SK172499A3

SK172499A3 - A method for plant protection against insects or nematodes

Info

Publication number: SK172499A3
Application number: SK1724-99A
Authority: SK
Inventors: Maarten Anthonie Jongsma; Borut Strukelj; Brigita Lenarcic; Kristina Gruden; Vito Turk; Hendrik J Bosch; Willem Johannes Stiekema
Original assignee: Ct Voor Plantenveredelingsen R
Priority date: 1997-06-18
Filing date: 1998-06-18
Publication date: 2000-09-12
Also published as: HU225427B1; CA2294421C; BR9810192A; AU752020B2; TR199903122T2; US6861578B1; HUP0001839A3; CZ300639B6; JP2002511755A; PL189808B1; PL337826A1; EP0991769B1; NZ501872A; CA2294421A1; AU8132498A; WO1998058068A3; CZ450399A3; ATE419365T1; DE69840404D1; EP0991769A2

Description

Spôsob ochrany rastlín proti hmyzu a nematódom

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka spôsobov ochrany rastliny, alebo jej časti, proti hromadnému napadnutiu jedným alebo viacerými druhmi hmyzu alebo nematódov, ktoré majú zažívacie cysteínové alebo aspartátové proteázy, pričom spôsob zahŕňa prezentáciu inhibičného množstva inhibítora cysteínovej alebo aspartátovej proteázy k lokusu, kde má byť daný hmyz alebo nematóda kontrolovaná.

Doterajší stav techniky

Veľa druhov zeleniny, záhradných a poľných plodín sú napadané škodlivým hmyzom. Väčšina rastlín vykazuje určitú odolnosť voči určitým druhom hmyzu alebo nematódom. Odolnosť môže byť fyzikálna alebo chemická. Napríklad: Vlasy na listoch mnohých rastlín môžu zastaviť drobný hmyz v približovaniu sa k povrchu, ktoré by stačilo k jeho požieraniu. V iných prípadoch rastliny používajú rad zložitých molekúl na to, aby ich tkanivá boli nepríťažlivé alebo jedovaté. Ku kontrole takéhoto fytofágneho hmyzu alebo nematódov sa čiastočne pristupovalo pomocou tradičných kultivačných alebo šľachtiacich metód. Účinnou cestou na znižovanie takýchto strát je používanie takých kultivarov plodín, ktoré majú gény na odolnosť voči škodcom (viď Painter (1951), Insect Resistance in Crop Plants, Macmillan: New York). Šľachtitelia rastlín sa snažili znižovať straty spôsobované napadnutím hmyzom alebo nematódami, vnesením génov rezistencie do ich variet pomocou konvenčných šľachtiteľských programov.

Klasické prístupy k hostiteľskej rastlinnej rezistencii sú skôr empirické, ale majú v niektorých prípadoch znamenitý úspech. Akonáhle sú objavené „znaky“ rezistencie, prenesú sa selekčnými postupmi do poľnohospodársky prijateľných línií. Jedným z obmedzení tohoto klasického prístupu je, že tento prenos génov na rezistenciu je obmedzený na druhy, ktoré možno krížiť. Naviac, môžu byť tieto typy rezistencie pod kontrolou mnohých génov, a preto pre rastlinného šľachtiteľa je obtiažné ich využívať. Odolné variety často vykazovali pokles výnosu a neboli schopné ekonomicky prežiť. Naviac nie je možné klasickým šľachtením zlepšovať rezistenciu voči hmyziemu škodcovi vtedy, keď nie je možné identifikovať rezistenciu v rámci druhu, alebo príbuzných druhov.

Kontrola hmyzu a nematódov sa významne spoliehala na chemické pesticídy. Tieto činidlá sú typicky aplikované alebo kladené na pôdu, alebo na rastlinné olistenie, alebo do staničných pascí. Navzdory dostupnosti veľkej rady chemických pesticídov, fytofágný hmyz a parazitné nematódy rastlín ostávajú vážnym problémom. Mnohé chemické pesticídy majú nevýhodu v tom, že vyžadujú opakované aplikácie. Veľkým problémom pri používaní mnohých pesticídov je schopnosť hmyzu nadobudnúť rezistenciu voči aplikovanému činidlu. Tento fenomén nastáva prostredníctvom selekcie najrezistentnejších členov populácie hmyzu pri opakovanej aplikácii daného činidla. Naviac tieto chemikálie poškodzujú životné prostredie a znečisťujú povrchovú vodu. Preto existuje potreba nových činidiel na kontrolu hmyzu, obzvlášť činidiel, ktoré majú iný charakter pôsobenia ako konvenčné insekticídy a nematicídy.

Ako alternatíva k syntetickým zlúčeninám boli izolované a vyvinuté ako pesticídy niektoré prirodzene sa vyskytujúce činidlá. Tie zahŕňajú rastlinné a mikrobiálne sekundárne metabolity a bielkoviny, a prirodzené predátory alebo patogény hmyzu a nematódov (vrátane iného hmyzu, húb, baktérií a vírusov). Naviac postupom technológie rekombinantnej DNA, bolo možné prenášať gény z donorového organizmu do recipientného organizmu, čo viedlo k novému fenotypu recipienta. V prípade transgénnych rastlín môže týmto fenotypom byť rezistencia voči poškodeniu hmyzom, alebo infekcií nematodami, pokiaľ vnesený gén kóduje polypeptid, ktorého účinok vedie k zasiahnutiu škodca. Preto má veľký význam a užitočnosť objavovať polypeptidy s takýmto účinkom. Gény pre tieto polypeptidy možno použiť na modifikáciu organizmov, zvlášť rastlín a mikróbov tak, aby negatívne pôsobili na rast a vývoj hmyzích škodcov. Bol popísaný rad takýchto polypeptidov z Bacillus thuringiensis, rôzne bielkovinové inhibítory proteáz a amiláz a rôzne rastlinné lektíny.

Jedným fyziologickým systémom hmyzu a nematód, o ktorom je známe, že podlieha rozbitiu špecifickými inhibítormi, je pôsobenie zažívacích proteáz. Zažívacie proteázy hydrolyzujú požité bielkoviny a polypeptidy štiepením peptidových väzieb. Výraz „proteáza je konkrétne použitý na označenie endopeptidáz a exopeptidáz štyroch hlavných katalytických tried: serínových proteáz, cysteínových proteáz, aspartátových proteáz a metaloproteáz (viď Laskowski et al. (1983), Ann, Rev, Biochem.. 49: 593 - 626). Trieda, ku ktorej konkrétna proteáza patrí môže byť určená pomocou rozsahu pH, v ktorom je aktívna, schopnosti štiepiť špecifické bielkoviny, podobnosti s inými, dobre charakterizovanými proteázami a citlivosti k rôznym inhibítorom.

Rôzne typy tráviacich enzýmov hmyzu a nematódov uvoľňujú z bielkovín obsiahnutých v diéte peptidy a aminokyseliny. Jednou triedou tráviacich enzýmov sú cysteínové proteázy. Výraz „cysteínová proteáza“ je určený na popis proteázy, ktorá má v katalytickom centre enzýmu vysoko reaktívnu thiolovú skupinu cysteínového zbytku. Existujú dôkazy, že mnohý fytofágny hmyz a parazitné nematódy rastlín sa spoliehajú, prinajmenšom čiastočne, na cysteínové proteázy prostredného čreva na trávenie bielkovín. Sem patria, ale bez obmedzenia, ploštice (Hemiptera), obzvlášť ploštice Anasa trístis, A.crostemum hilare, Riportus clavatus, a temer všetky chrobáky (Coleoptera) doteraz skúmané, obzvlášť mandelinka zemiaková (Leptinotarsa decemlineata), kohútik (Lema trílineata), šparglovníček obecný (Crioceris asparagi), chrobák Epilachna varivestis, múčiar (Tribolum castaneum), múčiar skladičtný (Tribolum confusum), drepčici (Chaetocnema spp., Haltica spp. a Epitrix spp.), Diabrotica spp., zrnokaz (Callosobruchus maculatus), kvetopas (Anthonomus grandi s), nosatci (Sitophyfus oryza, Sitophylus zeamais, Sitophylus granarius, Hypera postica), zrnokaz (Acantoscelides obtectus), Rhyzoptera dominica, múčiar múčny (Tenbrio molitor), strapky, obzvlášť strapka západná (Frankliniella occidentalis), dvojkrídle, obzvlášť minujúce druhy, kvetomilka (liriomyza trifolii), rastlinné parazitné nematódy, obzvlášť červy Globodera spp., Heterodera schachtii a Meloidogyne spp.

Inou triedou tráviacich enzýmov sú aspartátové proteázy. Výrazom “aspartátová proteáza“ sa myslí na popis proteázy, ktorá má v katalytickom mieste enzýmu dva vysoké reaktívne zbytky kyseliny asparagovej a ktorých nejčastejšou charakteristikou je špecifická inhibícia pepstatínom, nizkomolekulárnym inhibítorom takmer všetkých známych aspartátových proteáz. Existujú dôkazy, že mnohý fytofágny hmyz a parazitné nematódy rastlín sa čiastočne spolieha na aspartátove proteázy prostredného čreva na trávenie bielkovín, veľmi často v spojení s cysteínovými proteázami. Tu patria, ale bez obmedzenia, Hemiptera, obzvlášť Rhodnius prolixus a ploštice (Cimex spp.), a členovia čelade Phymatidae, Pentatomidae (knezovcoviti), Lygaeidae (ploštickovitý) a Belostomidae, Coleoptera (chrobáky) čelade Meloidae (majkovití) Chryzomelidae (mandelinkovití), Coccinelidae (slniečkovití) a Bruchidae (zrnokazovití), všetky prináležia do radu Cucujiformia, obzvlášť mandelinka zemiaková (Leptinotarsa decemlineata), kohútik (Lema trilineata), Diabrotica undecimpunctata, D. virgifera, kvetopas (Anthonomus grandis), ploštice Anasa tristis, chrobáky Phyllotreta crucifera, Callosobruchus maculatus, Epilachna varivestis, Ontodonta homi, Epicaute pestifera a múčiar Tribolium castaneum, Dvojkrídlí, obzvlášť mucha domáca (Musca domestica) (Terra a Ferreira (1994) Comp. Biochem. Physiol. 109B: 1-62, Wolfson a Murdock (1990) J. Chem. Ecol. 16:1089 -1102).

Zlúčeniny, ktoré tvoria komplexy s proteázami a inhibujú ich proteolytickú aktivitu sú v prírode široko rozšírené. Je známy rad proteázových inhibítorov s “nízkou molekulovou hmotnosťou“, väčšinou syntetického, nie prirodzeného, pôvodu. Určitý počet prirodzene sa vyskytujúcich inhibítorov s nízkou molekulovou hmotnosťou bol izolovaný z bakteriálnych alebo hubových zdrojov a charakterizovaný. Táto skupina zahrňuje také inhibítory, ako sú E64 (N-(L-36 trans-karboxypyran-22-carbamoyl)-L-leucyl-amido-4-guanidobutan), leupeptíny, činidlá proti bolestiam a pepstatíny.

Z rastlinných druhov bolo izolovaných niekoľko bielkovinných inhibítorov proteáz. Patria medzi obranné chemické látky rastlinných tkanív, ktoré sú ako vývojovo regulované, tak aj indukované ako odozva na napadnutie hmyzom a patogénami. V rastlinách boli zistené inhibítory serínových, cysteínových, aspartátových proteáz a metaloproteáz, obzvlášť v zásobných orgánoch, ako sú hľuzy a semená. Najbežnejšou a najširšou študovanou skupinou rastlinných proteázových inhibítorov sú tie, ktoré inhibujú zvieracie serínové proteázy, ktoré zahrňujú trypsín a chymotrypsín (viď Ryan (1990) Annu. Rev. Phytopathol. 28: 425-449).

Bielkovinové inhibítory cysteínových proteáz znižujú alebo eliminujú katalytickú aktivitu cysteínovej proteázy. Optimum pH cysteínových proteáz je obvykle v rozmedzí 3,5 - 7, čo je rozsah pH v lumene prostredného čreva hmyzu, ktorý používa cysteínové proteázy. Medzi inhibítormi cysteínových proteáz prevažuje cystatínova rodina, ktorá sa ďalej delí na štyri pod-rodiny s ohľadom na molekulovú hmotnosť, počet disulfidových väzieb, subcelulárnú lokalizáciu, a charakteristiku primárnej štruktúry. Tento klasifikačný systém je založený hlavne na informáciách, ktoré sa týkajú stavovčích a rastlinných cystatínov. Cystatíny boli testované ako in vitro, tak in vivo proti hmyzu a nematódam.

Príkladov iných bielkovinových inhibítorov cysteínových proteáz existuje dnes veľmi málo. Zo zemiakov je známa jedna ďalšia rodina inhibítorov cysteínových proteáz, ktorá patri k rodine rastlinných Kunitzových inbibítorov a ktorá rovnako zahrňuje inhibítory aspartátových proteáz (Strukelj (1992) Biol. Chem. Hope-Seyler 373: 477-482; Krizaj et al. (1993) FEBS Letters 333: 1522). Tento inhibítor, Kunitz PCPI8.3 je pevne sa viažucim inhibítorom kathepsína L (Ki = 0,07 nM) a dobrým inhibítorom papaína (Ki = 3,3 nM). Úplne nový typ inhibítora sulfhydrylových proteáz bol izolovaný z Diabrotica virgifera (svetový patent WO 95/24479). Tento inhibítor nemá žiadnu štruktúrnu podobnosť s inými inhibítormi cysteínových proteáz.

Nedávno sa objavila nová trieda inhibítorov cysteínových proteáz. Tieto bielkoviny majú spoločný rys opakovanej thyroglobulínovej domény typu I (Malthiery a Lissitzky (1987) Eur. J. Biochem. 165: 491-498). Z ľudí bol izolovaný invariantný reťazec odvodený od p41 spojeného s ľudským MHC triedy II (Ogrinc et al. (1993) FEBS Letters 336: 555-559, Bevec et al. (1996) J. Exp. Med. 183: 1331-1338). Je pevne sa viažúcim inhibítorom kathepsína L (Ki = 0,0017 nN) a dobrým inhibítorom papaína (Ki =1,4 nM). Podobný inhibítor cysteínových proteáz s opakujúcou sa thyroglobulínovou doménou typu I bol izolovaný z lososích vajíčok (Yamashita a Konagaya (1996) J. Biol. Chem. 271: 1282-1284). Konečne: Z morského mäkkýša Actinia equina bol izolovaný podobný inhibítor cysteínových proteáz, označený ako ekvistatín, s troma opakujúcimi sa thyroglobulínovými doménami typu I (Lenarcic et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:13899, Lenarcic et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:12682).

Okrem ľudského invariantného reťazca, ECI (vaječného inhibítora cysteínových proteáz) a ekvistatína majú domény homológne k opakujúcim sa thyroglobulínovým doménam typu I tiež časti iných bielkovín, vrátane bielkovín ako sú potkanie invariantné reťazce (McKnight et al., (1989) Nucleic Acids Res.

17: 3983-3984), saxifilín (Morabito a Moczydlowski (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2478-2482), nidogén (Mann et al., (1989) ENBO J. 8: 65-72), epiteliálny glykoproteín (Šimon et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2755-2759), IGF- viažúci proteín-3 (Brewer et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 152: 1287-1289), testican (Alliel et al., Eur. J. Biochem. 214: 347-350) a entactín (Durkin et al. (1988) J. Celí. Biol. 107: 2749-2756) (Obr. 3). Pre entactín a thyroglobulín bolo publikované, že neinhibujú cysteínové proteázy (Yamashita a Konagaya (1996) J. Biol. Chem. 271: 1282-1284). Tieto bielkoviny obsahujú dané konzervované sekvencie a dôvod prečo neinhibujú je temný.

Bielkovinové inhibítory aspartátových proteáz znižujú alebo eliminujú katalytickú aktivitu aspartátovej proteázy. Optimum pH aspartátových proteáz je obvykle v rozmedzí 2 - 5, čo je pH rozmedzie v tých častiach čreva, kde sú aspartátové proteázy aktívne. Je známych veľmi málo bielkovinových inhibítorov aspartátových proteáz. Jedna dobre charakterizovaná rodina inhibítorov kathepsína D sa nachádza v zemiakoch a príbuzných Solanceae (Strukelj et al. (1992) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 373: 477-482). Neboli publikované žiadne in vitro enzymatické testy alebo in vivo biotesty s použitím zemiakových inhibítorov aspartátových proteáz proti hmyzu alebo nematódam.

Australská patentová prihláška č. 36568/89 zverejňuje, že zvieracie cystatíny (ako je cystatín kuracieho vaječného bielka a kininogény) a nízkomolekulárne nepeptidové inhibítory cysteínových proteáz (ako sú E-64, antipaín a leupeptín) môžu byť účinné pri kontrole radu chrobákov, ktorý používajú cysteínové proteázy na trávenie.

WO 92/21753 zverejňuje, že multicystatín, 8-doménový cystatín zo zemiakov, je účinnejší ako iné cystatíny pri kontrole rôzneho hmyzu, ktorý používa cysteínové proteázy ku tráveniu v strednom čreve, pretože je odolnejší voči proteolýze karboxypeptidázami.

WO 96/16173 zverejňuje, že modifikované cystatíny môžu ochraňovať rastliny proti nematódam.

WO 95/24479 zverejňuje, že nový inhibítor thiolových proteáz, izolovaný z kukuričného červa a nazvaný virgiferín, môže ochraňovať rastliny proti hmyzu a nematódam, ktoré majú thiolové proteázy ako tráviace enzýmy.

Dôkazy pre tieto nároky boli publikované tiež vo vedeckej literatúre pre rôzny coleopterný a hemipterný hmyz, ako aj pre nematódy (Chen et al. (1992) Protein Express. Purification 3: 41-49, Edmonds et al. (1996) Entomol. Exp. Appl. 78: 83-94, Elden (1995) J. Econ. Entomol. 88: 1586-1590, Orr et al. (1994) J. Insect Physiol. 40: 893-900, Kurod et al. (1996) Biosci. Biotech. Biochem. 60: 209-212, Leple et a. (1995) Molecular Breeding 1: 319-328, Urwin et al. (1995) Plánt. J. 8: 121-131). Vo vysokých koncentráciách cystatíny spôsobovali mortalitu alebo znižovali fertilitu a rast niektorých druhov hmyzu a nematód (Tabuľka 1). Avšak: Koncentrácia inhibítorov cysteínových proteáz potrebná na dosiahnutie agronomický zaujímavých hladín ochrany v umelých diétach (200 - 2000 μΜ, viď Tabuľku 1) sú vo väčšine prípadov omnoho vyššie ako možno dosiahnúť v transgénnych rastlinách (10 - 40 μΜ, viď Tabuľku 1) a rovnako omnoho vyššie než aktuálna koncentrácia proteáz, u ktorých sa očakáva inhibícia (10 - 30 μΜ). Vysoké koncentrácie sú potrebné najpravdepodobnejšie preto, že sa neviažu dostatočne pevne k rôznym molekulárnym formám cysteínových proteáz prítomných v čreve. Slabé inhibítory môžu stále inhibovať proteázy, keď sú prítomné vo veľkom nadbytku k proteáze. Odhaduje sa, že v čreve je aktívnych niečo medzi 10 a 30 rôznych proteolytických enzýmov a že môže byť aktívne indukovaná transkripcia proteáz, ktoré nie sú inhibované, ako kompenzácia inhibície iných proteáz (Jongsma et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8041-8045, Bolter a Jongsma (1995) J. Insect Physiol. 41: 1071-1078). Druhým dôvodom chýbajúcej toxicity môže byť nestálosť v prostredí čreva a degradácia proteázami, ktoré nie sú inhibované.

Púha skutočnosť, že proteázový inhibítor je inhibítorom cysteínových alebo aspartátových proteáz teda nutne neznamená, že bude účinný in vitro proti hmyzu, ktorý používa tieto proteázy na trávenie (viď tiež WO 92/21753). Všeobecne možno povedať, že je vzácnosťou, keď jednotlivý inhibítor inhibuje plne celé spektrum aktivít cysteínových alebo aspartátových proteáz v čreve hmyzu alebo nematód v normálnych koncentráciách, ktoré môžu v rastlinách dosahovať (10-40 μΜ). Inhibítory, ktoré súčasne inhibujú ako cysteínové, tak aspartátové proteázy určitého hmyzu neboli nikdy predtým popísané, aj keď ich užitočnosť je zrejmá, pretože mnohý hmyz sa pri trávení spolieha na kombináciu týchto dvoch tried proteolytických enzýmov. Mnohý hmyz uvedený v tabuľke č. 1 sa spolieha na obidva typy proteáz a skutočnosť, že tieto inhybítory sú často nedostatočne toxické pre hmyz je pravdepodobne spôsobená skutočnosťou, že aspartátové proteázy zostávajú voľné pre trávenie bielkovín potravy a inhibítory cysteínových proteáz.

Tabuľka 1. Inhibítory cysteínových proteáz, ktoré ovplyvňujú životné parametre hmyzu pri podávaní v potrave alebo pri expresii v transgenných hostiteľských rastlinách.

Druh hmyzu	Pl - hladina v potrave / rastline (μΜ)	Účinok	Odkaz
Umelá potrava doplnená cys	tatínami
Tibolium castaneum (Col.)	10 000	35% WR	Chen et al., 1992
Hepera postica (Col.)	200	RF	Elden 1995
Diabrotica undecimpunctata (Col.)	100-200	40 - 70% M	Edmonds et al., 1996
Diabrotica undecimpunctata (Col.)	125 pg/cm²	50 % WR	Orret al., 1994
Diabrotica virgifera (Col.)	125 pg/crT?	50 % WR	Orret al., 1994
Callosobruchus chinensis (Col.)	100-2000	10-100%M	Kuroda et al., 1996
Riptorus clavatus (Hem.)	100-2000	0 —100%M	Kuroda et al., 1996
Transgenné rastliny exprimujúce cystatíny
Globodera pallida (Nemat.)	10 (paradajka)	Prázdne cysty	Urwin et al., 1995
Chrysomela tremulae (Col.)	40 (poplar)	40%M	Leple et al., 1995

WR = redukcia hmotnosti, RF = znížená fertilita, M = mortalita

Existuje dávnejšia literatúra, ktorá uvádza, že niektoré druhy hmyzu, ako mandelinka zemiaková, sú obzvlášť necitlivé k proteázovým inhibítorom, i keď sú izolované z úplne nepríbuzných zdrojov, ako z ryže alebo človeka (Michaud et al. (1995) Insect Biochem. Mol. Biol. 25: 1041-1048, Michaud et al. (1996) Archives of Insects Biochemistry and Physiology 31: 451-464, Michaud et al. (1993) FEBS Letters 331: 173-176). Niektoré z týchto proteázových inhibítorov boli pri testovaní proti inému hmyzu dosť účinné (Leple et a. (1995) Molecular Breeding 1: 319-328). Pri mandelinke zemiakovej však bolo zistené, že tieto inhibítory sú buď príliš špecifické pre len jeden typ proteázovej aktivity alebo že sú rozkladané aspartátovými proteázami.

Podstata vynálezu

Štruktúrne požiadavky pre vyššiu účinnosť inhibítorov cysteínových alebo aspartátových proteáz na črevné proteázy hmyzu alebo nematód sú úplne neznáme. Rastliny, obzvlášť príbuzné hostiteľskej rastline, sú zlým zdrojom účinných inhibítorov, pretože hmyz voči nim vyvinul proteázy necitlivé na inhibítory proteáz. Inhibítory cysteínových proteáz zo zdrojov iných ako rastliny, je možné testovať, ale doteraz neboli popísané žiadné bielkovinové inhibítory aspartátových proteáz iné než zo Solanaceae. Najviac žiadúci typ proteázových inhibítorov na kontrolu škodlivého hmyzu, používajúceho cysteínové alebo aspartátové proteázy na trávenie je, aby súčasne inhiboval viac ako 90% oboch aktivít u hmyzu, ktorý se živí na hostiteľskej rastline, a to tak, aby bol špecificky zameraný na proteázy necitlivé voči proteázovým inhibítorom hostiteľskej rastliny. V obore nie sú takéto inhibítory známe.

Teraz bolo zistené, že inhibítory cysteínových proteáz, vybrané zo skupiny bielkovín, ktoré obsahujú prinajmenšiom jednu opakujúcu sa thyroglobulinovú doménu typu I, sú účinné in vivo voči hmyzu alebo nematódom používajúcim cysteínové proteázy a prekvapivo bolo zistené, že menované inhibítory sú obzvlášť aktívne k hmyzím cysteínovým proteázam, ktoré sú necitlivé voči inhibítorom cysteínových proteáz, odvodených z hostiteľskej rastliny. Táto vlastnosť nemá predchodcu v iných typoch inhibitorov cysteínových proteáz, vrátane inhibitorov nerastlinného pôvodu. Výsledné sú menované inhibítory vysoko toxické, napr. pre larvy mandelinky zemiakovej.

Z jedného hľadiska sa tento vynález týka spôsobu ochrany rastliny alebo časti danej rastliny proti napadnutiu jedným alebo viacerými druhmi hmyzu alebo nematódov, ktoré majú tráviace cysteínové proteázy, pričom spôsob zahrňuje prezentáciu inhibičného množstva inhibítora cysteínovej proteázy, vybraného zo skupiny bielkovín, ktorá obsahuje prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulinovú doménu typu I, na lokusu, kde menovaný hmyz alebo nematódy majú byť kontrolované.

Ďalej: Teraz bolo zistené, že niektoré opakujúce sa thyroglobulinové domény typu I môžu byť účinné aj na aspartátové proteázy. Je veľmi cenné, že aktivity proti aspartátovým proteázam a cysteínovým proteázam sú prítomné na podobných štruktúrnych doménach a môžu byť kombinované v jednej bielkovine, ako ekvistatín, pretože vynálezcami je zistené, že pôsobi synergicky úplnejšiu inhibiciu všetkých hmyzích proteázových aktivít.

V súlade s tým sa druhý aspekt vynálezu týka inhibítorového peptidu opakujúcej sa thyroglobulinovej domény typu I, pričom menovaný peptid má aminokyselinovú sekvenciu pokrývajúcu aminokyselinové pozície 68 - 199 ekvistatína z Obr. 1, alebo modifikovaného aspartátovo - proteázového inhibítorového peptida opakujúcej sa thyroglobulinovej domény typu I, pričom menovaný modifikovaný peptid má v podstate aminokyselinovú identitu s aminokyselinovými pozíciami 68 - 199 ekvistatína, alebo úsekov peptida majúceho v podstate aminokyselinovú identitu a aminokyselinovými pozíciami 68 - 199 ekvistatína, pričom menovaný modifikovaný peptid je funkčným ekvivalentom k menovaným aminokyselinovým pozíciám 68- 199 ekvistatína v inhibičnej aktivite k aspartátovým proteázam.

V treťom ohľade sa vynález týka insekticídného alebo nematocidného prostriedku obsahujúceho bielkovinu, ktorá obsahuje najmenej jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I, pričom prostriedok je schopný zlepšiť odolnosť rastlinného tkaniva ináč podliehajúcemu napadnutiu jedným alebo viacerým hmyzom alebo nematódami, ktoré majú tráviace cysteínové alebo aspartátové proteázy.

V súlade s tým vynález poskytuje poľnohospodársky prostriedok obsahujúci nosič a hmyz alebo nematódy kontrolujúci, alebo napadajúci množstvo inhibítorov cysteínovej alebo aspartátovej proteázy, ako je tu definovaný.

V štvrtom ohľade sa vynález týka vektorov kódujúcich a schopných exprimovať jednu alebo viac opakujúcich sa thyroglobulínových domén typu I v rastlinnej bunke.

V súlade s tým vynález poskytuje biologicky funkčný prostriedok expresie obsahujúci promótor účinný pri riadení expresie pod nim zaradené kódujúce sekvencie v rastlinných bunkách, pričom kódujúca oblasť DNA kóduje v rastlinných bunkách expresiu bielkoviny zloženej z prinajmenšom jednej opakujúcej sa thyroglobulínovej domény typu I, a terminačnej sekvencie účinnej v terminácii transkripcie alebo translácie produktu genetickej konštrukcie v rastlinných bunkách, pričom genetická konštrukcia účinne exprimuje v danných bunkách dannej rastliny kontrolujúce množstvo bielkoviny, obsahujúcej prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I.

Ďalej vynález poskytuje spôsob ochrany rastliny alebo časti danej rastliny voči napadnutiu hmyzom alebo nematódami zahrňujúci zavedenie rastlinnej sekvencie do genómu dannej rastliny, pričom zavedená rastlinná sekvencia kóduje bielkovinu, ktorá obsahuje prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I s promótorovou sekvenciou aktívnou v danej rastline na spôsobenie expresie menovanej bielkoviny v hladinách, ktoré poskytujú hmyzu alebo nematódam kontrolujúce množstvo menovanej bielkoviny.

Menovaný spôsob obzvlášť zahrňuje kroky

a) kultiváciu buniek alebo tkanív z danej rastliny

b) zavedenie do buniek alebo tkaniva aspoň jednu kópiu génu kódujúceho bielkovinu obsahujúcu prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I,

c) regenerácia rezistencie celej rastliny z kultúry buniek alebo tkanív.

V piatom ohľade sa vynález týka transformovaných buniek a bunečných kultúr buniek, ktoré majú gény kódujúce peptid, ktorý obsahuje jednu alebo viac opakujúcich sa thyroglobulínových domén typu I, schopný ochrany rastlinného tkaniva ináč podliehajucému napadnutiu jedným alebo viacerým hmyzom alebo nematódami, ktoré majú tráviace cysteinové alebo aspartátové proteázy.

Ďalej vynález poskytuje transgennú rastlinu a jej pohlavné potomstvo rezistentné voči napadnutiu jedným alebo viacerým hmyzom alebo nematódami, ktoré majú tráviace cysteinové proteázy pričom menovaná transgenná rastlina exprimuje hmyz alebo nematódy kontrolujúce množstvo bielkovín obsahujúce prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I.

V šiestom ohľade sa vynález týka spôsobu výroby insekticídneho alebo nematocídneho prostriedku peptidu obsahujucého jednu alebo viac opakujúcich sa thyroglobulínových domén typu I, pričom menovaný prostriedok je schopný zlepšiť odolnosť rastlinného tkaniva inakšie podliehajucého napadnutiu jedným alebo viacerým hmyzom alebo nematódami, ktoré majú tráviace cysteinové alebo aspartátové proteázy.

Rad aspektov vynálezu je ďalej vysvetlený na sprievodných obrázkoch z ktorých:

Obrázok 1 zobrazuje nukleotidovú sekvenciu a odvodenú aminokyselinovú sekvenciu ekvistatínového génu z Actinia equina L.

Obrázok 2 zobrazuje porovnanie všetkých troch domén cDNA kódovaných aminokyselinových sekvencií ekvistatína a purifikovanej ekvistatínovej bielkoviny z Actinia equina L. s aminokyselinovými sekvenciami iných bielkovín s opakujúcimi sa thyroglobulínovými doménami typu I so známou a neznámou aktivitou inhibície proteáz.

Obrázok 3 zobrazuje in vitro účinky veľkej rady rôznych inhibítorov cysteínových proteáz na cysteínové proteázy lariev mandelinky zemiakovej (Leprinotarsa decemlineata), ktoré sú necitlivé na endogénne inhibítory cysteínových proteáz hostiteľskej rastliny, zemiakov.

Obrázok 4 zobrazuje účinky ekvistatína na rast a mortalitu lariev mandelinky zemiakovej.

Obrázok 5 zobrazuje účinok ekvistatína s porovnaní s inými inhibítormi cysteínových proteáz na in vitro proteolytickú aktivitu strapky západnej Frankliniella occidentalis.

Obrázok 6 zobrazuje účinok ekvistatína na produkčnú plodnosť samičiek strapiek dva dni po umiestnení na potravu obsahujúcu inhibítor.

Obrázok 7 zobrazuje mapu plazmidu pB3 - ekvistatín.

Obrázok 8 zobrazuje konštrukciu plazmidu pCAB1 - ekvistatín.

Obrázok 9 zobrazuje HPLC analýzy ekvistatína. Chromatogramy ukazujú HPLC elučný profil ekvistatína po inkubácií s rôznymi enzýmami. V panele A bol ekvistatín inkubovaný s kathepsinom D v konečnej molárnej koncentrácií 2:1, a v panele B bol ekvistatín fragmentovaný s použitím 1% (hmotn. i hmotn.) βtrypsínu. Identity vrcholov sú založené na N-koncových sekvenciách.

Obrázok 10 zobrazuje elektroforetické analýzy ekvistatína. A, SDS PAGE rozštiepeného ekvistatína. Dráhy: 1, štandardy molekulovej hmotnosti, 2, prvá doména ekvistatína (eq d-1), 3, spojená druhá a tretia doména ekvistatína (eq d-2,3). B, natívna PAGE tvorby komplexu ekvistatín - kathepsín D. Dráhy: 1, kathepsín D, 2, ekvistatín a kathepsín D zmiešané dokopy 30 minút pred elektroforézou, 3, ekvistatín. Gély boli vyfarbené Coomassie blue.

Obrázok 11 zobrazuje schématický diagram funkcie použitých fragmentov ekvistatína. Miesta proteolytického štiepenia sú zobrazené ako medzery a vyznačené číslami aminokyselín. Štiepiace miesta získané pôsobením β-trypsínu sú ukázané šípkami. Párovanie cysteínových zbytkov v disulfidových väzbách je zobrazené vodorovnou čiarou spojujúcou cysteínové zbytky.

Obrázok 12 zobrazuje titráciu aktívného miesta ekvistatína kathepsinom

D. Inhibícia 77 nM kathepsína D rastúcimi koncentráciami nativného ekvistatína. Zostatková aktivita je vyjadrená ako percento kontrolnej aktivity vo vzorcoch neobsahujúcich žiadny inhibítor.

Obsah všetkých odkazov tu citovaných je tu zahrnutý odkazom.

Teraz bolo stanovené, že medzi opakujúcimi sa thyroglobuiinovými doménami typu I existujú domény, ktoré sú aktívne voči aspartátovým proteázam ako ľudského tak hmyzieho pôvodu. V kombinácii s bielkovinami (fragmentom invariantného reťazca P41 a doménou I ekvistatína) s doménami, ktoré sú aktívne voči cysteínovým proteázam majú silnú inhibičnú aktivitu voči tráviacim „k proteázovým inhibítorom necitlivým“ cysteínovým a aspartátovým proteázam v širokom rozsahu druhov hmyzu patriacich k rôznym hmyzím radom vrátane mandelinky zemiakovej, strapiek, minujúcich druhov a červov. Pri enterálnom podávaní sú larvicidálne voči larvám hmyzu majúceho tráviace cysteínové a aspartátové proteázy, ako je mandelinka zemiaková, a silne znižujú produktívnu plodnosť hmyzu, ktorá pri trávení bielkovín závisí hlavne od cysteínových proteáz. Preukazuje sa, že táto vlastnost opakujúcej sa thyroglobulínovej domény typu I je unikátna vo veľmi širokom súbore inhibítorov cysteínových a aspartátových proteáz odvodenom takmer od všetkých známych typov inhibítorov cysteínových a aspartátových proteáz. Preto sa preukazuje, že nepostačuje, ako sa pred tým navrhovalo, používať inhibítory, ktoré majú veľkú evolučnú vzdialenosť od rastlín, pretože tie sú rovnako neaktívne ako inhibítory odvodené od rastlín. Namiesto toho len inhibítory cysteínových alebo aspartátových proteáz obsahujúce konzervované vlastnosti opakujúcej sa thyroglobulínovej domény typu I boli schopné plne inaktivovať „Pl-necitlivé cysteínové a aspartátové proteázy“ rôznych druhov hmyzu. Tento vynález teda poskytuje spôsob zabíjania hmyzu a nematód, ktoré majú „k proteázovým inhibítorom necitlivé“ tráviace cysteínové alebo aspartátové proteázy, vrátane lariev mandelinky zemiakovej, pričom spôsob zahrňuje enterálne podávanie larvicidiálného alebo nematocidiálného množstva bielkoviny obsahujúcej jednu alebo viac opakujúcich sa thyroglobulínových domén typu I larvám alebo nematódam v závislosti na tom, či daný hmyz používa jednu alebo viacej tried proteáz na trávenie.

Definície pojmov

Pojmy inhibítor proteáz a inhibítor proteínaz sa považujú za ekvivalentné. Výraz „proteáza necitlivá voči inhibítoru“ je mienený na označenie takej proteázy, ktorá je necitlivá na proteázové inhibítory hostiteľskej rastliny tvoriacich sa pri obrane voči napadajúcim škodcom, ale nie je mienený tak, aby vylučoval, že proteáza môže byť inhibovaná proteázovými inhibítormi izolovanými zo zdrojov iných ako hostiteľská rastlina. Výrazom hmyz a larva, i keď nie sú ekvivalentné pokiaľ sa používajú špecificky, je treba rozumieť tak, že zahŕňajú ako dospelé, tak larválne formy niektorého druhu, pokiaľ sa používajú všeobecne. Teda: Výrazu „hmyzia rezistencia“ treba rozumieť tak, že zahrňuje rezistenciu voči larválnym formám i dospelým, zvlášť keď ničenie lariev vedie k zodpovedajúcej neprítomnosti dospelých foriem.

Vo výhodnom prevedení je vynález zameraný na inhibítory cysteínových/aspartátových proteáz z morského mäkkýša Actinia equina, na ktorý sa odkazuje rovnako ako na „ekvistatín“. Pre účely tohto vynálezu je „ekvistatín“ mienený tak, že zahrňuje bielkovinu kódovanú génom majúcu sekvenciu udávanú na Obrázku č. 1 a jej funkčné deriváty. Ekvistatínový peptid, ktorý bol purifikovaný z mäkkýša Actinia equina vykazoval prítomnosť troch opakujúcich sa thyroglobulinových domén typu I (Lenarcic et al. (1997) J. Biol. Chem 272:13899, Lenarcic et al. (1997) J. Biol. Chem 273:12682). Prehľadanie knihovne cDNA z Actinia equina rádioaktívne značenou sondou získanou PCR s použitím dvoch degenerovaných primerov na celkovú cDNA viedlo ku klonu s kódujúcou sekvenciou obsahujúcou signálny peptid ku sekrécii a maturnú bielkovinovú časť s troma doménami takmer zhodnej bielkovinovej sekvencie v porovnaní s purifikovanou bielkovinou.

Primery na amplifikáciu ekvistatínovej cDNA:

El-deg1: CT (A, C, G, T) AC (A, C, G, T) AA (A, G) TG (T, C) CA(A, G) CA (A, G) El-deg2:

ATT(A, G) AC (A, C, G, T) TG(A, C, G, T) GG(A, C, G, T) CG(TC) TT (A, G) AA

Ako možno vidieť na Obrázkoch 1 a 2, zložka maturnej bielkoviny ekvistatínu je zložená z 3 domén, ktoré sa zdajú byť dôsledkom duplikácie genetického materiálu. Podľa predbežnej analýzy sekvencie cDNA sa môže v Actinia equina vyskytovať niekoľko štruktúrnych izoforiem ekvistatínu. Dané 3 domény zahrňujú 22 kD polypeptid. Každá doména obsahuje asi 65 - 68 aminokyselín, s predpokladanými tromi disulfidovými väzbami. Podľa sekvencie domén je zrejmé, že daná bielkovina je členom konzervovaného typu I opakujúcich sa thyroglobulinových domén a obsahuje opakujúce sa domény typu I. Konkrétne sekvencie týchto domén vykazujú vysokú konzerváciu aminokyselinovej sekvencie Cys-(Xxx)i8-29-Pro-Xxx-Cys-(Xxx) ₃-Gly-(Xxx) ₅-GlnCys- (Xxx) ₆-Cys-Thr-Cys-(Xxx) ₃-Gly-(Xxx) 10-15-Cys. Inhibítor s troma doménami purifikovaný z Actinia equina bol proteolytický štiepený na dva hlavné peptidy a rozdelený HPLC s reverznou fázou. Určenie N-koncov oboch fragmentov umožnilo ich lokalizáciu v sekvencii. Jeden peptid, nazvaný eq d-1, pozostával z prvej domény prebiehajúcej od zbytku 1 do 67, zatiaľčo druhý peptid, nazvaný eq d-2,3, obsahoval domény 2 a 3 so zbytkami 68 - 199. Intaktná ekvistatínová molekula môže byť inhibovaná len jednou molekulou papaína a jednou molekulou kathepsína D. Inhibičné testy s Eqd-1 a Eqd-2,3 určili, že Eqd-1 môže byť inhibovaná len papaínom a Eqd-2,3 len kathepsínom D. Inhibičné konštanty pre separované domény boli podobné intaktnej ekvistatínovej molekule. To preukázalo, že i keď sa tieto domény zdajú byť štruktúrne konzervované, špecifity k proteázam divergovali k úplne odlišným triedam proteáz. S existujúcimi dôkazmi nie je možné zistiť, ktoré zbytky určujú tento rozdiel v špecifítách.

Musí sa chápať, že s danými vedomosťami je možné syntetizovať alebo izolovať v podstate čisté funkčné deriváty prirodzene sa vyskytujúcich ekvistatínových molekúl. “Funkčný derivát“ ekvistatínu je zlúčenina, ktorá má biologickú aktivitu v podstate podobnú biologickej aktivite ekvistatínovej molekuly. Výraz funkčný derivát je mienený tak, že zahrňuje “fragmenty“ alebo “účinné homológné varianty.

“Fragment“ molekuly je mienený tak, že odkazuje na inhibičný polypeptidový sub-súbor ekvistatínovej molekuly.

“Účinné homológné varianty“ molekuly, ako je ekvistatínová molekula, sú mienené tak, že odkazujú na molekulu v podstate podobnú v sekvencii a funkcii buď celej molekuly, alebo jej fragmentu. Pre účely tohto vynálezu sú tieto molekuly identifikované tým, že obsahujú opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I. Všeobecne musí účinná homológna sekvencia zachovať vysokú konzerváciu v prirodzene sa vyskytujúcich pozíciách konzervovanej sekvencie Cys-(Xxx) 18-29-Pro- Xxx-Cys- (Xxx)₃-Gly- (Xxx) s-GIn-Cys- (Xxx) ₆-Cys-Thr-Cys(Xxx) ₃-Gly- (Xxx) w-15-Cys. Dva cysteíny na koncoch konzervovanej sekvencie sú konzervované, ale nemajú konzervované pozície. Pravdepodobne však vytvárajú štruktúrne dôležité disulfidové mostíky s ktorýmkoľvek z iných cysteínov, čo je dôvod, prečo sú zahrnuté. Pre účely tohto vynálezu je štruktúra jednej aminokyselinovej sekvencie účinne homológna k druhej aminokyselinovej sekvencii, keď aspoň 70 percent, s výhodou aspoň 80 percent, a najvýhodnejšie aspoň 90 percent aktívnej časti aminokyselinovej sekvencie je zhodných alebo ekvivalentných. Obecné kategórie potenciálne ekvivalentných aminokyselín sú udané nižšie, pričom aminokyseliny vo vnútri skupiny môžu byť substituované inou aminokyselinou tejto skupiny: 1) kyselina glutámová a asparagová, 2) lyzin, arginin a histidín, 3) alanín, valín, leucín a izoleucín, 4) asparagín a glutamín, 5) threonín a serín, 6) fenylalanín, tyrosín a tryptofan, a 7) glycín a alanín. Významnejšia a kritickejšia pre definíciu funkcie druhej aminokyselinovej sekvencie je účinne homologická s inou aminokyselinovou sekvenciou, keď druhá aminokyselinová sekvencia vyhovuje tercialnej štruktúre majúcej schopnosť znižovať alebo eliminovať katalytickú aktivitu tráviacej cysteínovej alebo aspartátovej proteázy.

Ak sa tu používa, výraz v podstate čistý“ je mienený tak, že popisuje bielkovinu obsahujúcu aspoň jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I, ktorá je homogénna podľa ešte jednej charakteristiky čistoty alebo homogenity. Napríklad: V podstate čistá molekula ekvistatínového peptidu bude vykazovať konštantné a reprodukovateľné charakteristiky v rámci štandardnej experimentálnej odchýlky pre parametre ako sú molekulárna hmotnosť, chromatografické chovanie a podobne. Výraz však nie je myslený tak, aby vylučoval umelé alebo syntetické zmesy molekúl ekvistatínového peptida s inými zlúčeninami. Výraz tak isto nie je myslený tak, aby vylučoval prítomnosť menších znečistení, ktoré neinterferujú s biologickou aktivitou molekuly ekvistatínového peptida a ktoré môžu byť prítomné napríklad z dôvodov neúplnej purifikácie. V podstate čisté molekuly ekvistatínového peptidu môžu byť izolované zo zdroja, v ktorom prirodzene existujú, ktoroukoľvek patričnou technikou purifikácie bielkovín. Príklady techník zahrňujú chromatografické techniky, ako je gelová filtrácia kvapalinovej chromatografie, ionexová chromatografia, afinitná chromatografia, vysoko výkonná kvapalinová chromatografia, chromatografia s reverznou fázou alebo použitie imunologických činidiel používajúcich anti-ekvistatínové protilátky.

Izolácia génu

Ekvistatínový peptid je možné syntetizovať in vitro z aminokyselín, z ktorých je zložený (viď Merrifield (1963), J. Amer. Chem. Soc., 85: 2149-2154, a Solid Phase Peptide Synthesis (1969), (ed.) Stewart a Young). Takto pripravené peptidy možno izolovať a purifikovať postupmi dobre známymi v obore (viď Current Protocols in Molecular Biology (1989), (ed.) Ausubel et al., a Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual).

Aj keď je možné stanoviť a syntetizovať celú aminokyselinovú sekvenciu ekvistatínového peptida, je výhodné izolovať celú sekvenciu ekvistatínového géna. DNA kódujúca ekvistatínový peptid môže byť pripravená z chromosomalnej DNA, cDNA alebo z DNA syntetického pôvodu použitím dobre známych techník.

Genomová DNA kódujúca ekvistatínový peptid môže byť izolovaná štandardnými technikami (Sambrook et al. (1989), vyššie). Konkrétne myslené ako časť tohto vynálezu sú genomové DNA sekvencie kódujúce alelické variantné formy ekvistatínového génu, ako i ich 5* a 3’ priľahlé oblasti. Rovnako je možné použiť primery a exponenciálne amplifikovať DNA in vitro za použitia sekvenčne špecifických oligonukleotidov a polymerazovej reťazovej reakcie (PCR) (viď Mullis et al. (1987), Meth. Enz., 155: 335-350, Horton et al., (1989), Gene 77: 61, a PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, (ed.) Erlich (1989)).

Preparáty cDNA sa zaligujú do rekombinantných vektorov za tvorby génovej knihovne. Alternatívne môžu byť cDNA exprimované vo vektore ako je lambda gt11 a knihovňa prehľadávaná použitím protilátok proti molekule ekvistatínového peptida.

Ku prehľadávaniu knihovní genómovej DNA alebo cDNA môžu byť v technikách, dobre známych v obore, používané vhodné oligonukleotidy, súbor oligonukleotidov alebo z PCR odvodené fragmenty DNA. K umožneniu detekcie žiadúcej sekvencie môže byť DNA sonda značená akýmkoľvek materiálom majúcim detekovateľnú fyzikálnu alebo chemickú vlastnosť. Všeobecné postupy pre izoláciu, purifikáciu a sekvenovanie žiadúcich sekvencií sú v obore dobre známe (viď Current Protocols in Molecular Biology, (1989), vyššie a Sambrook et al. (1989), vyššie).

Alternatívnou cestou získané genetické sekvencie, ktoré sú schopné kódovať aspoň jednu opakujúcu sa thyroglobuiínovú doménu typu I, je jej príprava oligonukleotidovou syntézou po tom, čo je sekvencia génu, o ktorý je záujem, stanovená (viď Caruthers (1983), v Methodology of DNA and RNA, (ed.) Weissman, Beaucage et al. (1981), Tetrahedron Letters 22: 1859-1962). Môže byť syntetizovaná séria oligonukleotidov tak, aby poskytovala sériu prekrývajúcich sa fragmentov a potom hybridizovaná a ligovaná dohromady s použitím dobre známych techník (viď Sambrook et al. (1989), vyššie). Alternatívne môže byť gén vytvorený syntézou primeru majúceho takzvaný “vejúci koniec“, ktorý sa nehybridizuje k cieľovej DNA: Potom sa genómové sekvencie amplifikujú a spoja dohromady extenziou prekryvu (viď Horton et al., (989), Gene 77: 61-68). Výsledný fragment DNS s predpovedanou veľkosťou sa izoluje elektroforézou a liguje do vhodného klonovacieho vektoru k amplifikácii a ďalšej manipulácii (viď Mullis et al. (1987), vyššie a Principles and Applications for DNA Amplification, (1989), vyššie).

Samozrejme možno do izolovaných sekvencií inkorporovať modifikácie, vrátane adície, delécie, alebo nekonzervatívnej substitúcie obmedzeného počtu rôznych nukleotidov alebo konzervatívna substitúcia mnohých nukleotidov, za predpokladu, že sa zachová správny čítací rámec. V patričných bodoch sa pridajú signály translačného ukončenia a štartu a na konce sa pridajú sekvencie vytvárajúce vhodné klonovacie miesta. Príklady techník pre modifikáciu oligonukleotidových sekvencií zahrňujú požitie riadenej mutagenézy sprostredkovanými polynukleotidami (viď Zolier et al. (1984, DNA 3: 479-488, Higuchi et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16: 7351-7367, Ho et al., (1989), vyššie, a Principles and Applications for DNA Amplification, (ed.) Erlich (1989).

Génová expresia

Pre dalšiu charakterizáciu takýchto genetických sekvencií je nutné zavedenie danej sekvencie do vhodného hostiteľa na expresiu bielkovín, ktoré tieto sekvencie kódujú, a potvrdenie, že obsahujú charakteristiky ekvistatínových peptidových molekúl. Techniky na takúto manipuláciu sú dobre známe a sú zverejnené Sambrookem et al. (1989), vyššie.

Vektory k transformácii vírusov, prokaryotických a eukaryotických buniek sú dostupné, alebo môžu byť ľahko pripravené. Všeobecne musia plazmidové alebo vírusové vektory obsahovať všetky riadiace DNA sekvencie potrebné ako k udržiavaniu, tak k expresii heterológnej DNA sekvencie v danom hostiteľovi. Takéto riadiace sekvencie všeobecne zahrňujú promótorovú sekvenciu, transkripčný štart alebo zavádzaciu sekvenciu, sekvenciu DNA kódujúcu signál kodonu translačného štartu, translačný terminačný kodon, a sekvenciu DNA kódujúcu 3’ netranslatovanú oblasť obsahujúcu signály riadiace termináciu RNA syntézy alebo modifikáciu messenger RNA. Konečne je žiadúce, aby vektory mali markerový gén, ktorý je schopný poskytovať fenotypovú vlastnosť, ktorá dovoľuje identifikáciu hostiteľských buniek obsahujúcich daný vektor, a v prípade monokotnej transformácie, intron v 5’ netranslatovanej oblasti, napr. intron 1 z génu kukuričnej alkohol dehydrogenázy, ktorý zvyšuje rovnovážne hladiny mRNA.

Príklady hostiteľských buniek zahrňujú prokaryotné a eukaryotné organizmy. Vhodné postupy k transformácii vybranej hostiteľskej buňky môžu byť nájdené v súlade s použitou hostiteľskou bunkou. Podľa súčasných skúseností sa rozdiely v expresii génov zavedených do buniek, ktoré by bolo možné pripočítať samotnému spôsobu transformácie, zdajú byť malé.

Konvenčná technológia pre zavádzanie biologického materiálu do hostiteľských buniek zahrňuje elektroporaciu (viď Shigekawa a Dower (1988), Biotechniques 6: 742, Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 856860, a Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54: 655-660), mechanismus priameho zachytenia DNA (viď Mendel a Giga (1972) J. Mol. Biol. 53: 159 - 162, Dityatkin et al. (1972) Biochimica et Biophysica Acta 281: 319-323, Wigler et al. (1979) Celí 16: 77, a Uchimiya et al. (1982) v Proc. 5^th Intl. Conf. Plánt Tissue and Celí Culture, ed. A. Fujiwara, Jap. Assoc. for Plánt Tissue Culture, Tokyo, str. 507-508), fúzny mechanizmus (viď Uchidax et al. (1980) v Introduction of Macromolecules into Viable Mammalian Celíš, ed. C. Baserga, G. C rose, a G. Rovera, Wistar Symposium Šerieš, sv. 1, A. R. Liss Inc., NY, str. 169-185), infekčný agens (viď Fraley (1986) CRC Crit. Rev. Plánt Sci. 4: 1-46, a Anderson (1984) Science 226: 401-409), mikroinjekčný mechanizmus (viď Crossway et al.. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 179-185) a mechanismus s projektilmi s vysokou rýchlosťou (viď

EPO 0 405 696).

Transformaty sa izolujú podľa konvenčných metód, obvykle použitím selekčnej techniky, ktorá umožňuje selekciu žiadúcich organizmov proti nemodifikovaným organizmom. Všeobecne po transformácií sa hostiteľské bunky rozrastajú asi 48 hodín na umožnenie expresie markerových génov. Bunky sa potom dajú do selekčného alebo “preberajucého média, kde sa netransformované bunky rozlíšia od transformovaných buď podľa zániku alebo biochemických vlastností. Selektované bunky môžu byť hodnotené expresiou molekuly ekvistatínového peptida alebo jeho funkčných derivátov testovacími technikami, ako je “imunoblotová“ analýza, test inhibičnej aktivity, ELISA, radioimunologické stanovenie alebo analýza na fluorescenčné aktivovanom bunečnom sortere, imunohistochemicky a podobne. Transformované tkaniva sú potom testované na aktivitu na kontrolu hmyzu.

Hostiteľské bunky môžu byť transformované na poskytnutie zdroja, z ktorého možno izolovať významné množstvo vektora obsahujúceho gén, ktorý je predmetom záujmu, k následnému zavedeniu do žiadúcich buniek, alebo k expresii a izolácii významného množstva bielkoviny. Príklady rekombinantných hostiteľských buniek zahrňujú jednobunečné prokaryontné a eukaryontné kmene. Prokaryontné mikróby, ktoré môžu byť použité ako hostiteľia, zahrňujú Escherichia coli a iné Enterobacteriaceae, Bacilli a rôzne druhy Pseudomonáz. Bežné eukaryontné mikróby zahrňujú Saccharomyces cerevisiae a Pichia pastoris. Bežné vyššie eukaryontné hostiteľské bunky zahrňujú bunky Sp2/0 alebo CHO. Iným výhodným hostiteľom sú hmyzie bunky, napríklad z lariev Drosophila, v ktorých vektor obsahuje Drosophila promótor alkohol dehydrogenázy.

Alternatívne môžu byť bakulovirové vektory, napríklad vírus jadernej polyhedrózy Autographa californica (viď Miller et al. (1983) Science 219: 715721) zostavené tak, aby exprimovali veľké množstvá molekúl ekvistatínového peptida alebo jeho funkčných derivátov v kultivovaných hmyzích bunkách (viď Andrews et al. (1988) Biochem J. 252: 199 - 206).

Poľnohospodárske prostriedky

Tento vynález poskytuje poľnohospodársky prostriedok na aplikáciu na rastliny alebo ich časti, ktoré podliehajú napadnutiu hmyzom alebo nematódami majúcimi tráviace cysteinové proteázy, pričom menovaný poľnohospodársky prostriedok zahŕňa bielkovinu obsahujúcu prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I. Daný poľnohospodársky prostriedok bude často obsahovať poľnohospodársky prijateľný nosič. Výrazom „poľnohospodársky prijateľný nosič“ je mienená látka, ktorá môže byť použitá na rozpúšťanie, dispergovanie alebo difúziu aktívnej zlúčeniny v prostriedku bez poškodenia účinnosti danej zlúčeniny a ktorá sama o sebe nemá škodlivý účinok na pôdu, zariadenia, úrodu alebo agronomické prostredie.

Poľnohospodársky prostriedok môže byť aplikovaný v širokom rade foriem vrátane práškov, kryštáľov, suspenzii, prachov, pelet, granúl, kapsúl, mikrokapsúl, aerosolov, roztokov, gélov alebo iných disperzii. Naviac k patričným kvapalným alebo tuhým nosičom môžu prostriedky obsahovať adjuvans, ako sú emulgačné a zvlhčovacie činidlá, činidlá pre postrek, dispergačné činidlá, adheziva alebo činidlá, ktoré stimulujú kŕmenie hmyzu podľa konvenčných poľnohospodarských praktík. Adjuvans pre formulovanie insekticídov sú dobre známe zbehlým v obore.

Koncentrácia bielkoviny obsahujúcej prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I bude široko kolísať v závislosti na povahe konkrétneho prípravku, najmä na tom, či sa jedná o koncentrát alebo o priame používanie. Bielkovina obsahujúca prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I bude všeobecne prítomná v aspoň jednom percente podľa hmotnosti a môže tvoriť až 100 percent hmotnosti.

Prezentácia poľnohospodárského produktu môže byť dosiahnutá externou aplikáciou buď priamo, alebo do blízkosti rastliny alebo rastlín. Poľnohospodárske prostriedky môžu byť aplikované do prostredia hmyzieho škodca (škodcov), napríklad pôdy alebo vody, pomocou sprejovania, práškovania, kropenia a pod.

Vynález ďalej uvažuje použitie rekombinantných hostiteľov (napríklad mikrobiálnych hostiteľov a vírusov hmyzu) transformovaných génom kódujúcim bielkovinu obsahujúcu prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I, a aplikáciu na alebo poblízku vybranej rastliny alebo rastlinnej časti podliehajúcej útoku hmyzu, ktorý je terčom zásahu. Hostitelia sú vyberaní tak, aby boli schopní kolonizovať rastlinné tkanivo podliehajúce napadnutiu hmyzom, alebo sa aplikujú ako mŕtve alebo neživotaschopné bunky obsahujúce bielkovinu, obsahujúcu prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I. Mikrobiálnými hostiteľmi obzvláštného záujmu budú prokaryonty a nižšie eukaryonty ako sú huby.

Charakteristiky mikrobiálnych hostiteľov uzatvárajúcich bielkovinu obsahujúcu prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I zahŕňajú ochranné kvality pre túto bielkovinu, ako je silná bunečná stena, pigmentácia a intracelulárne zbalenie alebo tvorba inkluzných teliesok, afinita k listom, netoxičnosť pre zvieratá, atraktivita pre škodcov k požieraniu, ľahkosť umŕtvenia alebo fixácie bez poškodenia bielkoviny obsahujúcej prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I, a schopnosť úpravy k predĺženiu aktivity bielkoviny obsahujúcej prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I. Charakteristiky mikrobiálnych hostiteľov ku kolonizácii zahŕňajú absencia fytotoxicity, ľahkosť zavedenia genetickej sekvencie kódujúcej bielkovinu obsahujúcu prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I, dostupnosť systémov expresie, účinnosť expresie a stabilita insekticídu v hostiteľovi.

Ilustratívne prokaryonty, ako Gram-negativné, tak - pozitívne, zahrňujú Enterobacteriaceae, ako sú Escherichia, Bacillaceae, Rhizoboceae ako je Rhizobium a Rhizobacter, Spirílaceae (ako je fotobakterium), Zymmonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum, Lactobacillaceae, Pseudomonadceae (ako je Pseudomonas a Acetobacter), Azotobacteriaceae a Nitrobacteriaceae. Medzi eukaryontami sú huby (ako Phycomycetes a Ascomycetes), ktoré zahrňujú kvasinky (ako Saccharomyces a Schizosaccharomyces), a Basidiomycetes kvasinky (ako je Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces) a podobne.

Vynález taktiež uvažuje o použití bakulovirov obsahujúcich gén kódujúci bielkovinu obsahujúcu prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I. Bakuloviry, zahrňujúce bakuloviry, ktoré infikujú hmyz (motýle, muchy) Heliothis virescens, Orgyla pseudotsugata, lymantria dispar, Autographica califomica, Neodiprion serfiter a Laspeyresia pomonella, sú registrované a používané ako pesticídy (viď US 4 745 051 a EP 175 852).

Rekombinantný hostiteľ môže byť formulovaný radom spôsobov. Môže byť používaný v zvlhčiteľných práškoch, granulách alebo prachu, alebo miešaný s rôznymi inertnými materiálmi, ako sú anorganické minerály (fylosilikáty, uhličitany, sírany, fosfáty, a podobne) alebo s botanickými materiálmi (práškované kukuričné palice, ryžové plevy, orechové šupky, a podobne). Prípravky môžu zahrňovať adjuvans na šírenie/prichytenie, stabilizačné činidlá, iné insekticidné pridané povrchovo aktívne látky, bakteriálne živiny alebo iné látky na podporu rastu alebo stability bakteriálnych buniek. Kvapalné prípravky môžu byť vodné alebo nevodné, a používané ako peny, gély, suspenzie, emulgovateľné koncentráty a pod. Zložky môžu zahrňovať rheologické činidlá, povrchovo aktívne látky, emulgátory, disperzanty alebo polyméry.

Transgenné rastliny

Alternatívne môže byť bielkovina obsahujúca prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I inkorporovaná do tkaniva príjmajúcej rastliny tak, že v priebehu napadnutia rastliny hmyz konzumuje hmyz - kontrolujúce množstvo vybranej bielkoviny obsahujúcej prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I. Tento spôsob ponúka zvláštne výhody pri zasahovaní rastlinného tkaniva tráveného hmyzom alebo nematodami, ktoré normálne je veľmi obtiažne dosiahnúť konvenčnou aplikáciou pesticídov. Naviac existujú dôležité ekonomické environnementálne výhody, ktoré sa získajú keď sa môže znížiť potreba aplikácie pesticídov.

Tento spôsob taktiež poskytuje výhody, keď sa zváži potenciál hmyzu stať sa rezistentným. Silná aplikácia insekticidných materiálov všeobecne na pole alebo geografickú oblasť prachom alebo sprayom alebo inkorporáciou do pôdy má tendenciu navodzovať silný selekčný tlak pretože hmyz nemá žiadny „azyl, kde by mohli prežívať nerezistentný jednotlivci. Avšak: Mnohí hmyzí škodcovia plodinových rastlín napádajú aj neplodinové druhy. Obmedzenie insekticidného materiálu len na plodinové rastliny v oblasti pomocou expresie insektícidného materiálu len v týchto rastlinách dovoľuje, aby pokračovalo prežívanie nerezistentného hmyzu v asociovaných burinových rastlinách, ktoré poskytujú nie len „azyl“ pred toxickými zlúčeninami, ale i potravu pre hmyz. To významne znižuje selekčný tlak a spomaľuje rozvoj a šírenie sa rezistentného hmyzu.

Tento spôsob rovnako ponúka výhody z pozície kontaminácie pôdy a spodnej vody, pretože nie je potrebný žiadny vehikel k aplikácii. Insekticídne zložky sú samé o sebe prírodného pôvodu a prirodzene sa rozkladajú, keď je rastlina trávená alebo keď sa rozkladá. Tento spôsob ponúka ďalšie výhody z pozície nákladov, pretože insekticídny materiál je súčasťou ceny semena alebo iného reprodukčného materiálu, ktorý si pestovateľ kupuje.

Jedným spôsobom prevádzania je inkorporácia bielkoviny obsahujúcu prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I vo vehikle netoxickom pre rastlinu, ktorý je uspôsobený na systémové podávanie prijímajúcej rastline. Avšak: Pretože gény kódujúce bielkovinu obsahujúcu prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I možno izolovať, vynález uvažuje, vo výhodnom prevedení, transgenné rastliny, ktoré sú schopné biologicky syntetizovať bielkoviny obsahujúce prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I a poskytovať rastline nový, alebo dodatočný mechanizmus ochrany proti útoku hmyzu alebo nematódov.

Vynález poskytuje spôsoby zavedenia odolnosti voči napadnutiu hmyzom, majúcom tráviace cysteínové alebo aspartátové proteázy, do rastlín prijmacieho taxónu, ktoré zahŕňajú: a) kultiváciu buniek alebo tkaniva z aspoň jednej rastliny daného taxónu, b) zavedenie, do danej bunkovej alebo tkanivovej kultúry, štruktumého génu, kódujucého bielkovinu obsahujúcu prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I vo funkčnom spojení s rastlinnými regulačnými sekvenciami, ktorá spôsobí expresiu daného génu v daných bunkách, a c) regenerácia celej rastliny rezistentnej voči hmyzu z bunkovej alebo tkanivovej kultúry.

Expresia unikátne vysokého množstva bielkovín obsahujúcich prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I môže byť škodlivá pre samotnú rastlinu. Použitie signálnych sekvencií k sekrécií alebo sekvestrovaniu do vybranej organely umožňuje bielkovine byť v metabolický inertnom mieste pokiaľ nie je uvoľnená v črevnom prostredí hmyzieho patogéna.

Táto DNA sekvencia bude všeobecne taká, že pochádza z organizmu odlišného od cieľového, alebo že má podstatnú sekvenčnú homológiu k bielkovine obsahujúcej prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I pochádzajúcej z organizmu odlišného od cieľového.

Optimálne expresie v rastlinách

Pre optimalizáciu transskripčnej a translačnej účinnosti takýchto systémov možno podrobiť skúmaniu frekvenciu využitia kodónov a určiť, ktoré kodóny sú v podstate preferované v transkripčných a translačných systémoch normálne prítomných v danej rastline. Keď sa použije takéto preferované využitie kodónov, možno skonštruovať sekvenciu kódujúcej bielkoviny, ktorá bude viesť k významne zvýšenej hladine transkripčnej a translačnej účinnosti ekvistatínového génu alebo funkčného deriváta tohoto génu v porovnaní s tým, čo by sa dosiahlo, keby sa vzala kódujúca sekvencia priamo v nemodifikovanej forme donorového organizmu. Naviac môže byť kódujúca sekvencia ďalej optimalizovaná odstránením potenciálných rastlinných polyadenylačných signálov, kryptických zostrihových miest a motívov nestability mRNA, ako bolo ukázané pri génoch toxína Bacillus thuringiensis.

Všeobecne sa inzercia heterológných génov pri použití ktorej koľvek transformačnej techniky javí ako náhodná, ale v súčasnosti existujú technológie na produkciu rastlín s miestnou špecifickou rekombináciou DNA do rastlinných buniek (viď WO/9109957). Aktivita cudzorodého génu zavedeného do rastlinných buniek je závislá na charakteristikách expresie jednotlivých zavedených génov, pochádzajúcich z riadiacich oblasti (promótory, polyadenylačné oblasti, zosilovače, atď.) a z vplyvov endogénnej rastlinnej

DNA, priľahlej k chimernému inzertu a počtu kópií.

Vybraný promótor musí byť schopný spôsobovať dostatočnú expresiu vedúcu k produkcii hmyz - kontrolujúceho množstva bielkoviny. Vhodné promótory môžu zahrňovať jednak tie, ktoré sú odvodené z niektorého génu, ktorý je prirodzene exprimovaný v rastlinách, ako aj syntetické promótorové sekvencie, ktoré môžu zahrňovať redundantné alebo herológne zosilovacie sekvencie. Mnoho promótorov, ktoré sú aktívne v rastlinách, zahrňujú promótory nopalin synthasy, oktopin synthasy a mannopin synthasy z nádorov indukujúcich plazmidov Agrobacterium tumefaciens. Tento vynález uvažuje o konštitutívnych promótoroch tak, že transformovaná rastlina bude mať zvýšenú toleranciu k hmyzím škodcom. Príklady konštitutívnych promótorov zahrňujú promótory CaMV 19S a 35S (JP 63287485), ubiquitinový promótor, ryžový aktinový promótor (WO/91099948).

V druhoch, ktoré produkujú natívnu bielkovinu obsahujúcu prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I, ktorá nie je produkovaná v tkanivách, ktoré sú normálne napádané hmyzom, alebo nie je do nich distribuovaná, môže byť použitý tkanivovo špecifický promótor k poskytnutiu lokalizovanej expresie alebo nadprodukcie bielkoviny, obsahujúcej prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I. Príklady tkanivovo špecifických promótorov zahrňujú koreňovo špecifické promótory ako kukuričného metalothioneninu (EP 452269), koreňovo špecifický promótor (WO/9113992), promótor skladovacieho telieska rastlinného semena (WO/9113993) a promótor alkohol dehydrogenázy-1. Promótory známe ako indukovateľné svetlom zahrňujú promótor génu kódujúceho malú podjednotku (ss) rubuloso-1,5-bisfosfat karboxylázy zo sójových bobov a promótor génu kódujúceho chlorofyl a/b viažúci proteín v zelenajúcich sa listoch (Coruzzi et al. (1983) J. Biol. Chem. 259: 1399. A Dunsmuir et al. (1983) J. Molecular and

App. Gen. 2: 285, Nap et al. (1993) Plánt. Molec. Biol. 23: 605-612).

Konečne: K poskytnutiu expresie bielkovín obsahujúcich prinajmenšiom jednu opakujúcu sa thyroglobuiínovú doménu typu I pri napadnutí tkaniva rastlinným škodcom môžu byť použité promótory indukovateľné poranením alebo patogénom. Príklady promótorov indukovateľných poranením alebo patogénom zahrňujú promótor proteinázového inhibítora II.

Rastlinné vektory

Vhodné vektory pre transformáciu rastlinného tkaniva boli popísané a tu sa uvádzajú (viď. deFrammond et al. (1983) Biotechnology 1: 262, An et al. (1985) EMBO J. 4: 277, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 183, Rothstein et al. (1987) Gene 53: 153, WO 90/08829 a WO 84/02913) a vo výhodnom prevedení pCAB1 (ako je popísané v Príkladoch). V praxi nie je potrebné, aby vektor obsahujúci gén selektovatefného markera obsahoval tiež gén, ktorý je predmetom záujmu: Skôr sa k transformácií rastlinných buniek používa kotransformácia takými vektormi.

Transformačné postupy

Patričný postup na produkciu dospelých transgénnych rastlín možno vybrať v súlade s použitým rastlinným druhom. Regenerácia kolísa od druhu k druhu rastlín. Účinná regenerácia bude závisieť na médiu, na genotype a histórií kultúry. Akonáhle sa získajú celé rastliny, môžu byť pohlavne alebo klonálne reprodukované takým spôsobom, že aspoň jedna kópia sekvencie je prítomná v bunkách potomstva reprodukcie. Takéto postupy možno vybrať v súlade s použitým rastlinným druhom.

Šľachtenie transgénnych rastlín

Dospelé rastliny, vyrastené z transformovaných rastlinných buniek, môžu byť rozmnožené na produkciu rovnakých inbredných rastlín. U diploidných rastlín môže byť typicky transformovaný jeden rodič a druhý rodič môže byť divokého typu. Rodičia budú skrížení pri tvorbe hybridov prvej generácie (F^, ktoré sa rozmnožia s produkciou hybridov druhej generácie (F₂). Hybridy F₂ s genetickým profilom bielkoviny obsahujúcej prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I sa vyberú a rozmnožia na produkciu inbrednej rastliny.

Na prenos ekvistatínového štrukturného génu alebo jeho funkčného derivátu možno použiť konvenčné postupy šľachtenia rastlín, kríženie a spätné kríženie. Takéto spôsoby obsahujú ďalej kroky a) pohlavné kríženie rastliny rezistentnej voči hmyzu s rastlinou z variety podliehajúcej hmyzu, b) získanie reprodukčného materiálu z potomstva kríženia a c) rast rastlín rezistentných voči hmyzu z danného reprodukčného materiálu. Ak je to žiadúce alebo potrebné, agronomické charakteristiky variety podliehajúcej hmyzu môžu byť v podstate zachované rozšírením tohoto spôsobu na zahrnutie ďalších krokov opakovane, d) spätné kríženie potomstva rezistentného voči hmyzu s vnímavými rastlinami z variety podliehajúcej hmyzu, a e) selekcia na expresiu rezistencie voči hmyzu (alebo na spojený markerový gén) medzi potomstvom spätného kríženia, pokiaľ nie je prítomné žiadúce percento charakteristík variety podliehajúcej hmyzu, spolu s génom vnášajúcim rezistenciu voči hmyzu. Následne sa môžu inbredné rastliny podľa vynálezu krížiť s inou inbrednou líniou na produkciu hybridu.

Potenciátory

Tento vynález ďalej uvažuje o použití, spolu s bielkovinou obsahujúcou prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I, adjuvansu, chemických alebo biologických aditiv, v snahe rozšíriť spektrum cieľových škodcov, predĺžiť trvanie účinnosti bielkoviny obsahujúcej prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I, alebo pomôcť stabilizovať poľnohospodársky prostriedok bielkoviny obsahujúcej prinajmenšom jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I.

Príklady potenciátorov by zahrňovali lektíny, amfipatické bielkoviny alebo komplementárne proteázové inhibítory. Napríklad: prítomnosť viac ako jedného ochranného proteína, v prítomnosti iných ochranných proteínov, môže mať dôležitú rolu pri ochrane rastliny pred útokom hmyzu. Vie sa, že hmyz Hemiptera a Coleoprera si vyvinul alternatívne cesty na trávenie potravy obsahujúcej vysoké hladiny určitých proteázových inhibítorov. Môže byť výhodné zahrnúť inhibítory z rodín ako sú cystatíny (typ I až II a fytocystatíny), inhibítory Kunitzovho typu, virgiferinové inhibítory, Bowmanove-Birkove inhibítory, sladové trypsinové inhibítory, zemiakové inhibítory I a II, inhibítory tekvicovité, bifunkčné inhibítory Ragi 1-2/kukurice, inhibítory karboxypeptidázy A a B a inhibítory aspartátových proeáz (viď Ryan (1990) Annu. Rev. Phytopathol. 28: 425 - 49)

Hmyz a nematódy

Tento vynález uvažuje o ochrane akejkoľvek rastliny taxóna, ktorý je vnímavý na napadnutie a poškodenie hmyzom alebo nematódami majúcimi tráviace cysteínové alebo aspartátové proteázy. Takýto hmyzí škodcovia zahrňujú najmä coleopterný hmyz čeľade Tenebrionidae, Curculionidae, Bruchidae a Chrysomelidae, thysanopterný hmyz a dipterný hmyz. Takéto rastlinné parazitické nematódy zahrňujú Globodera Pallida, Heterodera schachtii a Meloidogyne incognita. Špeciálne je uvedený hmyz Leptinotarsa decemlineata, Frankliniella occidentalis, Diabrotica virgifera a Liriomyza trifolii, na ktoré sa bežne odkazuje ako na mandelinku žemiakovú, strapky a minujúci hmyz. Iné konkrétne druhy hmyzu zahrňujú chrobáky múčiara, drepčíky, crestovníčky/šparglovníčky, zrnokazy a ploštice. Výrazom “taxón“ sa tu mieni jednotka, botanickej klasifikácie rodu alebo nižšia. Zahrňuje teda rod, druh, kultivar, varietu, variantu a iné menšie taxónomické skupiny, ktorým chýba konzistentná nomenklatúra.

Rastliny

Príklady rastlín zahrňujú zemiaky, kukuricu, paradajky, proso, bavlnu, fazuľu, repku, ďatelinu, špargľu, sladké zemiaky a chryzantémy. Toto sa však nekladie ako obmedzenie, pretože tento hmyz môže napadávať určité iné druhy úrody. Spôsoby podľa vynálezu sú teda ľahko aplikovateľné na početné rastlinné druhy podľa vyššie uvedeného zoznamu, vrátane, bez obmedzenia, druhy z rodu medicano, Trifolium, Vigna, Citrus, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Capsicum, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Helianthus,

Bromus, Asparágus, Panicum, Pennisetum, Cucumis, Glycine, Lolium, Triticum a Zea.

Príklady prevedenia vynálezu

Tento vynález je vysvetlovaný do ďalších podrobností nasledujúcimi príkladmi. Tieto príklady majú za účel len vysvetlenie a nemajú sa chápať ako obmedzovanie rozsahu vynálezu. Všetky sekvencie DNA sú dané v konvenčnom smere od 5’ ku 3’. Všetky aminokyselinové sekvencie sú dané v konvenčnom smere od N-konca ku C-koncu. Pri prevádzaní nasledujúcich príkladov boli všetky manipulácie DNA prevedené podľa štandardných postupov, pokiaľ nie je vyznačené ináč. Viď Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, vydaný Cold Spring Harbor Laboratory, U.S.A.

Príklad 1

Aktivita domény 2-3 ekvistatína k aspartátovým proteázam typu kathepsína D

Ekvistatín bol izolovaný z morského mäkkýša A. equina postupom, ktorý bol skôr popísaný, s využitím jeho inhibítorovej aktivity k cysteínovej proteáze, papaínu (Lenarcic et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 13899). Vedľa cysteínových proteináz bol ekvistatín hodnotený pri inhibícií dvoch iných tried proteináz, aspartátových proteináz (kathepsín D) a serinových proteináz (trypsín). Inhibičný účinok ekvistatína bol pozorovaný len keď reagoval s kathepsínom D. Získaná inhibícia bola neočakávaná, pretože ekvistatín je známy ako silný inhibítor cysteínových proteináz podobných papaínu. Naviac bolo ohlásené, že p41 fragment nemá inhibičný účinok na kathepsín D (Bevec et al. (1996) J. Exp. Ned. 183: 1331-1338). Na určenie, či ekvistatín nepôsobí ako substrát kathepsína D sme inkubovali obidva v rôznych molárnych koncentráciách v rôznych časových obdobiach a zmesy podrobili HPLC systému s reverznou fázou (Obr. 9A). U kathepsína D neboli pozorované žiadne degradačné produkty. Oproti tomu bolo zistené, že ekvistatín je dobrým substrátom pre trypsín a táto skutočnosť bola použitá pre separáciu thyroglobulinových domén typu I limitovanú proteolýzou β-trypsínom. 500 pg ekvistatína bolo inkubovaných s 5 pg β-trypsínu v 0,5 ml 0,1 M Tris/Hcl pufra pH 8,0 počas 40tich minút pri 37°C. Reakcia bola zastavená pridaním kyseliny trifluóroctovej. βtrypsínový digest ekvistatína bol rozdelený pomocou HPLC (Nilton Roy Co.) s použitím reverzne fázovej kolóny Vydac C18 ekvilibrovanej 5% acetonitrilom obsahujúcim 0,1% (objem/objem) kyseliny trifluóroctovej. Elucia sa prevádzala použitím lineárneho gradienta 80% (objem/objem) acetonitrila obsahujúceho 0,1 % (objem/objem) kyseliny trifluóroctovej. Absorbancia bola monitorovaná pri 215 nm. Na HPLC s reverznou fázou boli získané dva hlavné vrcholy (Obr. 9B). Molekulové hmotnosti, stanovené SDS PAGE za neredukujúcich podmienok, boli okolo 7 000 a 14 000 (Obr. 10). Stanovenie N-koncov oboch fragmentov umožnilo ich lokalizáciu v sekvencií ekvistatínovej molekuly, ako je schématicky ukázané na Obr. 11. C-konce daných fragmentov neboli priamo identifikované, ale ich veľkosť, ako ju ukazuje SDS PAGE, bola konzistentná s tým, že sú jednoduchou a dvojitou doménou. Menší fragment začína s N-koncom ekvistatína a preto zodpovedá prvej doméne (eq d-1). Väčší fragment odhalia dve sekvencie, začínajúce Ala68 a Val152. Väzba Lys67-Ala68 je umiestnená na začiatku druhej domény, zatiaľ čo štiepenie Arg151- Val152 nebolo výsledkom limitovanej proteolýzy (Obr. 11). Bolo ohlásené, že izolovaný ekvistatín je podstatne narušený medzi Arg151 a Val152, reťazce sú viazané disulfidovou väzbou a oddeľujú sa len po redukcii (Lenarcic et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 13899-13903). Tesný dvojitý pruh viditeľný na SDS PAGE je najpravdepodobnejšie výsledkom fragmentácie veľmi blízko C-konca, čo znamená, že tento fragment predstavuje spojenú druhú a tretiu doménu, eq d2,3. Podľa sekvenčných dát tieto tri sekvenčne homologické časti ekvistatína môžu mať tri potenciálne proteinázove väzbové miesta. V predchádzajúcej práci bolo ukázané, že väzbová stechiometria ekvistatína a papaína, ako predstaviteľov cysteínových proteináz, je 1: 1 (Lenarcic et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 13899). Keď bola aspartátova proteináza, kathepsín D, titrovaná ekvistatínom, bolo stanovené, že znova je potrebný 1 mol ekvistatína na saturáciu 1 molu kathepsína D (Obr. 12). Táto hodnota bola nezávislá cez široký koncentračný rozsah. Ku skúmaniu inhibičných aktivít jednotlivých domén ekvistatína bola prevedená podrobná kinetická analýza inaktivácie papaína a kathepsína D. Všetky kinetické a rovnovážne konštanty sú udávané v Tabuľke 2. Prvá doména, eq d-1, vykazovala prakticky rovnaké inhibítorové charakteristiky oproti papaínu ako intaktný ekvistatín, p41 fragment alebo ECI. Táto skupina inhibítorov, thyroglobulinových domén typu I, sa považuje za kompetitívnu, reversibilnú, pevne sa viažúcu inhibítorami cysteínových proteináz, ako papaín, kathepsín B a L a cruzipaín. Dvojdoménový inhibítor, eq d - 2,3, prakticky nevykazoval žiadnu inhibiciu papaína.

Kinetika väzby ekvistatína ku kathepsínu D bola prevádzaná s použitím syntetického substrátu, ktorý obsahuje chromofor, ako je nitrofenylalaninový zbytok, v pozícií Pľ. Citlivosť stanovenia, poskytovaná H-Pro-Thr-GluPhe*Nph-Arg-Leu-OH ako substrátom, nám umožnila použiť 6,4 nM koncentráciu enzýmu ako minimálnu koncentráciu v danom teste. Získaná rovnovážna disociačná konštanta pre interakciu medzi kathepsínom D a ekvistatínom (Ki = 0,3 nM) ukazuje, že ekvistatín je znamenitým inhibítorom aspartátovej proteinázy, kathepsína D. Pre fragment aktívny k papainu, eq d-1, bola stanovená hodnota Ki približne 1 mM. Táto hodnota je o niekoľko radov vyššia ako je hodnota Ki pre intaktný ekvistatín, čo ukazuje, že inhibičné aktívne miesto ekvistatína musí byť lokalizované na iných doménach. Eq d-2,3 skutočne vykazoval prakticky rovnaké inhibičné charakteristiky ako celý ekvistatín (Ki > 0,6 nM). Naviac bola tvorba pevného komplexu medzi kathepsínom D a ekvistatínom tiež zviditeľnená pomocou natívného PAGE (Obr. 10 B)

Ekvistatín je prvým bielkovinovým inhibítorom kathepsína D zvieraceho pôvodu so známou primárnou štruktúrou. Dosiaľ boli známe len deriváty pepstatína ako inhibírory kathepsína D rovnako silné ako ekvistatín.

Dáta poskytnuté v tejto štúdii jasne ukazujú, že rôzne thyroglobulínové domény typu I prítomné v ekvistatíne, navzdory rozsiahlej podobnosti ich aminokyselinových sekvencii, mieria k rôznym triedam proteináz, buď cysteínovej alebo k aspartátovej proteináze kathepsína D.

Tabuľka 2.

Kinetické konštanty pre interakciu ekvistatína, eq d-1, a eq d-2,3 s papaínom a kathepsínom D

Enzým	Inibítor	10’⁶ x k_a M‘¹s'¹	10·⁴ x k_ds¹	Ki NM
Papaín^a	Ekvistatín	12 ±0,6	12 ±0,6	12 ±0,6
	Eq d-1	12 ±0,6	12 ±0,6	12 ±0,6
	Eq d-2,3	ND^d	ND	>1000^e
Kathepsín D^Ď	Ekvistatín	ND	ND	12 ±0,6
	Eq d-1	ND	ND	> 1000
	Eq d-2,3	ND	ND	12 ±0,6

^a Ku kinetickej analýze interakcie papaína s inhibítormi bol použitý test kontinuálnej rýchlosti. Ki bola vypočítaná z pomeru kd / k_a ^b Dáta boli stanovené z inhibičného účinku inhibítora na ustálenú rýchlosť kathepsínom D katalyzovanej hydrolýzy chromoforného substrátu.

^d Nebolo stanovené ^e Významný vplyv nevykazoval, dokonca aj pri 5 mM, ani eq d-2,3 k papaínu, ani eq d-1 ku kathepsínu D: inhibičné konštanty boli teda odhadnuté ako väčšie než 1 mM.

Príklad 2

Molekulárne klonovanie ekvistatínu

Z jedinej vzorky morského mäkkýša Actinia equina L. boli izolované celkové RNA rozbitím tkaniva v kvapalnom dusíku. Dva gramy rozotreného, hlboko zmrazeného tkaniva boli prenesené do 20 ml roztoku guanidinium thiokyanatu (6,5 M GTC, 0,5 M EDTA, 0,2 M β-merkaptoethanol) a homogenizované v elektrickom mixéri (16 000 ot./min., 4 x 30 sekúnd). Následne bol roztok centrifugovaný pri 6000 x g, 20 min., pri 15°C. Desať ml číreho supernatantu bolo prenesených k 10 ml roztoku cesium TFA (p 1,5 mg/ml), doplneného 2,5 ml 0,5 M EDTA, pH = 8,0. Vzorka bola centrifugovaná 24 hodín pri 125 000 x g, 15°C. Supernatant bol odstránený a celková RNA (peleta) bola rozpustená v 1 ml roztoku proteinázy K (0,5 mg/ml). Po inkubácii roztoku pri 50°C, 1/2 hodiny, bola celková RNA zrazená 1/10 objemu 3 M KOAc, pH 5,2, a 2,5 objemu 96% ethanolu a zmes bola daná do mrazničky pri 20° C počas noci. Celková RNA bola usadená pri 8 000 x g a peleta rozpustená v 2 ml TE pufra. 1 ml rozpustenej vzorky bol zahriaty na 65° C počas 5 minút, ochladený na ľade a následne bolo pridaných 0,2 ml TE pufra doplneného 3 M NaCI. Celá vzorka bola nanesená na povrch náplne oligo (dT)-celulózy v kolone. Poly(A) + RNA bola eluovaná 1 ml TE pufra (rozdelenom na 4 alikvóty po 0,25 ml), predhriatého na 65°C. Jedna tretina vzorky (približne 1 gg) sa použil na syntézu cDNA podľa postupu výrobcu (Amersham). Syntéza prvého vlákna cDNA sa previedla za použitia 11 μΙ roztoku mRNA, 4 μΙ 5 x reakčného pufra, 1 μΙ roztoku Na-pyrofosfátu, 1 μΙ ribonukleazového inhibítora z ľudskej placenty (5 U/μΙ), 2 μΙ roztoku zmesy dNTP a roztoku oligo dT primeru (1 μΙ). Po pridaní 2 μΙ reverznej transkriptázy (10 U/μΙ) bola zmes inkubovaná pri 42°C 40 minút. Druhé vlákno cDNA bolo syntetizované pridaním nasledujúcich zložiek:

37,5 μΙ reakčného pufra pre druhé vlákno, 7 μΙ E. coli DNA polymerázy I (4 U/μΙ) a 1 μΙ E. coli ribonukleázy H (1 U/μΙ). Reakčná zmes bola inkubovaná postupne pri 12°C 60 minút a 22°C 60 minút. Po tepelnej denaturácii (5 minút pri 70°C), bolo pridaných 0,5 μΙ T4 DNA polymerázy (2 U/μΙ) a reakčná zmes bola inkubovaná pri 37°C 10 minút. K 1 μ9 cDNA bolo ligovaných 2,5 μΙ (250 pmol) EcoRI adaptorov za použitia 2 μΙ DNA ligázy (4 U/μΙ) v 20 μΙ ligačnej zmesy. Po 8 hodinách pri 16°C bola ligačná zmes podrobená kolonovej purifikácií/frakcionácií podľa veľkosti cDNA s naviazanými adaptormi za použitia stáčacích koloniek a TE pufra. Zobrané frakcie purifikovanej cDNA boli fosforylované T4 polynuklotidkinázou (8 U/μΙ) a cDNA bola ligovaná do ramien defosforylovaného Xgt11 bakteriofága za použitia T4 DNA ligázy(40 U/μΙ). Nakoniec bola celá ligačná zmes “zbalená“ in vitro s použitím “baliaceho“ extraktu od rovnakého výrobcu (Amersham). časť Xgt11 knihovne cDNA (10⁵pfu) bola použitá na infekciu buniek E. coli Y1090 a zmes nanesená na misky s LB agarom. Plaky boli presiaté na nitrocelulózové membrány. Membrány boli trikrát premyté v soľnom roztoku pufrovanom Tris s 0,01 % Tween-20 (TBST) a následne v blokovacom roztoku (20 (objem/objem) fetalného séra v TBST). Po premytí membrán v TBST bola pridaná prvá protilátka (králičie antiekvistatínové IgG) v TBST a na membrány sa pôsobilo cez noc pri 4°C. Potom boli membrány premyté trikrát s TBST a pôsobilo sa na nich druhou protilátkou (kozia anti-kraličia IgG-chrenová peroxidáza). Po finálnom umytí v TBST bola prevedená vizualizácia s diamidobenzidínom ako substrátom. Z agarových misiek boli izolované tri pozitívne klony a po novom nanesení boli fágy eluované z povrchu agarových misiek TE pufrom (5 ml na jednu misku). Fágová DNA bola izolovaná s použitím izolačnej súpravy Wizard Lambda Preps DNA (promega) podľa postupu výrobcu. Po reštrikčnej analýze s 2 μΙ reštrikčného enzýmu EcoRI (10 U/μΙ) na 3 μg KDNA a frakcionácii podľa veľkosti na 1% agarosovom géle boli cDNA inzerty vyrezané, purifikované so skleneným mliekom a subklonované do EcoRI klonovacieho miesta plazmidu pUC19. Celá ligačná zmes (10 μΙ každého vzorku) bola transformovaná do buniek E. coli DH5a inkubáciou 100 μΙ vysoko kompetentných buniek (OD550 = 0,6) a 10 μΙ ligačnej zmesy vo vodnom kúpeli (42°C) počas 45 sekúnd. Po pridaní LB média (900 μΙ) a 1 hodine inkubácie (37°C, 250 ot./min.) boli bakteriálne zmesy nanesené na LBA misky doplnené X-gal a IPTG a po inkubácii cez noc (37°C) boli biele kolónie prenesené do 5 ml LB média a inkubované ďalších 16 hodín (37°C, 250 ot./min.). Plazmidy boli izolované s použitím systému Wizard Plasmid Purification System (Promega) podľa inštrukcií výrobcu a analýzované stanovením nukleotidovej sekvencie za použitia T7 DNA polymerázy (T7 sekvenčná súprava, Phrmacia) a [³⁵S]dATPaS (Amersham) . Sekvenovanie vybraných cDNA klonov viedlo ku klonu cDNA plnej dĺžky, ako udáva Obr. 1.

Príklad 3

Expresia rekombinantnej ekvistatínovej cDNA v Escheríchia coli

K amplifikácii maturného proteínu ekvistatínu a k jeho klonovaniu ako Ncol-Ncol fragmentu za g3 signálnym peptidom prítomným v E. coli vektora expresie pB3 boli použité dva primery. Primer 1 bol PDEI-1: CGC GCC ATG GCG AGT CTA ACC AAA TGC CAA a primer 2 bol PDEI-2: GG TGC GGC CGC GCA TGT GGG GCG TTT AAA. Správne inzerty boli sekvenované na preverenie sekvenčných chýb a jeden kloň bol vybraný na získavanie rekombinantnej bielkoviny.

Rekombinantný ekvistatí n bol získaný rastom jedinej kolónie E. coli kmeňa HB2151 s plazmidom pB3 nesúcim ekvistatínovú cDNA, cez noc v 5 ml LB rastového média s ampicilínom (100 mg/ml, finálna koncentrácia) pri 37°C, 250 ot./min. Päť mililitrov kultúry narastenej cez noc bolo použitých na inokuláciu 800 ml LB média s ampicilínom (100 mg/ml, finálna koncentrácia) v 2 I banke. Buňky rástli pri trepaní (30°C, 250 ot./min.) do OD₆oo = 0,5. Za tým sa pridal zásobný roztok IPTG do finálnej koncentrácie 1 mM a rast buniek pokračoval pri použití rovnakých podmienok ako vyššie ďalších 6 hodín. Buňky boli umiestené na ľad na 1 hodinu, potom stáčané pri 4 000 g počas 10 minút pri 4°C a resuspendované v 50 ml ľadovo chladného 10 mM MgSO₄. Suspenzia sa umiestnila na -20°C pokiaľ kvapalina úplne nezamrzla a potom bol obsah roztopený ponorením baňky s roztokom do vodného kúpeľa (30°C). Okamžite po roztopení boli buňky odstránené centrifugáciou pri 6 000 x g počas 10 minút pri 4°C a supernatant uschovávaný pri -20°C pre následnú afinitnú purifikáciu na papaín -sepharóse.

Príklad 4

Purifikácia a charakterizácia rekombinantného ekvistatínu

A. Afinitná purifikácia s použitím papaín-sepharózy:

ml šliamu papaín-sepharózy sa zmieša s 15 ml 0,02 M NaOH na 10 minút. Následne sa šliam aplikuje do 15 ml kolony so sklenenou fritou. Kolona sa premyje 3 x s 30 ml 100 mM Tris pufra, pH = 7,0 a nakoniec s 10 ml 50 mM MES pufra, pH = 6,5 (s prídavkom cysteínu na finálnu koncentráciu 0,6 mg/ml). Supernatant z 1 I bakteriálnej kultúry získanej ako je popísané vyššie (Príklad 3) sa po kvapkách aplikuje na kolonu. Papaín- sepharóza sa potom premýva s 20 ml 50 mM NES pufra, pH = 6,5 (bez cysteínu) a s 50 ml 20 mN Tris pufra, pH = 7,5. Vzorka sa získa elúciou kolony s 20 ml 20 mM Tris pufra, pH = 10,3 (bez adjustácie pH s HCI), 20 % DMSO. Purifikovaný ekvistatin sa dialyzuje proti H₂O a koncentruje za použitia minikoncentratorov Sartricon k dosiahnutiu finálnej koncentrácie 350 μΜ.

B. Stechiometria a inhibičné konštanty pre rekombinantný ekvistatin

V mikrotitračnej doštičke sa spojí 20 μΙ roztoku papaínu (čerstvý roztok 1 mg/ml (Sigma) v MES pufra titrovaný E-64 na stanovenie aktívnej frakcie, obvykle 17 %) s 0 - 80 μΙ so známou bielkovinovou koncentráciou. Pridá sa MES pufra (50 mM MES, pH 6,5, 0,6 mg/ml L-cysteínu, 1 mg/ml BSA frakcie V) na konečný objem 150 μΙ. Zmes sa inkubuje 30 minút pri izbovej teplote a následne sa pridá 50 μΙ roztoku substrátu (60 μΙ 15 mg/ml Z-Phe-Arg-pNA rozpustených v methanole sa zriedi v 940 μΙ MES pufra pred použitím). Doštička sa okamžite umiestni do čítačky mikrotitračných doštičiek a meria pri 405 nm. Odčítané hodnoty až do OD600 hodnoty 0,3 sú lineárne. Zmeny rýchlosti sa použijú na stanovenie aktivity s rastúcimi množstvami inhibítorov. Výsledky sa graficky znázornia a pri stechiometrických koncentráciách je stanovené množstvo disociovaného komplexu na určenie zdanlivo rovnovážnej disociačnej konštanty (Ki). Tieto výsledky určili, že jedna molekula ekvistatínu bude inhibovať približne 1 molekulu papaínu. Zdanlivá rovnovážna disociačná konštanta pre papaín bola stanovená ako 0,6 nN v súlade s dátami publikovanými pre purifikovanú bielkovinu (Lenarcic et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 13899-13903).

Príklad 5

In vitro inhibícia proteázovej aktivity stredného čreva mandelinky zemiakovej

Čreva konečne instarnej fázy lariev mandelinky zemiakovej živené na methyljasmonatom indukovaných rastlinách boli izolované a extrahované v podstate ako je popísané (Bolter a Jongsma (1995) J. Insect Physiol. 41: 10711078). V týchto črevných extraktoch sú už proteázy, ktoré sú citlivé na proteázové inhibítory zo zemiakov, viazané v komplexoch. Zostávajúca proteázova aktivita pozostáva z proteáz necitlivých na zemiakové proteázové inhibítory, ktoré sú indukované ako odozva na methyljasmonatom indukované zemiakové inhibítory. Tieto proteázy sú proteázami, ktoré môžu priniesť u lariev chrobákov necitlivých voči proteázovému inhibítoru ochranu zemiakovej rastliny. Testovali sme veľkú radu inhibitorov cysteínových proteáz na aktivitu špecificky proti týmto indukovaným cysteínovým proteázam necitlivým k zemiakovým proteázovým inhibítorom. Skoro všetky tieto inhibítory boli purifkované v Ústave Jozefa Štefana v Slovinsku. Testovanie ich potenciálu proti mandelinke zemiakovej sa prevádzalo za použitia ako všeobecných bielkovinových substrátov (azokazeín, Tabuľka 2), tak špecifických syntetických substrátov (L-Arg-pNA, Tabuľka 3, pGlu-Phe-Leu-pNA, Tabuľka 4, zPhe-ArgpNA, Tabuľka 5, zArg-Arg-pNA, Tabuľka 6). V špecifických prípadoch boli inhibítory testované v dvoch koncentráciách, ekvimolárne a v prebytku k proteáze, pre získanie indikácie o pevnosti daného komplexu. Väčšina testovaných inhibítorov bola buď neaktívna alebo len slabo inhibičná. Len inhibítory cysteínových proteáz s opakujúcou sa thyroglobulínovou doménou typu I, ktoré boli testované (purifikovaný p41 fragment invariantného reťazca a purifikovaný ekvistatín) boli konzistentne vysoko aktívne proti testovanej endoa exo- proteolytickej aktivite lariev mandelinky zemiakovej (Tabuľky 2-6, Obrázok 4). Je dôležité, že táto trieda inhibítorov bola schopná inhibovať takmer všetku všeobecnú cysteínovo-proteázovú aktivitu. Molekula ekvistatínového peptida a jej funkčné deriváty neboli príliš aktívne proti aktivite cysteínových proteáz podobne amidopeptidázovej. Rekombinantný ľudský stefin A bol vysoko aktívny oproti tomuto typu aktivity. Najlepšia kombinácia inhibítorov pre plnú toxicitu proti mandelinke zemiakovej by teda bola kombinácia ekvistatínu alebo p41 fragmenta invariantného reťazca a inhibítorov podobných stefinu.

Tabuľka 3

Účinky rôznych inhibítorov cysteínových proteáz na všeobecnú proteolytickú aktivitu extrakta čriev lariev mandelinky zemiakovej meranú s azokazeínom

Rodina inhibítorov	Meno	Zbytková	aktivita	v
Cysteínových proteáz		prebytku inhibítora
Cystatíny typu 1.	Ľudský stefín A	90%
	Potkaní stefín A	90%
	Prasačí stefín B	100%
	Prasačí stefín D1	105 %
	Prasačí stefín D2	105%
Cystatíny typu II.	Kurací cystatín	105 %
	Ľudský cystatín C	105%
Cystatíny typu III.	Bovinný kininogén	110%
	Ľudský LMW kininogén	65%
	3. doména ľudského kininogénu	20%
Fytostatíny	Cystatín Chalidonium majus	100%
	Cystatín kravského bobu	75%
	Cystatín šošovice	60%
	Sójový cystatín	65%
	Zemiakový multicystatín	90%
	Bromelainový inhibítor	110%
Domény typu 1. thyroglobulínu	p41 fragment invariantného reťazca	10%
Rastlinný Kunitz CPI	PCPI 6.6	120 %

Tabuľka 4

Účinok rôznych inhibítorov cysteínových proteáz na aminopeptidázovú aktivitu meranú s L-Arg-pNA

	% zbytkovej aktivity
Prebytok inhibítora	Ekvimolárne
Ekvistatín a p41 fragment Invariantného reťazca	75%	85%
Ľudský stefín A	10%	60%
Kininogény	75%	Nestanovené
Fytostatíny z Fabaceae	75%	Nestanovené

Tabuľka 5

Účinok rôznych inhibítorov cysteínových proteáz na špecifickú tripeptidyl-peptidázovú a endoproteázovú aktivitu meranú s pGlu-Phe-Leu-pNA

	% zbytkovej aktivity
Prebytok inhibítora	Ekvimolárne
Ekvistatín a p41 fragment Invariantného reťazca	-5%	10%
Ľudský stefín A	90%	95%
Kininogény	20%	Nestanovené
Fytostatíny z Fabaceae	70%	Nestanovené

Tabuľka 6

Účinok rôznych inhibítorov cysteínových proteáz na širokospektrálnu endoproteázovú aktivitu meranú s Z-Phe-Arg-pNA

	% zbytkovej aktivity
Prebytok inhibítora	Ekvimolárne
Ekvistatín a p41 fragment Invariantného reťazca	20%	30%
Ľudský stefín A	80%	95%
Kininogény	-20 %	Nestanovené
Fytostatíny z Fabaceae	50%	65%

Tabuľka 7

Účinok rôznych inhibítorov cysteínových proteáz na úzkospektrálnu endoproteázovú aktivitu meranú s Z-Arg-Arg-pNA

	% zbytkovej aktivity
Prebytok inhibítora	Ekvimolárne
Ekvistatín a p41 fragment Invariantného reťazca	-5%	20%
Ľudský stefín A	90%	Nestanovené
Kininogény	10%	Nestanovené

Príklad 6

In vitro inhibícia proteázovej aktivity dospelých strapiek západných a minujúcich kvetoviek a konečnej instarnej fázy lariev mandelinky zemiakovej a mandelinky Diahrotica Spp. meraná s FITC - značeným hemoglobínom.

Dospelé strapky západné (Frankliniella occidentalis) a dospelé minujúce kvetovky (Liríomyza trífolii) boli zobrané z kultúry udržovanej na rastlinách chrysantém a kompletné strapky a kvetovky boli homogenizované v extrakčnom pufre (200 mN p-alanín-Hci, pH 3,5) v objeme päťkrát väčšom ako váha hmyzu. Hodnota pH pufra zodpovedala skôr stanovenému pH optimu proteázovej aktivity k hemoglobínu. Larvy konečnej instarnej fázy mandelinky zemiakovej udržované na rastlinách zemiakov ako je popísané v Príklade 5 boli testované na črevnú aspartátovo- proteázovú aktivitu s prípravou celkového črevného extraktu v pufre pH 3, ktorý je optimálny pre aspartátovú proteázu mandelinky zemiakovej (200 mM glycín, pH 3). Čreva boli homogenizované v 100 μΙ pufra na jedno črevo. Larvy tretej instarnej fázy mandelinky Diabrotica udržovanej na kukuričných koreňoch sa použili na vytiahnutie čreva. Desať čriev bolo homogenizovaných v 100 μΙ vody a stočené dvakrát kvôli odstráneniu nerozpustného materiálu. Na enzýmové testy boli použité dva typy pufrov. Jeden s pH 6 predpokladane uprednostňujúci cysteínové proteázy (50 mM MES, pH 6,5, 0,6 mg/ml L-cysteínu) a jeden na detekciu aspartátových proteáz (200 mM glycín, pH 3). Supernatany boli uschované pri -20°.

μΙ extraktu čreva boli spojené s 2 μΙ inhibítora (2 mM pepstatín v methanole, 4 mM E64 vo vode, 2 mg/ml rekombinantného ekvistatína vo vode. Koncentrácia ostatných bielkovinových inhibítorov nebola presne známa). Patričné pufry boli pridané do konečného objemu 100 μΙ. Po pätnásť minútovej preinkubácii bolo pridaných 20 μΙ substrátu (5 mg/ml FITC- hemoglobina) a inkubovaných 30 - 45 minút pri 37°C. Reakcia bola zastavená pridaním 100 μΙ 10 % TCA. Skúmavky boli centrifugované a 100 μΙ supernatanta zmiešaného so 100 μΙ 10 N NaOH bolo merených na fluórimetre k určeniu rozsahu hydrolýzy hemoglobína. Merania bola robené v duplikátoch na jednom (strapky, kvetovky a Diabrotica) alebo troch (mandelinka zemiaková) rôznych extraktoch čriev a líšili sa najviac o +/- 5 %.

Účinky rôznych inhibítorov cysteínových a aspartátových proteáz sú znázornené v Tabuľke 8. Zobrazuje účinky rôznych proteázových inhibítorov (PI) k Pl-necitlivým proteázam strapiek a kvetoviek na chryzantémach, mandeliniek na zemiakoch a Diabrotica na kukurici, pretože indukované PI prítomné v rastlinnom materiále a zožrané daným hmyzom budú prítomné v extrakte v komplexe s vnímavými proteázami.

Proteázová aktivita strapiek môže byť v 92% inhibovaná E64 (PI cysteínových proteáz) a v 16 % pepstatínom (PI aspartátových proteáz) pri pH 3,5, ktoré je optimálne pre všeobecnú proteázovú aktivitu strapiek. Aspartátové proteázy zrejme nie sú dominantné u tohto hmyzu. Invariantný reťazec p41 viedol k 87% inhibicií zatiaľ čo ekvistatín poskytoval 95 % inhibíciu proteázovej aktivity. Dobrými inhibítormi cysteínových proteáz strapiek sú zreteľne ako invariantný reťazec p41 (PI cysteínových proteáz), tak ekvistatín (PI cysteínových/ aspartátových proteáz), aj keď ekvistatín by mohl byť trocha lepší z dôvodov dodatočnej inhibície aspartátových proteáz.

Proteázy minujúcej kvetovky možno plne inhibovať len kombináciou E64 (PI cysteínových proteáz) a pepstatína (PI aspartátových proteáz), (97%). Zemiakový cystatín a Kunitz PCPI8.3 sú obidva inhibítory cysteínových proteáz, ktoré majú schopnosť inhibovať v 63%, zrovanteľných s 73% pre E64. Pridanie ekvistatína k týmto dvom inhibítorom vedie k 92% inhibícii, čo je dokladom toho, že ekvistatín musí mať vedľa inhibičnej aktivity k cysteínovej proteáze kvetovky aj inhibičnú aktivitu k aspartátovej proteáze kvetovky. K optimálnej kontrole kvetovky môže byť potrebné spoločné použitie ekvistatína so zemiakovým cystatínom a Kunitzom PCPI8.3.

Proteázy mandelinky zemiakovej môžu byť pri pH 3 plne (97%) ibhibované kombináciou E64 (24%) a pepstatínu (82 %). Prídavok ekvistatína buď k E64, alebo ku pepstatínu zvýšuje inhibíciu o 42% ( 24 % + 42 % = 66 %) respektíve 12 % (82 % + 12 % = 94 %) čo ukazuje, že ekvistatín inhibuje viac ako 50 % aktivity ako aspartátovej tak aj cysteínovej proteázovej aktivity pri tomto pH. Ekvistatín samotný inhibuje 62% celkovej proteázovej aktivity pri tomto pH. Zdá sa, že čiastočná inhibícia pri pH 3 spolu s takmer úplnou inhibíciou pri pH 6,5 (Príklad 5) je dostatočná na plnú kontrolu tohto hmyzu (Príklad 7).

O mandelinke Diabrotica se vie, že má kombináciu ako cysteínových, tak aj aspartátových proteáz (Gillikin et al. (1992) Árch. Insect Biochem. Physiol. 19: 285-298). Účinky ekvistatína, E64 a pepstatína boli testované pri dvoch rôznych hodnotách pH. Dáta v Tabuľke 8 ukazujú, že ekvistatín takmer úplne inhibuje takmer všetku aktivitu cysteínových a aspartátových proteáz (93% pri pH 6,5 a 98 % pri pH 3) a je dokonca silnejší ako kombinácia E64 s pepstatínom (79 % resp. 89 %). Tieto in vitro výsledky sú dokonca lepšie ako in vitro výsledky s mandelinkou zemiakovou v Príkladoch 5 a 6, a ukazujú, že u ekvistatína možno pri expresií v kukuričných koreňoch očakávať toxicitu k mandelinke Diabrotica.

Tabuľka 8

In vitro inhibičné testy: meranie zbytkovej proteázovej aktivity v extraktoch rožného hmyzu

Inhibitory	Strapka PH 3,5	Kvetovka pH 3,5	Mandelink a Zemiakov á pH 3	Mandelink a Diabrotica pH 6,5	Mandelin ka Diabrotic a pH 3
Kontrola	100%	100 %	100%	100%	100%
E 64	8%	27%	76%	51 %	35%
E 64/Ekvistatín (El)	nestan.	nestan.	34%	29%	8%
Pepstatín	84%	46%	18%	58%	45%
Pepstatín / El	nestan.	nestan.	6%	6%	0%
E64/Pepstatín	Nestan.	3%	3%	21 %	11 %
El	5%	24%	38%	7%	2%
p 41 invariantný reťazec	13%	43%	nestan.	nestan.	nestan.
zem. cystatín	nestan.	73%	nestan.	nestan.	nestan.
PCPI8.3	Nestan.	43%	nestan.	nestan.	nestan.
API	Nestan.	37%	nestan.	nestan.	nestan.
Zem. cystatín/PCPI8.3	Nestan.	8%	nestan.	nestan.	nestan.
zem. cystatín/PCPI8.3/API	Nestan.	7%	nestan.	nestan.	nestan.
zem. cystatín/PCPI8.3/EI	Nestan.	nestan.	nestan.	nestan.	nestan.
cystatín fazule	14%	nestan.	nestan.	nestan.	nestan.

- Rekombinantný Kunitz PCPI8.3 (Stiekema et al. (1987) Plánt. Molec. Biol. 11: 255-263) bol produkovaný v kvasinkách Pichia pastoris a purifikovaný zo supernatanta kultúry katexovou chromatografiou.

= Rekombinantný zemiakový cystatín (zem. cystatín) predstavuje monomer multicystatína klonovaného RT-PCR zo zemiakov cv. Superior a exprimovaného a purifikovaného ako fúzny proteín s glutathion-S-transferázou (Pharmacia).

- Ekvistatín bol buď purifikovaný z morského mäkkýša (Lenarcic et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 13899, Lenarcic et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 12682) (testy strapky a kvetovky), alebo rekombinantný z

E. coli (mandelinka zemiaková a mandelinka Diabrotica).

- Inhibítor aspartátovej proteázy (API) bol purifikovaný zo zemiakov (Kreft et al. (1997) Phytochemistry 44: 1001-1006).

Príklad 7

Toxicita ekvistatína ku larvám mandelinky zemiakovej

Hľuzy zemiakov kultivaru Surprise (Solanum tuberosum) boli naklíčené. Naklíčené hľuzy boli zasadené do 1 I kvetináčov a nechané rásť 3-4 týždne pri 22/18°C, 16/8 hodín rytmusu dňa a noci. Rastliny vysoké 10 - 15 cm sa dali do pohárov s papierovým knotom, na ktorý bolo pipetovaných 2 μΙ methyljasmonátu. Poháre boli okamžite uzavreté parafilmom a dané do klimatizovanej komory s 30°C a trvalým osvetlením. Kontrolné rastliny sa dali do komory s 25°C a 16/8 hodinovým rytmusom dňa a noci. Po jednom dni pri 30°C boli rastliny vybraté z pohárov a umiestené do rovnakej komory ako kontroly. Rastliny boli použité na 3 deň. Pre každý nasledujúci deň kŕmenia boli použité čerstvé spracované rastliny. Toto spracovanie viedlo k vysokým hladinám endogénných PI v rastlinách, na ktoré pôsobil methyl- jasmonát. Vrchná meristema bola oddelená z rastlín a z obidvoch strán potretá 175 μΜ roztokom rekombinantného ekvistatína v 0,3 % agare, získaného zmiešaním 1:1 zásobného 350 μΜ roztoku ekvistatína a 0,6 % vodného agara. Kontroly boli potierané 0,3 % agarom. Agarový roztok bol aplikovaný v koncentrácií 30 μΙ/cm². Knečná koncentrácia na listoch bola odhadnutá na 70 μΜ, čo je ekvivalentom 1,4 mg/g listov. Potrené listy boli umiestené do skúmavky obsahujúcej 0,4% agar a dané na filtračný papier vo vnútri Petriho misky. Na listy bolo umiestených 21 - 26 čerstvo vyliahnutých lariev mandelinky zemiakovej a Petriho miska sa dala do inkubátora nastaveného na 28°C. Každý deň čerstvo natrené listy nahradili staré. 7).

V tabuľkách 9 a 10 sú zhrnuté účinky na rast a mortalitu lariev mandelinky zemiakovej. Z týchto tabuliek je zrejmé, že ekvistatín aplikovaný na kontrolné rastliny s nízkymi hladinami endogénných proteázových inhibítorov je schopný prudko znížiť vývoj a spôsobovať vysokú mortalitu lariev už po 4 dňoch. Aplikácia ekvistatínu na listy obsahujúca vysoké endogénne hladiny PI, indukované predchádzajúcim pôsobením methyl- jasmonátu, však ďalej zosilňuje toxické účinky tohto inhibítora. To potvrdzuje očakávaný synergický účinok tohto inhibítora, pretože je špecificky zameraný na “Pl-necitlivé proteázy“ lariev mandelinky zemiakovej.

Tabuľka 9

Účinok rekombinantného ekvistatína na rast lariev mandelinky zemiakovej

Pôsobenie	Deň 1	Deň 2	Deň 3	Deň 4
Kontrola	n.d.	n.d.	9	13,8
Kontrola + ekvistatín	n.d.	n.d.	0,5	0,7
MeJa - kontrola	n.d.	n.d.	7,5	10
MeJa-kontrola + ekvistatín	n.d.	n.d.	n.g.	n.g.

V jednom experimente bolo testovaných 21 až 26 lariev. Udané sú hmotnosti v mg/larva. n.d. znamená nebolo stanovené n.g. znamená nerastú alebo nežijú

Tabuľka 10

Účinok rekombinantného ekvistatína na percentnú mortalitu lariev mandelinky zemiakovej

Pôsobenie	Deň 1	Deň 2	Deň 3	Deň 4
Kontrola	0	0	0	0
Kontrola + ekvistatín	0	10	52	76
MeJa - kontrola	0	0	0	0
MeJa-kontrola + ekvistatín	’o	23	77	92

V jednom experimente bolo testovaných 21-26 lariev.

Príklad 8

In vivo účinok ekvistatína na ovipozíciu strapiek

Vzorka 142 μΜ rekombinantného ekvistatína purifikovaného tak, ako je popísané v príklade 4 bol testovaný na aktivitu proti strapkám. Vzorka bola okyslená Hcl na pH 3 pre stabilizáciu ekvistatínovej bielkoviny. Kontroly obsahovali kyslú vodu alebo 2,5 mg/ml BSA rozpusteného v okyslenej vode. Ovipozičná rýchlosť samičiek strapiek bola testovaná použitím takzvaných Muraiho klietok. V stručnosti: Plexisklové trubice uzavrené na boku jemnou gázou boli inokulované 10 samičkami a včelím peľom. Trubice boli uzavrené parafilmom a na parafilm bolo umiestnených 300 μΙ kvapaliny. Kvapalina bola uzavretá druhou vrstvou parafilmu. Peľ a kvapalina vzorky boli menené každý deň, dva dni. Vajíčka znesené do kvapalinovej vzorky boli spočítané v deň 2.

Tabuľka 11

Ovipozičná rýchlosť dospelých samičiek 2 dni po tom, čo boli umiestnené na rôznu potravu

Potrava	Vajíčka na dospelú samičku na deň	Relatívne percento
BSA	1,8	100%
Voda	1,5	83%
Ekvistatín	0,3	17%

Príklad 9

Modifikácia ekvistatínového génu ku zlepšeniu expresie v rastlinách.

Ekvistatínová cDNA obsahuje v kódujúcej oblasti niekoľko potenciálnych rastlinných polyadenylačných signálov, motívy nestability mRNA a suboptimálne využitie kodónov na expresiu v rastlinách. Na zlepšenie hladiny génovej expresie v rastlinách môžu byť tieto motívy odstránené a kodóny môžu byť optimalizované riadenou mutagenézou bez zmeny primárnej bielkovinnej sekvencie. Nižšie je udaný príklad modifikácii potrebných na získanie zlepšenej génovej expresie v zemiakoch. Horné vlákno predstavuje kódujúcu časť cDNA klonu, pod ktorým je uvedená navrhovaná modifikácia cDNA sekvencie a pod tým je udaná kódovaná bielkovinná sekvencia s použitím jednopísmenových kódov pre aminokyselinové zbytky.

ATGGCTCTTÄGCCAAAACCAAGCCA.AGTTľTCCAAAGGATTCGTCGTGATGATTTGG G G G

K A L S Q N C A X r S K C- F V V í-i I W

GTAC'TATTCATTGCTTGTGCTATAACTTCAACTGAAGCTAGTCľTAACCAAATGCCAACAG C G

-13 VLFIACAITSTEASLTKCQQ -1 +1

120 CTCCAGGCCTCGGCTAACAGTGGTCTGATAGGTACTTATGTACCACAATGCAAAGÄAACG G T T T

LOASANSGLIGTYVPQCKST

180 GGAGAGTTCGAAGAAAAACAATGCTGGGGATCGACTGGTTACTGTTGGTGTGTGGATGAA T G T

GEFEEKQCWGSTGYCWCVDE

- 62 240 G ATGGAAAAGAGATTCTAGGAACGAAGATCCGTGGATCTCCGGATTGCAGCCGCAGAAAA TA A C T

DGXEILGTKIRGSPDCSR?. K

300 GCCGCGľTAACACrrTGCC AGATGÄTGCAAGCCATC ATTGTT AATGTCCCTGGT7GGTGT T C G

A A L T L C QMHQAI I V N V P G W C

360 GGCCCTCCATCGTGTAAAGCTGACGGCAGTTrrGACGAGGTTCAGTGCTGCGCAAGTAÄT A A

GPPSCKADGSFDEVQCCASN

20 GGAGAATGCTACTGTGTGGATÄAGAAAGGAAAAGAACTTGAAGGCACAAGACAACAGGGA

103 GECYCVDKKGXELEC 'fRQQG

430 AGGCCAACCTGCGAAAGACACCTAAGCGAATGCGAGGAAGCTCG.AATCAAGGCGCATTCA

G T A

123 R P T C E P. HLS ECEEARI KAKS

540 AACAGTCTTCGTGTTGAGATGTTCGTGCCAGAGTGTTTAGAAGATGG ATCATAT AACCCA T C T

143 NSLRVEMFVPSCLEDGSYNP •

600 GTACAGTGCTGGCCTAGCAC AGGATACTGTTGGTGCGTCGATGAAGG AGGGGTAAAGGTA T

163 VQCMPSTGYCMCVDEGGVKV

660 CCAGGTTCCGATGTCAGATTTAAACGCCCCACATGCTAA C C T

183 P G S D V R F X R P T C --199

Príklad 10

Konštrukcia rastlinných vektorov pre expresiu ekvistatína

Zemiakový Cab promótor (Nap et al. (1993) Plánt. Mol. Biol. 23: '605612) bol amplifikovaný z plazmidu pPPG pomocou PCR s použitím primerov P1-POTCAB a P2-POTCAB. Podobne bol Nos terminátor amplifikovaný z plazmidu pPPG pomocou PCR s použitím primerov NOS-TERM-DN a NOSTERM-UP. Promótorový a terminátorový fragment boli štiepené reštrikčnými enzýmami EcoRI a Sací a iigované do EcoRI digerovaného vektora pUCAP (Van Engelen et al. (1995) Transgenic Research 4: 288-290). Správny kloň bol vybraný a sekvenovaný. Tento kloň, pUCCABI bol digerovaný Ncol a Bglll a použitý na subklonovanie ekvistatínovej kódujúcej oblasti, ktorá bola amplifikovaná PCR z plazmidu pB3-ekvistatin s použitím primerov EQUISTATDN a EQUISTAT-UP, a rovnako štiepena Ncol a Bglll. Bol vybraný správny kloň a inzert ekvistatínovej cDNA klona bol sekvenovaný. Správny kloň, pUCCABIekvistatín, bol digerovaný EcoRI. EcoRI fragment obsahujúci kazetu expresie ekvistatinu bol ligovaný do rastlinného vektora pBINPLUS (Van Engelen et al. (1995) Transgenic Research 4: 288-290), ktorý bol rovnako digerovaný EcoRI. Bol vybraný správny kloň. Tento kloň, pCAB1-ekvistatín, bol elektroporovaný do buniek elektrokompetentného Agrobacterium tumefaciens AGL- 0. Pozitívne klony boli selektované na LB médiu obsahujúcom 100 mg/l kanamycína.

Tabuľka 12

PCR-primery použité k PCR amplifikácii

Meno DNA

P1-POTCAB:

P2-POTCAB:

NOS-TERM-DN:

NOS-TERM-UP:

EQUISTAT-DN:

EQUISTAT-BGL:

5'-GGGGGGGAATTCCTGACCTCTTACTAACTCG

S'-GGGGGGGAGCTCAGATCTTGCCATGGTTTTTCTTCTCTTTTTTTTTG ô’-AGATCTGAGCTCTCGTTCAAACATTTGGCA

5'-AAGCTTGAATTCGATCTAGTAACATAG

5’-GGGGCCATGGCTCTTAGCCAAAAC

5’-GGGGGAGATCTTTAGCATGTGGGGCCTTTAAA

Príklad 11

Transformácia zemiakov rastlinnými vektormi obsahujúcimi ekvistatínovú cDNA

V 1 deň bola naštartovaná kultúra Agrobacterium tumefaciens AGL-0 obsahujúca binárny vektor pCAB1 -ekvistatín v 50 ml LB média obsahujúceho 50 mg/l kanamycína a pretrepávaná dva dni pri 28°C. V deň 2 boli vnútorné uzlinky z in vitro kultúry zemiakového kultivaru Desiree linie V narezané na 0,5 až 1 cm kúsky a umiestené do R3B média (30 g/l sacharózy, 4,7 g/l Murashigeho a Skoogových solí, pH 5,8 (KOH), 8 g/l čisteného agaru, 2 mg/l NAA a 1 mg/l BAP), ktoré boli prekryté 2 sterilnými filtračnými papiermi, dopredu namočenými 2 ml PACM média (30 g/l sacharózy, 4,7 g/l Murashigeho a Skoogových solí, 2 g/l kaseinového hydrolýzátu, pH 6,5 (KOH), 1 mg/l 2,4-D a 0,5 mg/l kinetína). Misky boli uzavrené páskou parafilmu a inkubované cez noc pri 24°C za režimu 16 hodín svetla. 3 deň bola do sterilných Petriho misiek obsahujúcich tieto explantáty priliata kultúra A.Tumefaciens. Po 5 - 10 minútach boli explantáty vybrané z kultúry, umiestené na sterilný filtračný papier kvôli odstráneniu prebytku Agrobaktéria a umiestené späť na misky obsahujúce R3B médium po tom, čo bol najprv odstránený vrchný filtračný papier (a druhý ponechaný). Misky s explantátmi boli ďalej inkubované pri 24°C a 16 hodinami svetla do dňa 5, keď boli explantáty prenesené do misiek obsahujúcich ZCVK médium (20 g/l sacharózy, 4,7 g/l Murashigeho a Skoogových solí, pH 5,8 (KOH), 8 g/l čisteného agaru, 1 mg/l zeatínu, 200 mg/ml vancomycínu, 100 mg/l kanamycínu, 200 mg/l claforanu). V deň 19 a následne každé 3-4 týždne boli explantáty prenesené do nového ZCVK média. Keď sa objavili klíčky, boli klíčky prenesené do Murashigeho a Skoogovho média obsahujúceho 20 % sacharózy (MS20). Po zakorenení boli rastliny prenesené do skleníka.

Príklad 13

Biotesty s larvami mandelinky zemiakovej na transgénnych rastlinách zemiakov exprimujúcich ekvistatín

Ekvistatínová cDNA sekvencia, optimalizovaná pre expresiu v rastlinách zemiakov, bola klonovaná do vektora pCAB1 a transformovaná do línie V. Na rezistenciu voči čerstvo vyliahnutým larvám mandelinky zemiakovej bolo testovaných 8 rôznych primárnych transformantov. Z mladých rastlín boli oddelené listy, vložené do skúmavky obsahujúcej 0,4 % vodný čistený agar a umiestené do Petriho misky s filtračným papierom. Šesť náhodne vybraných čerstvo vyliahnutých lariev bolo umiestňovaných na jeden list. Listy boli vymieňané za čerstvé po dvoch dňoch. V deň 3 boli merané hmotnosti každej larvy jednotlivo. Tabuľka 13 poskytuje výsledky ukazujúce, že 3 zo 6 transformantov významne retardujú rast lariev. Niektorým rastlinám chýba rezistencia najpravdepodobnejšie kvôli nízkej expresii, spôsobenej suboptimálnou inzerciou T-DANN do rastlinného genómu. Rastliny boli príliš mladé na ďalšie predlžovanie pokusu pre chýbajúci listový materiál, ale bolo pozorované, že na pCAB1-EIM-1 boli všetky larvy na 4 deň mrtvé. Prítomnosť ekvistatínovej bielkoviny bola potvrdená „Western“ analýzou a odhadnutá v transgénoch, ktoré vykazovali rezistenciu na > 0,1 %.

Tabuľka 13

Výsledky biotestov na transgénnych rastlinách zemiakov transformovaných ekvistatínovým génom optimalizovaným pre expresiu v rastlinách

Rastlina ^a	Larválna hmotnosť ^Ď
Línia V	9,93 a
PBINPLUS	10,67 a
pCAB1 - EIM-1	4,03 b
pCAB1 - EIM-2	5,45 b
pCAB1 - EIM-3	8,77 a
pCAB1 - EIM-6	9,92 a
pCAB1 - EIM-7	8,55 a
pCAB1 - EIM-8	5,85 b
pCAB1 - EIM-9	9,18 a
pCAB1 -EIM-10	11,15a

^a Testované rastliny boli: Línia V, in vitro rastlina prenesená do skleníka súčasne s transformantami, pBINPLUS, transformat s prázdnym vektorom bez kazety, promótor gén, pCAB1-10, prvých osem transformantov línie V s optimalizovaným ekvistatínovým génom pod kontrolou CAB promótora.

^b Priemerná larválna hmotnosť (mg) šiestich lariev. Písmenkový kód za hmotnosťou lariev ukazuje významnosť stanovenú pomocou ANOVA.

Príklad 13

Izolácia homologických sekvencií z iných organizmov ku nájdeniu alebo generovaniu vylepšených inhibítorov.

Šesť aminokyselinových zbytkov Gly-Tyr-Vys-Trp-Cys-Val, ktoré sú silne konzervované medzi inhibítormi cysteínových a aspartátových proteáz s opakujúcou sa thyroglobulínovou doménou typu I, či už z ľudského, lososieho a mäkkýšieho zdroja, možno použiť ku izolácii homologických sekvencií so zlepšenou špecifitou. K týmto sekvenciam môžu byť navrhnuté degenerované PCR primery na amplifikáciu genomických alebo cDNA fragmentov, ktoré možno využiť ako sondy na izoláciu celých kódujúcich sekvencií, napríklad z cDNA knihovní alebo pomocou 5' RAČE experimentov z purifikovanej mRNA. Ako nový zdroj opakujúcich sa thyroglobulínových domén typu I možno použiť akýkoľvek organizmus. Zbierku génov možno použiť na experimenty s „prehadzovaním“ génov ku izolácií nových špecifit.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob ochrany rastliny alebo časti menovanej rastliny voči hromadnému napadnutiu hmyzom alebo červom, jedným alebo viacerými druhmi hmyzu alebo nematódov, ktoré majú tráviace cysteinové alebo aspartátové proteázy, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje prezentáciu inhibičného množstva inhibítora cysteínovej alebo aspartátovej proteázy, vybraného zo skupiny bielkovín, ktoré obsahujú aspoň jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I, k lokusu, kde má byť menovaný hmyz alebo nematóda(y) kontrolovaná(é).
2. Spôsob podľa nároku Vyznačujúci sa tým, že hmyz má cysteínové proteázy necitlivé na inhibítory cysteínových proteáz odvodené z hostiteľskej rastliny.
3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že hmyz je jedným alebo viacerým z mandelinky zemiakovej, mandelinky Diabrotica, strapky alebo minujúcej kvetovky,
4. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že nematódy sú červy cysty alebo koreňových uzlíkov.
5. Spôsob podľa ktorého koľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa t ý m , že bielkovina obsahujúca aspoň jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I, je ľudsky p41 fragment invariantného reťazca alebo jeho funkčný derivát alebo homológ.
6. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa t ý m , že bielkovina obsahujúca aspoň jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I, je izolovaná z morského mäkkýša Actinia equina a má aminokyselinovú sekvenciu udanú na obr. 1 alebo jej funkčný derivát alebo homológ.
7. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa t ý m , že bielkovina obsahujúca aspoň jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I, je bielkovina izolovaná z vajíčok lososa alebo jej funkčný derivát alebo homológ.
8. Spôsob podľa ktorého koľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa t ý m , že zahrňuje zavedenie kódujúcej sekvencie do genóma rastliny, pričom zavedená sekvencia kóduje bielkovinu, ktorá obsahuje aspoň jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I s promótorovou sekvenciou aktívnou v rastline pre spôsobenie expresie menovanej bielkoviny v hladinách, ktoré poskytuje hmyz alebo nematóda kontrolujúca množstvo menovanej bielkoviny.
9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrňuje kroky:

a) Kultivácia buniek alebo tkaniva z danej rastliny

b) Zavedenie do buniek alebo tkaniva aspoň jednu kópiu génu kódujúceho bielkovinu obsahujúcu aspoň jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I

c) Regeneráciu rezistentnej celej rastliny z kultúry buniek alebo tkanív.
10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrňuje krok pohlavnej klonovanej reprodukcie celej rastliny takým spôsobom, že aspoň jedna kópia sekvencie kódujúcej bielkovinu, ktorá obsahuje aspoň jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I s promótorovou sekvenciou aktívnou v rastline, je prítomná v bunkách potomstva reprodukcie.
11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrňuje kroky:

a) Výber plodnej rastliny, rezistentnej voči hmyzu alebo nematódam, pripravenej podľa spôsobu nároku 10

b) Pohlavné kríženie tejto rastliny rezistentnej voči hmyzu alebo nematódam s rastlinou podliehajúcou hmyzu alebo nematódam z podliehajúcej variety

c) Získanie reprodukčného materiálu z potomstva krížením a

d) Raôt rezistentných rastlín z tohoto reprodukčného materiálu.
12. Spôsob podľa nároku 11 na udelenie rezistencie voči hmyzu alebo nematódam v podstate homozygotná populácia rastlín podliehajúcej variety, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrňuje kroky opakovaného

a) Spätného kríženia potomstva rezistentného voči hmyzu alebo nematódam s v podstate homozygotnou populáciou rastlín podliehajúcou hmyzu alebo nematódam z podliehajúcej variety, a

b) Selekcie na expresiu ako rezistencie voči hmyzu alebo nematódam, tak na iné charakteristiky podliehajúcej variety medzi potomstvom spätného kríženia, pokiaľ nie je v potomstve prítomné žiadúce percento charakteristík podliehajúcej variety spolu s rezistenciou voči hmyzu alebo nematódam.
13. Transgenná rastlina a jej pohlavné potomstvo rezistentné voči napadnutiu jedným alebo viacerými druhmi hmyzu alebo nematód, ktoré majú tráviace cysteínové alebo aspartátové proteázy, vyznačujúce sa t ý m , že menovaná rastlina exprimuje hmyz alebo nematódy kontrolujúce množstvo bielkoviny obsahujúce aspoň jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I.
14. Biologicky funkčný vehikel expresie vyznačujúci sa tým, že obsahuje promótor účinný v riadení pod ním zaradené sekvencie v rastlinných bunkách, DNA kódujúcu oblasť, ktorá kóduje expresiu bielkoviny zloženej z aspoň jednej opakujúcej sa thyroglobulínovej domény typu I v rastlinných bunkách a terminačnú sekvenciu účinnú v terminácii transkripcie alebo translácie produktu genetickej konštrukcie v rastlinných buňkách, pričom genetická konštrukcia je účinná v expresii hmyz kontrolujúcého množstva bielkoviny obsahujúcej aspoň jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I v bunkách rastliny.
15. Biologicky funkčný vehikel expresie podľa nároku 14, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že DNA izolát kóduje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 1 alebo jej funkčný derivát.
16. Biologicky funkčný vehikel expresie podľa nároku 14, vyznačujúci sa t ý m , že vehikel expresie je pCAB1.
17. Hostiteľská bunka, vyznačujúca sa tým, že je transformovaná biologicky funkčným vehiklom expresie z hoci ktorého z nárokov 14 až 16.
18.Transgenná hostiteľská bunka vyznačujúca sa tým, že DNA sekvencia je riadená promótorom účinným v riadení pod nim zaradené kódujúce sekvencie v rastlinnej bunke, DNA sekvencia kóduje oblasť pre expresiu bielkoviny zloženej z aspoň jednej opakujúcej sa thyroglobulínovej domény typu I v rastlinných bunkách a terminačná sekvencia je účinná v terminácii transkripcie a translacie produktu genetickej konštrukcie v rastlinných bunkách, pričom genetická konštrukcia je účinná v expresii hmyz kontrolujúcich množtvách bielkoviny zloženej z aspoň jednej opakujúcej sa thyroglobulínovej domény typu I v bunkách rastliny na kontrolu jedného alebo viacerých druhov hmyzu majúceho tráviace cysteínové proteázy.
19. Spôsob podľa ktorého koľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa t ý m , že na lokus sa aplikuje poľnohospodársky produkt obsahujúci nosič a hmyz alebo nematódy kontrolujúce množstvo, alebo množstvo bojujúce s hmyzom alebo nematódami, inhibítorov cysteínovej proteázy.
20. Poľnohospodársky prostriedok vyznačujúci sa tým, že obsahuje ako aktívnu zložku hmyz alebo nematódy kontrolujúce množstvá, alebo množstvá bojujúce s hmyzom alebo nematódami, inhibítory cysteínovej proteázy ako je definovaný v nárokoch 1,5,6 alebo 7.
21. Inhibítorový peptid opakujúcej sa thyroglobulínovej domény typu I s aktivitou voči aspartátovým proteázam vyznačujúci sa tým, že menovaný peptid má aminokyselinovú sekvenciu v rozsahu od aminokyselinových pozícii 68- 199 ekvistatína z obr. 1, alebo modifikovaný inhibítorový peptid aspartátových proteáz s opakujúcou sa thyroglobulínovou doménou typu I, pričom menovaný modifikovaný peptid obsahuje peptid majúci podstatnú aminokyselinovú identitu s aminokyselinovými pozíciami

68 - 199 ekvistatína, skrátenie aminokyselinových pozícii 68 -199 ekvistatína alebo skrátenie peptida majúceho podstatnú aminokyselinovú identitu s aminokyselinovými pozíciami 68 - 199 ekvistatína a pričom je modifikovaný peptid funkčne ekvivalentný menovaným aminokyselinovým pozíciám 68 -199 ekvistatína v inhibičnej aktivite aspartátovej proteázy.
22. Spôsob ochrany rastliny alebo časti menovanej rastliny voči hromadnému hmyziemu alebo červiemu napadnutiu jedným alebo viacerými druhmi hmyzu alebo nematód, ktoré majú tráviace aspartátové proteázy, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje prezentáciu inhibičného množstva inhibítora aspartátovej proteázy, ako je definovaný v nároku 21, k lokusu, kde má byť menovaný hmyz alebo nematóda(y) kontrolovaná(é).
23. Spôsob ochrany rastliny alebo časti menovanej rastliny voči hromadnému hmyziemu alebo červovému napadnutiu jedným alebo viacerými druhmi hmyzu alebo nematód, ktoré majú tráviace cysteínové a aspartátové proteázy, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje prezentáciu inhibičného množstva inhibítora aspartátovej proteázy, ako je definovaný v nároku 21, a inhibítora cysteínovej proteázy, vybraného zo skupiny bielkovín, ktoré obsahujú aspoň jednu opakujúcu sa thyroglobulínovú doménu typu I, k lokusu, kde má byť menovaný hmyz alebo nematóda(y) kontrolovaná(é).