CN113030483A - 一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒，由设在盒体内的包被有RBD蛋白的微孔板、作为阳性对照的RBD中和抗体标准品溶液、阴性对照、样品稀释液、重组ACE2蛋白酶结合物、20×浓缩洗涤液、显示液A、显示液B、终止液和说明书构成。本发明还公开了所述试剂盒在检测含新型冠状病毒中和抗体生物样品中的应用。实验证实本发明的试剂盒稳定性高、选择性强，检测速度快、费用低廉、易于操作，克服了现有技术中检测中和抗体时，实验室环境要求高、操作时长等缺点，操作时间由120分钟缩短至45分钟，具有极大的临床应用前景。

Description

一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)中和抗体的检测，尤其涉及一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒及其应用，属于临床检验技术领域。
背景技术
由新冠病毒(SARS-CoV-2)引起的新冠肺炎(COVID-19)大流行是一个世纪以来人类面临的最严峻挑战。新型冠状病毒即“SARS-CoV-2”感染后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。因其传染力、存活力很高，一年时间内全球感染总人数已接近9000万人。专家们普遍认为，在研发出一个安全有效的疫苗并成功实施全球疫苗接种计划以前，全社会都无法回到疫情前的正常状态。
研究表明，冠状病毒S蛋白是病毒毒力的关键因子，是决定病毒毒力、组织嗜性和宿主范围的关键部分，也是中和抗体和疫苗设计的主要靶标。而评价疫苗接种后的效果，最直接的检测方法为新冠中和抗体的检测。因为，能识别新冠病毒的S(刺突)蛋白上的RBD区(受体结合域)的中和抗体，就可以阻断新冠病毒和人细胞上的ACE2受体结合，使得新冠病毒无法感染人细胞。此外，中和抗体可以与其他免疫成分——例如补体、吞噬细胞和自然杀伤细胞等——相互作用。这些效应反应都可以帮助清除病毒和被感染的细胞。中和抗体浓度越高，一般保护作用越好。因此，早期预测疫苗好坏的指标之一，就是看它能诱发人体内产生多少中和抗体。
传统的检测中和抗体的方法为活病毒或假病毒中和试验。试验方法需要专业细胞培养过程，对实验等级要求高，周期长、操作复杂，不适合普通接种疫苗人群高通量筛查。
中和抗体滴度可以反映出血液样品中抗体水平的指标，即接种疫苗后人体内免疫应答的好坏或强弱。随着新型冠状病毒疫苗的上市，对接种新冠疫苗人群和新冠感染后康复人群的中和抗体评价需要快速、可靠的、稳定、安全的评价方法。目前已有关于新型冠状病毒中和抗体酶联免疫的竞争抑制检测方法(CN202010919164.X、CN202010952237.5)，但上述公布的实验检测方法均属酶联免疫法竞争法和间接法，在实验操作中存在操作时间长(2-3小时)的缺陷。因新冠病毒传染力很强，增加人工操作和反应时间，也相应增加了操作人员被感染的可能性。基于此，迫切需要开发了一种具有高通量、灵敏度高、特异性好、重复性好等特点的体外新冠中和抗体诊断试剂或检测试剂盒。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒及其应用。
本发明所述的新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒，由设在盒体内的包被有RBD蛋白的微孔板、作为阳性对照的RBD中和抗体标准品溶液、阴性对照、样品稀释液、重组ACE2蛋白酶结合物、20×浓缩洗涤液、显示液A、显示液B、终止液和说明书构成；
其特征在于：
所述微孔板为聚苯乙烯微孔板，且其各孔包被有浓度为5-10μg/ml的重组RBD蛋白；
所述RBD中和抗体标准品溶液为：样品稀释液稀释的浓度为2000ng/ml的RBD中和抗体溶液；
所述阴性对照为正常人新冠病毒SARS-CoV-2抗体阴性血清；
所述样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、CTAB 1g、BSA 5g、TritonX-100 0.1mL、Proclin300 1mL，pH7.4；
所述重组ACE2蛋白酶结合物是辣根过氧化物酶标记的重组ACE2；该酶标ACE2酶结合物工作效价为1:5000，稀释液为酶结合物稀释液；
所述20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2 O 2.9g、吐温20 0.5mL；
所述显示液A是浓度为0.3mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)溶液；所述显示液B是浓度为0.74mg/mL的过氧化脲溶液；使用时将显示液A与显示液B按体积比1﹕1混合；
所述终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
上述的新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒中，所述微孔板的包被方法是：
1.1)配制包被液：即配制碳酸盐缓冲溶液，并调整pH值为9.6；
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.94g
纯化水 定容至1000mL
过滤除菌，4℃保存；
1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方及制法是：
Figure BDA0002952324260000021
过滤除菌，4℃保存；
1.3)配制封闭液，封闭液的配方及制法是：
Figure BDA0002952324260000031
过滤除菌，4℃保存；
1.4)用包被液将重组RBD蛋白稀释至工作浓度5-10μg/mL，混匀，并静置15分钟；
1.5)取标记好的微孔板，用8孔道排枪点板，使抗体液达到150μL/孔，盖上盖板膜；
1.6)置于2℃-8℃冰箱，包被4-6小时，然后，每孔加入5μL 0.1％SDS水溶液，过夜包被12-16小时；
1.7)取出包被板，室温平衡30min，甩掉抗体液，吸水纸拍干，每孔每次加300μL洗涤液，洗涤2次，吸水纸拍干；
1.8)每孔加入250μL封闭液，2℃-8℃过夜封闭16小时；
1.9)取出包被板，室温平衡30min，甩掉封闭液，吸水纸拍干；放在硅胶干燥器中干燥，在室温条件下，湿度30％以下保持5小时；
1.10)以铝箔袋真空包装包被板，做好标记，2-8℃保存，备用。
上述的新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒中：所述RBD蛋白是利用CHO细胞表达的新型冠状病毒SARS-CoV-2全长RBD的重组蛋白；所述ACE2蛋白是利用CHO细胞表达的新型冠状病毒SARS-CoV-2全长ACE2与BSA融合的重组蛋白，其中为保证ACE2的活性，ACE2在重组蛋白的N端；所述的RBD中和抗体是用来自于测定的新冠康复患者中和抗体可变区序列并与人源化Fc融合，通过CHO细胞重组表达形成的。
上述的新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒中，所述酶结合物稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、BSA5g、Proclin300 1mL。
上述的新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒中：所述显色剂的配制方法是以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂配制浓度为0.3mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)溶液，命名为A液，以pH5.5、0.2mol/L磷酸氢二钠与0.1mol/L柠檬酸缓冲液为溶剂配制浓度为0.74mg/mL的过氧化脲溶液，命名为B液，使用时将A液与B液按体积比1﹕1混合。
上述新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒在检测含新型冠状病毒中和抗体生物样品中的应用。
其中，检测含新型冠状病毒中和抗体样品的方法是：
(1)于微孔板内每孔先加入25uL样品稀释液，再将待测样品、阳性对照和阴性对照各取25uL分别加入到微孔板含有样品稀释液的孔中，最后每孔再加入100uL重组ACE2蛋白酶结合物，混匀后用不干胶封片封盖反应板，37℃温浴30分钟；
(2)反应结束后，用洗涤液洗板5次，每次应浸泡20s～40s，每孔加液量不少于350μL，洗涤完之后拍干；
(3)先加入显色液A 50μL，再加入显色液B 50μL，37℃避光温浴15分钟；
(4)加入终止液50μL，终止反应，用酶标仪检测各孔在450nm和630nm双波长的吸光值；
(5)根据吸光值计算抑制率，并判断结果；
Figure BDA0002952324260000041
结果判定标准：
S/CO≥20％：阳性，S/CO＜20％：阴性。
本发明所述新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒的应用及该指标在接种新冠疫苗人群和新冠感染后康复人群的中和抗体评价中的应用。
本发明提供的新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒具有高通量、灵敏度高、特异性好、重复性好等特点，可在生物安全二级实验室或普通实验室开展的快速中和抗体检测方法，有利于疫病流行病学调查、免疫抗体监测以及疫苗免疫效力评价。
本发明所述新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒的检测原理为：用重组RBD蛋白包被聚苯乙烯微孔板，辣根过氧化物酶标记ACE2蛋白(HRP-ACE2)制备酶结合物，加入样本稀释液、样本、HRP-ACE2，样本中的中和抗体与HRP-ACE2竞争结合微孔板上重组RBD蛋白，如果样本中含有新型冠状病毒中和抗体，则形成“中和抗体-RBD”复合物和“HRP-ACE2-RBD”复合物，如果样本中不含有新型冠状病毒中和抗体，则形成“HRP-ACE2-RBD”复合物，最后加入酶底物显色，在酶标仪上，于450nm，630nm处读取OD值。OD值与样本中RBD中和抗体的效价成反比。
本发明的有益效果是：(1)本发明公开的一种基于酶联免疫法检测新型冠状病毒中和抗体试剂盒，提供了更便捷的检测方法，该方法具有稳定性高、灵敏度高、选择性强，检测速度快、费用低廉、易于操作等优点。克服了现有技术中检测新型冠状病毒中和抗体时，操作复杂，操作时长，结果易受加样时间影响等缺点，操作时间由120分钟缩短至45分钟。(2)本发明公开的酶标记ACE2酶结合物利用重组融合ACE2蛋白，该蛋白因融合有BSA。BSA它可以起到“保护”或“载体”作用，既增加ACE2蛋白的稳定性，又有利于提高ACE2酶结合物的活性。
附图说明
图1：本发明所述新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒拟合曲线。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
实施例1：本发明所述新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒的制备
1、微孔板的包被：
1.1)配制包被液：即配制碳酸盐缓冲溶液，并调整pH值为9.6；
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.94g
纯化水 定容至1000mL
过滤除菌，4℃保存；
1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方及制法是：
Figure BDA0002952324260000051
过滤除菌，4℃保存；
1.3)配制封闭液，封闭液的配方及制法是：
Figure BDA0002952324260000052
Figure BDA0002952324260000061
过滤除菌，4℃保存；
1.4)用包被液将重组RBD蛋白稀释至工作浓度5-10μg/mL，混匀，并静置15分钟；
1.5)取标记好的微孔板，用8孔道排枪点板，使抗体液达到150μL/孔，盖上盖板膜；
1.6)置于2℃-8℃冰箱，包被4-6小时，然后，每孔加入5μL 0.1％SDS水溶液，过夜包被12-16小时；
1.7)取出包被板，室温平衡30min，甩掉抗体液，吸水纸拍干，每孔每次加300μL洗涤液，洗涤2次，吸水纸拍干；
1.8)每孔加入250μL封闭液，2℃-8℃过夜封闭16小时；
1.9)取出包被板，室温平衡30min，甩掉封闭液，吸水纸拍干；放在硅胶干燥器中干燥，在室温条件下，湿度30％以下保持5小时；
1.10)以铝箔袋真空包装包被板，做好标记，2-8℃保存，备用。
2、试剂盒溶液的配制：
基础溶液的配制
样本稀释液配方是：
Figure BDA0002952324260000062
调整pH为7.4，过滤除菌，4℃保存。
20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、吐温20 0.5mL。
所述RBD中和抗体标准品溶液为：样品稀释液稀释的RBD中和抗体，浓度为2000ng/ml。
所述阴性对照为正常人新冠病毒SARS-CoV-2抗体阴性血清。
所述RBD蛋白制备方法为利用CHO细胞表达的新型冠状病毒SARS-CoV-2全长RBD重组蛋白；制备过程为生物领域人员熟知方法。
RBD蛋白的包被量采用棋盘法依照灵敏度，检测范围为指标进行选择。
所述ACE2蛋白制备方法利用CHO细胞表达的新型冠状病毒SARS-CoV-2全长ACE2与BSA融合的重组蛋白；为保证ACE2的活性，ACE2在重组蛋白的N端，制备过程为生物领域人员熟知方法。
所述RBD中和抗体制备方法为用来自于测定的新冠康复患者中和抗体可变区序列并与人源化Fc融合，通过CHO细胞重组表达形成的。
所述RBD酶结合物的制备方法为：利用过碘酸钠法标记的重组ACE2与辣根过氧化物酶(HRP)的结合物。制备方法不限于此方法，其余蛋白标记方法亦可。
HRP标记的新冠刺突蛋白ACE2使用量的优化：在包被RBD蛋白微孔板中加入不同浓度的中和抗体标准溶液，再加入HRP标记的ACE2，选择HRP标记RBD使用量为其与包被抗原结合恰好饱和的量。优选的使用效价浓度为1：5000。
酶结合物稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、BSA 5g、Proclin300 1mL；
显色剂是以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂配制浓度为0.3mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)溶液为A液，以pH5.5、0.2mol/L磷酸氢二钠与0.1mol/L柠檬酸缓冲液为溶剂配制浓度为0.74mg/mL的过氧化脲溶液，为B液，使用时将A液与B液按体积比1﹕1混合；
终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
实施例2：本发明所述新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒在检测含新型冠状病毒中和抗体生物样品中的应用。
其中，检测含新型冠状病毒中和抗体样品优选的方法是：
(1)于微孔板内每孔先加入25uL样品稀释液，再将待测样品、阳性对照和阴性对照各取25uL分别加入到微孔板含有样品稀释液的孔中，最后每孔再加入100uL重组ACE2蛋白酶结合物，混匀后用不干胶封片封盖反应板，37℃温浴30分钟；
(2)反应结束后，用洗涤液洗板5次，每次应浸泡20s～40s，每孔加液量不少于350μL，洗涤完之后拍干；
(3)先加入显色液A 50μL，再加入显色液B 50μL，37℃避光温浴15分钟；
(4)加入终止液50μL，终止反应，用酶标仪检测各孔在450nm和630nm双波长的吸光值；
(5)根据吸光值计算抑制率，并判断结果；
Figure BDA0002952324260000081
结果判定标准：
S/CO≥20％：阳性，S/CO＜20％：阴性。
实施例3：本发明所述新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒的线性、准确性、回收率、精密度的检测
1)试剂盒的线性
(1)定标品配制：用样品稀释液分别将RBD中和抗体稀释至30ng/mL、60ng/mL、260ng/mL、390ng/mL、780ng/mL、1563ng/mL、3100ng/mL。
(2)定标品测试：将配制好的定标品通过实施例2所述方法检测，得到OD值；
(3)标准曲线的建立：根据校准品的制备浓度和OD值采用合适的拟合方式生成该批试剂的校准曲线。见表1和图1。
表1试剂盒线性
浓度 0ng/ml 30ng/ml 60ng/ml 260ng/ml 390ng/ml 780ng/ml 1563ng/mL 3100ng/ml
OD值 1.299 1.002 0.862 0.526 0.454 0.350 0.257 0.117
抑制率 - 22.89％ 33.36％ 59.54％ 65.02％ 73.03％ 80.20％ 90.97％
2)精密性试验：
分别以300ng/mL、1000ng/mL RBD中和抗体标准品平行测试10次，结果统计见表2。
表2：精密性试验结果
板孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 均值 SD CV
300ng/mL 0.489 0.487 0.476 0.477 0.481 0.481 0.492 0.486 0.493 0.478 0.484 0.00624 12.9％
1000ng/mL 0.318 0.323 0.321 0.323 0.325 0.318 0.321 0.316 0.326 0.314 0.3205 0.00392 12.2％
CV均＜15％，精密性良好。
实施例4:本发明的新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒在注射疫苗临床样本筛查中的应用
使用100例完成临床注射新冠疫苗免疫样本与500例未注射新冠疫苗样本，与临床细胞中和实验比对，计算本发明试剂盒测定结果与中和实验结果符合或差异程度的统计学指标，评价方法如表3。
表3本发明试剂盒与细胞中和试验对比
Figure BDA0002952324260000091
灵敏度计算：97/(97+2)×100％＝97.98％。
特异性计算：498/(498+3)×100％＝99.40％
总符合率：(97+498)/(97+2+498+3)×100％＝99.17％
以上试验说明，本发明提供的检测新型冠状病毒中和抗体的试剂盒及其检测方法，与中和抗体检测金标准有很好的一致性，可以用于接种新型冠状病毒疫苗后中和抗体产生评估，其灵敏度、特异性均较好，利于临床准确评估疫苗效果。

Claims (7)

1.一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒，由设在盒体内的包被有RBD蛋白的微孔板、作为阳性对照的RBD中和抗体标准品溶液、阴性对照、样品稀释液、重组ACE2蛋白酶结合物、20×浓缩洗涤液、显示液A、显示液B、终止液和说明书构成；
其特征在于：
所述微孔板为聚苯乙烯微孔板，且其各孔包被有浓度为5-10μg/ml的重组RBD蛋白；
所述RBD中和抗体标准品溶液为：样品稀释液稀释的浓度为2000ng/ml的RBD中和抗体溶液；
所述阴性对照为正常人新冠病毒SARS-CoV-2抗体阴性血清；
所述样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、CTAB 1g、BSA 5g、TritonX-100 0.1mL、Proclin300 1mL，pH 7.4；
所述重组ACE2蛋白酶结合物是辣根过氧化物酶标记的重组ACE2；该酶标ACE2酶结合物工作效价为1:5000，稀释液为酶结合物稀释液；
所述20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、吐温20 0.5mL；
所述显示液A是浓度为0.3mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)溶液；所述显示液B是浓度为0.74mg/mL的过氧化脲溶液；使用时将显示液A与显示液B按体积比1﹕1混合；
所述终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于，所述微孔板的包被方法是：
1.1)配制包被液：即配制碳酸盐缓冲溶液，并调整pH值为9.6；
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.94g
纯化水 定容至1000mL
过滤除菌，4℃保存；
1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方及制法是：
Figure FDA0002952324250000011
过滤除菌，4℃保存；
1.3)配制封闭液，封闭液的配方及制法是：
Figure FDA0002952324250000012
Figure FDA0002952324250000021
过滤除菌，4℃保存；
1.4)用包被液将重组RBD蛋白稀释至工作浓度5-10μg/mL，混匀，并静置15分钟；
1.5)取标记好的微孔板，用8孔道排枪点板，使抗体液达到150μL/孔，盖上盖板膜；
1.6)置于2℃-8℃冰箱，包被4-6小时，然后，每孔加入5μL 0.1％SDS水溶液，过夜包被12-16小时；
1.7)取出包被板，室温平衡30min，甩掉抗体液，吸水纸拍干，每孔每次加300μL洗涤液，洗涤2次，吸水纸拍干；
1.8)每孔加入250μL封闭液，2℃-8℃过夜封闭16小时；
1.9)取出包被板，室温平衡30min，甩掉封闭液，吸水纸拍干；放在硅胶干燥器中干燥，在室温条件下，湿度30％以下保持5小时；
1.10)以铝箔袋真空包装包被板，做好标记，2-8℃保存，备用。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：所述RBD蛋白是利用CHO细胞表达的新型冠状病毒SARS-CoV-2全长RBD的重组蛋白；所述ACE2蛋白是利用CHO细胞表达的新型冠状病毒SARS-CoV-2全长ACE2与BSA融合的重组蛋白，其中为保证ACE2的活性，ACE2在重组蛋白的N端；所述的RBD中和抗体是用来自于测定的新冠康复患者中和抗体可变区序列并与人源化Fc融合，通过CHO细胞重组表达形成的。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于，所述酶结合物稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、BSA 5g、Proclin300 1mL。
5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：所述显色剂的配制方法是以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂配制浓度为0.3mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)溶液，命名为A液，以pH5.5、0.2mol/L磷酸氢二钠与0.1mol/L柠檬酸缓冲液为溶剂配制浓度为0.74mg/mL的过氧化脲溶液，命名为B液，使用时将A液与B液按体积比1﹕1混合。
6.权利要求1所述的新型冠状病毒中和抗体酶联免疫法检测试剂盒在检测含新型冠状病毒中和抗体生物样品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，检测含新型冠状病毒中和抗体样品的方法是：
(1)于微孔板内每孔先加入25uL样品稀释液，再将待测样品、阳性对照和阴性对照各取25uL分别加入到微孔板含有样品稀释液的孔中，最后每孔再加入100uL重组ACE2蛋白酶结合物，混匀后用不干胶封片封盖反应板，37℃温浴30分钟；
(2)反应结束后，用洗涤液洗板5次，每次应浸泡20s～40s，每孔加液量不少于350μL，洗涤完之后拍干；
(3)先加入显色液A 50μL，再加入显色液B 50μL，37℃避光温浴15分钟；
(4)加入终止液50μL，终止反应，用酶标仪检测各孔在450nm和630nm双波长的吸光值；
(5)根据吸光值计算抑制率，并判断结果；
Figure FDA0002952324250000031
结果判定标准：
S/CO≥20％：阳性，S/CO＜20％：阴性。
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