CZ450399A3 - Způsob ochrany rostlin proti hmyzu a nematodám - Google Patents

Description

Způsob ochrany rostlin proti hmyzu a nematodám

Oblast techniky

Tento vynález se týká způsobů ochrany rostliny nebo části řečené rostliny proti hromadnému napadení jedním nebo více druhy hmyzu nebo nematod, jež mají trávící cysteinové nebo aspartátové proteasy, přičemž způsob zahrnuje presentaci inhibičního množství inhibitoru cysteinové nebo aspartátové proteasy k lokusu, kde má být řečený hmyz nebo nematoda kontrolován.

Dosavadní stav techniky

Mnohé druhy zeleniny, zahradních a polních plodin jsou napadány hmyzími škůdci. Většina rostlin vykazuje nějakou odolnost vůči určitým druhům hmyzu nebo nematod. Odolnost může být fyzikální nebo chemická. Například: Vlasy na listech mnoha rostlin mohou zastavit drobný hmyz v přibližování k povrchu, jež by dostačovalo k jeho požírání. V jiných případech rostliny používají řadu složitých molekul k tomu, aby jejich tkáně byly nepřitažlivé nebo jedovaté. Ke kontrole takovéhoto fytofágního hmyzu nebo nematod se částečně přistupovalo pomocí tradičních kultivačních nebo šlechtících metod. Účinnou cestou ke snižování takovýchto ztrát je používání takových kultivarů plodin, které mají geny pro odolnost vůči škůdcům (viz Painter (1951), Insect Resistance in Crop Plants, Macmillan: New York) . Šlechtitelé rostlin se snažili snižovat ztráty způsobované napadením hmyzem nebo nematodami vnesením genů resistence do jejich variet pomocí konvenčních šlechtitelských programů.

Klasické přístupy k hostitelské rostlinné resistenci jsou spíše empirické, ale mají v některých případech znamenitý úspěch. Jakmile jsou objeveny „znaky resistence, přenesou se selekčními postupy do zemědělsky přijatelných linií. Jedním omezením tohoto klasického přístupu je, že tento přenos genů pro resistenci je omezen na druhy, jež lze křížit. Navíc mohou být tyto typy resistence pod kontrolou mnoha genů, a proto je pro rostlinného šlechtitele obtížné je využívat. Odolné variety často vykazovaly pokles výnosu a nebyly schopné ekonomického přežití. Navíc není možné klasickým šlechtěním zlepšovat resistenci k hmyzím škůdcům tehdy, když nelze identifikovat resistenci v rámci druhu nebo příbuzných druhů.

Kontrola hmyzu a nematod se významně spoléhala na chemických pesticidech. Tato činidla jsou typicky aplikována nebo pokládána na půdu, nebo na rostlinné listoví nebo do staničních pastí. Navzdory dostupnosti velké řady chemických pesticidů, fytofágni hmyz a parasitní nematody rostlin zůstávají vážným problémem. Mnohé chemické pesticidy mají nevýhodu v tom, že vyžadují opakované aplikace. Velkým problémem při používání mnohých pesticidů je schopnost hmyzu stávat se resistentním k aplikovanému činidlu. Tento fenomén nastává prostřednictvím selekce nejresistentnějších členů hmyzí populace při opakované aplikaci daného činidla. Navíc tyto chemikálie poškozují životní prostředí a znečiščují povrchovou vodu. Proto existuje potřeba nových činidel ke kontrole hmyzu, obzvláště činidel, jež mají charakter působení jiný než konvenční insekticidy a nematicidy.

Jako alternativa k syntetickým sloučeninám byla isolována a vyvinuta jako pesticidy některá přirozeně se vyskytující činidla. Ta zahrnují rostlinné a mikrobiální sekundární metabolity a bílkoviny, a přirozené predátory nebo patogeny hmyzu a nematod (včetně jiného hmyzu, hub, bakterií a virů).

* · · · · ·

Navíc, jak postupovala technologie rekombinantní DNA, bylo možné přenášet geny z donorového organismu do recipientního organismu, což vedlo k novému fenotypu recipienta. V případě transgenních rostlin může tímto fenotypem být resistence k poškození hmyzem nebo k infekci nematodami, pokud vnesený gen kóduje polypeptid, jehož účinek vede k zasažení škůdce. V důsledku toho má velký význam a užitečnost nalézat polypeptidy s takovýmto účinkem. Geny pro tyto polypeptidy lze použít k modifikaci organismů, obzvlášť rostlin a mikrobů, tak aby negativně působily na růst a vývoj hmyzích škůdců. Byla popsána řada takovýchto polypeptidů z Bacillus thuringiensis, různé bílkovinné inhibitory proteas a amylas a různé rostlinné lektiny.

Jedním fysiologickým systémem hmyzu a nematod, o němž je známo, že podléhá rozbití specifickými inhibitory, je působení trávících proteas. Trávící proteasy hydrolyzují pozřené bílkoviny a polypeptidy štěpením peptidových vazeb. Výraz „proteasa je konkrétně zamýšlen k označení endopeptidas a exopeptidas čtyř hlavních katalytických tříd: serinových proteas, cysteinových proteas, aspartátových metaloproteas (viz Laskowski et al. (1983), proteas a Ann, Rev.

Biochem.. 49: 593-626). Třída, k níž konkrétní proteasa patří, může být určena pomocí rozsahu pH, v němž je aktivní, schopnosti štěpit specifické bílkoviny, podobnosti s jinými, dobře charakterizovanými proteasami a citlivosti k různým inhibitorům.

Různé typy trávících enzymů hmyzu a nematod uvolňují z bílkovin obsažených v dietě peptidy a aminokyseliny. Jednou třídou trávících enzymů jsou cysteinové proteasy. Výraz „cysteinová proteasa je zamýšlen k popisu proteasy, jež má v katalytickém centru enzymu vysoce reaktivní thiolovou skupinu cysteinového zbytku. Existují důkazy, že mnohý fytofágní hmyz a parasitní nematody rostlin se spoléhají, přinejmenším částečně, na cysteinové proteasy prostředního střeva pro trávení bílkovin. Sem spadají, ale bez omezení, ploštice (Hemiptera), obzvláště ploštice Anasa tristis, Acrosternum hilare, Riportus clavatus, a téměř všichni brouci (Coleoptera) dosud zkoumaní, obzvláště mandelinka bramborová (Leptinotarsa decemlineata), kohoutek (Lema trilineata), chřestovníček obecný (Crioceris asparagi) , brouk Epilachna varivestis, potemník (Tribolum castaneum), potemník skladištní (Tribolum confusum}, dřepčíci (Chaetocnema spp., Haltica spp. a Epitrix spp.), Diabrotica spp., zrnokaz (Callosobruchus maculatus) , květopas (Anthonomus grandis) , nosatci (Sitophylus oryza, Sitophylus zeamais, Sitophylus granarius, Hypera postica), zrnokaz (Acantoscelides obtectus), Rhyzoptera dominica, potemník moučný (Tenbrio molitor), třásněnky, obzvláště třásněnka západní (Frankliniella occidentalis), dvoukřídlí, obzvláště minující druhy, květomilka (Liriomyza trifolii), rostlinné parazitní nematody, obzvláště červi Globodera spp., Heterodera schachtii a Meloidogyne spp.

Jinou třídou trávících enzymů jsou aspartátové proteasy. Výraz „aspartátová proteasa je zamýšlen k popisu proteasy, jež má v katalytickém místě enzymu dva vysoce reaktivní zbytky kyseliny asparagové a jejíž nejčastější charakteristikou je specifická inhibice pepstatinem, nízkomolekulárním inhibitorem téměř všech známých aspartátových proteas. Existují důkazy, že mnohý fytofágní hmyz a parasitní nematody rostlin se částečně spoléhá na aspartátové proteasy prostředního střeva pro trávení bílkovin, velmi často ve spojení s cysteinovými proteasami. Sem spadají, ale bez omezení, Hemiptera, obzvláště Rhodnius prolixus a štěnice (Cimex spp.), a členové čeledí Phymatidae, Pentatomidae (kněžovcovití) , Lygaeidae (ploštičkovití) a Belostomidae, Coleoptera (brouci) čeledí

Meloidae (majkovití) Chrysomelidae (mandelinkovití), Coccinelidae (slunéčkovití) a Bruchidae (zrnokazovití), všichni náležející k řadě Cucujiformia, obzvláště mandelinka bramborová (Leptinotarsa decemlineata), kohoutek (Lema trilineata), Diabrotica undecimpunctata, D. virgifera, květopas (Anthonomus grandis), ploštice Anasa tristis, brouci phyllotreta crucifera, Callosobruchus maculatus, Epilachna varivestis, Ontodonta horni, Epicaute pestifera a potemník Tribolium castaneum, Dvoukřídlí, obzvláště mocha domácí (Musea domestica) (Terra a Ferreira (1994) Comp. Biochem. Physiol. 109B: 1-62, Wolfson a Murdock (1990) J. Chem. Ecol. 16: 10891102) .

Sloučeniny, které tvoří komplexy s proteasami a inhibují jejich proteolytickou aktivitu jsou v přírodě široce rozšířené. Je známa řada proteasových inhibitorů o „nízké molekulové hmotnosti , většinou syntetického, ne přirozeného, původu. Určitý počet přirozeně se vyskytujících inhibitorů o nízké molekulové hmotnosti byl isolován z bakteriálních nebo houbových zdrojů a charakterizován. Tato skupina zahrnuje takové inhibitory, jako jsou E64 (N-(L-3-trans-karboxypyran22-carbamoyl)-L-leucyl-amido-4-guanidobutan), leupeptiny, činidla proti bolestem a pepstatiny.

Z rostlinných druhů bylo isolováno několik bílkovinných inhibitorů proteas. Patří mezi obranné chemické látky rostlinných tkání, jež jsou jak vývojově regulovány, tak indukovány v odezvě na napadení hmyze a patogeny. V rostlinách byly nalezeny inhibitory serinových, cysternových, aspartátových proteas a metaloproteas, obzvláště v zásobních orgánech, jako jsou hlízy a semena. Nejběžnější a nej šíře studovanou skupinou rostlinných proteasových inhibitorů jsou ty, které inhibují zvířecí serinové proteasy, jež zahrnují • · · · ···· · · · · · · · • · · · · · 9 9 9 9 trypsin a chymotrypsin (viz Ryan (1990) Annu. Rev. Phytopathol. 28: 425-449).

Bílkovinné inhibitory cysteinových proteas snižují nebo eliminují katalytickou aktivitu cysteinové proteasy. Optimum pH cysteinových proteas je obvykle v rozmezí 3,5 - 7, což je rozsah pH v lumenu prostředního střeva hmyzu, jenž používá cysteinové proteasy. Mezi inhibitory cysteinových proteas převažuje cystatinová rodina, jež se dále dělí na čtyři pod-rodiny s ohledem na molekulovou hmotnost, počet disulfidovych vazeb, subcelulární lokalizaci, a charakteristiky primární struktury. Tento klasifikační systém je založen hlavně na informacích, jež se týkají obratlovcích a rostlinných cystatinů. Cystatiny byly testovány jak in vitro, tak in vivo proti hmyzu a nematodám.

Příkladů jiných bílkovinných inhibitorů cysteinových proteas existuje dnes velmi málo. Z brambor je známa jedna další rodina inhibitorů cysteinových proteas, jež patří k rodině rostlinných Kunitzových inhibitorů a jež rovněž zahrnuje inhibitory aspartátových proteas (Strukelj (1992) Biol. Chem. Hope-Seyler 373: 477-482; Krizaj et al. (1993) FEBS Letters 333: 15-22). Tento inhibitor, Kunitz PCPI8.3 je pevně se vážícím inhibitorem kathepsinu L (Ki = 0,07 nM) a dobrým inhibitorem papainu (Ki = 3,3 nM) . Úplně nový typ inhibitoru sulfhydrylových proteas byl isolován z Diabrotica virgifera (světový patent WO 95/24479). Tento inhibitor nemá žádnou strukturní podobnost s jinými inhibitory cysteinových proteas.

Nedávno se objevila nová třída inhibitorů cysteinových proteas. Tyto bílkoviny maj i společný rys opakované thyroglobulinové domény typu I (Malthiery a Lissitzky (1987)

Eur. J. Biochem. 165: 491-498). Z lidí byl isolován invariantní řetězec odvozený od p41 spojeného s lidským MHC • · · · ·· · · · · · · · · ··· · · · · « · · • · · · · · · 9 · · třídy II (Ogrinc et al. (1993) FEBS Letters 336: 555-559, Bevec et al. (1996) J. Exp. Med. 183: 1331-1338). Je pevně se vážícím inhibitorem kathepsinu L (Ki = 0,0017 nM) a dobrým inhibitorem papainu (Ki = 1,4 nM) . Podobný inhibitor cysteinových proteas s opakující se thyroglobulinovou doménou typu I byl isolován z lososích vajíček (Yamashita a Konagaya (1996) J. Biol. Chem. 271: 1282-1284). Konečně: Z mořského měkkýše Actinia equina byl isolován Podobný inhibitor cysteinových proteas, označený jako ekvistatin, s třemi opakujícími se thyroglobulinovými doménami typu I (Lenarcic et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 13899, Lenarcic et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 12682).

Kromě lidského invariantního řetězce, ECI (vaječného inhibitoru cysteinových proteas) a ekvistatinu mají domény homologní k opakujícím se thyroglobulinovým doménám typu I též části jiných bílkovin, včetně bílkovin jako jsou potkaní invariantní řetězec (McKnight et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17: 3983-3984), saxifilin (Morabito a Moczydlowski (1994) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 2478-2482), nidogen (Mann et al., (1989) EMBO J. 8: 65-72), epiteliální glykoprotein (Simon et al. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 2755-2759), IGFvážící protein-3 (Brewer et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 152: 1287-1289), testican (Alliel et al. , Eur. J. Biochem. 214: 347-350) a entactin (Durkin et al. (1988) J. Cell. Biol. 107: 2749-2756) (Obr. 3). Pro entactin a thyroglobulin bylo publikováno, že neinhibují cysteinové proteasy (Yamashita a Konagaya (1996) J. Biol. Chem. 271: 1282-1284). Tyto bílkoviny obsahují dané konservované sekvence a důvod proč neinhibují je temný.

Bílkovinné inhibitory aspartátových proteas snižují nebo eliminují katalytickou aktivitu aspartátové proteasy. Optimum pH aspartátových proteas je obvykle v rozmezí 2-5, což je pH rozmezí v těch částech střeva, kde jsou aspartátové proteasy aktivní. Je známo velmi málo bílkovinných inhibitorů aspartátových proteas. Jedna dobře charakterizovaná rodina inhibitorů kathepsinů D se nachází v bramborách a příbuzných Solanceae (Strukelj et al. (1992) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 373: 477-482). Nebyly publikovány žádné in vitro enzymatické testy nebo in vivo biotesty o použití bramborových inhibitorů aspartátových proteas proti hmyzu nebo nemátódám.

Australská patentová přihláška č. 36568/89 zveřejňuje, že zvířecí cystatiny (jako jsou cystatin slepičího vaječného bílku a kininogeny) a nízkomolekulární nepeptidové inhibitory cysteinových proteas (jako jsou E-64, antipain a leupeptin) mohou být účinné v kontrole řady brouků, kteří používají cysteinové proteasy k trávení.

WO 92/21753 zveřejňuje, že multicystatin, 8-doménový cystatin z brambor, je účinnější než jiné cystatiny při kontrole různého hmyzu, jenž používá cysteinové proteasy k trávení ve středním střevě, protože je odolnější k proteolýze karboxypeptidasami.

WO 96/16173 zveřejňuje, že modifikované cystatiny mohou ochraňovat rostliny proti nematodám.

WO 95/24479 zveřejňuje, že nový inhibitor thiolových proteas, isolovaný z kukuřičného červa a nazvaný virgiferin může ochraňovat rostliny proti hmyzu a nematodám, jež mají thiolové proteasy jako trávící enzymy.

Důkazy pro tyto nároky byly publikovány též ve vědecké literatuře pro různý coleopterní a hemipterní hmyz, jakož i

pro nematody (Chen	et al. (1992)	Protein	Express. Purification
3 : 41-	49, Edmonds	et al. (1996)	Entomol.	Exp. Appl. 78:	83-94,
Elden	(1995) J.	Econ. Entomol	. 88: 1586-1590, Orr	et al.
(1994)	J. Insect	Physiol. 40:	893-900,	Kurod et al.	(1996)
Biosci	Biotech.	Biochem. 60:	209-212,	Leplé et a.	(1995)

• · ·

Proč. Nati (1995) J.

Molecular Breeding 1: 319-328, Urwin et al. (1995) Plant. J.

8: 121-131). Ve vysokých koncentracích cystatiny způsobovaly mortalitu nebo snižovaly fertilitu a růst některých druhů hmyzu a nematod (Tabulka 1) . Avšak: Koncentrace inhibitorů cysteinových proteas potřebné k dosažení agronomicky zajímavých hladin ochrany v umělých dietách (200 - 2000 μΜ, viz Tabulku 1) jsou ve většině případů mnohem vyšší než lze dosáhnout v transgenních rostlinách (10 - 40 μΜ, viz Tabulku 1) a rovněž mnohem vyšší než aktuální koncentrace proteas, u nichž se očekává inhibice (10 - 30 μΜ). Vysoké koncentrace jsou potřebné nejpravděpodobně]i proto, že se neváží dostatečně pevně k různým molekulárním formám cysteinových proteas přítomných ve střevě. Slabé inhibitory mohou stále inhibovat proteasy, když jsou přítomné ve velkém nadbytku k protease. Odhaduje se, že ve střevě je aktivních něco mezi 10 a 30 různými proteolytickými enzymy a že může být aktivně indukována transkripce proteas, jež nejsou inhibovány, jako kompensace inhibice jiných proteas (Jongsma et al. (1995)

Acad. Sci. USA 92: 8041-8045, Bolter a Jongsma

Insect Physiol. 41: 1071-1078). Druhým důvodem chybějící toxicity může být nestálost v prostředí střeva a degradace proteasami, jež nejsou inhibovány.

Pouhá skutečnost, že proteasový inhibitor je inhibitorem cysteinových nebo aspartátových proteas tedy nutně neznamená, že bude účinný in vitro proti hmyzu, jenž používá tyto proteasy k trávení (viz též WO 92/21753) . Obecně lze říci, že je vzácné, když jednotlivý inhibitor inhibuje plně celé spektrum aktivit cysteinových nebo aspartátových proteas ve střevě hmyzu nebo nematod v normálních koncentracích, jichž lze v rostlinách dosahovat (10 - 40 μΜ) . Inhibitory, které současně inhibuji jak cysteinové, tak aspartátové proteasy • φ φφφφ φφ

- 10 φφ φφφ φ φφφ φφ φ φ φφ φφφφ φφφφ ΦΦΦ· ·· ·· ·· ·· ·· určitého hmyzu nebyly nikdy dříve popsány, i když jejich užitečnost je zřejmá, protože mnohý hmyz se u trávení spoléhá na kombinaci těchto dvou tříd proteolytických enzymů. Mnohý hmyz uváděný v Tabulce 1 se spoléhá na oba typy proteas a skutečnost, že tyto inhibitory jsou často nedostatečně toxické pro hmyz je pravděpodobně způsobována skutečností, že aspartátové proteasy zůstávají volné pro trávení bílkovin potravy a inhibitorů cysteinových proteas.

Tabulka 1. Inhibitory cysteinových proteas, jež ovlivňuji životní parametry hmyzu při podávání v potravě nebo při expresi v transgenních hostitelských rostlinách

Hmyz í druh	PI-hladina v potravě/ rostlině (μΜ)	Účinek	Odkaz
Umělá potrava doplněná cystatiny
Tríbolium castaneum (Col.)	10 000	35 % WR	Chen et al., 1992
Hepera postica (Col.)	200	RF	Elden 1995
Díabrotíca undecimpunctata (Col.)	100-200	40-70 % M	Edmonds et al., 1996
Díabrotíca undecimpunctata (Col.)	125 μg/cm2	50 % WR	Orr et al., 1994
Diabroti ca virgifera (Col.)	125 μ9/οιη2	50 % WR	Orr et al., 1994
Callosobruchus chinensis (Col.)	100 - 2 000	10-100 % M	Kuroda et al., 1996
Riptorus clavatus (Hem.)	100 - 2 000	0-100 % M	Kuroda et al., 1996
Transgenní rostliny exprimující cystatiny
Globodera pallida (Nemat.)	10 (rajče)	Prázdné cysty	Urwin et al., 1995
Chrysomela tremulae (Col.)	40 (poplar)	40 % M	Leple et al., 1995

WR = redukce hmotnosti, RF = snížená fertilita, M = mortalita.

- 11 ·· ♦· ·· 9999 99 99 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 99 99 99 99 99

Existuje dřívější literatura, která předvádí, že některé druhy hmyzu, jako mandelinka bramborová, jsou obzvláště necitlivé k proteasovým inhibitorům, i když jsou isolované z úplně nepříbuzných zdrojů, jako z rýže nebo člověka (Michaud et al. (1995) Insect Biochem. Mol. Biol. 25: 1041-1048, Michaud et al. (1996) Archives of Insects Biochemistry and Physiology 31: 451-464, Michaud et al. (1993) FEBS Letters

331: 173-176). Některé z těchto proteasových inhibitorů byly při testování proti jinému hmyzu shledány dosti účinnými (Leplé et a. (1995) Molecular Breeding 1: 319-328). U mandelinky bramborové však bylo zjištěno, že tyto inhibitory jsou buď příliš specifické pro pouze jeden typ proteasové aktivity nebo že jsou rozkládány aspartátovými proteasami.

Podstata vynálezu

Strukturní požadavky pro vyšší účinnost inhibitorů cysteinových nebo aspartátových proteas k střevním proteasám hmyzu nebo nematod jsou úplně neznámé. Rostliny, obzvláště příbuzné hostitelské rostlině, jsou špatným zdrojem účinných inhibitorů, protože hmyz proti nim vyvinul proteasy necitlivé k inhibitorům proteas. Inhibitory cysteinových proteas ze zdrojů jiných než rostliny je možné testovat, ale dosud nebyly popsány žádné bílkovinné inhibitory aspartátových proteas jiné než ze Solanaceae. Nejvíce žádoucí typ proteasových inhibitorů ke kontrole škodlivého hmyzu, používajícího cysteinové nebo aspartátové proteasy k trávení, aby současně inhiboval víc než 90 % obou aktivit u hmyzu, jenž se živí na hostitelské rostlině, tak, aby byl specificky zaměřen na proteasy necitlivé k proteasovým inhibitorům

- 12 • · • φ φφφφ φφ φφ φ φφ φ φφφφ φ φφ φ φφφφ φ φφ φφφφ φφφφ • ΦΦΦ φφ φφ «· φφ φφ hostitelské rostliny. V oboru nejsou takovéto inhibitory známé.

Nyní bylo zjištěno, že inhibitory cysteinových proteas, vybrané ze skupiny bílkovin, jež obsahují přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I, jsou účinné in vivo proti hmyzu nebo nematodám používajícím cysteinové proteasy a překvapivě bylo zjištěno, že řečené inhibitory jsou obzvláště aktivní k hmyzím cysteinovým proteasám, jež jsou necitlivé vůči inhibitorům cysteinových proteas, odvozených z hostitelské rostliny. Takováto vlastnost nemá předchůdce u jiných typů inhibitorů cysteinových proteas, včetně inhibitorů nerostlinného původu. Výsledně jsou řečené inhibitory vysoce toxické například k larvám mandelinky bramborové.

V jednom ohledu se tento vynález týká způsobu ochrany rostliny nebo části řečené rostliny proti napadení jedním nebo více hmyzy nebo nematodami, jež mají trávící cysteinové proteasy, přičemž způsob zahrnuje presentaci inhibičního množství inhibitoru cysteinové proteasy, vybraného ze skupiny bílkovin, jež obsahují přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I, na lokusu, kde řečený hmyz nebo nematody mají být kontrolovány.

Dále: Nyní bylo zjištěno, že některé opakující se thyroglobulinové domény typu 1 mohou být účinné rovněž proti aspartátovým proteasám. Je velmi cenné, že aktivity proti aspartátovým proteasám a cysteinovým proteasám jsou přítomné na podobných strukturních doménách a mohou být kombinovány v jedné bílkovině, jako ekvistatin, protože je vynálezci zjištěno, že působí synergicky úplnější inhibici všech hmyzích proteasových aktivit.

V souladu s tím se druhý aspekt vynálezu týká inhibitorového peptidu opakující se thyroglobulinové domény typu I, přičemž řečený peptid má aminokyselinovou sekvenci

- 13 φφ ·· fr Φ Φ 4 Φ Φ 1 • Φ φφφφ » ΦΦ Φ Φ Φ

Φ· ΦΦ pokrývající aminokyselinové posice 68 - 199 ekvistatinu z Obr. 1, nebo modifikovaného aspartátově-proteasového inhibitorového peptidu opakující se thyroglobulinové domény typu I, přičemž řečený modifikovaný peptid má v podstatě aminokyselinovou identitu s aminokyselinovými posicemi 68 199 ekvistatinu, nebo úseků peptidu majícího v podstatě aminokyselinovou identitu s aminokyselinovými posicemi 68

199 ekvistatinu, přičemž řečený modifikovaný peptid je funkčním ekvivalentem k řečeným aminokyselinovým posicím 68 199 ekvistatinu v inhibiční aktivitě k aspartátovým proteasám.

Ve třetím ohledu se vynález týká insekticidního nebo nematocidního prostředku obsahujícího bílkovinu, jež obsahuje přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I, přičemž prostředek je schopen zlepšit odolnost rostlinné tkáně jinak podléhající napadení jedním nebo více hmyzy nebo nematodami, jež mají trávící cysteinové nebo aspartátové proteasy.

V souladu s tím vynález poskytuje zemědělský prostředek obsahující nosič a hmyz nebo nematody kontrolující nebo napadající množství inhibitoru cysteinové nebo aspartátové proteasy, jak je zde definován.

Ve čtvrtém ohledu se vynález týká vektorů kódujících a schopných exprimovat jednu nebo více opakujících se thyroglobulinových domén typu I v rostlinné buňce.

V souladu s tím vynález poskytuje biologicky funkční prostředek exprese obsahující promotor účinný v řízení exprese pod nim zařazené kódující sekvence v rostlinných buňkách, přičemž kódující oblast DNA kóduje v rostlinných buňkách expresi bílkoviny složené z přinejmenším jedné opakující se thyroglobulinové domény typu I, a terminační sekvenci účinnou v terminaci transkripce nebo translace produktu genetické konstrukce v rostlinných buňkách, přičemž genetická konstrukce

9 9 9 1 • 9 9 9 1

9 9 9 9 4

9 9 9 9 4

99 99

- 14 99 99 » 9 9 9 • 9 « • 9 9*99

9999 99 do genomu dané sekvence kóduje rostliny, bílkovinu, účinně exprimuje v daných buňkách dané rostliny kontrolující množství bílkoviny obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I.

Dále vynález poskytuje způsob ochrany rostliny nebo části řečené rostliny proti napadení hmyzem nebo nematodou zahrnující zavedení rostlinné sekvence přičemž zavedená rostlinná jež obsahuje přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I s promotorovou sekvencí aktivní v dané rostlině pro způsobení exprese řečené bílkoviny v hladinách, jež poskytují hmyz nebo nematodu kontrolující množství řečené bílkoviny.

Řečený způsob obzvláště zahrnuje kroky

a) kultivace buněk nebo tkání z dané rostliny,

b) zavedení do buněk nebo tkáně alespoň jedné kopie genu kódujícího bílkovinu obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I,

c) regenerace resistentní celé rostliny z kultury buněk nebo tkání.

V pátém ohledu se vynález týká transformovaných buněk a buněčných kultur buněk, jež mají geny kódující peptid, jenž obsahuje jednu nebo více opakujících se thyroglobulinových domén typu I, schopný ochrany rostlinné tkáně jinak podléhající napadení jedním nebo více hmyzy nebo nematodami, jež mají trávící cysteinové nebo aspartátové proteasy.

Dále vynález poskytuje transgenní rostlinu a její pohlavní potomstvo resistentní k napadení jedním nebo více hmyzy nebo nematodami, jež mají trávící cysteinové proteasy, přičemž řečená transgenní rostlina exprimuje hmyz nebo nematody kontrolující množství bílkoviny obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I.

- 15 *9 99*9 ** *9 9999 ·9 99 · · 9 9 9 9 9 9 9 4

999 99 · 9 9 9 i

999 9 999 99 4

99 9 9 9 9 999« <999 99 99 99 99 99

V šestém ohledu se vynález týká způsobu výroby insekticidního nebo nematocidního prostředku peptidu obsahujícího jednu nebo více opakujících se thyroglobulinových domén typu I, přičemž řečený prostředek je schopen zlepšení odolnosti rostlinné tkáně jinak podléhající napadení jedním nebo více hmyzy nebo nematodami, jež mají trávící cysteinové nebo aspartátové proteasy.

Řada aspektů vynálezu je dále vysvětlena v doprovodných obrázcích, v nichž:

Obrázek 1 ukazuje nukleotidovou sekvenci a odvozenou aminokyselinovou sekvenci ekvistatinového genu z Actinia equina L.

Obrázek 2 ukazuje srovnání všech tří domén cDNA kódovaných aminokyselinových sekvencí ekvistatinu a purifikované ekvistatinové bílkoviny z Actinia equina L. s aminokyselinovými sekvencemi jiných bílkovin s opakujícími se thyroglobulinovými doménami typu I se známou a neznámou aktivitou inhibice proteas.

Obrázek 3 ukazuje in vitro účinky velké řady různých inhibitorů cysteinových proteas na cysteinové proteasy larev mandelinky bramborové (Leptinotarsa decemlineata), jež jsou necitlivé k endogenním inhibitorům cysteinových proteas hostitelské rostliny, brambor.

Obrázek 4 ukazuje účinky ekvistatinu na růst a mortalitu larev mandelinky bramborové.

Obrázek 5 ukazuje účinek ekvistatinu v porovnání s jinými inhibitory cysteinových proteas na in vitro proteolytickou aktivitu třásněnky západní Frankliniella occidentalis.

Obrázek S ukazuje účinek ekvistatinu na produkční plodnost samiček třásněnek dva dny po umístění na potravu obsahující inhibitor.

Obrázek 7 ukazuje mapu plasmidu pB3-ekvistatin.

- 16 • 99

Obrázek 8 ukazuje konstrukci plasmidu pCABl-ekvistatin.

Obrázek 9 ukazuje HPLC analýzy ekvistatinu. Chromatogramy ukazují HPLC eluční profil ekvistatinu po inkubaci s různými enzymy. V panelu A byl ekvistatin inkubován s kathepsinem D v konečné molární koncentraci 2 : 1, a v panelu B byl ekvistatin fragmentován s použitím 1 % (hmotn./hmotn.) β-trypsinu. Identity vrcholů jsou založeny na N-koncových sekvencích.

Obrázek 10 ukazuje elektroforetické analýzy ekvistatinu. A, SDS-PAGE rozštěpeného ekvistatinu. Dráhy: 1, standardy molekulové hmotnosti, 2, první doména ekvistatinu (eq d-1), 3, spojená druhá a třetí doména ekvistatinu (eq d-2,3). B, nativní PAGE tvorby komplexu ekvistatin-kathepsin D. Dráhy: 1, kathepsin D, 2, ekvistatin a kathepsin D smíchány dohromady 3 0 minut před elektroforesou, 3, ekvistatin. Gely byly vybarveny Coomassie blue.

Obrázek 11 ukazuje schematický diagram funkce použitých fragmentů ekvistatinu. Místa proteolytického štěpení jsou ukázána jako mezery a vyznačena čísly aminokyselin. Štěpící místa získaná působením β-trypsinu jsou ukázána šipkami. Párování cysteinových zbytků v disulfidových vazbách je ukázáno vodorovnou čarou spojující cysteinové zbytky.

Obrázek 12 ukazuje titraci aktivního místa ekvistatinu kathepsinem D. Inhibice 77 nM kathepsinu D rostoucími koncentracemi nativního ekvistatinu. Zbytková aktivita je vyjádřena jako procento kontrolní aktivity ve vzorcích neobsahujících žádný inhibitor.

Obsah všech odkazů zde citovaných je zde zahrnut odkazem.

Nyní bylo stanoveno, že mezi opakujícími se thyroglobulinovými doménami typu I existují domény, jež jsou aktivní vůči aspartátovým proteasám jak lidského, tak hmyzího

1Ί 9 9 99 99

9 9 9 9 původu. V kombinaci s bílkovinami (fragmentem invariantního řetězce P41 a doménou I ekvistatinu) s doménami, jež jsou aktivní vůči cysteinovým proteasám mají silnou inhibiční aktivitu vůči trávícím „k proteasovým inhibitorům necitlivým cysteinovým a aspartátovým proteasám v širokém rozsahu hmyzích druhů náležících k různým hmyzím řádům včetně mandelinky bramborové, třásněnek, minujících druhů a červů. Při enterálnim podávání jsou larvicidální vůči larvám hmyzu majícího trávící cysteinové a aspartátové proteasy, jako je mandelinka bramborová a silně snižují produktivní plodnost hmyzu, jež při trávení bílkovin závisí hlavně na cysteinových proteasách. Prokazuje se, že tato vlastnost opakující se thyroglobulinové domény typu I je unikátní ve velice širokém souboru inhibitorů cysteinových a aspartátových proteas, odvozeném téměř ze všech známých typů inhibitorů cysteinových a aspartátových proteas. Proto se prokazuje, že nepostačuje, jak se navrhovalo dříve, používat inhibitory, jež mají velkou evoluční vzdálenost od rostlin, protože ty jsou stejně neaktivní jako inhibitory odvozené z rostlin. Namísto toho pouze inhibitory cysteinových nebo aspartátových proteas obsahující konservované vlastnosti opakující se thyroglobulinové domény typu I byly schopné plně inaktivovat „PI-necitlivé cysteinové a aspartátové proteasy různých druhů hmyzu. Tento vynález tedy poskytuje způsob zabíjení hmyzu a nematod, jež mají „k proteasovým inhibitorům necitlivé trávící cysteinové nebo aspartátové proteasy, včetně larev mandelinky bramborové, přičemž způsob zahrnuje enterální podávání larvicidálního nebo nematocidálního množství bílkoviny obsahující jednu nebo více opakujících se thyroglobulinových domén typu I larvám nebo nematodám v závislosti na tom, zda daný hmyz používá jednu nebo více tříd proteas pro trávení.

• · · · · · • · · · · · *99 >9 9

9* 9 9 9 9 9

99 99

- 18 Definice pojmů

Pojmy inhibitor proteas a inhibitor proteinas se považují za ekvivalentní. Výraz „proteasa necitlivá k inhibitoru je míněn k označení takové proteasy, jež je necitlivá k proteasovým inhibitorům hostitelské rostliny tvořícím se v obraně proti napadajícím škůdcům, ale není míněn tak, že by vylučoval, že proteasa může být inhibována proteasovými inhibitory isolovanými ze zdrojů jiných než hostitelská rostlina. Výrazům hmyz a larva, i když nejsou ekvivalentní pokud se užívají specificky, je třeba rozumět tak, že zahrnují jak dospělé, tak larvální formy některého druhu, pokud se užívají obecně. Tedy: Výrazu hmyzí resistence je třeba rozumět tak, že zahrnuje resistenci k larválním formám i dospělým, obzvláště když hubení larev vede k odpovídající nepřítomnosti dospělých forem.

Ve výhodném provedení je vynález zaměřen na inhibitory cysteinových/aspartátovych proteas z mořského měkkýše Actinia equina, na něž se odkazuje rovněž jako na „ekvistatin . Pro účele tohoto vynálezu je „ekvistatin míněn tak, že zahrnuje bílkovinu kódovanou genem majícím sekvenci udávanou v Obrázku l a její funkční deriváty. Ekvistatinový peptid, jenž byl purifikován z měkkýše Actinia equina vykazoval přítomnost tří opakujících se thyroglobulinových domén typu I (Lenarcic et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 13899, Lenarcic et al. (1997) J. Biol. Chem. 273: 12682). Prohledání knihovny cDNA z Actinia equina radioaktivně značenou sondou získanou PCR s použitím dvou degenerovaných primerů na celkovou cDNA vedlo ke klonu s kódující sekvencí obsahující signální peptid k sekreci a maturní bílkovinnou část o třech doménách téměř shodné bílkovinné sekvence ve srovnání s purifikovanou bílkovinu.

Primery k amplifikaci ekvistatinové cDNA:

EI-degl: CT (A, C, G, T) AC (A, C, G, T) AA (A, G) TG (T, C) CA (A, G) CA (A, G) EI-deg2:

ATT (A, G) AC (A, C, G, T) TG (A, C, G, T) GG (A, C, G, T) CG (TC) TT (A, G) AA

Jak lze vidět v Obrázcích 1 a 2, složka maturní bílkoviny ekvistatinu je složena ze 3 domén, jež se zdají být důsledkem duplikace genetického materiálu. Podle předběžné analýzy sekvence cDNA se může v Actinia equina vyskytovat několik strukturních isoforem ekvistatinu. Dané 3 domény zahrnují 22 kD polypeptid. Každá doména obsahuje asi 65 - 68 aminokyselin, s předpokládanými třemi disulfidovými vazbami. Podle sekvence domén je zřejmé, že daná bílkovina je členem konservovaného typu I opakujících se thyroglobulinových domén a obsahuje opakující se domény typu I. Konkrétně sekvence těchto domén vykazují vysokou konservaci aminokyselinové sekvence Cys- (Xxx) ₁₈.₂₉-Pro-Xxx-Cys- (Xxx) ₃-Gly- (Xxx) _S-Gln-Cys(Xxx) ₆-Cys-Thr-Cys-(Xxx) ₃-Gly- (Xxx) ₁₀.₁₅-Cys . Inhibitor o třech doménách purifikovaný z Actinia equina byl proteolyticky štěpen na dva hlavní peptidy a rozdělen HPLC s reversní fází. Stanovení N-konců obou fragmentů umožnilo jejich lokalizaci v sekvenci. Jeden peptid, nazvaný eq d-1, sestával z první domény probíhající od zbytku 1 do 67, zatímco druhý peptid, ♦

nazvaný eqd-2,3, obsahoval domény 2 a 3 se zbytky 68 - 199.

> Intaktní ekvistatinová molekula může být inhibována pouze jednou molekulou papainu a jednou molekulou kathepsinu D.

Inhibiční testy s Eqd-1 a Eqd-2,3 určily, že Eqd-1 může být inhibována jen papainem a Eqd-2,3 jen kathepsinem D. Inhibiční konstanty pro separované domény byly podobné intaktní ekvistatinové molekule. To prokázalo, že i když se tyto domény zdají být strukturně konservované, specifity k proteasám

- 20 • · ·· divergovaly k úplně odlišným třídám proteas. S existujícími důkazy není možné zjistit které zbytky určují tento rozdíl ve specifitách.

Musí se chápat, že za daných znalostí lze syntetizovat nebo isolovat v podstatě čisté funkční deriváty přirozeně se vyskytujících ekvistatinových molekul. „Funkční derivát ekvistatinu je sloučenina, jež má biologickou aktivitu v podstatě podobnou biologické aktivitě ekvistatinové molekuly. Výraz funkční derivát je zamýšlen tak, že zahrnuje „fragmenty nebo „účinně homologní varianty .

„Fragment molekuly je míněn tak, že odkazuje na inhibiční polypeptidový sub-soubor ekvistatinové molekuly.

„Účinně homologní varianty molekuly, jako je ekvistatinová molekula, jsou míněny tak, že odkazují na molekulu v podstatě podobnou v sekvenci a funkci bud' celé molekule, nebo jejímu fragmentu. Pro účele tohoto vynálezu jsou tyto molekuly identifikovány tím, že obsahují opakující se thyroglobulinovou doménu typu I. Obecně musí účinně homologní sekvence zachovat vysokou konservaci v přirozeně se vyskytujících posicích konservované sekvence Cys-(Xxx) ₁₈_₂₉-ProXxx-Cys- (Xxx) ₃-Gly- (Xxx) _S-Gln-Cys- (Xxx) ₆-Cys-Thr-Cys- (Xxx) ₃-Gly(Xxx) ₁₀_₁₅-Cys. Dva cysteiny na koncích konservované sekvence jsou konservovány, ale nemají konservované posice. Pravděpodobně však vytvářejí strukturně důležité disulfidové můstky s kterýmkoli z jiných cysteinů, což je důvod proč jsou zahrnuty. Pro účele tohoto vynálezu je struktura jedné aminokyselinové sekvence ucmne homologní k druhé aminokyselinové sekvenci když alespoň 70 procent, s výhodou alespoň 80 procent, a nejvýhodněji alespoň 90 procent aktivní části aminokyselinové sekvence je shodných nebo ekvivalentních. Obecné kategorie potenciálně ekvivalentních aminokyselin jsou udány níže, přičemž aminokyseliny uvnitř ♦ · · · • ·

- 21 skupiny mohou být substituovány jinou aminokyselinou této skupiny: 1) kyselina glutamová a asparagová, 2) lysin, arginin a histidin, 3) alanin, valin, leucin a isoleucin, 4) asparagin a glutamin, 5) threonin a serin, 6) fenylalanin, tyrosin a tryptofan, a 7) glycin a alanin. Významněji a kritičtěji pro definici, funkce druhé aminokyselinové sekvence je účinně homologická s jinou aminokyselinovou sekvenci když druhá aminokyselinová sekvence vyhovuje terciární struktuře mající schopnost snižovat nebo eliminovat katalytickou aktivitu trávící cysteinové nebo aspartátové proteasy.

Jak se zde používá, výraz „v podstatě čistý je míněn tak, že popisuje bílkovinu obsahující alespoň jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I, jež je homogenní podle ještě jedné charakteristiky čistoty nebo homogenity. Například: V podstatě čistá molekula ekvistatinového peptidů bude vykazovat konstantní a reprodukovatelné charakteristiky v rámci standardní experimentální odchylky pro parametry jako jsou molekulová hmotnost, chromatografické chování a podobně. Výraz však není zamýšlen tak, aby vylučoval umělé nebo syntetické směsi molekul ekvistatinového peptidů s jinými sloučeninami. Výraz rovněž není zamýšlen tak, aby vylučoval přítomnost menších znečištění, jež neinterferují s biologickou aktivitou molekuly ekvistatinového peptidů a jež mohou být přítomné například z důvodu neúplné purifikace. V podstatě čisté molekuly ekvistatinového peptidů mohou být isolovány ze zdroje, v němž přirozeně existují, jakoukoli patřičnou technikou purifikace bílkovin. Příklady technik zahrnují chromatografické techniky, jako je gelová filtrace kapalinové chromatografie, ionexová chromatografie, afinitní chromatografie, vysoce výkonná kapalinová chromatografie, chromatografie s reversní fází nebo použití imunologických činidel používajících anti-ekvistatinové protilátky.

- 22 • · · · · A A · A A A A • * * · A * A AAAA ···· ·« ·· AA AA AA

Isolace genu

Ekvistatinový peptid je možné syntetizovat in vitro z aminokyselin, z nichž je složen (viz Merrifield (1963),

J. Amer. Chem. Soc., 85: 2149-2154, a Solid Phase Peptide

Synthesis (1969), (ed.) Stewart a Young). Takto připravené peptidy lze isolovat a purifikovat postupy dobře známými v oboru (viz Current Protocols in Molecular Biology (1989), (ed.) Ausubel et al., a Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual).

I když je možné stanovit a syntetizovat celou aminokyselinovou sekvenci ekvistatinového peptidu, je výhodné isolovat celou sekvenci ekvistatinového genu. DNA kódující ekvistatinový peptid může být připravena z chromosomální DNA, cDNA nebo z DNA syntetického původu s použitím dobře známých technik.

Genomová DNA kódující ekvistatinový peptid může být isolována standardními technikami (Sambrook et al. (1989), výše). Konkrétně zamýšleny jako část tohoto vynálezu jsou genomové DNA sekvence kódující alelické variantní formy ekvistatinového genu, jakož i jejich 5' a 3' přilehlé oblasti.

Rovněž je možné použít primery a exponenciálně amplifikovat DNA in vitro s použitím sekvenčně specifických oligonukleotidů a polymerasové řetězové reakce (PCR) (viz Mullis et al.

(1987), Meth. Enz,, 155: 335-350, Horton et al. , (1989), Gene

77: 61, a PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, (ed.) Erlich (1989)).

Preparáty cDNA se zaligují do rekombinantních vektorů za tvorby genové knihovny. Alternativně mohou být cDNA exprimovány ve vektoru jako je lambda gtll a knihovna

- 23 • · · * ·· ·· c · · · · · · >··» ··· · · * 9 · · • · ·«· · · · · · · · • · · ♦ · ♦ · · · * · ···· ·· ·· ·· ·· ·· prohledávána s použitím protilátek proti molekule ekvistatinového peptidu.

K prohledávání knihoven genomové DNA nebo cDNA mohou být v technikách, dobře známých v oboru, používány vhodné oligonukleotidy, soubor oligonukleotidů nebo z PCR odvozené fragmenty DNA. K umožnění detekce žádoucí sekvence může být DNA sonda značena jakýmkoli materiálem majícím detekovatelnou fyzikální nebo chemickou vlastnost. Obecné postupy pro isolaci, purifikaci a sekvenování žádoucích sekvencí jsou v oboru dobře známé (viz Current Protocols in Molecular Biology, (1989), výše a Sambrook et al. (1989), výše).

Alternativní cestou získání genetické sekvence, jež je schopna kódovat alespoň jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I, je její příprava oligonukleotidovou syntézou poté, co je sekvence genu, o nějž je zájem, stanovena (viz Caruthers (1983), v Methodology of DNA and RNA, (ed.) Weissman, Beaucage et al. (1981), Tetrahedron Letters 22:

1859-1962). Může být syntetizována série oligonukleotidů tak, aby poskytovala sérii překrývajících se fragmentů a pak hybridizována a ligována dohromady s použitím dobře známých technik (viz Sambrook et al. (1989), výše). Alternativně může být gen vytvořen syntézou primeru majícího takzvaný „vlající konec , jenž se nehybridizuje k cílové DNA: Pak se genomové sekvence amplifikují a spojí dohromady extensí překryvů (viz Horton et al., (989), Gene 77: 61-68). Výsledný fragment DNS o předpověděné velikosti se isoloje elektroforesou a liguje do vhodného klonovacího vektrou k amplifikaci a další manipulaci (viz Mullis et al. (1987), výše a Principles and Applications for DNA Amplification, (1989), výše).

Samozřejmě lze do isolovaných sekvencí inkorporavat modifikace, včetně adice, delece, nebo nekonservativní substituce omezeného počtu různých nukleotidů nebo

- 24 • » » · · konservativní substituce mnoha nukleotidů, za předpokladu, že se zachová správný čtecí rámec. V patřičných bodech se přidaj i signály translačního ukončení a startu a na konce se přidají sekvence vytvářející vhodná klonovací místa. Příklady technik pro modifikaci oligonukleotidových sekvencí zahrnují požití řízené mutagenese s zprostředkované polynukleotidy (viz Zoller et al. (1984, DNA 3: 479-488, Higuchi et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16: 7351-7367, Ho et al., (1989), výše, a Principles and Applications for DNA Amplification, (ed.) Erlich (1989) .

Genová exprese

Pro další charakterizaci takovýchto genetických sekvencí je žádoucí zavedení dané sekvence do vhodného hostitele k expresi bílkovin, jež tyto sekvence kódují, a potvrzení, že obsahují charakteristiky ekvistatinovývh peptidových molekul. Techniky pro takovou manipulaci jsou dobře známé a jsou zveřejněny Sambrookem et al. (1989), výše.

Vektory k transformaci virů, prokaryotických a eukaryotických buněk jsou dostupné, nebo mohou být snadno připraveny. Obecně musí plasmidové nebo virové vektory obsahovat všechny řídící DNA sekvence potřebné jak k udržování, tak k expresi heterologní DNA sekvence v daném hostiteli. Takovéto řídící sekvence obecně zahrnují promotorovou sekvenci, tranckripční start nebo zaváděcí sekvenci, sekvenci DNA kódující signál kodonu translačního startu, translační terminační kodon, a sekvenci DNA kódující 3' netranslatovanou oblast obsahující signály řídící terminaci RNA syntézy nebo modifikaci messenger RNA. Konečně je žádoucí, aby vektory měly markerový gen, jenž je schopen poskytovat • · ····

0 0 0

- 25 fenotypovou vlastnost, která dovoluje identifikaci hostitelských buněk obsahujících daný vektor, a v případě monokotní transformace, intron v 5' netranslatované oblasti, např. intron 1 z genu kukuřičné alkohol dehydrogenasy, jenž zvyšuje rovnovážné hladiny mRNA.

Příklady hostitelských buněk zahrnují prokaryotní a eukaryotní organismy. Vhodné postupy k transformaci vybrané hostitelské buňky mohou být nalezeny v souladu s použitou hostitelskou buňkou. Podle současných zkušeností se rozdíly v expresi genů zavedených do buněk, jež by bylo možné přičítat samotnému způsobu transformace, zdají být malé.

Konvenční technologie pro zavádění biologického materiálu do hostitelských buněk zahrnují elektroporaci (viz shigekawa a dower (1988), Biotechniques 6: 742, Miller et al. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 856-860, a Powell et al. , Appl. Environ. Microbiol. 54: 655-660), mechanismus přímého zachycení DNA (viz Mendel a Giga (1972) J. Mol. Biol. 53: 159162, Dityatkin et al. (1972) Biochimica et Biophysica Acta 281: 319-323, Wigler et al. (1979) Cell 16: 77, a Uchimiya et al. (1982) v Proč. 5^th Intl. Conf. Plant Tissue and Cell Culture, ed. A. Fujiwara, Jap. Assoc. for Plant Tissue Culture, Tokyo, str. 507-508), fúzní mechanismus (viz Uchidax et al. (1980) v Introduction of Macromolecules into Viable Mammalian Cells, ed. C. Baserga, G. Crose, a G. Rovera, Wistar Symposium Series, sv. 1, A. R. Liss lne., NY, str. 169-185), infekční agens (viz Fraley (1986) CRC Crit. Rev. Plant Sci. 4: 1-46, a Anderson (1984) Science 226: 401-409), mikroinjekční mechanismus (viz Crossway et al.. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 179-185) a mechanismus s projektily o vysoké rychlosti (viz EPO 0 405 696) .

• · ··· ·

- 26 na expresi molekuly funkčních derivátů „imunoblotová analýza,

Trnsformati se usolují podle konvenčních metod, obvykle s použitím selekční techniky, jež umožňuje selekci žádoucích organismů proti nemodifikovaným organismům. Obecně po transformaci se hostitelské buňky rozrůstají po asi 48 hodin k umožnění exprese markerových genů. Buňky se pak dají do selekčního nebo „probíracího média, kde se netransformované buňky rozliší od transformovaných bud' podle zániku nebo biochemické vlastnosti. Selektované buňky mohou být hodnoceny ekvistatinového peptidů nebo jeho testovacími technikami, jako je test inhibiční aktivity, ELISA, radioimunologické stanovení nebo analýza na fluorescenčně aktivovaném buněčném sorteru, imunohistochemicky a podobně. Transformované tkáně jsou pak testovány na aktivitu v kontrole hmyzu.

Hostitelské buňky mohou být transformovány k poskytnutí zdroje, z nějž lze isolovat významná množství vektoru obsahujícího gen, jenž je předmětem zájmu, k následnému zavedení do žádoucích buněk, nebo k expresi a isolaci významných množství bílkoviny. Příklady rekombinantních hostitelských buněk zahrnují jednobuněčné prokaryontní a eukaryontní kmeny. Prokaryontní mikrobi, jež mohou být použity jako hostitelé, zahrnují Escherichia coli a jiné Entrobacteriaceae, Bacilli a různé druhy Pseudomonas. Běžné eukaryontní mikrobi zahrnují Saccharomyces cerevisiae a Pichia pastoris. Běžné vyšší eukaryontní hostitelské buňky zahrnují buňky Sp2/0 nebo CHO. Jiným výhodným hostitelem jsou hmyzí buňky, například z larev Drosophila, v nichž vektor obsahuje Drosophila promotor alkohol dehydrogenasy.

Alternativně mohou být bakulovirové vektory, například virus jaderné polyhedrosy Autographa californica (viz Miller et al. (1983) Science 219: 715-721) sestaveny tak, aby

- 27 • · φ φ * φ φ φφφφ φφφ φ» φ φφφφ φφ φφφ φ φφφ φφ φ φ φφ φφφφ φφφφ φφφφ φφ Φ· φφ φφ φφ exprimovaly velká množství molekul ekvistatinového peptidu nebo jeho funkčních derivátů v kultivovaných hmyzích buňkách (viz Andrews et al. (1988) Biochem J. 252: 199-206).

Zemědělské prostředky

Tento vynález poskytuje zemědělský prostředek k aplikaci na rostliny nebo jejich čsáti, jež podléhají napadení hmyzem nebo nematodami, majícími trávící cysteinové proteasy, přičemž řečený zemědělský prostředek zahrnuje bílkovinu obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I. Daný zemědělský prostředek bude často obsahovat zemědělsky přijatelný nosič. Výrazem „zemědělsky přijatelný nosič je míněna látka, jež může být použita k rozpuštění, dispergování nebo difusi aktivní sloučeniny v prostředku bez poškození účinnosti dané sloučeniny a jež sama o sobě nemá škodlivý účinek na půdu, zařízení, úrodu nebo agronomické prostředí.

Zemědělský prostředek může být aplikován v široké řadě forem včetně prášků, krystalů, suspensí, prachů, pelet, granulí, kapslí, mikrokapslí, aerosolů, roztoků, gelů nebo jiných dispersí. Navíc k patřičným kapalným nebo tuhým nosičům mohou prostředky zahrnovat adjuvans, jako jsou emulgační a zvlhčovači činidla, činidla pro rozstřik, dispergační činidla, adhesiva, nebo činidla, jež stimulují krmení hmyzu podle konvenčních zemědělských praktik. Adjuvans pro formulování insekticidů jsou dobře známé zběhlým v oboru.

Koncentrace bílkoviny obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I bude široce kolísat v závislosti na povaze konkrétního přípravky, zejména na tom, zda jde o koncentrát nebo o přímé používání. Bílkovina obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou

- 28 • · · » ft · » · · ft · • ftft (například mikrobiálních transformovaných genem jež je terčem byli schopni k pozření, bílkoviny doménu typu I bude obecně přítomna v alespoň 1 procentu podle hmotnosti a může tvořit až 100 procent hmotnosti.

Presentace zemědělského prostředku může být dosažena externí aplikací bud' přímo, anebo do blízkosti rostlin nebo částí rostlin. Zemědělské prostředky mohou být aplikovány do prostředí hmyzího škůdce (hmyzích škůdců), např. půdy nebo vody, pomocí sprej ování, práškování, kropení a podobně.

Vynález dále uvažuje použití rekombinantních hostitelů hostitelů a hmyzích virů) kódujícím bílkovinu obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I, a aplikaci na nebo poblíž vybrané rostliny nebo rostlinných částí podléhajících útoku hmyzu, zásahu. Hostitelé jsou vybráni tak, aby kolonizovat rostlinnou tkáň podléhající napadení hmyzem, anebo se aplikují jako mrtvé nebo neživotaschopné buňky obsahující bílkovinu obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I. Mikrobiálními hostiteli obzvláštního zájmu budou prokaryonty a nižší eukaryonty, jako jsou houby.

Charakteristiky mikrobiálních hostitelů uzavírajících bílkovinu obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I zahrnují ochranné kvality pro tuto bílkovinu, jako je silná buněčná stěna, pigmentace a intracelulární sbalení nebo tvorba inklusních tělísek, afinita k listům, netoxičnost pro zvířata, atraktivita pro škůdce snadnost umrtvení nebo obsahující přinejmenším thyroglobulinovou doménu typu I, k prodloužení aktivity bílkoviny obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I. Charakteristiky mikrobiálních hostitelů ke kolonizaci rostliny zahrnují fixace bez poškození jednu opakující se a schopnost úpravy • · ···· • ·

- 29 absenci fytotoxicity, snadnost zavedení genetické sekvence kódující bílkovinu obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I, dostupnost systémů exprese, účinnost exprese a stabilita insekticidu v hostiteli.

Ilustrativní prokaryonty, jak Gram-negativní, tak -positivní, zahrnují Enterobacteriaceae, jako jsou Escherichia, Bacillaceae, Rhizoboceae jako je Rhizobium a Rhizobacter, Spirilaceae (jako je fotobakterium), Zymmonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum, Lactobacillaceae, Pseudomonadceae (jako je Pseudomonas a Acetobacter) , Azotobacteriaceae a Nitrobacteriaceae. Mezi eukaryonty jsou houby (jako Phycomycetes a Ascomycetes), jež zahrnují kvasinky (jako Saccharomyces a Schizosaccharomyces) , a Bas idiomycetes kvasinky (jako je Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces) a podobně.

Vynález rovněž uvažuje použití bakulovirů obsahujících gen kódující bílkovinu obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I. Bakuloviry, zahrnující bakuloviry, jež infikují hmyz (motýly, mouchy) Heliothis virescens, Orgyla pseudotsugata, Lymantria dispar, Autographica californica, Neodiprion serfiter a Laspeyresia pomonella, jsou registrovány a používány jako pesticidy (viz

US 4 745 051 a EP 175 852).

Rekombinantní hostitel může být formulován v řadě způsobů. Může být používán ve zvlhčitelných prášcích, granulích nebo prachu, nebo míchán s různými inertními materiály, jako jsou anorganické minerály (fylosilikáty, uhličitany, sírany, fosfáty, a podobně) nebo botanickými materiály (práškované kukuřičné palice, rýžové plevy, ořechvé slupky, a podobně). Přípravky mohou zahrnout adjuvans k šíření/přichycení, stabilizační činidla, jiné insekticidní přídatné povrchově • · · · 9 ·

9

9

- 30 99·· 9 9 aktivní látky, bakteriální živiny nebo jiné látky k podpoře růstu nebo stability bakteriálních buněk. Kapalné přípravky mohou být vodné nebo nevodné, a používány jako pěny, gely, suspense, emulgovatelné koncentráty, nebo podobně. Složky mohou zahrnovat rheologická činidla, povrchově aktivní látky, emulgátory, dispersanty, nebo polymery.

Transgenní rostliny

Alternativně může být bílkovina obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I inkorporována do tkáni přijímající rostliny tak, že v průběhu napadení rostliny hmyz konsumuje hmyz-kontrolující množství vybrané bílkoviny obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I. Tento způsob nabízí obzvláštní výhody při zasahování rostlinné hmyzem nebo nematodami, jež je travene obtížné existuj í normálně tkáně velmi dosáhnout konvenční aplikací pesticidů. Navíc důležité ekonomické a environmentální výhody, jež se získají když se může snížit potřeba aplikace pesticidů.

Tento způsob rovněž poskytuje výhody, když se uváží potenciál hmyzu stát se resistentním. Silná aplikace insekticidnich materiálů obecně na pole nebo geografickou oblast prachem nebo sprejem nebo inkorporací do půdy má tendenci navozovat silný selekční tlak, protože hmyz nemá žádný „azyl , kde by mohli přežívat neresistentní jednotlivci. Avšak: Mnozí hmyzí škůdci plodinových rostlin napadají rovněž neplodinové druhy. Omezení insekticidního materiálu pouze na plodinové rostliny v oblasti pomocí exprese insekticidního materiálu pouze v těchto rostlinách dovoluje, aby pokračovalo přežívání neresistentního hmyzu v asociovaných plevelných rostlinách, jež poskytují nejen „azyl před toxickými

- 31 • 9 ·· • · · · • » · • · · · • · · ···· ·· ·· 99·· »9 · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· • · 9 9 • · · · • · · · • · · 9 «9 99 sloučeninami, ale i potravu pro hmyz. To významně snižuje selekční tlak a zpomaluje rozvoj a rozšiřování resistentního hmyzu.

Tento způsob rovněž nabízí výhody z posice kontaminace půdy a spodní vody, protože není potřeba žádného vehiklu k aplikaci. Insekticidní složky jsou samy o sobě přírodního původu a přirozeně se rozkládají, když je rostlina trávena nebo když se rozkládá. Tento způsob nabízí další výhody _t z posice nákladů, protože insekticidní materiál je součástí ceny semen nebo jiného reprodukčního materiálu, jenž si pěstitel kupuje.

Jedním způsobem provádění je inkorporace bílkoviny obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I ve vehiklu netoxickém pro rostlinu, jenž je uzpůsoben pro systémové podávání přijímající rostlině. Avšak: Protože geny kódující bílkovinu obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I lze isolovat, vynález uvažuje, ve výhodném provedení, transgenní rostliny, jež jsou schopné biologicky syntetizovat bílkoviny obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I a poskytovat rostlině nový, nebo dodatečný, mechanismus ochrany proti útoku hmyzem nebo nematodami.

Vynález poskytuje způsoby zavedení odolnosti k napadení hmyzem, majícím trávící cysteinové nebo aspartátové proteasy, do rostlin přijímacího taxonu, jež zahrnují: a) kultivaci buněk nebo tkání z alespoň jedné rostliny z daného taxonu, b) zavedení, do dané buněčné nebo tkáňové kultury, strukturního genu kódujícího bílkovinu obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I ve funkčním spojení s rostlinnými regulačními sekvencemi, jež způsobí expresi daného genu v daných buňkách, a c) regenerace celé rostliny resistentní k hmyzu z buněčné nebo tkáňové kultury.

Φ* φφφφ

- 32 φφ ·Φ • · ♦ » • · · • φ φ φ • φ · φφφφ φφ φ φ · φ · φ φ φ · · φ φ φ φ φφ «φ φφ φφ φ φ · φ φ φ φ « φ φ · φ φ φ φ φ φφ φφ

Exprese unikátně vysokých množství bílkovin obsahujících přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I může být škodlivá pro samotnou rostlinu. Použití signálních sekvencí k sekreci nebo sekvestrování do vybrané organely umožňuje bílkovině být v metabolicky inertním místě dokud není uvolněna ve střevním prostředí hmyzího patogenu.

Tato DNA sekvence bude obecně taková, jež pochází z organismu odlišného od cílového, nebo jež má podstatnou sekvenční homologii k bílkovině obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I pocházející z organismu odlišného od cílového.

Optimální exprese v rostlinách

Pro optimalizaci transkripční a translační účinnosti takovýchto systémů lze podrobit zkoumání frekvenci využití kodonů a stanovit, které kodony jsou v podstatě preferovány v transkripčních a translačních systémech normálně přítomných v dané rostlině. Když se použije takovéto preferované využití kodonů, lze konstruovat sekvenci kódující bílkovinu, která povede k významně zvýšené hladině transkripční a translační účinnosti ekvistatinového genu nebo funkčního derivátu tohoto genu ve srovnání s tím, čeho by se dosáhlo, kdyby se vzala kódující sekvence přímo v nemodifikované formě donorového organismu. Navíc může být kódující sekvence dále optimalizována odstraněním potenciálních rostlinných polyadenylačních signálů, kryptických sestřihových míst a motivů nestability mRNA, jak bylo ukázáno pro geny toxinu Bacillus thuringiensis.

Obecně se inserce heterologních genů při použití kterékoli transformační techniky jeví jako náhodná, ale v současnosti existují technologie k produkci rostlin s místně specifickou • · · · · ·

- 33 9999 99 l· rekombinací DNA do rostlinných buněk (viz WO/9109957). Aktivita cizorodého genu zavedeného do rostlinných buněk je závislá na charakteristikách exprese jednotlivých zavedených genů, pocházejících z řídících oblasti (promotory, polyadenylační oblasti, zesilovače, atd.) a z vlivů endogenní rostlinné DNA, přilehlé k chimérnímu insertu, a počtu kopií.

Vybraný promotor musí být schopen způsobovat dostatečnou expresi vedoucí k produkci hmyz-kontrolujícího množství bílkoviny. Vhodné promotory mohou zahrnovat jak ty, jež jsou odvozeny z některého genu, jenž je přirozeně exprimován v rostlinách, tak syntetické promotorové sekvence, které mohou zahrnout redundantní nebo herologní zesilovací sekvence. Řada promotorů, jež jsou aktivní v rostlinách, zahrnuje promotory nopalin synthasy, oktopin synthasy a mannopin synthasy z nádory indukujících plasmidů Agrobacterium tumefaciens. Tento vynález uvažuje konstitutivní promotory tak, že transformovaná rostlina bude mít zvýšenou toleranci k hmyzím škůdcům. Příklady konstitutivních promotorů zahrnují promotory CaMV 19S a 35S (JP 63287485), ůbiquitinový promotor, rýžový aktinový promotor (W0/91099948).

V druzích, které produkují nativní bílkovinu obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I, jež není produkována v tkáních, jež jsou normálně napadány hmyzem, nebo není do nic distribuována, může být použit tkáňově specifický promotor k poskytnutí lokalizované exprese nebo nadprodukce bílkoviny obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I. Příklady tkáňově specifických promotorů zahrnují kořenově specifické promotory jako kukuřičného metalothioneninu (EP 452269), kořenově specifický promotor (WO/9113992), promotor skladovacího tělíska rostlinného semene (WO/9113993) a promotor alkohol dehydrogenasy-1. Promotory známé jako

- 34 indukovatelné světlem zahrnují promotor genu kódujícího malou podjednotku (ss) rubuloso-1,5-bisfosfát karboxylasy ze sójových bobů a promotor genu kódujícího chlorofyl a/b vážící protein v zelenajících se listech (Coruzzi et al. (1983) J. Biol. Chem. 259: 1399. A Dunsmuir et al. (1983) J. Molecular and App. Gen 23: 605-612) .

Konečně: přinejmenším

2: 285, Nap et al. (1993) Plant. Molec. Biol.

K poskytnutí exprese bílkovin obsahujících jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I při napadení tkáně rostlinným škůdcem mohou být použity promotory indukovatelné poraněním nebo patogenem. Příklady promotorů indukovatelných poraněním nebo patogenem zahrnují promotor proteinasového inhibitoru II.

Rostlinné vektory

Vhodné vektory pro transformaci rostlinné tkáně byly posány a uvádějí se zde (viz deFrammond et al. (1983) Biotechnology 1: 262, An et al. (1985) EMBO J. 4: 277, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 183, Rothstein et al. (1987) Gene 53: 153, WO 90/08829 a WO 84/02913) a ve (jak je popsáno v Příkladech). aby vektor obsahuj ící gen obsahoval rovněž gen, jenž je výhodném provedení pCABl V praxi není potřebné selektovatelného předmětem zájmu markéru

Spíše se k transformaci rostlinných buněk používá kotransformace takovýmito vektory.

Transformační postupy

Patřičný postup k produkci dospělých transgenních rostlin lze vybrat v souladu s použitým rostlinným druhem. Regenerace kolísá od druhu k druhu rostlin. Účinná regenerace bude

9« ·· 9· • « 9 9 ♦ · • 99 · » • · · · 9 · * · · · • 999 9 9 záviset na médiu, genotypu a historii kultury. Jakmile se získají celé rostliny, mohou být pohlavně nebo klonálně reprodukovány takovým způsobem, že alespoň jedna kopie sekvence je přítomna v buňkách potomstva reprodukce. Takovéto postupy lze vybrat v souladu s použitým rostlinným druhem.

Šlechtění transgenních rostlin

Dospělé rostliny, vyrostlé z trnasformovaných rostlinných buněk, mohou být rozmnoženy k produkci stejných inbredních rostlin. U diploidních rostli může být typicky transformován jeden rodič a druhý rodič může být divokého typu. Rodiče budou zkříženi za tvorby hybridů první generace (FJ , jež se rozmnoží za produkce hybridů druhé generace (F₂

Hybridy F₂ s genetickým profilem bílkoviny obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I se vyberou a rozmnoží k produkci inbrední rostliny.

K přenosu ekvistatinového strukturního genu nebo jeho funčního derivátu lze použít konvenčních postupů šlechtění rostlin, křížení a zpětného křížení. Takovéto způsoby obsahují dále kroky a) pohlavního křížení rostliny resistentní k hmyzu s rostlinou z variety podléhající hmyzu, b) získání reprodukčního materiálu z potomstava křížení a c) růstu reprodukčního rostlin resistentních k hmyzu z daného materiálu. Když je to žádoucí nebo potřebné, agronomické charakteristiky variety podléhající hmyzu mohou být v podstatě zachovány rozšířením tohoto způsobu k zahrnutí dalších kroků opakovaně, d) zpětné křížení potomstva resistentního k hmyzu s vnímavými rostlinami z variety podléhající hmyzu, a e) selekce na expresi resistence k hmyzu (nebo na spojený markerový gen) mezi potomstvem zpětného křížení, dokud není přítomno žádoucí procento charakteristik variety podléhající

- 36 hmyzu spolu s genem vnášejícím reistenci k hmyzu. Následně se mohou inbrední rostliny podle vynálezu křížit s jinou inbrední linií k produkci hybridu.

Potenciátory

Tento vynález dále uvažuje použití, spolu s bílkovinou obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I, adjuvans, chemických nebo biologických aditiv, ve snaze rozšířit spektrum cílových škůdců, prodloužit trvání účinnosti bílkoviny obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I, nebo pomoci stabilizovat zemědělský prostředek bílkoviny obsahující přinejmenším jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I.

Příklady potenciátorů by zahrnovaly lektiny, amfipatické bílkoviny nebo komplementární proteasové inhibitory. Například: Přítomnost více než jednoho ochranného proteinu, v přítomnosti jiných ochranných proteinů, může mít důležitou roli v ochraně rostliny před útokem hmyzu. Ví se, že hmyz Hemiptera a Coleoptera si vyvinul alternativní cesty k trávení potravy obsahující vysoké hladiny určitých proteasových inhibitorů. Může být výhodné zahrnout inhibitory z rodin jako jsou cystatiny (typ I až II a fytocystatiny), inhibitory Kunitzova typu, virgiferinové inhibitory, Bowmanovy-Birkovy inhibitory, sladové trypsinové inhibitory, bramborové inhibitory I a II, inhibitory tykvovitých, bifunkční inhibitory Ragi 1-2/kukuřice, inhibitory karboxypeptidasy A a B a inhibitory aspartátových proteas (viz Ryan (1990) Annu.

Rev. Phytopathol. 28: 425-49.

- 37 • » ·» · * · · φ · φφφφ φ φ φ « φ · · « · φφφφφφ φ φ <·φ φ» φφ φ* • * · · • φ φ φ φ φ φ · φ φ φ φ

Hmyz a nematody

Tento vynález uvažuje ochranu jakékoli rostliny taxonu, jenž je vnímavý k napadení a poškození hmyzem nebo nematodami majícími trávící cysteinové nebo aspartátové proteasy. Takovýto hmyzí škůdci zahrnují obzvláště coleopterní hmyz čeledí Tenebrionidae, Curculionidae, Bruchidae a Chrysomelidae, thysanopterní hmyz a dipterní hmyz. Takovéto rostlinné parazitické nematody zahrnuji Globodera Pallida, Heterodera schachtii a Meloidogyne incognita. Speciálně je zmiňován hmyz Leptinotarsa decemlineata, Frankliniella occidentalis, Diabrotica virgifera a Liriomyza tri folii, na nějž se běžně odkazuje jako na mandelinku bramborovou, třásněnky a minující hmyz. Jiné konkrétní druhy hmyzu zahrnují brouky potemníky, dřepčíky, cřestovníčky, zrnokazy a ploštice. Výrazem „taxon se zde míní jednotka, botanická klasifikace rodu nebo nižší. Zahrnuje tedy rod, druh, kultivar, variety, varianty a jiné menší taxonomické skupiny, jež postrádají konsistentní nomenklaturu.

Rostliny

Příklady rostlin zahrnují brambory, kukuřici, rajčata, proso, bavlnu, fazole, řepku, jetel, chřest, sladké brambory a chrysantémy. Toto se však neklade jako omezení, protože tento hmyz může napadat určité jiné druhy úrody. Způsoby podle vynálezu jsou tedy snadno aplikovatelné na četné rostlinné druhy se seznamu zde výše, včetně, bez omezení, druhů z rodů medicano, Trifolium, Vigna, Citrus, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapís, Capsicum, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Helianthus, Bromus, Asparagus, Panicům, Pennisetum, Cucumis, Glycine, Lolium, Triticum a Zea.

« · · φ • ·

- 38 Příklady provedení vynálezu

Tento vynález je vysvětlován do dalších podrobností následujícími příklady. Tyto příklady jsou jen k účelu vysvětlování a nemají se chápat jako omezující rozsah vynálezu. Všechny sekvence DNA jsou dány v konvenčním směru od 5' ke 3'. Všechny aminokyselinové sekvence jsou dány v konvenčním směru od N-konce k C-konci. Při provádění následujících příkladů byly všechny manipulace DNA provedeny podle standardních postupů, pokud není vyznačeno jinak. Viz Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, vydaný Cold Spring Harbor Laboratory, U.S.A.

Příklad 1

Aktivita domény 2-3 ekvistatinu k aspartátovým proteasám typu kathepsinu D

Ekvistatin byl isolován z mořského měkkýše A. equina postupem, jenž byl dříve popsán, s využitím jeho inhibitorové aktivity k cysteinové protease, papainu (Lenarcic et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 13899). Vedle cysteinových proteinas byl ekvistatin hodnocen na inhibici dvou jiných tříd proteinas, aspartátových proteinas (kathepsin D) a serinových proteinas (trypsin). Inhibiční účinek ekvistatinu byl pozorován jen když reagoval s kathepsinem D. Získaná inhibice byla neočekávaná, protože ekvistatin je znám jako silný inhibitor cysteinových proteinas podobných papainu. Navíc bylo ohlášeno, že p41 fragment nemá inhibiční účinek na kathepsin D (Bevec et al. (1996) J. Exp. Med. 183: 1331-1338). K určení,

- 39 • · » ft zda ekvistatin nepůsobí jako substrát kathepsinu D jsme inkubovali oba v různých molárních koncentracích po různá časová období a směsi podrobili HPLC systému s reversní fází (Obr. 9A) . U kathepsinu D nebyly pozorovány žádné degradační produkty. Naproti tomu bylo nalezeno, že ekvistatin je dobrým substrátem pro trypsin a tato skutečnost byla použita pro separaci thyroglobulinových domén typu I limitovanou proteolýzou β-trypsinem. 500 pg ekvistatinu bylo inkubováno s 5 pg β-trypsinu v 0,5 ml 0,1 M Tris/Hcl pufru pH 8,0 po 40 minut při 37°C. Reakce byla zastavena přidáním kyseliny trifluoroctové. β-trypsinový digest ekvistatinu byl rozdělen pomocí HPLC (Milton Roy Co.) s použitím reversně fázové kolony Vydac C18 ekvilibrované 5 % acetonitrilem obsahujícím 0,1 % (objem/objem) kyseliny trifluoroctové. Eluce se prováděla s použitím lineárního gradientu 80 % (objem/objem) acetonitrilu obsahujícího 0,1 % (objem/objem) kyseliny trifluoroctové. Absorbance byla monitorována při 215 nm. Na HPLC s reversní fází byly získány dva hlavní vrcholy (Obr. 9B) . Molekulové hmotnosti, stanovené SDS PAGE za neredukujících podmínek, byly kolem 7 000 a 14 000 (Obr. 10). Stanovení N-konců obou fragmentů umožnilo jejich lokalizaci v sekvenci ekvistatinové molekuly, jak je schematicky ukázáno v Obr. 11. C-konoce daných fragmentů nebyly přímo identifikovány, ale jejich velikost, jak ji ukazuje SDS PAGE, byla konsistentní s tím, že jsou jednoduchou a dvojitou doménou. Menší fragment začíná s N-koncem ekvistatinu a proto odpovídá první doméně (eq d-1) . Větší fragment odhali dvě sekvwence, začínající Ala68 a Vall52. Vazba Lys67-Ala68 je umístěna na začátku druhé domény, zatímco štěpení ArglSlVall52 nebylo výsledkem limitované proteolýzy (Obr. 11) . Bylo ohlášeno, že isolovaný ekvistatin je podstatně narušen mezi • ·

- 40 • · ««»* « · » «* 4 · » A «»

Argl51 a Vall52, řetězce jsou vázány disulfdovou vazbou a oddělují se jen po redukci (Lenarcic et al. (1997) J. Biol.

Chem. 272: 13899-13903). Těsný dvojitý pruh viditelný na SDS

PAGE je nejpravděpodobněji výsledkem fragmentace velmi blízko C-konce, což znamená, že tento fragment představuje spojenou druhou a třetí doménu, eq d-2,3. Podle sekvenčních dat tyto tři sekvenčně homologické části ekvistatinu mohou mít tři potenciální proteinasová vazební místa. V dřívější práci bylo j, ukázáno, že vazebná stechiometrie ekvistatinu a papainu, jako představitele cysteinových proteinas, je 1: 1 (Lenarcic et al.

(1997) J. Biol. Chem. 272: 13899) . Když byla aspartátová proteinasa, kathepsin D, titrována ekvistatinem, bylo stanoveno, že znovu je potřebný 1 mol ekvistatinu na saturaci 1 molu kathepsinů D (Obr. 12) . Tato hodnota byla nezávislá přes široký koncentrační rozsah. Ke zkoumání inhibičních aktivit jednotlivých domén ekvistatinu byla provedena podrobná kinetická analýza inaktivace papainu a kathepsinů D. Všechny kinetické a rovnovážné konstanty jsou udány v Tabulce 2. První doména, eq d-1, vykazovala prakticky stejné inhibitorové charakteristiky proti papainu jako intaktní ekvistatin, p41 fragment nebo ECI. Tato skupina inhibitorů, thyroglobulinových domén typu I, se považuje za kompetitivní, reversibilní, pevně se vážící inhibitory cysteinových proteinas, jako papainu, kathepsinů B a L a cruzipainu. Dvoudoménovy inhibitor,

Λ “ eq d-2,3, prakticky nevykazoval žádnou inhibici papainu.

* Kinetika vazby ekvistatinu ke kathepsinů D byla prováděna s použitím syntetického substrátu, jenž obsahuje chromofor, jako je nitrofenylalaninovy zbytek, v posici PÍ'. Citlivost stanovení, poskytovaná H-Pro-Thr-Glu-Phe*Nph-Arg-Leu-OH jako substrátem, nám umožnila použít 6,4 nM koncentraci enzymu jako minimální koncentraci v daném testu. Získaná rovnovážná disociační konstanta pro interakci mezi kathepsinem D a ekvistatinem (Ki = 0,3 nM) ukazuje, že ekvistatin je znamenitým inhibitorem aspartátové proteinasy, kathepsinu D. Pro fragment aktivní k papainu, eq d-1, byla stanovena hodnota Ki přibližně 1 mM. Tato hodnota je o několik řádů vyšší než je hodnota Ki pro intaktní ekvistatin, což ukazuje, že inhibiční aktivní místo ekvistatinu musí být lokalizováno na jiných doménách. Eq d-2,3 skutečně vykazoval prakticky stejné inhibiční charakteristiky jako celý ekvistatin (Ki >0,6 nM). Navíc byla tvorba pevného komplexu mezi kathepsinem D a ekvistatinem rovněž zviditelněna pomocí nativní PAGE (Obr. 10B).

Ekvistatin je prvním bílkovinným inhibitorem kathepsinu D zvířecího původu o známé primární struktuře. Dosud byly známy jen deriváty pepstatinu jako inhibitory kathepsinu D stejně silné jako ekvistatin.

Data poskytnutá v této studii jasně ukazují, že různé thyroglobulinové domény typu I přítomné v ekvistatinu, navzdory rozsáhlé podobnosti jejich aminokyselinových sekvencí, míří k různým třídám proteinas, buď cysteinovým nebo k aspartátové proteinase kathepsinu D.

í «

-i & S9 a β » a s-4

- 42 Tabulka 2.

Kinetické konstanty pro interakci ekvistatinu, eq d-1, a eq d-2,3 s papainem a kathepsinem D

Enzym	Inhibitor	10'* x ka M'1S'1	104 S'1	X kd	Ki nM
Papain3	ekvistatin	12 + 0,6	12	+ 0,6	12 + 0,6
	eq d-1	12 + 0,6	12	± 0,6	12 + 0,6
	eq d-2,3	NDd	ND		> 1000θ
Kathepsin Db	ekvistatin	ND	ND		12 + 0,6
	eq d-1	ND	ND		> 1000
	eq d-2,3	ND	ND		12 + 0,6

³ Ke kinetické analýze interakce papainu s inhibitory byl použit test kontinuální rychlosti. Ki byla vypočtena z poměru k_d/k_a · ^b Data byla stanovena z inhibičního účinku inhibitoru na ustálenou rychlost kathepsinem D katalyzované hydrolýzy chromoforního substrátu ^d nebylo stanoveno ^θ Významný vliv nevykazoval, dokonce i při 5 mM, ani eq d-2,3 k papainu, ani eq d-1 ke kathepsinu D: inhibiční konstanty byly tedy odhadnuty jako větší než 1 mM.

- 43 3 Φ $ Φ & $ & * ‘ί, S ¥ € «, * ff' « á * 6 ΐ « a « τ * 5 S * 5 £ $ <

Příklad 2

Molekulární klonování ekvistátinu

Z jediného vzorku mořského měkkýše Actinia equina L. byla isolována celková RNA s rozbitím tkáně v kapalném dusíku. Dva gramy rozetřené, hluboce zmražené tkáně byly přeneseny do 20 ml roztoku guanidinium thiokyanátu (6,5 M GTC, 0,5 M EDTA, 0,2 M β-merkaptoethanol) a homogenizovány v elektrickém mixéru (16 000 obr./min., 4 x 30 vteřin). Následně byl roztok centrifugován při 6000 x g, 20 min., při 15°C. Deset ml čirého supernatantu bylo přeneseno k 10 ml roztoku cesium TFA (p = 1,5 mg/ml), doplněného 2,5 ml 0,5 M EDTA, pH = 8,0. Vzorek byl centrifugován po 24 hodin při 125 000 x g, 15°C. Supernatant byl odstraněn a celková RNA (peleta) byla rozpuštěna v 1 ml roztoku proteinasy K (0,5 mg/ml). Po inkubaci roztoku při 50°C, 1/2 hodiny, byla celková RNA sražena 1/10 objemu 3 M KOAc, pH = 5,2, a 2,5 objemy 96 % ethanolu a směs byla dána do mrazáku při -20°C přes noc. Celková RNA byla usazena při 8 000 x g a peleta rozpuštěna v 2 ml TE pufru. 1 ml rozpuštěného vzorku byl zahřát na 65°C po 5 minut, ochlazen na ledu a následně bylo přidáno 0,2 ml TE pufru doplněného 3 M NaCl. Celý vzorek byl nanesen na vršek náplně oligo (dT) -celulosy v koloně. Póly(A) + RNA byla eluována 1 ml TE pufru (rozděleným na 4 alikvoty po 0,25 ml), předehřátého na 65°C. Jedna třetina vzorku (přibližně

I ng) se použil k syntéze cDNA podle postupu výrobce (Amersham). Syntéza prvního vlákna cDNA se provedla s použitím

II μΐ roztoku mRNA, 4 μΐ 5 x reakčního pufru, 1 μΐ roztoky Napyrofosfátu, 1 μΐ ribonukleasového inhibitoru z lidské placenty (5 U/μΙ), 2 μΐ roztoku směsi dNTP a roztoku oligo dT

9

- 44 » 9 a ¥ č < *· β í 5 ž primeru (l μΐ) . Po přidání 2 μΐ reversní transkriptasy (10 U/μΙ) byla směs inkubována při 42°C po 40 minut. Druhé vlákno cDNA bylo syntetizováno přidáním následujících složek: 37,5 μΐ reakčního pufu pro druhé vlákno, 7 μΐ E. coli DNA polymerasy I (4 U/μΙ) a 1 μΐ E. coli ribonukleasy Η (1 U/μΙ) . Reakční směs

byla	inkubována postupně při 12	°C po	60	minut a 22°C po 60
minut	. Po tepelné denaturaci (5	minut	při	70°C) , bylo přidáno
0,5	μΐ T4 DNA polymerasy (2	U/μΙ)	a	reakční směs byla
inkubována při 37°C po 10 minut	. K 1		cDNA bylo ligo váno

2,5 μΐ (250 pmol) EcoRI adaptorů za použití 2 μΐ DNA ligasy (4 U/μΙ) v 20 μΐ ligační směsi. Po 8 hodinách při. 16°C byla ligační směs podrobena kolonové purifikaci/frakcionaci podle velikosti cDNA s navázanými adaptory za použití stáčecích kolonek a TE pufru. Sebrané frakce purifikované cDNA byly fosforylovány T4 polynuklotidkinasou (8 U/μΙ) a cDNA byla ligována do ramen defosforylovaného Xgtll bakteriofága za použití T4 DNA ligasy(40 U/μΙ). Nakonec byla celá ligační směs „sbalena in vitro s použitím „balícího extraktu od stejného výrobce (Amersham) . Část Xgtll knihovny cDNA (10⁵ pfu) byla použita k infekci buněk E. coli Y1090 a směs nanesena na misky s LB agarem. Plaky byly přesáty na nitrocelulosové membrány. Membrány byly třikrát promyty v solném roztoku pufrovaném Tris s 0,01 % Tween-20 (TBST) a následně v blokovacím roztoku (20 % (objem/objem) fetálního séra v TBST). Po promytí membrán v TBST byla přidána první protilátka (králičí antiekvistatinové IgG) v TBST a na membrány se působilo přes noc při 4°C. Potom byly bemrány promyty třikrát s TBST a působilo se na ně druhou protilátkou (kozí anti-králičí IgG-křenová peroxidasa). Po finálním mytí v TBST byla provedena • · 9 9 · 9

99

9 9 9 9 • 9 9 4 · · · · 9

vizualizace s diamidobenzidinem jako substrátem. Z agarových misek byly isolovány tři positivní klony a po novém nanesení byly fágy eluovány z povrchu agarových misek TE pufrem (5 ml na jednu misku). Fágová DNA byla isolována s použitím isolační soupravy Wizard Lambda Preps DNA (promega) podle postupu výrobce. Po restrikční analýze s 2 μΐ restrikčního enzymu EcoRI (10 U/μΙ) na 3 μg ÁDNA a frakcionaci podle velikosti na 1 % agarosovém gelu byly cDNA inserty vyříznuty, purifikovány se skelným mlékem a subklonovány do EcoRI klonovacího místa plasmidu pUC19. Celá ligační směs (10 μΐ každého vzorku) byla transformována do buněk E. coli DH5a inkubací 100 μΐ vysoce kompetentních buněk (OD_SS0 = 0,6) a 10 μΐ ligační směsi ve vodné lázni (42°C) po 45 vteřin. Po přidání LB média (900 μΐ) a 1 hodině inkubace (37°C, 250 obr./min.) byly bakteriální směsi naneseny naLBA misky doplněné X-gal a IPTG a po inkubaci přes noc (3 7°C) byly bílé kolonie přeneseny do 5 ml LB média a inkubovány po dalších 16 hodin (37°C, 250 obr./min.). Plasmidy byly isolovány s použitím systému Wizard Plasmid Purification System (Promega) podle instrukcí výrobce a analyzovány stanovením nukleotidové sekvence za použití T7 DNA polymerasy (T7 sekvenační souprava, Phrmacia) a [³⁵S]dATPaS (Amersham) .

Sekvenování' vybraných cDNA klonů vedlo ke klonu cDNA plné délky, jak udává Obr. 1.

• · · · * ·

- 46 Přiklad 3

Exprese rekombinantní ekvistatinové cDNA v Escherichia coli

K amplifikaci maturního proteinu ekvistatinu a k jeho klonování jako Ncol-Ncol fragmentu za g3 signálním peptidem přítomným v E. coli vektoru exprese pB3 byly použity dva primery. Primer 1 byl PDEI-1: CGC GCC ATG GCG AGT CTA ACC AAA TGC CAA a primer 2 byl PDEI-2: GG TGC GGC CGC GCA TGT GGG GCG TTT AAA. Správné inserty byly sekvenovány k prověření sekvenčních chyb a jeden klon byl vybrán k získávání rekombinantní bílkoviny.

Rekombinantní ekvistatin byl získán růstem jediné kolonie E, coli kmene HB2151 s plasmidem pB3 nesoucím ekvistatinovou cDNA, přes noc v 5 ml LB růstového média s ampicilinem (100 mg/ml, finální koncentrace) při 37°C, 250 obr./min. Pět mililitrů kultury narostlé přes noc bylo použito k inokulaci 800 ml LB média s ampicilinem (100 mg/ml, finální koncentrace) v 2 1 baňce. Buňky rostly za třepání (30°C, 250 obr./min.) do OD_S00 = 0,5. Poté se přidal zásobní roztok IPTG do finální koncentrace 1 mM a růst buněk pokračoval za použití stejných podmínek jako shora pod dalších 6 hodin. Buňky byly umístěny η- led. po 1 hodinu, pak stočeny při 4 000 g po 10 minut při 4°C a resuspendovány v 50 ml ledově chladného 10 mM MgS0₄. Suspense se umístnila na -20°C dokud kapalina úplně nezmrzla a pak byl obsah roztát ponořením baňky s roztokem do vodné lázně (30°C) . Okamžitě po roztátí byly buňky odstraněny centrifugací při 6 000 x g po 10 minut při 4°C a supernatant uschováván při -20°C pro následnou afinitní purifikaci na papain-sepharose.

- 47 Purifikace a charakterizace rekombinantního ekvistatinu

Příklad 4

A. Afinitní purifikace s použitím papain-sepharosy:

ml šlemu papain-sepharosy se smíchá s 15 ml 0,02 M NaOH na 10 minut. Následně se šlem aplikuje do 15 ml kolony se skleněnou fritou. Kolona se promyje 3 x s 30 ml 100 mM Tris pufru, pH = 7,0 a nakonec s 10 ml 50 mM MES pufru, pH = 6,5 (s přídavkem cysteinu na finální koncentraci 0,6 mg/ml). Supernatant z 1 1 bakteriální kultury získané jak je popsáno shora (Příklad 3) se po kapkách aplikuje na kolonu. Papainsepharosa se pak promývá s 20 ml 50 mM MES pufru, pH = 6,5 (bez cysteinu) a s 50 ml 20 mM Tris pufru, pH = 7,5. Vzorek se získá elucí kolony s 20 ml 20 mM Tris pufru, pH = 10,3 (bez adjustace pH s HC1), 20 % DMSO. Purifikovaný ekvistatin se dialyzuje proti H₂0 a koncentruje za použití minikoncentrátorů Sartricon k dosažení finální koncentrace 350 μΜ.

B. Stechiometrie a inhibiční konstanty pro rekombinantní ekvistatin

V mikrotitrační destičce se spojí 20 μΐ roztoku papainu (čerstvý roztok 1 mg/ml (Sigma) v MES pufru titrovaný E-64 ke stanovení aktivní frakce, obvykle 17 %) s 0 - 80 μΐ o známé bílkovinné koncentraci. Přidá se MES pufr (50 mM MES, pH 6,5, 0,6 mg/ml L-cysteinu, 1 mg/ml BSA frakce V) na konečný objem 150 μΐ. Směs se inkubuje po 30 minut za pokojové teploty a následně se přidá 50 μΐ roztoku substrátu (60 μΐ 15 mg/ml Z-Phe-Arg-pNA rozpuštěných v methanolu se zředí v 940 μΐ MES

9 • 000 • 0 00

pufru před použitím). Destička se okamžitě umístí do čtečky mikrotitračních destiček a měří při 405 nm. Odečítané hodnoty až do OD600 hodnoty 0,3 jsou lineární. Změny rychlosti se aktivity s rostoucími se graficky vynesou použijí ke inhibitoru.

stanoveni Výsledky stechiometrických koncentracích je disociovaného komplexu ke stanovení množstvími a při množství rovnovážné stanoveno zdánlivé disociační konstanty (Ki). Tyto výsledky určily, že jedna molekula ekvistatinu bude inhibovat přibližně 1 molkulu papainu. Zdánlivá rovnovážná disociační konstanta pro papain byla stanovena jako 0,6 nM v souladu s daty publikovanými pro purifikovanou bílkovinu (Lenarcic et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 : 13899-13903) .

Příklad 5

In vitro inhibice proteasové aktivity středního střeva mandelinky bramborové

Střeva konečné instarní fáze larev mandelinky bramborové živené na methyljasmonátem indukovaných rostlinách byla isolována a extrahována v podstatě jak je popsáno (Bolter a Jongsma (1995) J. Insect Physiol. 41: 1071-1078). V těchto střevních extraktech jsou již proteasy, jež jsou citlivé k proteasovým inhibitorům z brambor, vázány v komplexech. Zbývající proteasová aktivita je složena z proteas necitlivých k bramborovým proteasovým inhibitorům, jež jsou indukovány v odezvě na methyljasmonátem indukované bramborové inhibitory. Tyto proteasy jsou proteasami, jež mohou přinést u larev brouků necitlivých k proteasovému inhibitoru ochranu bramborové rostliny. Testovali jsme velkou řadu inhibitorů

	- 49 -	9 · · 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99	• ♦ 9 9 9 9 9 • · · 9 9 9 9 ··· 9*9 99 9
9 9 9 9	9 9 9 9
cysteinových	proteas na aktivitu	specificky	proti	těmto
indukovaným	cysteinovým proteasám	necitlivým	k bramborovým
proteasovým	inhibitorům. Skoro všechny tyto inhibitory	byly

purifkovány v Ústavu Jozefa Stefana ve Slovinsku. Testování jejich potenciálu proti mandelince bramborové se provádělo s použitím jak obecných bílkovinných substrátů (azokasein, Tabulka 2), tak specifických syntetických substrátů (L-Arg-pNA, Tabulka 3, pGlu-Phe-Leu-pNA, Tabulka 4, zPhe-Arg-pNA, Tabulka 5, zArg-Arg-pNA, Tabulka 6). Ve specifických případech byly inhibitory testovány ve dvou koncentracích, ekvimolární a v přebytku k protease, pro získání indikací o pevnosti daného komplexu. Většina testovaných inhibitorů byla bud' neaktivní nebo jen slabě inhibiční. Pouze inhibitory cysteinových proteas s opakující se thyroglobulinovou doménou typu I, jež byly testovány (purifikovaný p41 fragment invariantního řetězce a purifikovaný ekvistatin) byly konsistentně vysoce aktivní proti testované endo- a exo- proteolytické aktivitě larev mandelinky bramborové (Tabulky 2 - 6, Obrázek 4) . Je důležité, že tato třída inhibitorů byla schopna inhibovat téměř veškerou obecnou cysteinově-proteasovou aktivitu. Molekula ekvistatinového peptidu a její funkční deriváty nebyly příliš aktivní proti aktivitě cysteinových proteas podobné amidopeptidasové. Rekombinantní lidský stefin A byl vysoce aktivní proti tomuto typu aktivity. Nej lepší kombinací inhibitorů pro plnou toxicitu proti mandelince bramborové by tedy byla kombinace ekvistatinu nebo p41 fragmentu invariantního řetězce a inhibitorů podobných stefinu.

·· ····

- 50 ·· ·· » 4 4 4 • · 4

4 4 4 • 4 4 4

9 4 4

4 9 4

4 4 ·

44

Tabulka 3

Účinky různých inhibitorů cysteinových proteas na obecnou proteolytickou aktivitu extraktů střev larev mandelinky bramborové měřenou s azokaseinem

Rodina inhibitoru cysteinových proteas	Jméno	Zbytková aktivita v přebytku ihibitoru
Cystatiny typu I	Lidský stefin A	90 %
Potkaní stefin A	90 %
Prasečí stefin B	100 %
Prasečí stefin Dl	105 %
Prasečí stefin D2	105 %
Cystatiny typu II	Kuřecí cystatin	105 %
Lidský cystatin C	105 %
Cystatiny typu III	Bovinní kininogen	110 %
Lidský LMW kininogen	65 %
3. doména lidského kininogenu	20 %
Fytostatiny	Cystatin Chalidonium maj us	100 %
Cystatin kravského bobu	75 %
Cystatin čočky	60 %
Sójový cystatin	65 %
Bramborový multicystatin	90 %
Bromelainový inhibitor	110 %
Domény typu I thyroglobulinu	p41 fragment invariantního řetězce	10 %
Ekvistatin	10 %
Rostlinný Kunitz CPI	PCPI 6.6	120 %

♦ 9 • 9 9 • 9 · 9

- 51 • · 9 9 • 9 9 ·

9« 9

9 9 ·

9 »9

Tabulka 4

Účinek různých inhibitorů cysteinových proteas na aminopeptidasovou aktivitu měřenou s L-Arg-pNA

	% zbytkové aktivity
přebytek inhibitoru	ekvimolární
Ekvistatin a p41 fragment invariantního řetězce	75 %	85 %
Lidský stefin A	10 %	60 %
Kininogeny	75 %	nestanoveno
Fytostatiny z Fabaceae	75 %	nestanoveno

Tabulka 5

Účinek různých inhibitorů cysteinových proteas na specifickou tri-peptidyl-peptidasovou a endoproteasovou aktivitu měřenou s pGlu-Phe-Leu-pNA

	% zbytkové aktivity
přebytek inhibitoru	ekvimolární
Ekvistatin a p41 fragment invariantního řetězce	~5 %	10 %
Lidský stefin A	90 %	95 %
Kininogeny	20 %	nestanoveno
Fytostatiny z Fabaceae	70 %	nestanoveno

• * · · · · ·· ·· • * ·

- 52 ····

• 9 9 9 9 9 • ♦ · · · · 9

9· · · * · · • · ·· ·« ··

Tabulka 6

Účinek různých inhibitorů cysteinových proteas na širokospektrální endoproteasovou aktivitu měřenou s Z-Phe-Arg-pNA

	% zbytkové aktivity
přebytek inhibitoru	ekvimolární
Ekvistatin a p41 fragment invariantního řetězce	20 %	30 %
Lidský stefin A	80 %	95 %
Kininogeny	~20 %	nestanoveno
Fytostatiny z Fabaceae	50 %	65 %

Tabulka 7

Účinek různých inhibitorů cysteinových proteas na úzkospektrální endoproteasovou aktivitu měřenou s Z-Arg-Arg-pNA

	% zbytkové aktivity
přebytek inhibitoru	ekvimolární
Ekvistatin a p41 fragment invariantního řetězce	~5 %	20 %
Lidský stefin A	90 %	nestanoveno
Kininogeny	10 %	nestanoveno

9 9

- 53 99 99 99

9 9 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9 ·

9999 99 «9

9 9 9

9 9 · 9 • 9 9 9

99

Příklad 6

In vitro inhibice proteasové aktivity dospělých třásněnek západních a minujících květomilek a konečné instarní fáze larev mandelinky bramborové a mandelinky Diabrotica Spp. měřená s FITC-značeným hemoglobinem ) ' Dospělé třásněnky západní (Frankliniella Occidental is) a « dospělé minující květilky (Liriomyza trifolii) byly sklizeny z kultury udržované na rostlinách chrysantém a kompletní třásněnky a květilky byly homogenizovány v extrakčním pufru (200 mM β-alanin-Hcl, pH 3,5) v objemu pětkrát větším než váha hmyzu. Hodnota pH pufru odpovídala dříve stanovenému pH optimu proteasové aktivity k hemoglobinu. Larvy konečné instarní fáze mandelinky bramborové udržévané na rostlinách brambor jak je popsáno v Příkladu 5 byly testovány na střevní aspartátovéproteasovou aktivitu s přípravou celkového střevního extraktu v pufru pH 3, jenž je optimální pro aspartátovou proteasu mandelinky bramborové (200 mM glycin, pH 3) . Střeva byla homogenizována v 100 μΐ pufru na jedno střevo. Larvy třetí instarní fáze mandelinky Diabrotica udržované na kukuřičných kořenech se použily k vytažení střeva. Deset střev bylo homogenizováno ve 100 μΐ vody a stočeno dvakrát k odstranění nerozpustného materiálu. K enzymovým testům byly použity dvatypy pufrů. Jeden o pH 6 předpokládané upřednostňující cysteinové proteasy (50 mM MES, pH 6,5, 0,6 mg/ml L-cysteinu) a jeden k detekci aspartátových proteas (200 mM glycin, pH 3). Supernatany byly uschovány při -20°.

μΐ extraktu střeva byly spojeny s 2 μΐ inhibitoru (2 mM pepstatin v methanolu, 4 mM E64 ve vodě, 2 mg/ml rekombinantního ekvistatinu ve vodě. Koncentrace ostatních ·· ·· » · · 1 » · · <

• · · 1 • · · 4 ·· ·· bílkovinných inhibitorů nebyly přesně známé), Patřičné pufry byly přidány do konečného objemu 100 μΐ. Po patnáctiminutové preinkubaci bylo přidáno 20 μΐ substrátu (5 mg/ml FITChemoglobinu) a inkubováno po 3 0 - 45 minut při 37°C. Reakce byla zastavena přidáním 100 μΐ 10 % TCA. Zkumavky byly centrifugovány a 100 μΐ supernatantu smíchaného s 100 μΐ 10 N NaOH bylo měřeno na fluorimetru k určení rozsahu hydrolýzy hemoglobinu. Měření byla provedena v duplikátech na jednom (třásněnky, květilky a Diabrotica) nebo třech (mandelinka bramborová) různých extraktech střev a lišila se nejvýše o +/- 5 %.

Účinky různých inhibitorů cysteinových a aspartátových proteas jsou vyneseny v Tabulce 8. Poskytují účinky různých proteasových inhibitorů (PI) k „PI-necitlivým proteasám třásněnek a květilek na chrysantémách, mandelinek na bramborách a Diabrotica na kukuřici, protože indukované PI přítomné v rostlinném materiálu a pozřené daným hmyzem budou přítomné v extraktu v komplexu s vnímavými proteasami.

Proteasová aktivita třásněnek může být z 92 % inhibována E64 (PI cysteinových proteas) a z 16 % pepstatinem (PI aspartátových proteas) při pH 3,5, jež je optimální pro obecnou proteasovou aktivitu třásněnek. Aspartátové proteasy zřejmě nejsou dominantní v tomto hmyzu. Invariantní řetězec p41 vedl k 87 % inhibice zatímco ekvistatin poskytoval 95 % inhibice proteasové aktivity. Dobrými inhibitory cysteinových proteas třásněnek jsou jasně jak invariantní řetězec p41 (PI cysteinových proteas), tak ekvistatin (PI cysteinových/ aspartátových proteas), i když ekvistatin by mohl být trochu lepší z důvodu dodatečné inhibice aspartátových proteas.

Proteasy minující květilky lze plně inhibovat jen kombinací E64 (PI cysteinových proteas) a pepstatinu »· ··*·

- 55 ·♦ ♦ ♦ • ·· · · · · · · < · ··· ·· · ···· ·· ··· · · · · · » » • · · · · ♦ · · · · · ···* 9· »» ·» _{M W}* (PI aspartátových proteas). (97 %). Bramborový cystatin a

Kunítz PCPI8.3 jsou oba inhibitory cysteinových proteas, jež mají schopnost inhibovat z 63 %, srovantelných s 73 % pro E64. Přidání ekvistatinu k těmto dvěma inhibitorům vede k 92 % inhibice, což dokládá, že ekvistatin musí mít vedle inhibiční aktivity k cysteinové protease květilky i inhibiční aktivitu k aspartátové protease květilky. K optimální kontrole květilky může být potřebné společné použití ekvistatinu s bramborovým cystatinem a Kunitzem PCPI8.3.

Proteasy mandelinky bramborové mohou být při pH 3 plně (97 %) ibhibovány kombinací E64 (24 %) a pepstatinu (82 %) .

Přídavek ekvistatinu buď k E64, nebo k pepstatinu zvyšuje inhibici o 42 % ( 24 % + 42 % = 66 %) respektive 12 % (82 % + 12 % = 94 %) což ukazuje, že ekvistatin inhibuje víc než 50 % activity jak aspartátové tak cysteinové proteasové aktivity za tohoto pH. Ekvistatin samotný inhibuje 62 % celkové proteasové aktivity za tohoto pH. Zdá se, že částečná inhibice při pH 3 spolu s téměř úplnou inhibici při pH 6,5 (Příklad 5) je dostatečná k plné kontrole tohoto hmyzu (Příklad 7) .

mandelince Diabrotica se ví, že má kombinaci jek cysteinových, tak aspartátových proteas (Gillikin et al. (1992) Arch. Insect Biochem. Physiol. 19: 285-298). Účinky ekvistatinu, E64 a pepstatinu byly testovány při dvou různých hodnotách pH. Data v Tabulce 8 ukazují, ře ekvistatin téměř úplně inhibuje veškoru aktivitu cysteinových a aspartátových proteas (93 % při pH 6,5 a 98 % při pH 3) a je dokonce silnější než kombinace E64 a pepstatinu (79 % resp. 89 %) . Tyto in vitro výsledky jsou dokonce lepší než in vitro výsledky pro mandelinku bramborovou v Příkladech 5 a 6 a ukazují, že u ekvistatinu lze při expresi v kukuřičných kořenech očekávat toxicitu k mandelince Diabrotica.

ftft ftft··

- 56 ftft ftft ft ftft · • ftft ftft ftft ftftft · * · · ftftft •••ftftft ftft • ft ft · · · • · · · • ftft · • ftft · • ft ftft

Tabulka 8

In vitro inhibiční testy: měření zbytkové proteasové aktivity v extraktech různého hmyzu

Inhibitory	Třásněnka pH3,5	Květilka pH3,5	Mandelinka bramborová pH3	Mandelinka Diabrotica pH6,5	Mandelinka Diabrotica pH 3
kontrola	100 %	100 %	100 %	100 %	100 %
E64	8%	27%	76%	51 %	35 %
E64/ekvistatin (El)	nestán.	nestán.	34%	29%	8%
Pepstatin	84%	46%	18%	58 %	45 %
Pepstatin/EI	nestán.	nestán.	6%	6%	0%
E64/ Pepstatin	nestán.	3%	3%	21 %	11 %
El	5%	24%	38 %	7%	2%
p41 invariantní řetězec	13%	43 %	nestán.	nestán.	nestán.
br. cystatin	nestán.	73 %	nestán.	nestán.	nestán.
PCPI8.3	nestán.	43%	nestán.	nestán.	nestán.
API	nestán.	37%	nestán.	nestán.	nestán.
br. cystatin/ PCPI8.3	nestán.	8%	nestán.	nestán.	nestán.
br. cystatin/ PCPI8.3/API	nestán.	7%	nestán.	nestán.	nestán.
br. cystatin/ PCPI8.3/EI	nestán.	nestán.	nestán.	nestán.	nestán.
cystatin fazole	14%	nestán.	nestán.	nestán.	nestán.

- Rekombinantní Kunitz PCPI8.3 (Stiekema et al. (1987) Plant. Molec. Biol. 11: 255-263) byl produkován v kvasinkách Pichia pastoris a purifikován ze supernatantu kultury katexovou chromatografií.

= Rekombinantní bramborový cystatin (br. cystatin) představuje monomer multicystatinu klonovaného RT-PCR z brambor cv. Superior a exprimovaného a purifikovaného jako fúzní protein s glutathion-S-transferasou (Pharmacia).

•r «»»·

- 57 ·· ·· • · · · · · • · · · · · • · • ·* · ·· • · 4

49 «· ·· • * · 4 • 4 4 4

Ekvistatin byl buď purifikován z mořského měkkýše (Lenarcic et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 13899, Lenarcic et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 12682) (testy třásněnky a květilky), nebo rekombinantní z E. coli (mandelinka bramborová a mandelinka Diabrotica).

t

Inhibitor aspartátové z brambor (Kreft et al. (1997) proteasy (API) byl purifikován Phytochemistry 44: 1001-1006).

Příklad 7

Toxicita ekvistatinu k larvám mandelinky bramborové

Hlízy brambor kultivaru Surprise (Solanum tuberosum) byly naklíčeny. Naklíčené hlízy byly zasazeny do 1 1 květináčů a nechány růst po 3 - 4 týdny při 22/l8°C, 16/8 hodin rytmu dne a noci. Rostliny vysoké 10 - 15 cm byly dány do sklenic spolu s papírovým knotem, na nějž bylo pipetováno 2 μΐ methyljasmonátu. Sklenice byly okamžitě uzavřeny parafilmem a dány do klimatizované komory s 30°C a trvalým osvětlením. Kontrolní rostliny byly dány do komory s 25°C a 16/8 hodinovým rytmem dne a noci. Po jednom dni při 30°C byly rostliny vyňaty ze sklenic a umístěny do stejné komory jako kontroly. Rostliny byly použity v den 3. Pro každý následující den krmení byly použity čerstvě zpracované rostliny. Toto zpracování vedlo k vysokým hladinám endogenních PI v rostlinách, na něž působil methyljasmonát. Vrchní meristema byla oddělena z rostlin a potřena po obou stranách 175 μΜ roztokem rekombinantního ekvistatinu v 0,3 % agaru, získaného smícháním 1:1 zásobního 350 μΜ roztoku ekvistatinu a 0,6 % vodného agaru. Kontroly byly potřeny ·· ···· ·· r· • · · · · · • · · · · • · · « · · • · · řtte ·« ·· ·· • · * · * • · · · · • e · · · * • · · · · · · ·· *· ·· we

0,3 % agarem. Agarový roztok byl aplikován v koncentraci 30 μΐ/cm². Knečná koncentrace na listech byla odhadnuta na 70 μΜ, což je ekvivalent 1,4 mg/g listů. Potřené listy byly umístěny do zkumavky obsahující 0,4 % agar a dány na filtrační papír uvnitř Petriho misky. Na listy bylo umístěno 21 - 26 čerstvě vylíhlých larev mandelinky bramborové a Petriho miska byla dána do inkubátoru nastaveného na 28°C. Každý den čerstvé natřené listy nahradily staré. 7).

V tabulkách 9 a 10 jsou shrnuty účinky na růst a mortalitu larev mandelinky bramborové. Z těchto tabulek je zřejmé, že ekvistatin aplikovaný na kontrolní rostliny s nízkými hladinami endogenních proteasovych inhibitorů je schopen prudce snížit vývoj a způsobovat vysoké mortality na larvách už po 4 dnech. Aplikace ekvistatinu na listy obsahující vysoké endogenní hladiny PI, indukované předchozím působením methyljasmonátu, však dále zesiluje toxické účinky tohoto inhibitoru. To potvrzuje očekávaný synergický účinek tohoto inhibitru, protože je specificky zaměřen k „PI-necitlivým proteasám larev mandelinky bramborové.

• » « * · · · ·

- 59 • · · · • · · · • · · · • · · · ·

Tabulka 9

Účinek rekombinantního ekvistatinu na růst larev mandelinky bramborové

Působení	Den 1	Den 2	Den 3	Den 4
Kontrola	n.d.	n.d.	9	13,8
Kontrola + ekvistain	n.d.	n.d.	0,5	0,7
MeJa-kontrola	n.d.	n.d.	7,5	10
MeJa-kontrola + ekvistatin	n.d.	n.d.	n.g.	n.g.

V jednom experimentu bylo testováno 21 - 26 larev. Udány jsou hmotnosti v mg/larvu. n.d. znamená nebylo stanoveno, n.g. znamená nerostou nebo nežijí.

Tabulka 10

Účinek rekombinantního ekvistatinu na procentní mortalitu larev mandelinky bramborové

Působení	Den 1	Den 2	Den 3	Den 4
Kontrola	0	0	0	0
Kontrola + ekvistain	0	10	52	76
MeJa-kont rola	0	0	0	0
MeJa-kontrola + ekvistatin	0	23	77	92

V jednom experimentu bylo testováno 21-26 larev.

- 60 Příklad 8

In vivo účinek ekvistatinu na oviposici třásněnek

Vzorek 142 μΜ rekonťbinantního ekvistatinu purifikovaného jak je popsáno v Příkladu 4 byl testován na aktivitu proti třásněnkám. Vzorek byl okyselen Hel na pH 3 ke stabilizaci ekvistatinové bílkoviny. Kontroly obsahovaly okyselenou vodu nebo 2,5 mg/ml BSA rozpuštěného v okyselené vodě. Oviposiční rychlost samiček třásněnek byla testována s použitím takzvaných Muraiho klícek. Ve stručnosti: Plexisklové trubice uzavřené na straně jemnou gázou byly inokulovány 10 samičkami a včelím pylem. Trubice byly uzavřeny parafilmem a na parafilm bylo umístěno 300 μΐ kapaliny. Kapalina byla uzavřena druhou vrstvou parafilmu. Pyl a kapalina vzorku byly vyměňovány každý den po dva dny. Vajíčka snesená do kapalného vzorku byla spočítána v den 2.

Tabulka 11

Oviposiční rychlost dospělých samiček dva dny poté, co byly umístěny na různou potravu

Potrava	Vaj íček na dospělou samičku za den	Relativní procento
BSA	1,8	100 %
Voda	1,5	83 %
Ekvistatin	0,3	17 %

• « • · · ·

- 61 • · · toto · · · · to • to ··· · to to · toto to

Příklad 9

Modifikace ekvistatinového genu ke zlepšené expresi v rostlinách

Ekvistatinová cDNA obsahuje v kódující oblasti několi potenciálních rostlinných polyadenylačních signálů, motivy nestability mRNA a suboptimální využití kodonů pro expresi v rostlinách. Ke zlepšení hladiny genové exprese v rostlinách mohou být tyto motivy odstraněny a kodony mohou být optimalizovány řízenou mutagenesou bez změny primární bílkovinné sekvence. Níže je udán příklad modifikací potřebných k získání zlepšené genové exprese v bramborách. Horní vlákno představuje kódující část cDNA klonu, pod nímž je uvedena navrhovaná modifikace cDNA sekvence a pod tím je udána kódovaná bílkovinná sekvence s použitím jednopisměnových kódů pro aminokyselinové zbytky.

-3:

ATGGCTCTTAGCCAA.AACC.AAGCCAAGTTTTCCAA-.GGATTCGTCGTG.-.TGATTTGG

G C- G malsqnqakfskg F v V H I w

0 GTACTATTCATTGCTTGTGCTATAACTTCAACTGAAGCTAGTCTAACCAAATGCCAACAG C G

-13 VLFIACAITSTEAS LT KCQQ -1 +1

120 CTCCAGGCCTCGGCTAACAGTGGTCTGATAGGTACTTATGTACCACAATGCAAAGAAACG G T T T

LQASANSGLIGTYVPQCKST

180 GGAGAGTTCGAAGAAAAAC AATGCTGGGGATCGACTGGTTACTGTTGGTGTGTGGATGAA TG T

GEFEEKQCWGŠTGYCWCVDE ·· ·« · · ···· ·· ·· • · · · ·· · ···· ··· · · · · · · · • · · · · · ··· · · · • ·· ···· ···· ···· ·· ·· ·· ·· ··

240	GATGGAAAAGAGATTCTAGGAA.CCAAGATCCGTGGATCTCCGGATTGCAGCCGCAGAAAA TA A C T
48	DGXEI L GTKIRGSP DCS RRK
300	GCCGCG7TAACACTTTGCCAGATGATGCAAGCCATCATTGTTAATGTCCCTGGTTGGTGT T C G
68	A A L T L C Q Η M Q A I IV Ν V P G W C

360	GGCCCTCCATCGTGTAAAGCTGACGGCAGTITTGACGAGGTTCAGTGCTGCGCAAGTAAT
«	A A
88	GPPSCKADGSFDSVQCCASN
420	GGAGAATGCTACTGTGTGGATAAGAAÁGGAAAAGAACTTGAAGGCACAAGACAACAGGGA
103	G Ξ C Y C V D KKG.KSLEGTR Q Q G
480	AGGCCAACCTGCGAAAGACACCTAAGCGAATGCGAGGAAGCTCGAATCAAGGCGCATTCA
123	G T A RPTCEP. HLS ECESAR I K A H S
540	AACAGTCTTCGTGTTGAGATGTTCGTGCCAGAGTGTTTAGAAGATGGATCATATAACCCA T C T
* 143 / i	NSLRVEMFVPSCLEDGSYNP

r 600	GTACAGTGCTGGCCTAGCACAGGATACTGTTGGTGCGTCGATGAAGGAGGGGTAAAGGTA *T*
163	X VQCWPSTGYCWCVDEGGVKV

660	CCAGGTTCCGATGTCAGATTTAAACGCCCCACATGCTAA C C T
188	PGSDVRFKRPTC---

199 • ·

- 63 • · · · · · φ · · · · • · · · · • · · · · « ·

Příklad 10

Konstrukce rostlinných vektorů pro expresi ekvistatinu

Bramborový Cab promotor (Nap et al. (1993) Plant. Mol.

Biol. 23: 605-612) byl amplifikován z plasmidu pPPG pomocí PCR s použitím primerů Pl-POTCAB a P2-POTCAB. Podobně byl Nos terminátor amplifikován z plasmidu pPPG pomocí PCR s použitím \ primerů NOS-TERM-DN a NOS-TERM-UP. Promotorový a terminátorový fragment byly štěpeny restrikčními enzymy EcoRI a Sací a

I ligovány do EcoRI digerovaného vektoru pUCAP (Van Engelen et al. (1995) Transgenic Research 4: 288-290). Správný klon byl vybrán a sekvenován. Tento klon, pUCCABl byl digerován Ncol a BglII a použit k subklonování ekvistatinové kódující oblasti, jež byla amplifkována PCR z plasmidu pB3-ekvistatin s použitím primerů EQUISTAT-DN a EQUISTAT-UP, a rovněž štěpena Ncol a BglII. Byl vybrán správný klon a insert ekvistinové cDNA klonu byl sekvenován. Správný klon, pUCCABl-ekvistatin, byl digerován EcoRI. EcoRI fragment obsahující kazetu exprese ekvistatinu byl ligován do rostlinného vektoru pBINPLUS (Van Engelen et al. (1995) Transgenic Research 4: 288-290), jenž byl rovněž digerován EcoRI. Byl vybrán správný klon. Tento klon, pCABl-ekvistatin, byl elektroporován do buněk

G elektrokompetentního Agrobacterium tumefacíens AGL-0.

• Positivní klony byly selektovány na LB médiu obsahujícím 100

I mg/1 kanamycinu.

- 64 • 99 ·· ΦΦΦΦ ·· Φ Φ ·φ«ζ ΦΦ Φ · · Φ ·

ΦΦΦ ΦΦ Φ Φφφ· • · ΦΦΦ · ΦΦΦ Φφ ·

Tabulka 12

PCR-primery použité k PCR amplifikaci

Jméno DNA

I

Λ

Λ i

Pl - POTCAB:

P2-POTCAB:

NOS-TERM-DN:

NOS-TERM-UP:

EQUISTAT-DN:

EQUISTAT-3GL

S ' -GGGGGGGAATTCCTGACCTCTTACTAACTCG ' -GGGGGGGAGCTCAGATCTTGCCATGGTTTTTCTTCTCTTTTTTTTTG 5 ' - AGATCTGAGCTCTCGTTCAAACATTTGGCA ' - AAGCTTGAATTCGATCTAGTAACATAG ' -GGGGCCATGGCTCTTAGCCAAAAC ' -GGGGGAGATCTTTAGCATGTGGGGCGTTTAAA_

Příklad 11

Transformace ekvistatinovou	brambor cDNA	rostlinnými vektory	obsahuj ícími
V den 1	byla	nastartována kultura	Agrobacteri um
tumefaciens AGL	-0 obsahujícího binární vektor pCABl-ekvistatin

v 50 ml LB média obsahujícího 50 mg/1 kanamycinu a třepána po dva dny při 2 8°C. V den 2 byly vniřní uzlinky z in vitro kultury bramborového kultivaru Desiree linie V nařezány na 0,5 - 1 cm kousky a umístěny do R3B média (30 g/1 sacharosy, 4,7 g/1 Murashigeho a Skoogových solí, pH 5,8 (KOH), 8 g/1 čištěného agaru, 2 mg/1 NAA a 1 mg/1 BAP), jež bylo překryto 2 sterilními filtračními papíry, předem smočenými s 2 ml PACM média (30 g/1 sacharosy, 4,7 g/1 Murashigeho a Skoogových solí, 2 g/1 kaseinového hydrolyzátu, pH 6,5 (KOH), 1 mg/1 2,4-D a 0,5 mg/1 kinetinu). Misky byly uzavřeny páskou parafilmu a inkubovány přes noc při 24°C za režimu 16 hodin světla. V den 3 byla do sterilních Petriho misek obsahujících tyto explantáty

- 65 φ φ φφφφ φ φ

přilita kultura A. tumefaciens. Po 5 - 10 minutách byly explantáty vyňaty z kultury, umístěny na sterilní filtrační papír k odstranění přebytku Agrobakteria a umístěny zpět na misky obsahující R3B médium poté, co byl napřed odstraněn svrchní filtrační papír (a druhý ponechán). Misky s explantáty byly dále inkubovány při 24°C a 16 hodinách světla do dne 5, kdy byly explantáty přeneseny do misek obsahujících ZCVK médium (20 g/1 sacharosy, 4,7 g/1 Murashigeho a Skoogových solí, pH 5,8 (KOH), 8 g/1 čištěného agaru, 1 mg/1 zeatinu, 200 mg/ml vancomycinu, 100 mg/1 kanamycinu, 200 mg/1 claforanu) . V den 19 a následně každé 3-4 týdny byly explantáty přeneseny do nového ZCVK média. Když se objevily klíčky, byly klíčky přeneseny do Murashigeho a Skoogova média obsahujícího 20 % sacharosy (MS20). Po zakořenění byly rostliny přeneseny do skleníku.

Příklad 13

Biotesty s larvami mandelinky bramborové na transgenních rostlinách brambor exprimujících ekvistatin

Ekvistatinová cDNA sekvence, optimalizovaná pro expresi v rostlinách brambor, byla klonována do vektrou pCABl a transformována do linie V. Na resistenci k čerstvě vylíhlým larvám mandelinky bramborové bylo testováno 8 různých primárních transformantů. Z mladých rostlin byly odděleny listy, vloženy do zkumavky obsahující 0,4 % vodný čištěný agar a umístěny do Petriho misky s filtračním papírem. Šest náhodně vybraných čerstvě vylíhlých larev bylo umísťováno na jeden list. Listy byly vyměňovány za čerstvé po dvou dnech. V den 3 « ·

- 66 •9*9 99 99 99 byly měřeny hmotnosti každé larvy jednotlivě. Tabulka 13 poskytuje výsledky ukazující, že 3 z šesti transformantů významně retardují růst larev. Některé rostliny postrádají resistenci nejpravděpodobněji pro nízkou expresi, způsobenou suboptimálni insercí T-DNA do rostlinného genomu. Rostliny byly příliš mladé k delšímu prodlužování pokusu pro chybějící listový materiál, ale bylo pozorováno, že na pCABl-EIM-1 byly všechny larvy v den 4 mrtvé. Přítomnost ekvistatinové bílkoviny byla potvrzena „western analýzou a odhadnuta v transgenech, jež vykazovaly resistenci, na > 0,1 %.

Tabulka 13

Výsledky biotestů na transgenních rostlinách brambor transformovaných ekvistatinovým genem optimalizovaným pro expresi v rostlinách

Rostlina3	Larvální hmotnost15
Linie V	9,93 a
PBINPLUS	10,67 a
pCABl-EIM-1	4,03 b
pCABl-EIM-2	5,45 b
pCABl-EIM-3	8,77 a
pCABl-EIM-6	9,92 a
pCABl-EIM-7	8,55 a
pCABl-EIM-8	5,85 b
pCABl-EIM-9	9,18 a
pCABl-EIM-10	11,15 a

• 9

- 67 9999 99 9 999·

999 99 9 9999

9 9 · · 999 99 9

99 999 9 9999

999999 99 99 99 99 ^a Testované rostliny byly: Linie V, in vitro rostlina přenesená do skleníku současně s transformanty, pBINPLUS, transformant s prázdným vektorem bez kazety promotor-gen, pCABl-10, prvních 8 transformantů linie V s optimalizovaných ekvistatinovým genem pod kontrolou CAB promotoru.

^b Průměrná larvální hmotnost (mg) šesti larev. Písmenkový kód za hmotností larev ukazuje významnost stanovenou pomocí ANOVA.

Příklad 13

Isolace homologických sekvencí z jiných organismů k nalezení nebo generování vylepšených inhibitorů

Šest aminokyselinových zbytků Gly-Tyr-Vys-Trp-Cys-Val, jež jsou silně konservované mezi inibitory cysteinových a aspartátových proteas s opakující se thyroglobulinovou doménou typu I, ať. už z lidského, lososího a měkkýšího zdroje, lze použít k isolaci homologických sekvencí se zlepšenou specifitou. K těmto sekvencím mohou být navrženy degenerované PCR primery k amplifikaci genomických nebo cDNA fragmentů, jež lze využít jako sondy k isolaci celých kódujících sekvencí, například z cDNA knihoven nebo pomocí 5' RACE experimentů z purifikované mRNA. Jako nový zdroj opakujících se thyroglobulinových domén typu I lze použít jakýkoli oraganismus. Sbírku genů lze použít k experimentům s „přehazováním genů k isolaci nových specifit.

Claims (22)

1. PATENTOVÉ

   99 99

   9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

   9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

   1. Způsob ochrany rostliny nebo části řečené rostliny proti hromadnému hmyzímu nebo červovému napadení jedním nebo více druhy hmyzu nebo nematod, jež mají trávící cysteinové nebo aspartátové proteasy, vyznačující se tím, že zahrnuje presentaci inhibičního množství inhibitoru cysteinové nebo aspartátové proteasy, vybraného ze skupiny bílkovin, jež obsahují alespoň jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I, k lokusu, kde má být řečený hmyz nebo nematoda(y) kontrolován(y).
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že hmyz má cysteinové proteasy necitlivé k inhibitorům cysteinových proteas odvozeným z hostitelské rostliny.
3. 3. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že hmyz je jedním nebo vícerým z mandelinky bramborové, mandelinky Diabrotica, třásněnky nebo minující květilky.

   Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že nematody jsou červi cyst nebo kořenových uzlíků.
4. 5. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že bílkovina obsahující alespoň jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I je lidský p41 fragment invariantního řetězce nebo jeho funkční derivát nebo homolog.

   •9 9999

   - 69
5. 6. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že bílkovina obsahující alespoň jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I je isolována z mořského měkkýše Actinia equina a má aminokyselinovou sekvenci udanou v Obrázku 1 nebo její funkční derivát nebo homolog.
6. 7. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že bílkovina obsahující alespoň jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I je bílkovina isolovaná z lososích vajíček nebo její funkční derivát nebo homolog.
7. 8. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že zahrnuje zavedení kódující sekvence do genomu rostliny, přičemž zavedená sekvence kóduje bílkovinu, jež obsahuje alespoň jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I s promotorovou sekvencí aktivní v rostlině pro způsobení exprese řečené bílkoviny v hladinách, jež poskytují hmyz nebo nematodu kontrolující množství řečené bílkoviny.
8. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že dále zahrnuje kroky

   a) kultivace buněk nebo tkání z dané rostliny,

   b) zavedení do buněk nebo tkáně alespoň jedné kopie genu kódujícího bílkovinu obsahující alespoň jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I,

   c) regenerace resistentní celé rostliny z kultury buněk nebo tkání.

   - 70 • 0

   00 0000

   0 0 0 0 0 ·

   0 0 0 0 0 0 0

   0 0 0 0 0 0 0

   00 00 00
9. 10.

   Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok pohlavní nebo klonální reprodukce celé rostliny takovým způsobem, že alespoň jedna kopie sekvence kódující bílkovinu, jež obsahuje alespoň jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I s promotorovou sekvencí aktivní v rostlině, je přítomna v buňkách potomstva reprodukce.
10. 11.

    Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že dále zahrnuje kroky

    a) výběru plodné rostliny, resistentní k hmyzu nebo nematodám, připravené podle způsoby nároku 10,

    b) pohlavního křížení této rostliny resistentní k hmyzu nebo nematodám s rostlinou podléhající hmyzu nebo nematodám z podléhající variety,

    c) získání reprodukčního materiálu z potomstva křížení a

    d) růstu resistentních rostlin z tohoto reprodukčního materiálu.
11. 12 .

    Způsob podle nároku 11, k udělení resistence k hmyzu nebo nematodám v podstatě homozygotní populaci rostlin podléhající variety vyznačující se tím, že dále zahrnuje kroky opakovaného

    a) zpětného křížení potomstva resistentního k hmyzu nebo nematodám s v podstatě homozygotní populací rostlin podléhajících hmyzu nebo nematodám z podléhající variety, a

    b) selekce na expresi jak resistence k hmyzu nebo nematodám, tak na jiné charakteristiky podléhající variety mezi potomstvem zpětného křížení, dokud není v potomstvu přítomno žádoucí procento charakteristik ·· ····

    - 71 podléhající variety spolu s resistencí k hmyzu nebo nematodám.
12. 13. Transgenní rostlina a její pohlavní potomstvo resistentní k napadení jedním nebo více druhy hmyzu nebo nematod, jež maj i traviči cysteinove vyznačující se exprimuj e hmyz nebo bílkoviny obsahující nebo aspartátové proteasy, tím, že řečená rostlina nematody kontrolující množství alespoň jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I.
13. 14. Biologicky funkční vehikl exprese vyznačuj ící se tím, že obsahuje promotor účinný v řízení pod ním zařazené kódující sekvence v rostlinných buňkách, DNA kódující oblast, jež kóduje expresi bílkoviny složené z alespoň jedné opakující se thyroglobulinové domény typu I v rostlinných buňkách a terminační sekvenci účinnou k terminaci transkripce nebo translace produktu genetické konstrukce v rostlinných buňkách, přičemž genetická konstrukce je účinná v expresi hmyz kontrolujících množství bílkoviny obsahující alespoň jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I v buňkách rostliny.

    i
14. 15. Biologicky funkční vehikl exprese podle nároku 14, vyznačující se tím, že DNA isolát kóduje aminokyselinovou sekvenci udanou v Obrázku 1 nebo její funkční derivát.
15. 16. Biologicky funkční vehikl exprese podle nároku 14, vyznačující se tím, že vehikl exprese je pCABl.

    «· ·»* · ·« ·· • · · · • · ·

    9 9 9 9

    9 9 9

    9999 99

    - 72 9 9 9

    9 9 9

    9 9 9

    9 9 9 9

    99 99

    99 99

    9 9 9 9

    9 9 9 9

    9 9 9 9 9

    9 9 9 9

    99 99
16. 17. Hostitelská buňka vyznačující se tím, že je transformovaná biologicky funkčním vehikle exprese z kteréhokoli z nároků 14 až 16.
17. 18. Transgenní hostitelská buňka vyznačující se tím, že DNA sekvence je řízena promotorem účinným v řízení pod ním zařazené kódující sekvence v rostlinné buňkce, DNA sekvence kóduje oblast pro expresi bílkoviny složené z alespoň jedné opakující se thyroglobulinové domény typu I v rostlinných buňkách a terminační sekvence je účinná v terminaci transkripce nebo translace produktu genetické konstrukce v rostlinných buňkách, přičemž genetická konstrukce je účinná v expresi hmyz kontrolujících množství bílkoviny složené z alespoň jedné opakující se thyroglobulinové domény typu I v buňkách rostliny ke kontrole jednoho nebo více druhů hmyzu majícího trávící cysteinové proteasy.
18. 19. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že na lokus se aplikuje zemědělský prostředek obsahující nosič a hmyz nebo nematody kontrolující množství, nebo množství bojující s hmyzem nebo nematodami, inhibitoru cysteinové proteasy.
19. 20. Zemědělský prostředek vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku hmyz nebo nematody kontrolující množství, nebo množství bojující s hmyzem nebo nematodami, inhibitoru cysteinové proteasy jak je definován v nárocích 1, 5, 6 nebo 7.
20. 21. Inhibitorový peptid opakující se thyroglobulinové domény typu I s aktivitou proti aspartátovým proteasám ** ·»«·

    - 73 - 0 ·' c i se tím, že sekvenci v rozsahu od ekvistatinu z Obr. l,

    0» ·♦ • · 0 0 · « 0 0 0 0 ♦ 0 · « · · « 0 0 0 0 0

    000« «0 00 «

    0« 00 0 0 0 · ♦

    I 0««·

    0 0 0 0 0 ·

    0 0 0 0 · » *0 0* posic 68 - 19 inhibitorový peptid aspartátových proteas s opakující se thyroglobulinovou doménou typu I, přičemž řečený modifikovaný peptid obsahuje peptid mající podstatnou aminokyselinovou identitu s aminokyselinovými posicemi 68 199 ekvistatinu, zkrácení aminokyselinových posic 68 - 199 ekvistatinu, nebo zkrácení peptidu majícího podstatnou aminokyselinovou identitu s aminokyselinovými posicemi 68 199 ekvistatinu a přičemž je modifikovaný peptid funkčně ekvivalentní řečeným aminokyselinovým posicím 68 - 199 ekvistatinu v inhibiční aktivitě aspartátové proteasy.
21. 22. Způsob ochrany rostliny nebo části řečené rostliny proti hromadnému hmyzímu nebo červovému napadení jedním nebo více druhy hmyzu nebo nematod, jež mají trávící aspartátové proteasy, vyznačující se tím, že zahrnuje presentaci inhibičního množství inhibitoru aspartátové proteasy, jak je definován v nároku 21, k lokusu, kde má být řečený hmyz nebo nematoda(y) kontrolován(y).
22. 23. Způsob ochrany rostliny nebo části řečené rostliny proti hromadnému hmyzímu nebo červovému napadení jedním nebo více druhy hmyzu nebo nematod, jež mají trávící cysteinové a aspartátové proteasy, vyznačující se tím, že zahrnuje presentaci inhibičního množství inhibitoru aspartátové proteasy, jak je definován v nároku 21, a inhibitoru cysteinové proteasy, vybraného ze skupiny bílkovin, jež obsahují alespoň jednu opakující se thyroglobulinovou doménu typu I, k lokusu, kde má být řečený hmyz nebo nematoda(y) kontrolován(y).