (zh) * | 2017-10-27 | 2018-03-30 | 江苏浩欧博生物医药股份有限公司 | 一种抗线粒体抗体IgG的检测试剂盒及其检测方法 |
| CN110954690A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-03 | 北京维德维康生物技术有限公司 | 一种检测羊包虫病elisa抗体检测试剂盒及其应用 |
| CN110988362A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-10 | 迈克生物股份有限公司 | 抗组蛋白抗体测定试剂、试剂盒及其使用方法 |
| CN112062858A (zh) * | 2020-07-17 | 2020-12-11 | 青海省畜牧兽医科学院 | 一种用于诊断泡型棘球蚴病的串联蛋白及其克隆表达方法 |
| CN113238056A (zh) * | 2021-01-08 | 2021-08-10 | 中国人民解放军陆军第九五八医院 | 检测囊型包虫病方法 |
-
2021
- 2021-11-02 CN CN202111289647.7A patent/CN114088937B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102539782A (zh) * | 2011-10-09 | 2012-07-04 | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 | 检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条及制备方法 |
| CN103217524A (zh) * | 2012-12-28 | 2013-07-24 | 新疆维吾尔自治区实验动物研究中心 | 适用于检测泡型包虫病抗体的囊型包虫病囊液脱酯抗原及其制备方法 |
| CN107860914A (zh) * | 2017-10-27 | 2018-03-30 | 江苏浩欧博生物医药股份有限公司 | 一种抗线粒体抗体IgG的检测试剂盒及其检测方法 |
| CN110988362A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-10 | 迈克生物股份有限公司 | 抗组蛋白抗体测定试剂、试剂盒及其使用方法 |
| CN110954690A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-03 | 北京维德维康生物技术有限公司 | 一种检测羊包虫病elisa抗体检测试剂盒及其应用 |
| CN112062858A (zh) * | 2020-07-17 | 2020-12-11 | 青海省畜牧兽医科学院 | 一种用于诊断泡型棘球蚴病的串联蛋白及其克隆表达方法 |
| CN113238056A (zh) * | 2021-01-08 | 2021-08-10 | 中国人民解放军陆军第九五八医院 | 检测囊型包虫病方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 张海涛 等: "细粒棘球绦虫抗原B 8kDa亚单位在虫体发育过程中的阶段性表达研究", 《新疆医科大学学报》 * |
| 黎明 等: "细粒棘球蚴95抗原在真核昆虫表达系统中表达、纯化及免疫原性初步分析", 《宁夏医科大学学报》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114088937B (zh) | 2023-08-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111337682B (zh) | 一种新型冠状病毒IgM/IgG磁微粒化学发光免疫检测试剂盒 | |
| Grauballe et al. | Optimized enzyme‐linked immunosorbent assay for detection of human and bovine rotavirus in stools: Comparison with electron‐microscopy, immunoelectro‐osmophoresis, and fluorescent antibody techniques | |
| DE2943648C2 (de) | Spezifische Bindungs-Untersuchungsmethode zur Bestimmung einer Vielzahl von verschiedenen Liganden in einer einzigen Flüssigkeitsprobe | |
| AU2002248996B2 (en) | Detection of candida | |
| CN111337673B (zh) | 一种用于新型冠状病毒免疫检测的合成多肽组合物及应用 | |
| CN113009154A (zh) | 一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用 | |
| CN113009153A (zh) | 一种基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒及其应用 | |
| CN106526171A (zh) | 免疫检测套组 | |
| CN111474346B (zh) | 猪流行性腹泻病毒IgA和IgG抗体检测试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN107966561A (zh) | 一种检测hiv抗体的试纸条和试剂盒 | |
| PT88615B (pt) | Equipamento e metodo de dosagem imunometrica aplicavel a celulas completas | |
| CN113030483A (zh) | 一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒及其应用 | |
| CN110221066B (zh) | 一种旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法与应用 | |
| CN106053783A (zh) | 一种适用于结核感染t细胞检测的快速时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法 | |
| Treanor et al. | Development of an enzyme immunoassay for the Hawaii agent of viral gastroenteritis | |
| CN110297091B (zh) | 一种口蹄疫O、A、AsiaⅠ型抗体多重管式化学发光检测试剂盒 | |
| CN114088937A (zh) | 基于化学发光免疫分析技术的检测包虫病抗体的试剂盒及其制备方法、使用方法 | |
| CN112255399A (zh) | 基于双抗体夹心均相化学发光法猪瘟病毒检测试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN110470848A (zh) | 一种髓鞘碱性蛋白抗体检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN115166238A (zh) | 羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条 | |
| CN114994306A (zh) | 一种蛋白质pknox1在制备诊断酒精性心肌病的试剂中的应用及诊断试剂盒 | |
| CN117777259B (zh) | 检测结核感染的抗原组合物、试剂盒及其应用 | |
| CN103163302B (zh) | 一种采用定向交叉偶联技术制备的短肽抗体试剂盒 | |
| CN112213483A (zh) | 一种检测单纯疱疹病毒1+2型IgM抗体的化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法 | |
| CN109655626A (zh) | 一种完全均相测定胰高血糖素的检测试剂盒及其方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |