CN115078737B - 一种检测狂犬免疫血浆效价的试剂盒及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测狂犬免疫血浆效价的试剂盒及其制备方法、应用。本发明提供的试剂盒包括：所述试剂盒包括：抗原包被板、血清稀释板、样品稀释液A、样品稀释液B、酶标记物抗人IgG、标准品、底物液A、底物液B、洗涤液、终止液。本发明采用间接法检测狂犬免疫血浆效价，准确性高，稳定性好，能够提高对狂犬免疫血浆的效价评价效率，并对各效价进行分类，为规范疫苗效力检测提供了依据。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测狂犬免疫血浆效价的试剂盒及其制备方法、应用。
背景技术
狂犬病（rabies）是有弹状病毒科、狂犬病毒属的狂犬病病毒导致的急性人畜共患传染病。狂犬病病毒是一种严格的嗜神经病毒，主要存在于动物的中枢神经组织和唾液腺中，主要是通过患病动物的咬伤传播，也有少数通过患病动物舔触伤口和黏膜表面而感染。对于狂犬病病毒的Ⅲ级暴露，即一处或多处皮肤的穿透性咬伤或抓伤，或被可以的疯动物的唾液污染黏膜，需要立即接种疫苗进行主动免疫。
疫苗进入体内后可以刺激机体产生抗体，足够的抗体可以保护机体抵抗病毒或细菌的感染。效价测定能够测定疫苗进入体内后产生的抗体的多少。
目前检测狂犬免疫血浆效价的方法中，MNT法所需检测时间长，对环境和技术要求高，且实验过程中，影响因素多。RFFIT法和FAVN法是目前在评价抗体活性中应用较广的方法。目前检测方法，检测的准确性仍有待提高。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种检测狂犬免疫血浆效果的试剂盒。
本发明还提供了一种利用上述试剂盒在检测狂犬免疫血浆效果中的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种检测狂犬免疫血浆效价的试剂盒，所述试剂盒包括：所述试剂盒包括：抗原包被板、血清稀释板、样品稀释液A、样品稀释液B、酶标记物抗人IgG、标准品、底物液A、底物液B、洗涤液、终止液。
进一步的，所述抗原包被板为狂犬病毒抗原的微孔反应板，包被量为100μL，具体制备方法为：将狂犬病毒抗原采用柠檬酸缓冲液稀释，然后加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，将稀释液包被酶标板，每孔100μl，4℃过夜后，去稀释液，每孔加含10％小牛血清的封闭液 4℃过夜；去封闭液，吹干后4℃保存备用。
上述柠檬酸缓冲液的pH值为9.0～9.5；所述乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺在柠檬酸缓冲液中的浓度为1.2mol/L。
进一步的，所述样品稀释液A含有以下成分：聚乙二醇 0.8～1.0g/L、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠0.1～0.2g/L、月桂醇聚氧乙烯醚0.3～0.5 g/L、二月桂甘油硫酸酯0.15g/L、氯化钠8.5～10.5g/L、硼酸盐缓冲液 0.8～1.2 g/L、叠氮钠0.3～0.5g/L；所述样品稀释液B为浓度为7.5g/L的吐温80-生理盐水溶液。
进一步的，所述底物液A为TMB溶液，具体是由： TMB3～5g/L、4-氨基安替比林 0.8～1.2g/L、葡甘露聚糖 3～5g/L、甘油 0.5～1.0g/L及余量的双蒸水；所述底物液B为：3'-羟基洛克米兰酰胺10-15g/L、柠檬酸3～8g/L及余量的双蒸水。
进一步的，所述洗涤液为氯化钠15g/L、碘化钾3g/L、磷酸氢钠0.255g/L，磷酸氢钾0.45g/L。
进一步的，所述终止液为0.8mol/L 的H2SO4。
本发明还提供了上述试剂盒检测狂犬免疫血浆效价的方法，具体包括以下步骤：
（1）样品预稀释：在血清稀释板上，每孔加入样品稀释液A 100uL，再加入待测样品10uL，轻轻震荡混匀待用；
（2）加样：在抗原包被板上，设标准品孔（10、5、2.5、1IU/mL），每孔加入相应标准品100uL；留空白对照1孔；在其余样品孔，每孔加入样品稀释液B 100uL，再加入预稀释过的样品10uL，轻轻震荡混匀；
（3）温育：加好样品的抗原包被板，用封口胶封盖后置37℃温育30分钟；
（4）洗板：温育结束后，用洗板机加入洗涤液洗涤5次，每次浸泡30秒，洗完后拍干；
（5）加酶：每孔加入酶标记物100uL；
（6）温育：加好酶标记物的抗原包被板，用封口胶封盖后置37℃温育20分钟；
（7）洗板：温育后，用洗板机洗涤5次，每次浸泡30秒，洗完后拍干；
（8）显色：每孔先加入底物液A 50 uL、再加入底物液B 50 uL，轻轻震荡混匀，用封口胶封盖后置37℃避光显色10分钟；
（9）测量：显色完毕后，每孔加入终止液50 uL，轻轻震荡混匀，10分钟内测定结果；以空白对照孔调零，置酶标仪采用双波长测定各孔吸光值。
述双波长为450nm/630nm（620nm）。
本发明的有益效果为：本发明采用间接法检测狂犬免疫血浆效价，准确性高，稳定性好，能够提高对狂犬免疫血浆的效价评价效率，并对各效价进行分类，为规范疫苗效力检测提供了依据。
附图说明
图1为实施例1中狂犬抗体标准曲线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
本发明所制备的狂犬免疫血浆效价评价的试剂盒非医疗器械产品，仅用于血浆效价的分类，不能用于临床检验。
实施例1
1、检测试剂盒组成为：
抗原包被板为狂犬病毒抗原的微孔反应板，包被量为100μL，具体制备方法为：将狂犬病毒抗原采用pH值为9.0的柠檬酸缓冲液稀释，然后加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺至其浓度为1.2mol/L，将稀释液包被酶标板，每孔100μl，4℃过夜后，去稀释液，每孔加含10％小牛血清的封闭液 4℃过夜；去封闭液，吹干后4℃保存备用。
所述样品稀释液A含有以下成分：聚乙二醇 0.8g/L、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠0.2g/L、月桂醇聚氧乙烯醚0.5 g/L、二月桂甘油硫酸酯0.15g/L、氯化钠9g/L、硼酸盐缓冲液 1.0 g/L、叠氮钠0.5g/L；所述样品稀释液B为浓度为7.5g/L的吐温80-生理盐水溶液。
所述底物液A为TMB溶液，具体是由： TMB 5g/L、 4-氨基安替比林 1.0g/L、葡甘露聚糖 5g/L、甘油 1.0g/L及余量的双蒸水；所述底物液B为3'-羟基洛克米兰酰胺15g/l、柠檬酸3g/L及余量的双蒸水。
所述洗涤液为氯化钠15g/L、碘化钾3g/L、磷酸氢钠0.255g/L，磷酸氢钾0.45g/L。
所述终止液为0.8mol/L 的H2SO4。
2、样本要求
a．新鲜采集的人血清或血浆，含有EDTA、柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的样品可用于本实验。
b．要求样品无污染，无重度溶血，无悬浮纤维蛋白，不含叠氮钠。
c．样品2-8℃可储存7天，长期储存应低于-20℃，避免反复冻融。
3、实验操作
a.样品预稀释
在血清稀释板上，每孔加入样品稀释液A 100uL，再加入待测样品10uL，轻轻震荡混匀待用。
b.加样：在抗原包被板上，设标准品孔（10、5、2.5、1IU/mL），每孔加入相应标准品100uL；留空白对照1孔；在其余样品孔，每孔加入样品稀释液B 100uL，再加入预稀释过的样品10uL，轻轻震荡混匀；
c.温育：加好样品的抗原包被板，用封口胶封盖后置37℃温育30分钟。封口胶只限一次性使用，避免交叉污染。
d.洗板：取1瓶浓缩洗液，用纯化水稀释定容至1000mL后使用；温育结束后，用洗板机洗涤5次，每次浸泡30秒，洗完后拍干。
e.加酶：每孔加入酶标记物100uL。
f.温育：加好酶标记物的抗原包被板，用封口胶封盖后置37℃温育20分钟。
g.洗板：温育后，用洗板机洗涤5次，每次浸泡30秒，洗完后拍干。
h.显色：每孔先加入底物液A 50 uL、再加入底物液B 50 uL，轻轻震荡混匀，用封口胶封盖后置37℃避光显色10分钟。
i.测量：显色完毕后，每孔加入终止液50 uL，轻轻震荡混匀，10分钟内测定结果；以空白对照孔调零，置酶标仪450nm波长处测定各孔吸光值（建议用双波长450nm/630nm（620nm）检测）。
4、结果判定
a可提供准确检测值的线性范围为1-10IU/mL，待检样品抗体效价高于10 IU/mL时，需增加样品稀释倍数。
b.标准品10IU/mL孔吸光值均值≥0.7；空白对照孔吸光值≤0.10，线性回归系数R2≥0.98，实验视为有效；
c.结果计算：
（1）将标准品（10、5、2.5、1 IU/mL）的抗体效价值与对应的吸光值做曲线，导出线性回归方程，将待测样品吸光值代入方程，计算得到样品的抗体效价值。
例如：以标准品的抗体效价值为自变量（X），以对应的吸光值为因变量（Y），导出线性回归方程为：Y＝0.111X+0.063。
某一样品在450nm的吸光值A＝0.612时，带入以上方程计算抗体效价值为：（0.612-0.063）÷0.111=4.94IU/mL。
具体结果见表1，标准曲线如图1所示。
表1
5、注意事项
a.使用前请将试剂平衡至室温（建议30分钟），未用完的包被板条须放入有干燥剂的自封袋中，置2～8℃密封保存。
b.各步加液均应使用经校验的加样器，以避免误差。加入不同样品或不同试剂组份时，应更换加样头和加样槽。
c.不同批次试剂组分不得混用。试验结果必须以酶标仪读数为准进行判定。
对比例1
（1）试剂盒组成同实施例1；
抗原包被板为狂犬病毒抗原的微孔反应板，包被量为100μL，具体制备方法为：将狂犬病毒抗原采用pH值为9.0的柠檬酸缓冲液稀释，将稀释液包被酶标板，每孔100μl，4℃过夜后，去稀释液，每孔加含10％小牛血清的封闭液 4℃过夜；去封闭液，吹干后4℃保存备用。
其他同实施例1。
对比例2
（1）试剂盒组成同实施例1；
抗原包被板为狂犬病毒抗原的微孔反应板的制备同实施例1。
所述样品稀释液A含有以下成分：聚乙二醇 1.0g/L、月桂醇聚氧乙烯醚0.5 g/L、二月桂甘油硫酸酯0.15g/L、氯化钠9g/L、硼酸盐缓冲液 1.0 g/L、叠氮钠0.5g/L；所述样品稀释液B为浓度为7.5g/L的吐温80-生理盐水溶液。
其他同实施例1.对比例3
所述样品稀释液A含有以下成分：聚乙二醇 0.8g/L、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠0.2g/L、月桂醇聚氧乙烯醚0.5 g/L、二月桂甘油硫酸酯0.15g/L、氯化钠9g/L、硼酸盐缓冲液 1.0 g/L、叠氮钠0.5g/L；所述样品稀释液B为浓度为7.5g/L的吐温80-生理盐水溶液。
所述底物液A为TMB溶液，具体是由： TMB 5g/L、 4-氨基安替比林 1.0g/L、葡甘露聚糖 5g/L、甘油 1.0g/L及余量的双蒸水；所述底物液B磷酸氢二钠15g/l、柠檬酸3g/L及余量的双蒸水。
所述洗涤液为氯化钠15g/L、碘化钾3g/L、磷酸氢钠0.255g/L，磷酸氢钾0.45g/L。
所述终止液为0.8mol/L 的H2SO4。
效果实施例1
采用实施例1和对比例2对质控品进行稀释后，将稀释后的质控品置于0℃条件下保存，检测质控品的浓度变化，具体检测结果见表2。
表2
效果实施例2
将实施例1、对比例1及对比例3制备的试剂盒及方法对待检品进行检测，采用MNT法作为对照，分别检测3批样品，具体结果见表3。
表3
Claims (7)
1. 一种检测狂犬免疫血浆效价的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：所述试剂盒包括：抗原包被板、血清稀释板、样品稀释液A、样品稀释液B、酶标记物抗人IgG、标准品、底物液A、底物液B、洗涤液、终止液；
所述抗原包被板为狂犬病毒抗原的微孔反应板，包被量为100μL，具体制备方法为：将狂犬病毒抗原采用柠檬酸缓冲液稀释，然后加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，将稀释液包被酶标板，每孔100μl，4℃过夜后，去稀释液，每孔加含10％小牛血清的封闭液 4℃过夜；去封闭液，吹干后4℃保存备用
所述样品稀释液A含有以下成分：聚乙二醇 0.8～1.0g/L、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠0.1～0.2g/L、月桂醇聚氧乙烯醚0.3～0.5 g/L、二月桂甘油硫酸酯0.15g/L、氯化钠8.5～10.5g/L、硼酸盐缓冲液 0.8～1.2 g/L、叠氮钠0.3～0.5g/L；所述样品稀释液B为浓度为7.5g/L的吐温80-生理盐水溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述柠檬酸缓冲液的pH值为9.0～9.5；所述乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺在柠檬酸缓冲液中的浓度为1.2mol/L。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述底物液A为TMB溶液，具体是由：TMB3～5g/L、4-氨基安替比林 0.8～1.2g/L、葡甘露聚糖 3～5g/L、甘油 0.5～1.0g/L及余量的双蒸水；所述底物液B为：3'-羟基洛克米兰酰胺10-15g/L、柠檬酸3～8g/L及余量的双蒸水。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为氯化钠15g/L、碘化钾3g/L、磷酸氢钠0.255g/L，磷酸氢钾0.45g/L。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述终止液为0.8mol/L 的H2SO4。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的试剂盒检测狂犬免疫血浆效价的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）样品预稀释：在血清稀释板上，每孔加入样品稀释液A 100uL，再加入待测样品10uL，轻轻震荡混匀待用；
（2）加样：在抗原包被板上，设标准品孔，每孔加入相应标准品 100uL；留空白对照1孔；在其余样品孔，每孔加入样品稀释液B 100uL，再加入预稀释过的样品10uL，轻轻震荡混匀；
所述标准品孔内加入的标准品的浓度分别为10、5、2.5、1IU/mL；
（3）温育：加好样品的抗原包被板，用封口胶封盖后置37℃温育30分钟；
（4）洗板：温育结束后，用洗板机加入洗涤液洗涤5次，每次浸泡30秒，洗完后拍干；
（5）加酶：每孔加入酶标记物100uL；
（6）温育：加好酶标记物的抗原包被板，用封口胶封盖后置37℃温育20分钟；
（7）洗板：温育后，用洗板机洗涤5次，每次浸泡30秒，洗完后拍干；
（8）显色：每孔先加入底物液A 50 uL、再加入底物液B 50 uL，轻轻震荡混匀，用封口胶封盖后置37℃避光显色10分钟；
（9）测量：显色完毕后，每孔加入终止液50 uL，轻轻震荡混匀，10分钟内测定结果；以空白对照孔调零，置酶标仪采用双波长测定各孔吸光值。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述双波长为450nm/630nm或450nm/620nm。
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