CZ20002005A3 - Způsob zlepšení rezistence nebo tolerance rostlin k patogenům a molekula DNA kódující fúzní protein - Google Patents

Abstract

Způsob zlepšení rezistence nebo tolerance k patogenům rostlin ajejich potomstva, který spočívá v tom, že se do genomu rostlin integruje gen kódující fuzní protein, který obsahuje: a) první protein nebo proteinovou doménu s anti-patogenní aktivitou, b) spojovací peptid a c) druhý protein nebo proteinovou doménu s anti-patogenní aktivitou. Dalším předmětem řešení je genový konstrukt, kódované fuzní proteiny a také transgenní rostliny, exprimující tyto fuzní proteiny

Description

Způsob zlepšení rezistence nebo tolerance rostlin k patogenům a molekula DNA kódující fúzní protein

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu zlepšení rezistence nebo tolerance rostlin vůči patogenům, který spočívá v tom, že rostlina je transformována transgenem, který kóduje fúzní protein nebo dva či více proteinů nebo proteinových domén, které jsou schopné, pokud jsou samy exprimovány, zlepšit rezistence nebo tolerance rostlin vůči patogenům. Jako příklad provedení vynálezu je uvedeno vnesení dvou odlišných inhibitoru proteináz jako fúzního proteinu do Arabidopsis zhaliana, které vedlo ke zvýšení rezistence nebo tolerance k hlísticím (Nematena) parazitujícím na rostlinách. Transgenní rostliny připravené podle předkládaného vynálezu jsou rezistentní nebo tolerantní nejen k hlisticím, ale také k virům, houbám, bakteriím, hmyzu, roztočům a dalším škůdcům.

Dosavadní stav techniky

Hlístice (Kemazoda] jsou hlavním živočišným parazitem rostlin, který způsobuje celosvětové ztráty v zemědělství odhadované na více než 100 miliard dolarů ročně. Zlepšená odolnost k hlísticím je proto velmi potřebná, aby se snížilo používání chemických prostředků k hubení hlístic (nematicidů), z nichž některé patří k nejvíce škodlivým pesticidům užívaným v zemědělství vývoje transgenních rostlin k' hlisticím. Patří sem např.

Existuje několik možností se zlepšenou rezistencí inti-invazní a migrační

strategie, atenuace živných buněk a protihlísticové krmné strategie (Atkinson et al., Tibtech 13: 369-374, 1995). Druhý způsob využívá inhibitory proteinéz (PI), které představují důležitý prvek přirozené obranné strategie rostlin (Ryan, Annu. Rev. Phytopathol. 28: 425-49, 1990). Existuje 10 skupin PZ charakterizovaných u rostlin, které reprezentují všechny čtyři skupiny třídy proteináz, zejména cystein-, serin-, metalo- a aspartylproteinázy (Richardson, Methods in Plant Biochemistry 5: 259-305, 1991). Patentová přihláška EP-A-502 730 ukazuje, ze je možné dosáhnout účinné, na PI založené transgenní obrany proti hlísticím. Jednou z významných vlastností PI při boji proti hlísticím je jejich malá velikost. Potenciál PI pro ochranu transgenních rostlin je ještě zvýšen tím, že mnohé PI nemají žádné vedlejší cDNA kódující cysteir.zvé a serinové trávicí proteinázy cystických hlístic byly klonovány, jejich hlavní proteolytická aktivita byla lokalizována ve střevu, a bylo ukázáno, že inhibitory proteináz (PI; CpTI a oryzacystatin (Oc-I) účinně působí proti těmto proteinázám. Místně cílené mutageneze u Oc-I vedla po deleci jedné aminokyseliny ke zlepšení K:. Takto modifikovaný cystatin (Oc-IAD86) jako transgen má zvýšenou účinnost proti cystickým hlísticím brambor (Urwin et al., Plant J 8: 121-131, 1995). Pokud je exprimován v Arabidopsis, omezuje růst cystických hlístic háďátka řepného (Kezercdera schachtii) a hlístice Meloidogyne incognita v kořenových uzlinách.

Potomstvo křížení transgenního tabáku exprimujíci CpTI a lektin z hrachu projevovalo aditivní účinnost proti larvám Heliothis virescens (Boulter et al. Crop Protection, 9: 351354, 1990).

Pomocí tandemových konstruktů promotor/gen je možné dosáhnout podobného výsledku, aniž by bylo nutné křížit • ·

-J rostliny. Příroda sama navrhla přinejmenším dvě další alternativní cesty, jak dosáhnout exprese více než jednoho inhibitoru, a sice biřunkční inhibitory (Wen et al, Plant. Mol. Biol. 19: 313-814, 19 S 2 ; a multidomér.ové PI (Waldron et al., Plant. Mol. Biol. 23: 301-312, 1953; .

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je tedy způsob zlepšení rezistence nebo tolerance k patogenúm tím, že se vnese více než jeden protein, který ovlivňuje rezistenci nebo toleranci. Termín rezistence v předkládané přihlášce vynálezu popisuje účinek vneseného transcenu, který vede k omezení odolat nebo se zase zotavit z poškozeni po napadení patogenem

a dosáhn	out dobrého výnosu, tak	: rezistence	tak i tolerance
k patogenu vedou ke snížení š	kcd na plodině způsobených
patogenem.
Předkládaný vynález tedy pc	:>skytuj e:
-	Způsob zlepšení rezist<	=nce nebo tolerance rostlin
a jejich	potomstva k patogenúm,	který obsahuje krok, kdy se
do genomu těchto rostlin integruje gen	kódující fúzní
protein,	který obsahuje:
a)	první protein nebo	proteinovou	doménu s anti-
	patogenní aktivitou,
b)	spojovací peptid, a
c)	druhý protein nebo	proteinovou	doménu s anti-

patogenní aktivitou.

Předkládaný vynález zejména poskytuje způsoby, geny a proteiny, jak bylo již zmíněno výše, kdy • další proteiny nebo proteinové domény s anti-patogenní aktivitou jsou fúzovány s fúzním peptidem pomocí spojovacích peptidu, • alespoň jeden z prcceinu nebo jedna z proteinových domén s anti-patogenní aktivitou má aktivitu inhibitoru proteináz, • alespoň jeden z prcoeinú nebo jedna z proteinových domén s anti-patogenní aktivitou je proteinázový inhibitor OcIAD36 • alespoň jeden z prcoeinů nebo jedna z proteinových domén s anti-patogenní aktivitou je proteinázový inhibitor CpTI • gen ie funkčně soc~en s crctctorcvt sekvencí, která řídí expresi, přednesené ; kořeni rostli:., • spojovací peptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která j c p ΓΟ ί ΘΟ i 7C i C K 7 S ~ 6 C ΞΓ. 5. Z C S !---- Π C ΰ • spojovací peptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je v rosclině proceslyticky scabilní

• spojovací	peptid	obsahuj e	aminokyselinové u	sekvenci
QASSYTAPQPQ
• spojovací	peptid	obsahuj e	aminokyselinovou	sekvenci
VILGVGPAKIQFEG
• spojovací	peptid	obsahuje	aminokyselinovou	sekvenci

QASIEGRYTAPQPQ • je zlepšena rezistence nebo tolerance k hlísticim.

Předkládaný vynález dále poskytuje transgenní rostliny, které jsou získatelné způsobem podle vynálezu popsaným výše.

• φ · φφφ ··· ··· · φφφφ · · φ • φφ ·

Vynález především poskytuje:

• rostlinu exprimující fúzní protein, který je kódován molekulou DMA podle vynálezu

Kromě toho podle vynálezu je možné použít DMA molekuly podle vynálezu ke zlepšení rezistence nebo tolerance rostlin i jejich potomstva k patcgenum.

Pro lepší porozumění vynálezu jsou v následujícím textu podrobněji vysvětleny některé často užívané termíny:

Rostlina znamená jakoukoliv rostlinu, zejména semennou rostlinu. Strukturní a fyziologickou jednotkou rostlin je rostlinné buňka, která se skládá z prctoplastu a buněčné stěny.

Termín rostlinu která buďto tvoří čá = buňka označuje jakoukoliv buňku, rostliny nebo z rostliny pochází.

K příkladům	buněk patří	di f ereuo	tuané buňky, které	j SCu
součástí živ	ých rostlin,	difere:	:;ji.' ·;cuΓϊj j ό	uněčné
v η 1 r i ·, ř p . n a d i f e' e n o * v a n é		> ; 7 7 ' Ί ť r r p ;	buňky
n e d i f e r e n c o v a:	ných pletiv	J 5 f. 0	je kalus nebo n	ádory,
diferencované	buňky v seme	nu, emb	ryu, prcpagulu nebo	pylu.
Konkrétně tedy rostlinné	ounky	3 sou buďto ve	formě
izolovaných	j ednotlivých	buněk	nebo ve formě	vyšší
organizované	jednotky jako	je ros	tlinné pletivo nebo	orgán
rostliny.
Skupina	rostlinných	buněk múze být organizována do
strukturní a	funkční jednotky, kt	:erá se nazývá rostlinné
pletivo. Tento termín zahrnuje (al	e není pouze na ně c	mezen)

rostlinné orgány, semena, řízky, buněčné nebo tkáňové kultury a také jakékoliv skupiny rostlinných buněk organizované do strukturních a/nebo funkčních jednotek.

Termín rostlinný materiál označuje obecně listy, stonky, kořeny, květy, části kvetu, plody, pyl/ pylovou láčku, vajíčka, embryonální váček, vaječné buňky, zygoty, • · * · embrya, semena, řízky, buněčné nebo tkáňové kultury nebo jakékoliv části rostlin nebo produkty rostlin.

Rostliny nebo buňky, které obsahují trvale inkorporovanou rekombinntní DNA ve svém genomu se nazývají transgenní rostliny nebo transgenní buňky.

Termín transformace označuje vnesení nukleové kyseliny do buňky, zejména stabilní integraci DNA do genomu požadovaného organismu.

Termín rekombinantní DNA označuje jednu nebo několik molekul DNA vytvořených spojením segmentu DNA. pocházejících z různých zdrojů, která byla získána technikami rekombinantní DNA (tj . genového inženýrství) jak jsou popsány např. v příručce Sambrook e~ al., Molecular Clcning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,

NY, USA., 193 9	Techniky rekombinantní	DNA. (t j .	gen	ového
inženýrství c	oskyfujf rekcmbinarzi LNA :	) .0 V Z t r o,	ktei	: a se
přenáší do bur	:ěk, kde muže být expromová	na a muo	žena	;viz
např. Concise	Li cti;nerv of Eiomedici·	ze and	?jo 1 e	cul ar
Biology, Ed. Juo, Ce.C .-ress, Boča Raton,	1996).	rm — Ά . S h
přenos DNA. do	protcplastu nebo buněk se	provádí	'7 V· ·, i	z n y o u
formách, např.	jako (1) nahá DNA	v cirkul	ární	nebo
lineární formě	nebo jako nadšroubovice ,	(2) DNA	cbs	a ženě
v nukleosomech	nebo chromosomech, nebo	v jádru	či	jeho
částech, (3)	DNA komplexovaná nebo asociovaná	s jinými

molekulami, (4) DNA uzavřená v liposomech, sféroplastech, buňkách nebo protoplastech, a nebo (5) DNA přenášená z jiného organismu než je hostitelský organismus (např. z Agrcbac ten um tuntsisciens) . Tyto a mnohé daisi metody přenosu rekombinantní DNA do buněk jsou odborníkům známy a lze je užít pro přípravu transgenních buněk nebo transgenních rostlin podle předkládaného vynálezu.

Počáteční vložení rekombinantní DNA do genomu rostlin generace RD se neprovádí tradičním šlechtitelským způsobem, • · • ·· ale technickým způsobem, který je zde popsán. Po počátečním vložení se může transgenní potomstvo množit tradičními šlechtitelskými metodami.

Termín gen označuje diskrétní úsek chromozomu, který obsahuje regulační sekvence DNA, zodpovědné za řízení exprese kódující sekvence, které je transkribována a translatována do určitého peptidu nebo proteinu. Zejména se gen týká kódující sekvence a s ní asociovaných regulačních sekvencí, přičemž kódující sekvence je trarskribována do RNA jako je mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, sense-RNA. nebo antísense-RNA. Příklady regulačních sekvencí jsou promotorové sekvence, 5' a 3' netranslatované sekvence a terminační sekvence. Další prvky, které se mohou vyskytovat, jsou např. intrcny.

Za kódující sekvenci se považuje sekvence DNA. molekuly, jejíž transkripce a translace vede k vytvoření polypeptidu nebo proteinu.

pripace ízv,

COUZt enoogennino zenu r.eoo transgenu v rost_me.

antisense konstruktu se termín expresi transkripce antisense-DNA.

Molekula DNA, která obsahuje alespoň dvě heterogenní části, např. sekvence DNA, spoj eny, castz pocházející z jiz orive existující které ale v původním stavu nejsou spolu se nazývá chimérický gen. Takové chimérické molekuly se výhodně připravují technikami rekombinantní DNA.

Termín heterologní se zde užívá ve významu odlišného přírodního nebo syntetického původu. Tak např. když je hostitelská buňka transformovaná sekvencí nukleové kyseliny, která se v netransformované buňce nevyskytuje, pak je tato nukleová kyselina vzhledem k buňce heterologní. Transformující nukleová kyselina může obsahovat heterologní promotor nebo heterologní kódující sekvenci nebo heterologní terminační sekvenci. Alternativně transformující sekvence DNA

9 » 4

9 9

9 9

9999 II

99 může být úplně heteroloaní nebo muže obsahovat libovolnou kombinaci heterologních a endogenních sekvencí nukleových kyselin.

Způsob podle předkládaného vynálezu je založen na konstrukci genů, které kódují různí nebo efektorové proteiny nebo proteinové domény. Jako příklad provedení vynálezu jsou vybrány konstrukty sne os hlísticim, ve ktere- jsou fúzovány PI CpTi a Oc-IAD36. Tyto PI byly vybrány proto, vykazuj í odlišné mniorcni charakteristiky vedoucí k odlišitelným účinkům u cystických hlístic. CpTI ovlivňuje pohlavní vývoj a Oc-IAESc potlačuje růst, zejména u vyvíjejících se samic hlístic. Transgenní exprese takových fúzních proteinů vede ke zmenšení populace napadajícího patogenu v průběhu jediné generace, jak bylo určeno pro hlístice podle tvorby nových vajíček, nejméně o 25 b, výhodně o 50 -.

D ·~· <-* c Γ ο. ~ ,-' tj r*. z^-' l a > ov ý c h spcjovacíc; .<í clé ’ΖΪΖΟ Z r.*J. j 1 t Z β protein, vlastnosti jako fúzní protein ého třístucu codle vynálezu je užití peptidu peptidcvých spojek, linkeruj, oba PO jsou translatcvány jako fúzní .ir.keru určují také způsob přenosu, tedy nebo jako separátně po proteolytickém štěpení. Strategie využití linkeru má široké možnosti značně přesahující jen obranu proti hlísticím. Nabízí se tím nové možnosti skládání obranných genů pro zlepšení účinnosti a trvanlivosti odolnosti nebo tolerance transgenních rostlin.

Aby se zlepšila rezistence nebo tolerance rostlin k patogenům, způsob podle vynálezu obsahuje integraci do genornu těchto rostlin cenu kócujíoícho fúzní protein, který g

obsahuj e: a) první protein nebo proteinovou doménu s antipatogenní aktivitou, spojovací peptid,

c) druhý protein nebo proteinovou doménu s antipatogenní aktivitou, a

d) případně jeden nebo několik proteinů nebo proteinových domén s anti-patogenní aktivitou fúzovaných pomocí jednoho nebo několika peptidových spoj ek.

Výhodné proteiny nebo proteinové domény s antipatogenní aktivitou jsou ?I, toxiny z Bacillus thuringiensis, proteiny vztahující se k patogenezi, chitinázy, glukanázy, peptidy včetně lytických peptidů, thioniny, kolagenázy, lipázy, iektiny, proteiny inaktivující ribozorný, inhibitory pektináz, inhibitory lipáz, inhibitory α-amylázy, protein inhibující polygalakturonidázu, patatin, permatin, lysozym, cholesteroloxidáza, vircvý obalový protein, protilátky, ίednořetězcové u s p e s n c s t s .< c o i o v e r. o n z a nebo snižují zorány : by se takovéto fúzr. vyskytovaly v přírodě • - t ' ·· škůdci zpusober ;teinv nebo o o r- l G . Λ β 27 Z Z 27 3.27:0 , 2 5 r zzei2zcvé demén v v coacoe rozrozen, c:

i zen odpovídající genové sekvence výhodně pocházejí z genemu více než jednoho organismu a vyžadují užít techniky rekombinantní DNA, aby bylo možné je spojit. Ve srovnání s několikanásobným užitím stejné efektorové domény, což vede skutečně ke zvýšení efektorové koncentrace, odlišné domény dvou nebo i více efektorových proteinů umožňují existenci synergickéhc nebo aditivního účinku. Jestliže jeden nebo více proteinu nebo proteinových domén odpovídá doméně kódované specifickým úsekem genomu rostliny, která má být transformována, dojde jistě k integraci fúzního konstruktu podle předkládaného vynálezu v různých úsecích genomu. Zvláště výhodné jsou proteiny nebo proteinové domény s anti-patogenní aktivitou ·* 44 44 44 • · · 4 4 4 ·

4 444 φ 4 4 4

44 444 44 4 ··· · 4 44 4 ·· <4 >4 44 • 4 44 • 4 4 4 • 44 • · · 4 • 4 ·

444 4 44 ί' proti více než jednomu patogenu pro určitou plodinu, nebo anti-patogenní proteiny, které jsou účinné proti asociaci škůdců, jak k ní dochází např. mezi Fusarinm and Meloidogyne.

Některé hlístice vytvářejí živná místa obsahující modifikované rostlinné buňky a krmí se na jednom místě několik hodin nebo i déle. Sem patří druhy a rody Meloidogyne Globcdera, Hetercdera, Rotylenchulus, Tylencr.ulus, Macccbus, Miphinema, Longidcrus, Faralcncidcrus, Cryphodera, Trcphotylenchulus, Hemicyclicphora, Criconemella, Verutus a Heliocotylenchus. K rodům, které se krmí po více omezených období na jednom místě patří Pratylenchus, Radopholus, Hirschmanniella, Trichcdcrus, Faratrichcdorus, Ditylenchus, Aphelencnoides, Scuzeilcnema, a Belonolainus. Vzhledem ke snaze hubit škůdce výše uvedených rodu a další fytofágní rody hlístic jako jsou L zajímavé PI, koiag catatinv a cholesze:

'laimidae a Tylenchidae jsou zvláště zy, inhibitory pektinázy, lektány, rxidáza. Mnohé PI natři k zásobním crcceim m semenu.

Inhibitory cysteinové nebo serinové trávicí proteinázy lokalizované ve střevu hlístic jsou výhodné pro užití podle předkládaného vynálezu. Zvláště zajímavé jsou z tohoto hlediska cystenové proteinázy, protože nepatří k trávicím enzymům savců. Zvláště účinný je oryzacystatin (Oc-I). Místně cílená mutageneze u Oc-I vedla po deleci jedné aminokyseliny ke zlepšení K<. Takto modifikovaný cystatin (Oc-IAD86) jako transgen má zvýšenou účinnost proti cystickým hlísticím brambor (Urwin et al., Planí J 8: 121-131, 1995). Pokud byl exprimován v Arabidopsís, omezoval růst jak háďátka řepného (Hetercdera scnachtii), tak i cystické hlístice Meloidogyne incognita v kořenových uzlinách. Účinek jediného PI na členy obou hlavních skupin ekonomicky důležitých hlístic dovoluje výběr z velice široké strategie navození tt ··· • tt » tt • tt • · tt · • tt •tt tttt • tttt • tt tttttt tt tttt tttt tt tttt · • tt tttt tttt tttt tt tttt « • tttt « tt tttt * • tttt · tttt tttt rezistence k různým hlísticím u vybrané plodiny. To je v silném kontrastu s velmi omezeným rozsahem cílových druhu spojených s přirozenými geny rezistence. Tak např. rezistence H1 přítomná v kultivarech jako je Maris Piper poskytuje kvalitativní rezistenci proti jediné cystické hlístici brambor (Globcdera rcszcchiensis) , a přitom vůbec žádnou rezistenci k velmi blízce příbuzné hlístici jiného druhu (G. pal li dá) .

Funkce spojcv patogenní proteiny nenarušila jejich délku 3 až 15 amine) Ser a Thr se velmi a obecně to jscu flexibilitu a ostal umožňuje interakci ; peptidu (linkeru) je spojit anti:c proteinové domény tak, aby se ce . Přirozené linkery mají obvykle in. Pentapeptidy složené pouze z Gly, co vyskytují jako přirozené linkery ajlepší linkery

Glycin poskytuje s Ql ?m dvě amino:

z o o u s t e d 1 v vseliny jsou polární, což nebo vznik vodíkové vazby jis tt by reagovaly s j ir.ývr čáscvi svíjených vrcíeivu nebo proteinových domén a ne^-sou náchylné k tomu, aby je štěpily proteázy hostitelského organismu. Za výhodné aminokyseliny z tohoto hlediska jscu považovány také Ala, ?rc, Asp, Lys, Gin, a Asn. Hydrofobní zbytky nejsou vhodné, jak např. Arg a Glu, největší z bazických a kyselých zbytku. Linkery náchylné ke štěpení široce rozšířenými proteázami často obsahují jednu nebo více nevýhodných složek. Např. jde o motiv Gly-Gly-X, kdy X je často aminokyselinový zbytek s hydrofobním postranním řetězcem, který je častým cílem proteolytického působení. Tyto záležitosti a také seznam potenciálně vhodných linkeru byly popsány v publikaci Argos, P., J. Mol. Sici. 211, 943-958, 1990. Tam se ovšem nijak zvlášť neuvažovalo o linkeru, který je štěpitelný.

• 99 9 9 9

Linkery byly použity v řadě aplikací. Nejvýznamnější v souvislosti s předkládaným vynálezem je použití línkem pro expresi molekul funkčních protilátek jako jsou jednořetězcové protilátky v rostlinách. V rostlinách byly exprimovány jak úplné protilátky tak i protilátky modifikované metodami genového inženýrství. Jednořetězcové fragmenty (ScFv) protilátkových Fv se mohou připravovat spojením variabilních domén těžkého (V_;._:) a lehkého (V·) řetězce protilátkového genu (V). jedním ze způsobů, jak toho docílit, je použití peptidových línkem, účel pomoci počítače troj rozměrných peptidc

Úspěšný linker linker s přilehlými a: aminokyselin: KESG5V;

423-427, 1988; sektu s aminokyselinovou se science z a z: a z 3 — — z , jyla navržena řada peptidu pro tento :h programu a prohledáváním knihoven yl např. přirozený imunoglobulinový nokyselinovým zbytky mající sekvenci FQLAQFRSLD (Bird et al. , Science 242 ce id. č. 12) V dalším peptidu -encí EGNssGSGSESK? (Bird et al. , 338; sekvence ii. č. 13) převládají

ScFv v rostlinách .Cuen et al . , Biotechnolcgy 10, 730-794;

1992) . Linker a aminokyselinovou sekvencí GGGGSGGGGSGGGGS (sekvence id. č. 14) byl doporučen jako vhodný pro protilátky ScFv na základě stanovení euklidovské vzdálenosti mezi C-koncem V_H domény a N-koncem V_L domény (Huston et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. 85, 5879-5833; 1988). Tento linker má vhodnou flexibilitu a uchovává si stabilitu a konformaci v roztoku (Argos, ?, J. Mol. Biol. 211, 943-958, 1990) .

V jednom provedení předkládaného vynálezu jsou úseky kódující inhibitory preteináz Oc-IAD86 a CpTI uspořádány tak, že vytvářejí tandem a jsou spojeny ve shodném čtecím rámci peptidovým linkerem, který byl navržen tak, že je schopen proteolýzy. Sekvence peptidového linkeru obsahuje sekvenci aminokyselin (VILGVGPAKIQFEG, sekvence id. č. 1) z centrálního úseku oddělovače” z proteinu podobného metalothioneinu z hrachu PsMTa (Evans et al., FEES 262: 29-32,

1990) . Tento oddělovací úsek je znám tím, že je citlivý k proteinázám (Kille et al., FE3S 295:171-175, 1991 a Tommey et al., FEBS 292: 48-52, 1991). Jak CpTI tak Oc-IÁD86 byly přítomny zejména jako samostatné proteiny, když byly exprimovány v transgenních rostlinách Arabidopsis. Mnohé jiné proteiny byly pcpsár.y jako citlivé k proteinázám a bylo charakterizováno několik rozpoznávacích sekvencí (Uhlen et al., Meth. Enzymol. 183: 129-143, 1990 a Fcresberg et al.,

J. Prot. Chem. 11: 2CÍ-211, 1992) .

Přirozeným přec: k proteázám je multicy tandem jedenácti cyst; které jsou schopně pro

Plant. Mol io cn;

Eiol. 2 :e štěně:

_ a n i n z ; inových . e o 1 y í i c í 01-812., použití línkem citlivých :ramboru, PML, který obsahuje domén spojených sekvencemi, éno štěpení (Waldron et al., 1993 i . Ale není známo, že by

Vr5t’vě V hiiZcCn. c? ~ Z. cl ~ Z f Z 3 7 3 chílVOVáZ CO CO 5Θ fragmentuje v trávicím systému některých druhu hmyzu. PML však není vhodný pro použití proti hlísticím, neboť je nepravděpodobné, že hy mohly spolknout protein velikosti 86.8 kDa.

Skvrny ozdobného tabáku Nicotiana alata obsahují neobvyklý Pl (ΝΑ-ΡΙ-ΪΙ) . Je exprimován jako prekurzorový protein předpokládané velikosti 41.6 kDa, který je štěpen na šesti místech, a tim dochází ke vzniku sedmi peptidů. Všechny, až na jeden peptid, mají stejnou velikost a sdílejí N-koncovou sekvenci, ale sedmý peptid zřejmě nemá funkční inhibiční místo pro inhibici chyraotrypsinem nebo trypsinem. Místa vedoucí k uvolnění Pl nebyla dosud určena.

• ·

Molekuly, které jsou podrobeny takovému opracování, existují také u živočichu, jedním příkladem je profilaggrin, který se účastní terminální diferenciace epidermis savců.

V jiném provedení vynálezu jsou kódující úseky ?I Oc-IAD86 a CpTI uspořádány v tandemu a spojeny do čtecího rámce peptidovým linkerem, jehož sekvence je navržena tak, aby byla odolná proteolýze. Tento linker odpovídá úseku 11 aminokyselin (QA.SSYT.-.PQPQ; sekvence id. č. 2) houbového enzymu galaktózccxidázy, který spojuje dvě domény tohoto enzymu. Tento úsek je znám tím, že je strukturně rigidní (Ito et al., Nátuře 350: 57-31, 1391) a není žádný důkaz o tom, že by byla proteolyticky štěpen, což napovídá, že není náchylný k rychlé proteolýz fúzního proteinu 1 jako protein vel semirigidní linker; et al., J. Chem. který lze užít

Arabidcpsis konstrukt řídí expresi ΣΔΡ86 and CpTI, který zůstává intaktní ostí 23 kDa. Byly popsány i jiné, jako např. linker glukoamylázy 1 (Kramer o. Farad. Trans. 89: 2595-2602, 1993), :c stejnou funkci. Sekvence linkeru e rút modifikována tak, aby se stala citlivou k proteolytiokému štěpeni. Tato modifikovaná sekvence linkeru ýASlFCFYTAPQPQ ísekvence id. č. 11) je proteolyticky štěpena v houbovém expresním systému.

Kódující sekvence fúzního proteinu podle předkládaného vynálezu je v rostlinách, indukovatelné, s promotorem funkčním patří konstitutivní, vývojově regulované, operativně spojena K výhodným promotorům časově regulované, chemicky regulované, tkáňově výhodné a tkáňově specifické promotory.

K výhodným konstitutivním promotorům patří promotory

35S a 19S CaMV (Fraley et al., U.S. Patent 5, 352, 605). Další výhodný promotor je odvozen z kteréhokoliv z několika aktinových genu, o kterých je známo, že jsou exprimovány v buňkách většiny typu. Promotorové expresní kazety popsané • · • φφ • φ φ φφφφ · · · · • ΦΦΦ ·· ·· ·· ·· «φ

v publikaci 1-lcElroy í	?“ al., Mol. Gen. Genet. 231: 150-160,
1991 lze snadno modif:	skovat pro expresi kódujících sekvencí
a jsou zvláště vhodné	pro použití v jednoděložné hostitelské
rostlině.

Další výhodný konstitutivní promotor je odvozen z ubikvitinu, což je další genový produkt známý tím, že se akumuluje v mnoha typech buněk. Ubikvitincvý promotor byl klonován z několika druhů a lze ho užít u transgenních

rostlin (např. sluneč	nice - Binet et al., Plant Science 79:
87-94 (1991), kukuřic.	= - Christensen et al. , Plant Molec.
Biol. 12: 619-632 (198	2>;. Na základě ubikvitovéno promotoru
kukuřice byly vyvinu-	ty transgenní jednoděložné systémy
a příslušné sekvence a	vektcry konstruované pro transformaci
j ednoděložných rostli:'	jscu popsány v patentové přihlášce
EP-A-342 926 autoru Ch:	ttsfíansen et a1..
Tkáňově spécifi	zké nebo tkáňově výhodné promotory
vhodné pro expresi kéž	lajících sekvencí v rostlinách, zejména
v kukuřici a cukrové ř;	spě, jsou takové promotory, které řídí
expresi v kořenu, dřen:	i, listu nebo oylu. K příkladu takových
promouoru patří ΡΝΞ1	z jenu bl-tubulinu z Arabidopsis
zo.aliana (Snustad et	al., Plant Cell 4: 549, 1992),
promotorcvý úsek PsE	'db z metalothioneinu podobného genu
z Pisum sativum (Evans	et al., EEBS Letters 262: 29, 1990),
promotory RPL16A and	ARSK1 z .Arabidopsis zhaliana a další

promotory popsané v patentových přihláškách WO 97/20057

a WO 93/07278. Dalším	vhodným promotorem je promotorový
fragment wunl z brambo:	:u (Siebertz et al., Plant Cell 1: 961-
968, 1989), který je :	indukován v tkáních obklopujících místa

poranění. Navíc, pro řízení exprese jsou užitečné chemicky indukovatelné promotory a jsou také výhodné (viz

WO 95/194 43) .

Kromě promotoru se v chimérických genech podle předkládaného vynálezu muže užít celá řada transkripčních

9 9 9 9 terminátoru. Transkriponí terminátory jsou zodpovědné za terminaci transkripce za transgenem a jeho správnou polyadenylaci. V jednom výhodném provedeni vynálezu je kódující sekvence operativně spojena vyskytující polyadenylační signální transkripčním terminátorům, z těch, se S'.^rou pnrozene se sekvenci. K vhodným které jsou funkční v rostlinách, patří CaMV 35S terminátor, tmi terminátor, rbcS E9 terminátor z hrachu terminátory. Vhodné z Ti plazmidů Ά. torné.

a další odborníkovi známé erminační úseky jsou dostupné :ien.s, jako iscu naoř. terminační úseky oktopmsyntazy publikace jako např. Guerineau et al., Proudfoot, Cell, 64: Dev., 5: 141-14 9; M (1990); Munrce et ai

- oseň;

nopaí msyntazy.

srg et ai. , Gene, :n. Geuet., 262:141-144 ί (1991¹; Sanfaotn et sl

Viz také další 56:125 (1937);

151-153 (1990);

(1991); G e n e s

1261-1272

Sallas er

Nucleic Acids to

Nucleic Acid Res., 1:

Sylv nalezeny četu expresi z transkriponí ý ve spojení s kódující v transgenních rostlinách sekvence zvyšují expresi rostlin. Tak naoř. se

17:7391-7903 (1 )639 (1937) ) . sekvence, xt

Jcshi et al., zvvsuti cenovou sekvencí pro zvýšení exprese 3ylo ukázáno, že mnohé intronové zvláště v buňkách jednoděložných ujistilo, že introny genu adnl z kukuřice významně zvyšují expresi divokého typu genu řízeného svým původním promotorem, když se vloží do buněk kukuřice (Callis et al. , Genes Develop. 1: 1183-1200 (1987)).

rutinně vkládají do vektorů pro typicky do netranslatované vedoucí

Intronové sekvence se transformaci rostlin, sekvence.

Konstrukty podle vvnále mohou také obsahovat regulátory jako je jaderný lokalizační signál (Kaldercn et al. Cell 39: 499-5C9 (1984); a Lassner et al., Plant ···· ·· ·· ·· ·· ··

Molecular biology 1' kanonické sekvence 6643-6653 (1937)), :229-234 {1991);, rostlinné translační (Joshi, C.P., Nuoleic Acids Research 15: introny (Luehrsen and Walbot, Mol. Gen.

Genet. 225: 81-93 (1991)), a podobné sekvence, operativně spojené s vhodnou nukleotidovou sekvencí.

Výhodně vedoucí sekvence 5' je součástí konstruktu expresní kazety. Taková vedoucí sekvence působí tak, že zvyšuje expresi. Translační vedoucí sekvence jsou odborníkům známy a patří k nim např. vedoucí sekvence picornavirú, např. ECMV (5' nekódující úsek viru

Stein, 0., Fuers:, T.R., a Moss,

66: 6126-6130 (1959: ; pctyviru, na

Virus), MDMV (Maize Lwarř Mosaic Virus) (Allison et al.), Virology, 154: 9-21 (1956)), a vazebný protein těžkého řetězce lidského imuncglcbulinu (EiP), (Macejak, D.G., Samow, P. , Nátuře 353: 90-94 (1991), netranslatovaná vedoucí sekvence mRNA pro obalový protein viru mozaiky vojtěšky (AMV RNA 4)(Jobling, S.A., Gebrke, L., Nátuře tlcmyocarditis) (ElroyFroc. Nati. Acad. Sci. USA. zvviru, např. TEV (Tobacco Eten

325

622-62:

l:

vedoucí ekver.ee viru mozaiky tabáku (TMV) (Gallie, pages 23^-256(1939) : skvrnitosti kukuřice al., Mciecular-biology o a veocuci sekvence vtru cnzorcticte s (MCMV) iLcmmel, S.A. et al., Virology 91: 362-335 (1991)).

Viz také Della-Cicppa et al., Plant Physiology 34: 965-963-,

1937 .

Geny kódující fúzní proteiny podle vynálezu mohou být vneseny do rostlin řadou různých způsobů v oboru známých. Odborníkovi je známo, že výběr vhodné metody závisí na druhu rostliny vybrané pro transformaci. K metodám vhodným pro transformaci rostlinných buněk patří mikroinjekce (Crossway et al., BioTechnigues 4: 320-334 (1986)), elektroporace (Riggs et al., Prcc. Nati. Acad. Sci. USA 33: 5602-5606 (1936), Acrcbacterium-zerestředkovaná transfromace (Hinchee • · • · ♦ · tt »· » · · · tttt ·· · · •» tttt et al., Biotechnology 6:515-921 (1983;; viz také Ishida et al., Nátuře Biotechnology 14: 745-750 (June 1996) transformace kukuřice., přímý přenos genu (Paszkowski et al. , EMBO J. 3; 2717-2722 (1934); Hayashimooo et al., Plant

Physiol. 93: S57-363 (1990) (rice)), a balistické urychlování částic pomocí zařízení od firmy Agracetus, lne., Madison, Wisconsin nebo Dupont, lne., Wilmington, Delaware (viz např. U.S onologv 6: 923—í Annual ?.ev. Genet.

Particulace

S v a o e t (chloroc 671-674 92 6 (19í

85:

Sanford et al.

Cell 2: 6)

Biotechnology al., Nátuře Biotechnology

Bio/Ta ch r.olc gy

4,945,050;	a McCabe	et	al
i . Viz také	Weissinger	et	al
77 (1933);	Sanford	et	al

C i Θ V ?rcc	ce and Technology o: 2/-37	91937) (cibule);
	a ad. ící. Do A 8 /; s	526-8530	(1990)
tab	áku ; Chr	iscou et al. , Plar	:t Physiol	. 3 7 ;
; (se	'a;; McCabe et al., Bic/Teci	; nology 6:	923-
ja) ;	Klein et	al. , Proč. Nati. .	Acad. Sci.	USA,
309	.1933)	(kukuřice); Klem	n et	al. ,
y 6:	552-563	(1933) (kukuřice);	Klein et	al. ,
. 91	: 443-444	(1933) (kukuřice);	Fromm et	al. ,
'/ 3 :	333-:39 (	1990); a Gcrdon-Kamm et al. ,	Plant
3-61	3 1990)	(kukuřice); Ko	ziel et	al . f
Ί 1 ·	154-200	(1993! ( kukuřice)	; Shimamoto ec
3 3?:	2_--277	í 1 Q o ' ί θ } / (3 V	rostou et	al. ,
9:	95_-962	(1991 i (rýže);	Datta et	al. ,

8:~3c-/4Q (1990)(rýže); Evropská patentová přihláška EP-A-332 zahradní traviny a další Pooideae);

Vasil et al., Biotechnology 11

Weeks et al., Plant Physiol Wan et al., Plant Physiol.

102

1553-1558 (1993) (pšenice);

1077-1034 (1993) (pšenice);

al

Proč. Nati

1993)(čirck); Somers et (Dec. 1992) (oves; Torbert ?t al.,

104: 37-43 (1994)(ječmen); Jahne et al., Theor. Appl. Genet. 89:525-533 (1994)(ječmen); Urnbeck et al., Bio/Technology 5: 263-266 (1987)(bavlník); Casas et

Acad. Sci. USA 90:11212-11216 (Dec.

al., Bio/Technology 10:1589-1594

Plant Cell Reports 14:

• · · · » · ft <

• ftft • «I • · • ftftft ftft

635-640 (1995)(oves); Neeks et al., Plant Physiol. 102: 10771084 (1993)(pšenice); Chány et al., WO 94/13322 (pšenice) a Nehra et al., Tr.e Plant Journal 5:235-297 (1994)( pšenice).

Jedním příkladem zvláště výhodného provedení vnesení rekombinantních molekul DNA. do cukrové řepy transformací zprostředkovanou Agrcbacterium je postup popsaný v Konwar, J. Plant Biochem & Biotech 3: 37-41, 1994.

Metody užívající přímý přenos genu, ostřelování částicemi nebo transformaci zprostředkovanou Agrobacterium, užívají výhodně, i když nebo markér vhodný pro s k antibiotikum (jako je methotrexat) nebo herci selektovateiného markem transformovaných rostli v předkládaném vynálezu. r.ptll, který uděluje re antibiotikům (Vieira & Bevan et al.

-----tj z icr. :

Nátuře 304:134-13 udělute rezistenci

Nucl .

- Cl OS

Appl. Genet rezistenci zně, selektovatelný markér který poskytuje rezistenci anamycin, hygromycin nebo př. fosfinotricin) . Výběr em vhodného orc screeninc rm_aoy vnocnyoh genu jsou gen tencí ke kanamycinu a příbuzným ;sir.g, Gene 19: 259-263 (1982);

(1933)), gen ?ar, kterv herbicidu f;

; i metr ic mu nygremyemu 4: 2929-2931' et al., z al., Theor. utery uděluje (Blochlínger a gen dhfr, ’Wnit<

tes. 1·?: mm mm , iper.cer 79: 615-631 193()), gen hph, k antmictiuu a Diggelmann, Mol. Cell. Biol. který uděluje rezistenci k methotrexatu (Bourouis a Jarry, EMBO J. 2: 1099-1104 (1933)). Transformaci lze provést jediným druhem DNA. nebo několika druhy DNA (jde o tzv. kotransformaci) a oba způsoby jsou vhodné např. pro kódující sekvence Pl.

Dalším provedením předkládaného vynálezu je fúzní protein popsaný výše, který obsahuje • · • · • ·· • · « »· · · · · užit & )

b)

c) první protein nebo proteinovou aomenu s antipatogenní aktivitou, spojovací peptid, druhý protein nebo proteinovou ocménu s antipatogenní aktivitou, a případně jeden nebo více dalších proteinu nebo proteinových domén s anti-patogenní aktivitou fúzovaných pomocí jednoho nebo několika peptidových spojek, a LNA kon stři rostlin a jejich poť nebo nepohlavně zisk ome z í t a o ’' k i o ~ uvede-» c ^vc t p i LSter.ce nebo tolerance ;va, které je definováno další cenerace, včetně .y, které lze }. patogenúm jako pohlavně ootomstva, i když na n tr

Patogeny jako híístioe způsobují ekoncmicue ztráty na většině plodin pěstovaných po celém světě. Patří sem např. ze zemědělství mírného pásma brambory, cukrová řepa, zeleniny (rajčata, okurka, zeií, květák, celer, salát, karotka, řepa, čočka a cizrna), olejniny, luštěniny, kukuřice, ječmen, oves, žito, rýže a další obiloviny, trávy pastinák pšenice, a pícniny y :ne :e _ e raď.

_esKyj , lesní stromy, opadavé stromy a ořechy, ovocné stromy a keře včetně :esnek, :ibule vinné révy, ozdobné rostliny a cibuloviny, a skleníkové rostliny. Patří sem také tropické .plodiny jako je rýže a další obiloviny (včetně pšenice, ječmene, kukuřice, ovsa, čiroku a prosa), kořenové nebo hlíznaté plodiny (okopaniny jako brambory, sladké brambory, maniok, hlízy Dioscorea, taro), luštěniny, zeleniny (včetně rajčat, okurek, okurek pro nakládání, cantaloupských a jiných melounů, vodního melounu, zelí, květáku, čili-papriček, lilku, česneku, cibulí, celeru, dýní a patiscnu, salátu, cizrny a čočky), podzemnice olejna, .trus;·, subtr coto.te a trooicue • · · · » · · » · · · · » 0 4 94

4 4 4 9 0

0 4 9 4 4 9 4

9 4 9 4 4 4 9

4 4 · 4 4 4 ► 44 4 4 44 ovocné stromy, kokcsová palma a jiné palmy, kávovník, kakaovník, čajovní?., banánovníky druhu plaintain i abaca, cukrová třtina, tabák, ananas, bavlník a další tropické technické plodiny a také celá řada koření.

Zmíněné dvouděložné i jednoděložné rostliny transgenně exprimující fúzní proteiny předkládaného vynálezu představují další výhodné provedení vynálezu, a stejně tak jejich potomstvo a jejich semena.

Dalším předmětem vynálezu je komerční sáček obsahující semena takových rostlin. Výhodným provedením je obchodní sáček s označením a instrukcemi k použití semen obsažených ' ' ’ . Genetické vlastnosti vnesené ío rostlin popsaných se předává'·! dále pohlavní rozmnožováním nebo :e vegetativním růstem v potomstvu těchto a množení se užívají metody v c byly vypracovány pro· specifick; nebo sklízení. Specializované hydroponické nebo skleníkové využít, jelikož jscu rostoucí a poškození hmyzem r.ebo infekcemi, a kcmpeticí s plevely, je pro dosažení tudíž udržovat a rozmnožovat Cbecně řečeno k udržování sboru zemědělství známé, :ý účel, jako je oráni, meto dy, jako jsou které např.

také mohou učinit příslušná ; škodlivému hmyzu, K těmto opatřením technologie se plodiny náchylné k napadení také jsou ohrožovány dobrého výnosu třeba natření proti plevelům, chorobám rostlin, hlísticím a ostatním škodlivým vlivům, patří mechanická opatření jako je orání půdy nebo odstraňování plevelu a infikovaných rostlin, ale také aplikace agrochemických prostředků jako jsou herbicidy, fungicidy, gametocidy, nematicidy, růstové regulátory, dozrávací činidla a insekticidy.

Výhodné genetické vlastnosti transgenních rostlin a semen podle předkládaného vynálezu je možné dále využít ve šlechtění rostlin s cílem vyšlechtit rostliny se zlepšenými vlastnostmi jako žscu naoř. tolerance ke škůdcům, herbicidům ·· 99 99 99 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 999 999 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 99 99

nebo stresům, zlepšené rr	utr iční	hodnota, zvj
zlepšená struktura, uzer	á vede	ke snížení
polehéním nebo opadáním	. Jedn	otiivé kroky
procesu jsou charakterů	zovány	dobře def in·
zásahy jako je výběr	linií	ke křížení,
rodičovských linií nebo	výběr	potomstva.

;Π7 vynos, šlechtitelského požadovaných vlastnostech se provádějí různá šlechtitelská opatření. Odpovídající techniky jsou v oboru dobře známy a nejsou omezeny pouze na hybridizací, inbreeding, zpětné křížení, víceliniové křížení, křížení variet, mezidruhovou hybridizací, aneuploidr.í techniky apod. Hybridizační techniky £> a : 1 i J. .; C L o i G i.; — J. - .

nebo biochemickými : samčí sterilitou p rostliny se samčí uniformně vlastncs^-

'.anictymz, chemicuymi opylení rostliny se „r.é linie zajišťuje, ou ale samičí fertilit u rodičovských linií ze aencm transgenní semena a rostliny podle předkládaného vynálezu se mohou použít k vyšlechtění zlepšených linií rostlin,' které např. zvyšují účinnost konvenčních metod jako je ošetření herbicidy nebo pesticidy, nebo se díky svým modifikovaných genetickým vlastnostem obejdou Alternativně je možné získat nov; tolerancí ke stresu, které díky genetické výbavě pos· bez těchto prostře ují produkty plodiny se zlepšenou jejich optimalizované v leoší kvalitě než produkty rostlin, které nejsou schopné tolerovat srovnatelně nepříznivé vývojové podmínky.

V semenářství jsou kvalita klíčení a uniformita osiva nezbytnými charakteristikami produktu, zatímco kvalita klíčení a uniformita semen sklízených a prodávaných farmáři nejsou důležité. Jelikož je obtížné udržovat plodinu v čistém stavu bez příměsi semen jiné plodiny nebo plevelu, kontrolovat nemoci ořenášené semeny, a produkovat osivo inacne φφ φφ ·· ·· ·· ·· φφφφ φφφ ΦΦΦ· φ φφ · · ··· · · · ·

4 9 4 · 4 4 4 4 9 4 4 9

9 9 4 4 4 4 9 4 4 4

9949 44 94 44 44 49 s dobrou kvalitou klíčeni definované techniku výroby osiva, kteří mají zkus: a udržováním a čistého osi’ kupuje certifikované ose standardům, místo aby p Materiál používaný jako osi vrstvou obsahující herbi baktericidy, nematicidy, mol Obvykle užívané ochranné kaptan, karboxin, chirac extenzivní dobře osiva byly vyvinuty producenty ;nosti s pěstováním, zkoušením ua. Je běžnou praxí, že farmář vo odpovídající kvalitativním ižíval osivo z vlastní úrody, .vo je obvykle ošetřen ochrannou cidy, insekticidy, fungicidy, uscicidy nebo jejich různé směsi, zrstvy obsahují sloučeniny jako : (TMTD), metalaxyl (Apron) a pirimifosmetyl sloučenin·; tvoř:

Accellio uiua ootreoa, tvte látkami, nosiči, surfaktanty nebe adjuvans usnadňujícími aplikaci, což se běžně užívá oři fcrmulaci prostředku pro ochranu před poškozením bakteriálními, houbovými nebo živočišnými škůdci. Schranná vrstva se muže aplikovat impregnací osiva tekutým prostředkem nebo kombinovanou aplikací kapalného a suchého prostředku. Jiné způsoby aplikace lze také použít, např. přímé ošetření pupenů nebo plodu.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká nových zemědělských zpusebu, jejichž příklady jsou uvedeny v předchozím textu, a které jsou charakterizovány použitím transgenních rostlin, transgenního rostlinného materiálu nebo transgenního osiva podle předkládaného vynálezu, který je v dalším textu podrobněji vysvětlen formou neomezujících příkladu. V těchto příkladech byly způsoby přípravy a další manipulace a analýzy nukleových kyselin prováděny standardními postupy, které jsou popsány v laboratorní příručce Sambrook et ai. in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA, 1989.

99 99 99 99 I » · · 9 9 9 9 9 9 9

999 9 9999 · ·· ·· 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • ·· · 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 99 9

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava expresní razeny s i jitým inhibitorem

Fúzní proteiny obsahující jak Gc-IAD86 tak i CpTI kódující úseky oddělené sekvencí spojky (linkeru) byly připraveny dvoukrokovou polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). Kódující úsek Oc-IAD36 byl amplifikován v PCR z již existujícího konstruktu (Urwin et al, Plant J 8: 121-131, 1955) užitím oligonukleotiáovéhc· primeru ?1

,. c to i e m e o a¹ •konci ocdo;

:u, a uroněno primeru TGCATTTGCACTGGCATC-3' ;

s e r v e n o e i o. c. - , .otěr y j kódujícího úseku Co-IAI?6 a k 5'-konci podtržené, proteě; st6Cite±r.é, s e k v e n o e 11 n e r u z i s x sněno ze se k v e n c e rostlinného genu podobného mezaiothioneinu (Evans et al., FEBS 262: 29-32, 1990). Podobně byl amplifikován v PCR gen CpTI z binárního vektoru pRCK/CpTI+5 obsahujícího CpTI cDNA pod kontrolou promotoru CaMV 355 (Hilder et al., Nátuře 330: 160-163, 1937) užitím oligonukleotidového primeru

P3 (5'-GTCGGTCCGGCGAAGATCCAGTTTGFAGG?AGTAATCATCATGATGAC-3', sekvence id. č.

3' úsek podtržené, PsMTa a 5 —konec >) , který byl navržen tak, aby kódoval proteázou štěpitelné sekvence linkeru kódujícího- úseku CpTI, a primeru

5'-Τ T C T TAC TCATCAT C Τ TCATC C<

TGGACTTGC-3' ieKvence id.

č. 6), který je komplementární k 3'-konci kódujícího úseku

CpTI. Amplifikované sekvence OC-IAD86 a CpTI obsahují komplmentární úsek velikosti 18 bp na příslušných 5' a 3' koncích a byly spojeny dohromady specifickou PCR technikou zvanou SOEing (Ho et al, Gene 77: 51-59, 1939, Horton et «« ·· ·· 49 44 44

9 4 9 9 4 9 9 9 9 9 ·«· · 4 994 9 4 4 ·

4 4 4 4 4 9 » 9 9 4 4 · • · · ···· · · · · ···· »* φ· ·· ·« al, Gene 77: 61-68, 1959) užitím oligonukleotidových primeru

Pl a P4. Výsledkem štěpitelnvm lir.

VIL GVGPAKKAFEG, kde φ Τ T o, že Oc-IAD86 a CpTI jsou odděleny n s aminokyselinovou sekvencí ipky ukazují potenciální štěpná místa (fúzní protein Oc-IAD5c \PsMTa\ CpTI ).

Podobný postup byl užit k přípravě fragmentu DNA, který kóduje Oc-IAD86 a CpTI, mezi kterými je neštěpitelný linker (fúzní protein Oc-IAD36/go/CpTI), který byl získán ze sekvence genu pro galaktózooxidázu (McPherson et al. 1992) na jedné straně užitím páru oligonukleotidových primerú Pl, který byl uveden výše, a

P5 (5'-CTGGGGGGCTGTGTAAGAACTAGCTTGGGCATTTGCACTGGCATC-3' ;

:exvenc tt J. .

ruhé :aru ortmeru íTCATCATGATGAC-3';

?4, který byl již uveden výše mjicí ____ .t rzer.

íkvencí neštěoitelného línkem má složení sekvence QA5SYTAPQFQ.

Amplifikované fútní konstrukty byly nejdříve klonovány do vektoru PCRII (Invitrogen, Leek, The Netherlands) a z něho pak do místa Smál expresního vektoru pQE32 (Qiagen) kvůli sekvencování aexpresním studiím. Pak byly přemístěny z pQE32 jako Pst I (T4 polymerázou zatupené)/Bam HI fragmenty do pBI121 (Clonetech Laboratories lnem, kde nahradily původní gen GUS po vštěpení PStl (T4 polymerázou zatupené)/BamHI. Fúzní sekvence jsou ped kontrolou promotoru CaMV35S z pBI121.

Příklad 2

Příprava expresní:

·« ·« ·· ·· ·· *·

9*9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 · 9 9· 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · · 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 99 99

Sekvence kódující zralý inhibitor trypsinu (CpTI) z vigny byla amplifikována z plazmidů pUSSR (Hilder et al, Nátuře 220: 160-163, 1987; polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) užitím oligonukleotidových primerú navržených na základě publikované sekvence, ale s místy pro restrikční enzymy (podtržena) pro snazší klonování vektoru. Tyto dva primery měly sekvence 5' -A.CTATGGATCCAxGTAA.TCA.TCATGA.TGA.GTC-3' (sekver ^ΊΟΑΤΟΤΤΤ-3' 'sekvence ____ .

do

5' -ATATT A? GCTT^TC do expresního id. č.

. d. č . 10)

J. Ο í; C V či 1.

utn' systém, oiagen) incizi inkorporovaných expresmr.c \extern p·,:? ^_.-ezpružitím restrikčních míst Sam-I a prostřednictvím primeru.

Sekvence kcoujtcz Cc-r tyla ampízzzxovane z gencmove DNA Gryza saziva D. ýapcnfca pclymerázcvou řetězovou reakcí (PCR) užitím oligonukleotidových primeru

P7 (5' -ACATGTCGAATTCTTA.GGCATTTGCA.CTGGC-3' ; sekvence id. č. 15) a P8 (5'-GAGGAGCCCGGGTCGA.GCGA.CGGA-3'; sekvence id. č. 16). Introny byly odstraněny specifickou PCR technikou zvanou xdv oviv car v

SOEing (Ho et al., supra), oligonukleotidových primeru

P7/P9 (5'-CTCGAACTCTA.G.AAGAGAATTGGCCTTGTTGTG-3' ; sekvence id.

č. 17) a

P8/P10 (5'-AAxTTCTCTTCTAGAGTTC-3' ; sekvence rd. č. 18) pro ampliřikaci dvou exonu.

Oba produkty pak bylv spojeny SOEing ampliřikaci užitím primerů P7 a P8 a výsledný produkt byl klonován do plazmidů Bluescript naštěpeného Smal/EcoRI. Pak byl takto upravený gen Oc-I klonován do expresního vektoru typu IV pQE • ··

4 4 ·

4444 4 4 (Qiagen) užitím restrikčních míst BamHI/HindlII. Pak byla užita klonovací strategie 'Unique Sítě Elimination' (Pharmacia), aby se vytvořila změna jediného

Cc-I užitím oligonukleotidového primerů

Pil (5' -AAACCATGGATGTTCAA.GGAGCTC-3' ; sekvence id. č. 19).

octu v aenu

Příklad 3

Transformace rostlin

Plazmidy odvozené z plazmidu pBI byly vneseny do kompetentních elektropcrací ouneu ;o stupe

Agr.

cri

LBA4 4 0 4

Nucleic použity transformaci rest technikou A. tumeísc. kterou popsali Clarku al. , t urei a ci ens zbaliaca ekotypu C24

Γ-ίο 1. Biol. Rep . 10: 17 3byla sklizena z jednotlivých rostlin užitím Araconu (Eeta-Tech, Gent, Belgium), aby se zajistilo, že nedojde k smocpylení. Arabidcpsis nesoucí 35S/Cc-IAD86 (Urwin et al., The Plant Journal 12, 455-461, 1997) byly také použity v této studii.

Příklad 4

Zxprese v E. coli

Exprese z obou typů konstruktu, jak s jedním tak se dvěma efektory, byla provedena postupme podle Urwin et al.,

Plant J. 8: 121-131, 1995. Proteiny byly exprimovány jako fúzní proteiny obsahující 6xHis na svém N-konci kódovaný « · • · • · • · ··>· · φ ·· ·· ·· ·· vektory pQ30 a pQE32, a byly purifíkovány užitím niklové pryskyřice, s výjimkou CpTI uvolněného z fúzního proteinu Oc-IAD86\PsMTaXCpTI. tomto případě byl surový homocenát testován po· odstraněni Cc-IAD86 pomocí značky 6-His-tag. Inhibiční hladina surového homogenátu z netransformovaných

E. coli byla odečtena cd vzorku Cp-TI. Oc-IAD86 byl detekován polyklonální protilátkou jak ji popsali Urwin et al. (Urwin et al., 1995, supra] a CpTI byl detekován monoklonální protilátkou připravenou postupem, který popsali Liddell a Cryer, A practical guide to monoclonal antibodies, John Wiley and Sons, New York, USA, s. 188, 1991. V inhibičních testech cysteinových a serinových proteináz byly užity trypsin a papain, v podstatě tak, jak to popsali Abrahamson e c a 1. , J . 5 i o 1. C.oem. 2 62: 9668-9694, 19 8 /, a jako suc s t r a t

Příklad 5

Detekce exprese a příjmu hlísticemi

Hilden, Germany) jak popsali al., Pia n t J. 8: 12 ± —131, c a u o .

Proteiny exprimcvané v E. coli byly purifíkovány užitím systému QIAexpress iQiagen,

Urwin et al., 1995, Urwin e’

Frakce celkového proteinu z Arabidopsís vhodné pro analýzu SDS-PAGE byly získány homogenizací kořenu v třecí misce v 0,15 M Naci, 10 mM HEPES, and 10 mM EDTA pH 7,4. Proteinové vzorky byly před nanesením na elektroforézu solubilizovany povařením v nanášecím pufru pro SDS-PAGE (15% β-mercaptoetanol, 15% SDS, 1.5% bromfenolová modř, 50% glycerol).

Exprese PI byla detekována analýzou westernových přenosů • ·♦ křenové peroxidázy výrobce (National podle Urwin et al. (The Plant Journal 12, 455-461, 1997) pomocí protilátky konjugované s křenovou peroxidázou, aby se mohl využít chemiluminiscenční systém (HRPL), který byl užit podle pokynu

Diagnostice, Atlanta, Georgia). Rozpustná proteinová frakce se sbírala extrakcí rozmělněného rostlinného materiálu v pufru (0,15 M NaCi, 10 mM Hepes, 10 mM EDTA pH 7,4). nerozpustné materiály byly peletovány 15 minut při 75 000 rpm (centrifuga Beckman Optima s rotorem TLA100.2), aby se oddělil rozpustný (cytcsol) a nerozpustný materiál. Pelet byl pak silně resuspendován v lOOmM uhličitanovém pufru pH 11, stočen stejně jako před tím, a pak byl odebrán supernatant obsahující proteiny asociované s membránou. Pelet byl cc.

:nnuz

Ί 1Z ouf:

ac;

tr'--, resuspenacva: 'zou byl; FA.GE .

sem k tomu, hlísulcem:

y-V sebrány z kořenu Arabidcpsis, aby se zaručila nepřítcmncst kontaminujícího rostlinného maueriálu. Přibližně 70 hlístic bylo sebráno z rostlin exprimujících jeden nebo dva Pl. Hlístice byly rozdrceny v mikrocentrifugační zkumavce a resuspendovány v pufru: 0,15M NaCl, lOmM Hepes, lOmM EDTA. pH 7,4, obsahujícím směs komerčně dostupných inhibitorů (Bcehringer Mannheim, Lewes prcteaz oovařenu nanaseotm uuzru ;ro analýza westernovým přenosem,

Vzorky

SDS-PAGE a byla provedena jak bylo již popsáno výše. CpTI a OclAD86 reagovaly v homogenátech z Arabidopsis

UK!

ny pak byly

Protilátky připravené proti s proteinovými pásy správné M exprimujících jediný konstrukt ?I. Žádná z protilátek nereagovala křížově v detekovatelném rozsahu s žádným dalším

Pl než vlastním, a nereagovala ani s jiným proteinem

8 8 8 8 9 8 8 · 8 ·

88 8 8 9 88 9 8 8 8

8 8 8 8 9 8 8 8 8 8 8 8

8 8 8 8 8 8 8 8 8 9

8 8 8 8 8 8 9 8 8 9 8 9 '0

Jak homogenity z E. coli thaliana s konstrukty produkt velikosti asi poznán oběma protilátkami a tudíž í signál odpovídající tomu PI, který přítomným v rostlinném homogenitu tak i z kořenů Arabidopsis Oc-lAD36/go/CpTI poskytly hlavn 23 kDa, který byl ;

obsahuje oba PI. Si;

má nižší molekulovou hmotnost byl detekován s každou protilátkou, což ukazuje na nízkou míru disociace fúzního proteinu. Konstrukt Cc-IAD5 ž/Psl-ll vzorec ve westernovém přenosu, reaktivitu s produkty s nižší -A

'a/CpTI	poskytla	převrácený
což	ukazovalo	na	vyšší
než s	vyšší M;..	To	zřejmě
ládaj i	naštěpěné	PI.	Testy
provedeny	s pr	odukty
/CpTI 2	: E. coli.	Oba	testy

relativní inhibice byly

Oc-IAD86\PsMTa\cpti a Oc-ΙΔΤ35/gc/CpT ukázaly 95'· inhibici papainové a trypsinové 1 η. _P J ·— £ rr.1 a - ~ i rh^; br i e aktivity, což r~ Ui C ^-,A C 6 á

V um terénových nomcoen;

tr;

unii

Pro každý :tyrs byly provedeny na elou řadu transformovaných ;rstruktu byla vybrána jedna linie pro další studie. Každá z vybraných linií exprimovala jeden nebo oba cílc-vé PI jako 0,4% celkového proteinu. Analýzy příjmu inhibitoru hlísticemi pomocí obou protilátek ukázaly, že samice M. incognita přijímaly s potravou Oc-IÁD36 nebo CpTI, když rostliny, na kterých parazitovaly, exprimovaly jediný konstrukt. Také intaktní fúzní protein Oc-IAD86/go/CpTI je detekován oběma protilátkami. Současně každá protilátka detekuje menší produkt odpovídající jednotlivým PI. Překvapivě nebyly žádné produkty očekávané velikosti u hlístic izolovaných z rostlin exprimujících konstrukt Oc-IÁDo6/PsMTa/CpTI. výsledky pro H. schachtii byly podobné jako pro M. incognita s výjimkou toho, ze neštěpený produkt nelze v hlísticích detekovat. To, že nebylo možné detekovat produkt Gc-IADc6/PsMTa/CpTI v hlísticích, bylo neočekávané, pokud oba inhibitory byly přítomné v hostitelské rostlině. Analýzy westernovým přenosem odlišně frakcionovaného rostlinného materiálu ukázaly, že oba produkty Oc-IAD86/?s.ATa/CpT' jsou asociované s membránou, ale nejsou to integrální membránové proteiny.

Příklad o

Infekce hlísticemi, zotavení a měření na schachtii byly udržovány i týdny staré rostliny kapusty byly • θ c x -í 1 * · X c C í S U '3 Η 1 2. ]i ’ · _f k á Θ

Populace háďátka E. rostlinách kapusty. Čtyř ínfikovanv tím, že se oř kapusty byly pěstovány ve 22'Z při norm Infikovaný substrát použitý pro pěstování c« odebrán a pak byl spočten počet vajíček provedeno trojnásobné sériové ředění s 50- směsí hlína/písek pomocí děliče substrátu a ty pak byly použity k pěstování Arabidcpsis divokého typu C24. V předběžných pokusech bylo zjištěno, že počet vajíček 9 g~ vedl k největšímu, pětinásobnému zvýšení. Avšak při další infekci bylo použito jen 5 vajíček na g-1, aby se navodila dobrá infekce, ale přitom aby rostlin nebyly nadměrně stresovány.

Populace M. ir.ccgniza byly udržovány na rajčatech pěstovaných ve 24 ⁼C s 15 hodinovou světelnou periodou. Celé kořenové svazky infikovaných rostlin byly nasekány na malé kousky a použity k přípravě sériového ředění v 50% směsi hlíny a písku. Alikvotní části ze sériového ředění byly použity ke stanovení optimální míry infekce, přičemž celý objem základní půdy byl udržován při 10° C.

;hto rostlin byl na g-1. Bylo

Čistý infikovaný materiál kořenu a cysty byly odebrány z rostlin pěstovaných v 50% směsi písku a hlíny. Ruční sběr nlístic v časném stadiu byl usnadněn obarvením kořenu kyselým fuchsinem, jak popsali Urwin et al. (Urwin et al., The Plant

Jcurnal 12, 455-461, 1337) , kromě tňaííana nevyžadovaly krok mytí. Seinhorstuv elutriatcr (Seinhorst vyhodnocována ručním počítáním odebraných ze skupiny rostlin.

toho, že kořeny Arabidopsis Pro sběr cyst byl využit 1964). Plodnost samic byla vajíček ze všech jedinců

Infikované rostliny Arabidopsis thaliara byly pěstovány při 16 hodinovém dni při ozářencsti 6 mmol fotonu m ' s‘ a 22 C v růstové komoře Sanyo MLR3500. Kultivační nádoby obsahující rostliny Arabidopsis divokého typu C24 a obsahující rostliny exprimující inhibitory byly umístěny dle náhodného schématu.

Modifikací .mxeru z joxicaz·;

Aminokyselinová sekvence spojovacího úseku (linkeru) mezi doménou 1 a doménou 2 galaktózooxidázy byla modifikována tím, že tři aminokyselinové kodony AGT TCT TAC kódující aminokyseliny SSY byly nahrazeny sekvencí TCT ATC GAA GGT CGC (sekvence id. č. 20) kódující aminokyselinovou sekvenci SZEGR (sekvence id. č. 21). První kcdon jednoduše nahradil >s a v a on:

to o on

Mímcc· čtvři kodonv kódují proteolytické štěpné místo faktoru Xa. Postup mutageneze založené v Baron et al., J. Modifikovaný gen

PCR, který byl použit, byl popsán

Biol. Chem. 269, galaktózooxidázy

25095-25105, 1994.

byl exprimován v Aspergillus nidulans. Překvapivě na SDS-PAGE byly nalezeny dva proteinové pásy odpovídající velikosti domény 1 (asi 16 kDa) a doméně 2+3 (asi 52 kDa) . Žádné proteiny nebyly detekovány v poloze odpovídající galaktózooxidáze plné délky. Tyto výsledky ukazují, že modifikovaný linker galaktózooxidázy je štěpen houbovými proteázami. Použití tohoto linkeru nebo· jeho dalších modifikací zajistí, že rostlinné proteázy zpracují mulzimerní molekuly in planta.

Vynález byl v předcházejícím textu popsán podrobně, aby byl popis jasný a byle mu dobře porozuměno. Odborníkovi je přitom zřejmé, že lze učinit různé změny formy a některých detailu, aniž by došit k odchýlení cd vynélezecké myšlenky předkládaného vynálezu, který je definován následujícími patentovými nároky.

• Λ ···· ·»

Seznam sekvencí (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 14 aminokyselin
	\B)	TYP: aminokyseliny
	ÍO)	TY? VLÁKNA: jednoduché
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: peptid
(iii)	HYPOTETICKÁ: NE
(iii)	ΑΝΤΙ	-SENSE: NE

(v) TYP FPAQ4ENTU: vnitřní (iv) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: PsMTa Linker

Val Ile Leu Gly Val Gly Pro Ala Lys Ile Gin Phe Glu Gly 15 10

PRO )I S IDENTIFIKAČNÍM CISj (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 11 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: KE (iii) ANTI-SENSE: NE (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (iv) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Linker galaktózooxidázy (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 2:

·» ·· · · 9»

4*44 · · · ♦ « 4 · • 44 4 4444 · · · «

4 4 * 4 44 · 4 · 44 4

Gin Ala Ser Ser Tyr Thr Ala Pro Gin Pro Gin 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHAPA.KTERI5TIKA. SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3C páru baží (B) TYP:nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: KE (iii) ANTI-SENSE: NE (iv) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: olico PÍ (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 3:

ATGTCGAGCG ACGGACGGCC GGTGCTTGGC (2

INECP.MACE PRO

IDENTIEIKACNIM ČÍSLEM (i i CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

A) DÉLKA: 43 páru baží

B) TYP: nukleová kyselina

C) TYP VLÁKNA: jednoduché

D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NÉ (iv) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: oligo P2 (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 4:

♦ « · 9 •9 » 99 · • · * 9 «9

GATCTTCGCC GGACCGACGC CAAGAATCAC GGCATTTGCA CTGGCATC 48 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

A) DÉLKA: 48 páru baží

Bi TYP: nuklecvá kyselina

C) TYP VLÁKNA: jednoduché

D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová;

(iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE (iv) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: oligo P3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE 5 ID. Č. 5:

GTCGGTCCGG CGAAGATCCA GTTTGAAGGT AGTAATCATC ATCATCAC

2) INECPMACE PRO SEKVENCI S IDENTIEIKAČN	ÍM ČÍSLE!	1 6
( i )	CHARAKTER!ΞΤIPDA SEKVENCE :
A)	DÉLKA: 32 páru baží
B)	TYP: nukleové kyselina
C)	TYP VLÁKNA: jednoduché
D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: DNA (genomová)
(iii)	HYPOTETICKÁ: NÉ
(iii)	ANTI-SENSE: NÉ
( iv)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A) CRG.ANISMUS: oligo P4
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID.	Č. 6:

TTCTIACTCA TCATCTTCAT CCCTCGACTT GC « · • ··· (2) INFOPMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

A) DÉLKA: 45 párů baží

B) TYP: nukieová kyselina

C) TYP VLÁKNA: jednoduché

D) TOPOLOGIE: lineární

(ii)	TYP MOLEKULY: DNA	(genomová)
(iii)	HYPOTETICKÁ: NE
(iii)	ANTI-SENSE: NE
(iv)	PŮVODNÍ ZDROJ: i A) ORGANISMUS:	oligo P5
(xi)	PCrIS Sr.Kvr.NCE: S	EKVENCE S ID

CTGGGGGGCT GTGTAAGAAC TAGCTTGGGC ATTTGCACTG GCATC 45

INFCP-LAOE PRO SEK ;C^T . r\.-í ^rM mí

C) TY? VLÁKNA: jednoduché

D) TOFClOG2.r.: lineární (ii) TY? MOLEKULY: DNA (genomová (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE (iv) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: oligo P6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 8:

AGTTCTTACA CAGCCCCCCA GCCTGGTAGT AATCATCATG ATGAC • · • * · » • « • · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

A) DÉLKA: 31 péru baží

B) TYP: nukleová kyselina

C) TYP VLÁKNA: jednoduché

D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DN.A (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: IV (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 9:

ACTATCGATC CAGTAATCAT CATCATGACT C (2) INFORMACE PRO SEKVENCI 3 IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

A) DÉLKA: 29 páru baží

B) TYP: nukleová kyselina

C) TYP VLÁKNA: jednoduché

D) TOPOLOGIE: lineární (iii) ANtI-SfNSu: Nu (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 10:

ATAVEAAGCT TTTCTTACTC ATCATC1TC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 14 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (C) TY? VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: NE ft ft • ♦ • · • * ·· (iii; ANTI-SENSE: NE (v) TY? FRAGMENTU: vnitřní (iv) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Modifikovaný linker z galaktózocxidázy (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 11:

Gin Ala Ser Ile Glu Gly Arg Tyr Thr Ala Pro Gin Pro Gin 15 10 (2) INFOPUACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

(i) CHAPAKTERÍŠTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 15 aminokyselin
(B)	TYP: aminokyseliny
(0)	TTr vE.-r.NA: j edr.cduche
(D)	TOPOLOGIE: lineární
TYP	MOLEKULY: peptid

(iii) HYPOTETICKÁ: IE (iii' ANTI-SENSE: IE

		(A)	CRGAN	_SMUS: Přircz	.ený linker
			z i mu	noglchul inu
(	xi)	POPIS	SEKVED	CE: SEKVENCE	S ID. Č. 12:
Lys	Glu	Ser Gly	Ser Val	Ser Ser Glu Gin	Leu Ala Gin Phe	Arg Ser
1			5	10		15
Leu	Asp

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (C) TY? VLÁKNA: jednoduché ·· • « · · · » ·«!· ·» *· *·

9 99 (iv) (XÍ j

Glu Gly (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní

PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: peptidový linker

POPIS SEKVENCE: SEKVENCE Ξ ID. Č. 13:

Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Pro

10 :2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 aminokyselin (3) TYP: aminokyseliny (C) TY? VLÁKNA.: jednoduché (D) TCPCLCGIE: lineární (iii TY? MOLEKULY: peptid (v) TY? FRAGMENTU: vnitřní (iv) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: PsMTa Linker (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. li:

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

A) DÉLKA: 31 páru baží

8) TYP: nuklecvá kyselina • ···

C)	TYP VLÁKNA: jednoduché
D)	TOPOLOGIE: lineárz	-
ii)	TYP MOLEKULY: DNA	(gencmová)
iii)	HYPOTETICKÁ: NE
iii)	ANTI-SENSE: NE
iv)	PŮVODNÍ ZDROJ: (A) ORGANISMUS:	oligo P7
XÍ)	POPIS SEKVENCE: SI	KKVENCE S ID

ACATGTCGAA TTCTTAGGCA TTTGCACTGG C (2) INFORMACE PRO SEKVENCI .ΞΝΤΙFIKAČNIM CÍSLEM1 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: A)DÉLKA: 24 páru bázi

D) TYP: nukleová kyselina

E) TYP VLÁKNA: jednoduché D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA 'cencmcvá) (iv) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: oligo Po (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE 5 ID. Č. 16:

GAGGAGCCCG GGTCGAGCGA CGGA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

A) DÉLKA: 33 páru baží

B) TYP: nukleové kyselina

C) TYP VLÁKNA: jednoduché

D) TOPOLOGIE: lineární

ΦΦ φφ »φ φφ φ φφφ φ φ φ φφφ φ φφφφ (ii) TYP MOLEKULY: DNA (gencmová, (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE (iv) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: oligo P9 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 17

CTCGAACTCT AGAAGAGAAT TGGCCTTGTT GTG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

5; TYP: nukleová kyselina

C) TYP VLÁKNA: jednoduché

D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (ger.omová) (iii) HYPOTETICKÁ: KE (iii) ANTI-SENSE: ΝΞ (iv) PUVCENÍ ZCR1C:

(A) ORGANISMUS: oligo P10 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 18:

AATTCTCTTC TAGAGTTC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

A) DÉLKA: 24 párů baží

B) TYP: nukleová kyselina

C) TYP VLÁKNA: jednoduché

D) TOPOLOGIE: lineární • · φ φφ • φφφ • φ • φφ φφφφ φφφ φφφφ φφ φφ φφ · · *· (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová, (iii) HYPOTETICPÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE (iv) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: oligo Pil (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 19:

AAACCATGGA TGTTCAAGGA GCTC 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:

(i) CHA.PA.KTERISTIKA SEKVENCE:

A) DÉLKA: 15 cáru baží

B) TYP: nukleové kyselina

C) TY? VLÁKNA: jednoduché

D) TOPOLOC-IE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA. (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE

TCTATCGAAG GTCGC 15 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (C) TY? VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) H1TOTETICKÁ: NE (iii) ANTI-SENSE: NE ·· φ φ ► φ φ

I Φ Φ Φ Φ ·· φφ v · · · φ ·· φ φ · ΦΦΦ· φ φ

Φ· ·Φ • φ · φ φ φ φ φ • · · φ φ φ φ · φφ ·Φ (ν) TUP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 21:

Ser Ile Glu Gly Arg

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Zpfisob zlepšení rezistence nebo tolerance rostlin a jejich potomstva k patogenum vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se do genomu rostlin integruje gen kódující fúzní protein, který obsahuje

   a) první protein nebo proteinovou doménu s anti-patogenní aktivitou, b) spojovací pepti d, a c) druhý protein nebo prooeinovcu doménu s anti-patogenní a k t i v i t o n .

   „ O .... .

   zpusco podře naroxu ± v y z n a c u j i o i se l z m, že další proteiny nebo proteinové domény s anti-patogenní aktivitou jsou fúzovány s fúzním proteinem pomocí spojovacího peptidu.

   Způsob podle nároku 1 v y z n a č u že alespoň jeden z proteinu nebo s anti-patogenní aktivitou má oroteináz.

   ící se tím, proteinových domén tivitu inhibitoru j
2. 4. Způsob podle nároku 3 vyznačuj ící se tím, že alespoň jeden z proteinů nebo proteinových domén s anti-patogenní aktivitou je inhibitor proteinázy OC-IÁD86.
3. 5. Způsob podle nároku 4 vyznačující se tím, že alespoň jeden z proteinů nebo proteinových domén s anti-patogenní aktivitou je inhibitor proteinázy CpTI.

   44 4·

   4 4 4

   4 4 4 44

   4 4 · 4

   44 44

   4 4 4 4

   4 44 • 4 4

   4444 44

   44 44

   4 4 4 4

   4 4 4 4

   4 4 4 4

   44 44
4. 6. Zpusc-b podle nárcku 1 vyznačuj ící se z í m, že gen je funkčně spojen s promotorovou sekvencí řídící expresi přednostně v kořenech rostlin.
5. 7. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že spojovací peptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je v rostlině proteolyticky štěpena.

   8 . Způsob podle nároku že spojovací peptid 1 v y z n obsahuj e a č u amine k j •; c ící s el inc-vou e tím, sekvenci, j'. _ Θ Z ά j S V 27 C ¹S Z 1 ί Γ. 6 Ό o Zpusc-b podle r.árc ku 1 v y z n a č u J ící s e zim, že spojovací oeoz·d obsahui e amino 1 , , . setinovou sekvenci QASSíTAPQPQ. 10. Způsob podle nároku 7 v y z n a č u J ící s e zim, že spojovací peptid obsahuj e amino ky selinovou sekvenci VILGVGPAKIQFEC-. Ί Ί Zpuscb podle nároku 7 v y z n a č a - Z Z Z s e zim, Z £ £pOjO V 5Cl pepz z ό ccs ahuze amine * J zelinovou sekvenci QASIEGRYTAFQPQ. 12 . Způsob podle nároku 3 v y z n a č u j ící s e tím,

   že zlepšuje rezistenci nebo roleranci k hlísticím.

   13. Molekula DNA schopná kódovat fúzníprotein, který obsahuje

   a) první protein nebo proteinovou doménu s anti-patogenní aktivitou ,

   b) spojovací peptid, a

   c) druhý protein nebo proteinovou doménu s anti-patogenní aktivitou.

   ·· ·» ·* ·· φ · · · · · · ·*·· • ·« · 9 9·· · · · ·

   4» 9 8 9 8 8 9 9 9 «· * • · · · · · · · · · · ···· ·· ·* *· ·· ·· lý Molekula DNA podle nároku 13, kde kódovaný fúzní protein obsahuje další proteiny nebo proteinové domény s antipatogenní aktivitou fúzované pomocí spojovacích peptidů.

   15. Fúzní protein, který je kódovaný molekulou DNA podle nároku 13.

   16. Rostlina, která exprimuje fúzní protein kódovaný * molkeulou DNA podie nároku 13.

   * 17. Použití molekuly DNA podie nároku 13 ke zlepšení rezistence nebo tolerance rostlin a jejich potomstva