DE602004007250T2

DE602004007250T2 - Verfahren für volumen mit hohem durchsatz bei der fraktionierung von biomolekülen durch chromatographische systeme

Info

Publication number: DE602004007250T2
Application number: DE602004007250T
Authority: DE
Inventors: Marie Bendix Hansen; Allan Otto Lihme
Original assignee: Upfront Chromatography AS
Current assignee: Upfront Chromatography AS
Priority date: 2003-03-21
Filing date: 2004-03-19
Publication date: 2008-02-28
Anticipated expiration: 2024-03-20
Also published as: DE602004007250D1; EP1605772A1; NZ542956A; US20070092960A1; EP1605772B1; WO2004082397A1; ATE365463T1; DK1605772T3; AU2004222627A1; AU2004222627B2

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein chromatographisches Verfahren in industrieller Größenordnung zur Fraktionierung und Isolierung von Bio-Molekülen aus Fluiden, z. B. Proteinen aus Milch und Molke, auf kosteneffiziente Weise. Das Verfahren lässt die Verarbeitung von großen Mengen von Fluiden in kurzer Zeit und zur verbesserten Adsorbens-Effizienz mittels des Betreibens des Verfahrens bei hohen Temperaturen und hohen Durchflussgeschwindigkeiten zu.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Im Allgemeinen steht eine sehr breite Palette von unterschiedlichen chromatographischen Verfahren zur Verfügung für die Fraktionierung und/oder Isolierung in industrieller Größenordnung von biologischen Molekülen, wie z. B. Proteinen, Lipiden, Sacchariden, Lipoproteinen, Polynukleotiden, DNA, RNA, Plasmiden, Viren, Zellen und Zellbestandteilen.
Bei der Verwendung von chromatographischen Verfahren für die Produktion in industrieller Größenordnung sind die Produktionseffizienz und die wirtschaftlichen Konsequenzen eine Frage von gründlichen Überlegungen. Es wurden viele Versuche vorgenommen, um die Effizienz von chromatographischen Verfahren zu verbessern, z. B. durch das Bereitstellen von Adsorbens-Partikeln in kleineren Größen, die Vergrößerung der Oberfläche des Adsorbens-Partikels, so dass die adsorbierende Kapazität des Adsorbens gegenüber einem Bio-Molekül verbessert wird.
Dennoch besteht immer noch ein Bedarf an der Verbesserung der Effizienz von chromatographischen Verfahren für die Produktion in industrieller Größenordnung. Insbesondere kann eine höhere Produktivität bei der Isolierung oder Fraktionierung von Bio-Molekülen aus Fluiden mit geringem Gehalt der Ziel-Bio-Moleküle erforderlich sein. Z. B. ist die Konzentration von Laktoferrin in entrahmter Kuhmilch üblicherweise gering, im typischen Fall zwischen 80 und 200 mg/l, abhängig z. B. vom Pasteurisierungsverfahren und der weiteren Vorbehandlungshistorie der entrahmten Milch.
Damit ist ein Verfahren zur Erhöhung der Produktivität bei der Fraktionierung und der Isolierung des Laktoferrins von Milch oder Molke von besonderem Interesse. WO 02/096215 bezieht sich auf ein Verfahren zur Fraktionierung von Laktoferrin aus Milch oder Molke unter Verwendung von Durchflussgeschwindigkeiten von rund 200 bis 900 cm/Std. Darüber hinaus ist die Fraktionierung von Immunoglobulinen von Interesse. WO 98/08603 bezieht sich auf ein Verfahren zur Isolierung von Immunoglobulinen. Herkömmlicherweise wurden diese Methodologien unter Verwendung von Temperaturen in einem Bereich von rund 10°C durchgeführt.
In einem industriellen Umfeld für die Produktion von Bio-Molekülen, z. B. für die Produktion von Lebensmitteln oder Lebensmittelbestandteilen und Bio-Pharmazeutika, gibt es einen unabdingbaren Bedarf an einer sorgfältigen Kontrolle der Mikrobiologie zwecks Verhinderung von Kontamination und Abbau des Ziel-Biomolekül-Produkts. In vielen Fällen ist das Biomolekül-Ziel darüber hinaus eine empfindliche Substanz, z. B. ein Enzym oder anderes Protein oder Peptid, ein Polynukleotid, ein Viruspartikel oder eine andere, leicht abbaubare Substanz, die bei erhöhten Temperaturen nur eine begrenzte Stabilität aufweist.
Daher besteht eine allgemeine Notwendigkeit, die Verarbeitungstemperaturen unter 10–15 Grad Celsius zu halten, da solche niedrigen Temperaturen im Allgemeinen das mikrobielle Wachstum inhibieren, während sie gleichzeitig das Risiko des Verderbens des Ziel-Biomoleküls minimieren.
Chromatographische Adsorptionsverfahren sind allgemein dafür bekannt, in der Lage zu sein, sich an einen großen Bereich von Verarbeitungstemperaturen anzupassen, und es ist in dem Fachbereich wohl bekannt, dass erhöhte Betriebstemperaturen die Massentransferkinetik eines chromatographischen Systems verbessern. Damit werden hohe Betriebstemperaturen häufig in analytischen HPLC-Säulen für die Analyse von Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht eingesetzt.
In einem industriellen Umfeld mit der Notwendigkeit zur Bekämpfung des mikrobiellen Wachstums ist es jedoch nicht optimal, das chromatographische Adsorptionsverfahren in einem Temperaturintervall zu betreiben, in dem gemeine Mikroorganismen rasch wachsen. Es gibt auch einen Nachteil im Bereich des chromatographischen Adsorptionsverfahrens gegenüber dem Betreiben des chromatographischen Adsorptionsverfahrens bei hohen Temperaturen, da das Ziel-Biomolekül bei diesen hohen Temperaturen ein erhöhtes Risiko des Abbaus, der Oxidation, der Denaturierung oder einer anderen Form der Beschädigung aufweist. Ein wichtiger Nachteil bei den bisher im großen Maßstab angewendeten chromatographischen Adsorptionsverfahren in diesem Zusammenhang ist, dass die machbare Durchflussgeschwindigkeit durch die Säule aufgrund der physikalischen Einschränkungen von typischen gepackten Bett-Adsorptionssäulen in Bezug auf einen erhöhten Rückdruck bei hohen Durchflussgeschwindigkeiten, Kompression und schlechter Adsorptionseffizienz bei hoher Durchflussgeschwindigkeiten sehr niedrig war. Je höher die Größenordnung des Betriebs, desto problematischer werden die erwähnten Nachteile sein.
Aufgrund der physikalischen Einschränkungen einer gepackten Bett-Adsorptionssäule wird eine Erhöhung der Betriebstemperatur keine erhebliche Erhöhung der betrieblichen Durchflussgeschwindigkeit zulassen ohne eine sehr erhebliche Erhöhung des Rückdrucks über der Säule, was bei vielen kommerziellen Produktionsanwendungen in industrieller Größenordnung unzulässige Kosten verursachen würde.
Die Forscher berichten hierin von einem Verfahren zur erheblichen Verbesserung der Produktivität von chromatographischen Verfahren in industrieller Größenordnung durch das Bereitstellen von Mitteln für den Betrieb der chromatographischen Verfahren mit sehr hohen Durchflussgeschwindigkeiten bei gleichzeitiger Beibehaltung einer hochgradig effizienten Adsorption und der Integrität des Bio-Moleküls unter Temperaturbedingungen, die mikrobielles Wachstum inhibieren. Damit können solche Verfahren eine kosteneffizientere Fraktionierung und/oder Isolierung von interessanten Bio-Molekülen zulassen.
Das Patent 5596082 legt ein industrielles Verfahren für die Isolierung von Laktoperoxidase und Laktoferrin aus Milch und Milchprodukten mit einer gepackten Bettchromatographie unter Verwendung eines starken Kationenaustauschers (SP Sepharose Big Beads von Amersham Biosciences) offen. Die für das Verfahren beschriebenen chromatographischen Perlen haben eine durchschnittliche Partikelgröße in der Größenordnung von 100–300 Mikronen und es können Arbeitsdurchflussgeschwindigkeiten in der Größenordnung von 2000–3000 cm/Std. verwendet werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein chromatographisches Verfahren, das in der Lage ist, sehr große Volumen von bio-molekülhaltigen Fluiden in kurzer Zeit zu verarbeiten und die fähig sind, eine hohe Produktivität zu bieten und dabei gleichzeitig eine hohe Reinheit und Integrität des vom Verfahren isolierten biologischen Moleküls zu erreichen. Dies kann durch das Betreiben von chromatographischen Verfahren in einer Kombination von hohen Durchflussgeschwindigkeiten und hohen Temperaturen erfolgen.
Damit bezieht sich ein primärer Aspekt der Erfindung auf ein allgemeines Verfahren zur Fraktionierung und/oder Isolierung von einem oder mehreren Bio-Molekülen) aus einem Bio-Moleküle enthaltenden Fluid, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) wahlweise Einstellung des pH-Wertes des bio-molekülhaltigen Fluids;
b) Veranlassung der Temperatur des bio-molekülhaltigen Fluids, auf mindestens 40°C zu bringen;
c) Anbringung einer Menge des bio-molekülhaltigen Fluids mit einer Temperatur von mindestens 40°C auf eine chromatographische Säule, z.B. einer expanded Bett-Adsorptionssäule, die ein Adsorbens umfasst, wobei die expanded Bettsäule mit einer linearen Strömungsgeschwindigkeit von mindestens 1500 cm/Stunde betrieben wird;
d) wahlweises Waschen der Säule;
e) Eluierung von mindestens einem Bio-Molekül vom Adsorbens.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht im Bereitstellen eines verbesserten Verfahrens zur Fraktionierung und/oder Isolierung in industrieller Größenordnung von Proteinen, wie z. B. Laktoferrin, aus geeigneten Körperflüssigkeiten oder davon abgeleiteten Fluiden, unter Einschluss von Milch und Molke.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Forscher der vorliegenden Erfindung erbringen hierin den Nachweis dafür, dass die Kombination von höheren Betriebstemperaturen und einer hohen Durchflussgeschwindigkeit, die auf das Laden von bio-molekülhaltigen Fluiden auf eine chromatographische Säule erfolgt, die adsorptive Kapazität und Produktivität des Adsorbens der chromatographischen Säule erheblich verbessert, während sie gleichzeitig das mikrobielle Wachstum inhibiert und das Bio-Molekül intakt lässt. Wie aus dem Beispiel 1 abgeleitet werden kann, führt das Betreiben eines chromatographischen Verfahrenes bei einer Temperatur von 50°C anstatt der herkömmlichen 10°C zur Verdopplung der adsorbierenden Kapazität des Adsorbens, d. h. der Menge (g) an auf 1 l Adsorbens adsorbiertem Laktoferrin wurde verdoppelt. Darüber hinaus erhöht sich beim Betreiben des chromatographischen Verfahrens bei 50°C und bei höheren Durchflussgeschwindigkeiten als den konventionellen Durchflussgeschwindigkeiten (von 1500 cm/Std. auf 3000 cm/Std.) die Menge des bio-molekülhaltigen Fluids, die auf die Säule geladen werden kann, erheblich, und zwar bei gleichzeitigem Erreichen derselben hohen Adsorbenskapazität (Beispiel 2). Damit erhöht sich die Produktivität bei der Erhöhung der linearen Durchflussgeschwindigkeit während des Ladens des bio-molekularhaltigen Fluids auf die Säule. Die Produktivität kann als die Menge des Bio-Moleküls gesehen werden, die auf 1 Liter Adsorbens in 1 Stunde adsorbiert werden kann. Wie aus Beispiel 3 ersichtlich, wird die Verfahrendauer beim Betreiben des chromatographischen Verfahrenes bei hohen Temperaturen, wie z. B. 50°C, in Verbindung mit einer höheren linearen Durchflussgeschwindigkeit, wie z. B. 2100 cm/Std., spürbar reduziert.
Durch analytische Standardverfahren, wie z. B. Größen-Ausschlusschromatographie und Natrium-Dodecyl-Gelelektrophorese, konnte weder ein Abbau noch eine Denaturierung der Laktoferrinmoleküle festgestellt werden. Die bei den hohen Temperaturen angewendete sehr hohe Durchflussgeschwindigkeit soll aufgrund der kurzen Zeit, die vom Heizen auf die Zieltemperatur vergeht, bis das Bio-Molekül an dem chromatographischen Adsorbens adsorbiert wird (eine Zeitspanne von wenigen Sekunden), das zu einer geringeren Beeinträchtigung des Laktoferrin-Bio-Moleküls führen.
Da die chromatographische Adsorption als ein expanded Bett-Adsorptionsverfahren durchgeführt wurde, gab es keine erhebliche Erhöhung des Rückdrucks über dem Adsorbensbett, der von der höheren Durchflussgeschwindigkeit verursacht wurde. Dies steht im krassen Widerspruch zu dem, was bei einer gepackten Bett-Adsorptionssäule mit derselben bindenden Effizienz der Fall wäre.
Damit scheint die Kombination von hohen Temperaturen und hohen Durchflussgeschwindigkeiten ein überraschend viel versprechender Ansatz bei der Erhöhung der Produktivität von chromatographischen Systemen, insbesondere bei bestimmten Systemen von industrieller Größenordnung zu sein, in denen jede Kostenreduzierung von großer kaufmännischer Bedeutung sein kann.
Dementsprechend bezieht sich die Erfindung in einem primären Aspekt auf ein Verfahren zur Fraktionierung und/oder zur Isolierung von einem oder mehreren Bio-Molekül(en) von einem bio-molekülhaltigen Fluid, umfassend die folgenden Schritte:

a) wahlweise Einstellung des pH-Wertes des bio-molekülhaltigen Fluids;
b) Veranlassung der Temperatur des bio-molekülhaltigen Fluids, auf mindestens 40°C zu steigen;
c) Anbringung einer Menge des bio-molekülhaltigen Fluids mit einer Temperatur von mindestens 40°C auf eine chromatographische Säule, wie vorzugsweise eine expanded Bett-Adsorptionssäule, die ein Adsorbens umfasst, wobei die expanded Bettsäule mit einer linearen Durchflußgeschwindigkeit von mindestens 1500 cm/Stunde betrieben wird;
d) wahlweises Waschen der Säule;
e) Eluierung von mindestens einem Bio-Molekül vom Adsorbens.

Bio-Moleküle
Wie hierin definiert, soll der Begriff „Bio-Molekül" für jedes Molekül und jede Einheit stehen, das/die aus biologischer Herkunft erhalten werden kann und ein Molekulargewicht von mindestens 1000 Dalton hat. Es versteht sich von selbst, dass das Biomolekül durch die Verwendung von synthetischen Mitteln, Gentechnologie und/oder Fermentierung erhalten werden kann. Darüber hinaus kann das Bio-Molekül aufgrund der Ableitung des Bio-Moleküls unterschiedlich von dem Bio-Molekül biologischen Ursprungs sein. Damit soll der Begriff „Bio-Molekül" Bio-Moleküle umfassen, die aus biologischem Ursprung erhalten werden können sowie deren Derivate. Im typischen Fall sind solche Bio-Moleküle Peptide, Proteine, Lipide, Hormone, Lipoproteine, Polysaccharide, Polynukleotide, Bio-Polymere oder Mischungen davon. Darüber hinaus umfasst der Begriff „Bio-Molekül" in einigen Ausbildungen der Erfindung ebenfalls Einheiten, die von biologischem Ursprung mit einem Molekulargewicht von mindestens 20000 D erhalten werden können, z. B. DNA (Plasmid-DNA, Virus-DNA), RNA, wie z. B. Virus-RNA oder Viruszellen und Bestandteile davon, sogar Bakterienzellen und Bestandteile davon. Der Begriff „Bio-Molekül" soll ebenfalls Zellbestandteile und Zellen mit einbeziehen.
Es wird in Betracht gezogen, dass das Verfahren praktische Bedeutung für Bio-Moleküle mit einem höheren Molekulargewicht erwirbt. Somit hat/haben in einigen Ausbildungen der Erfindung das eine oder die mehreren Bio-Molekül(e) ein Molekulargewicht von mindestens 1500 Dalton, stärker bevorzugt von mindestens 2000 Dalton.
Es ist selbstverständlich, dass das Verfahren der Erfindung auf eine große Vielfalt von Bio-Molekülen Anwendung finden kann, so lange irgendein Adsorbens verfügbar ist, der zum Binden des entsprechenden Bio-Moleküls in der Lage ist. Daher ist/werden in den Ausbildungen der Erfindung das eine oder die mehreren Bio-Moleküle) aus Peptiden, Proteinen, Lipiden, Lipoproteinen, Polysacchariden, Polynukleotiden, Plasmiden, DNA, RNA, Viruspartikeln, Zellbestandteilen, Zellen oder Kombinationen davon ausgewählt.
In interessanten Ausbildungen davon wird/werden das eine oder die mehreren Bio-Molekül(e) ausgewählt aus:

• Proteinen, wie z. B. Laktoferrin, Immunoglobine, β-Laktoglobulin, α-Laktalbumin, Laktoperoxidase, Patatin, Protease-Inhibitoren und anderen Proteinen aus Kartoffeln, Enzymen, wie z. B. Lysozym.
• Lipiden, wie z. B. Phospholipiden aus Milch.
• Polysacchariden, wie z. B. Stärken (Maisstärke und Kartoffelstärke) und Pektinen, wie z. B. Chitosan.
• Polynucleotiden
• Plasmiden
• DNA UND RNA
• VIRUSPARTIKELN
• ZELLEN UND ZELLBESTANDTEILEN

Bio-molekülhaltiges Fluid
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zielt wenigstens zum Teil auf Fraktionierungsverfahren in industrieller Größe oder im großen Rahmen ab, bei dem große Mengen zu bearbeiten sind. Von Interesse sind bio-molekülhaltige Fluide mit geringem Bio-Molekülgehalt, wie z. B. Fluide, die ansonsten entsorgt werden würden, z. B. Prozesswasser, das interessante Bio-Moleküle enthält, jedoch in zu geringen Mengen, um ein kommerzielles Interesse zu wecken. Allerdings werden bio-molekülhaltige Fluide, die große Mengen an Bio-Molekülen enthalten, von der vorliegenden Erfindung nicht berücksichtigt und können weitere interessante Ausbildungen darstellen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll der Begriff „bio-molekülhaltiges Fluid" ein Fluid biologischen Ursprungs oder ein davon abgeleitetes Fluid bezeichnen, das mindestens ein oder mehrere Bio-Molekül(e) umfasst, das/die innerhalb des Zusammenhangs dieser Erfindung in industrieller Größenordnung oder im großen Rahmen zu fraktionieren, teilweise oder vollständig zu reinigen oder zu isolieren ist/sind. Im typischen Fall beinhalten solche Fluide oder davon abgeleitete Fluide Milch, entrahmte Milch, Molke oder andere von Milch abgeleitete Fluide; Blut oder davon abgeleitete Fluide; Plasma oder davon abgeleitete Fluide; Serum oder davon abgeleitete Fluide; Lymphe oder davon abgeleitete Fluide; Harn oder davon abgeleitete Fluide; Eiweiß oder davon abgeleitete Fluide; oder Eigelb oder davon abgeleitete Fluide. Im typischen Fall soll das bio-molekülhaltige Fluid auch Fermentierungsfluide; Abwasser; Prozesswasser; Pflanzenextrakte, wie z. B. von Früchten abgeleitete Fluide; Extrakte aus Tiergewebe, wie z. B. von Fischen abgeleitete Fluide, Blutplasma aus Tieren oder Serum aus Tieren; Synthesemischungen; und/oder davon abgeleitete Fluide enthalten.
Dementsprechend wird in einigen Ausbildungen der Erfindung das bio-molekülhaltige Fluid aus Körperflüssigkeiten, Fermentierungsflüssigkeiten, Abwasser, Prozesswasser, Pflanzenextrakten, Extrakten aus Tiergewebe, Blutplasma aus Tieren, Serum aus Tieren, Synthesemischungen und/oder davon abgeleiteten Fluiden ausgewählt.
In einigen Ausbildungen der Erfindung ist das bio-molekülhaltige Fluid Prozesswasser aus der Lebensmittel- und/oder Futterindustrie, z. B. Prozesswasser aus der Produktion von Stärken, z. B. Kartoffelstärke und/oder Maisstärke. In noch anderen Ausbildungen ist das bio-molekülhaltige Fluid Abwasser mit unerwünschten organischen Molekülen, wie z. B. Toxinen, Allergenen, Pestiziden, so dass das Abwasser von dem Gehalt derartiger organischer Moleküle gereinigt werden muss, bevor es in die Umwelt abgegeben oder für die Zubereitung von Trinkwasser verwendet wird.
In hierin interessanten Ausbildungen wird das bio-molekülhaltige Fluid aus der Gruppe ausgewählt, die Milch, entrahmte Milch, Molke oder jede andere aus Milch abgeleitete Fluide umfasst.
pH-Wert-Anpassung
Es versteht sich von selbst, dass das bio-molekülhaltige Fluid vor dem Beladen einer chromatographischen Säule in Abhängigkeit von dem entsprechenden Protein, der Chemie des Liganden und der Art des bio-molekülhaltigen Fluids eine Anpassung des pH-Wertes erfordern kann.
In einigen Ausbildungen der vorliegenden Erfindung wird der pH-Wert des bio-molekülhaltigen Fluids angepasst, bevor es auf die Adsorbens-Säule angewendet wird, um das Einfangen des Bio-Moleküls, wie z. B. eines Proteins, durch das Adsorbens zu erleichtern. Dieser pH-Wert kann an einen pH-Wert angepasst werden, der in der gesamten Bereich der pH-Werte ausgewählt wird, bevorzugt zwischen 2 und 13, stärker bevorzugt zwischen 3 und 11.
Chromatographische Säule
Die zu verwendende chromatographische Säule kann jede entweder für EBA (Expanded Bed Adsorption – expanded Bett-Adsorption) oder nicht-gepackte Bett-Adsorption oder eine Kombination davon geeignete Art sein. Die chromatographische Säule kann entweder in einem Batch-System oder in einem kontinuierlichen System verwendet werden. Damit ist die chromatographische Säule in einigen Ausbildungen der Erfindung eine expanded Bett-Adsorptionssäule, und in noch anderen Ausbildungen ist die chromatographische Säule eine aufgerührte Tank-Adsorptionssäule.
In dem vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „chromatographische Säule" auf jede Art von Behälter, der mit wenigstens einem Einlauf und wenigstens einem Auslauf für die Anwendung von bio-molekülhaltigem Fluid auf die Säule und die darauf folgende Eluierung von einem oder mehreren Bio-Molekül(en) von Interesse geliefert werden.
Die Tatsache, dass die EBA-Technologie im Allgemeinen effizient mit nicht-geklärten Fluiden arbeiten kann, macht sie für die Implementierung bei der Isolierung und der Fraktionierung von Bio-Molekülen aus Fluiden, wie z. B. Milch, Molkefermentationsfluiden und Prozesswasser attraktiv. Im Vergleich zu gepackten Bett-Adsorptionstechniken kann EBA ein solides Verfahren mit weniger Schritten bieten, was in einen erhöhten Ertrag und eine verbesserte Verfahrensökonomie resultiert. Aufgrund der Expansion des Adsorbensbettes während der Ausführung eines EBA-Verfahrenes können EBA-Säulen ohne erhebliche Berücksichtigung des erhöhten Rückdrucks oder Zusammenbruchs des Verfahrens aufgrund von Blockierungen des Systems auf industrielle Größe skaliert werden. Dies wird bei der Verwendung von gepackten Bettsäulen häufig als Problem angesehen.
Allerdings behandelt der gegenwärtige Stand der Technik innerhalb der EBA-Technologie nicht die Lösung, wie größere Mengen von Fluiden adäquat behandelt werden können, und dabei gleichzeitig eine hohe Produktivität zu erreichen.
Die allgemeine Expansions-Bett-Adsorptionstechnologie ist dem Fachmann bekannt, und das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann an die Verfahren angepasst werden, die z. B. in WO 92/00799 , WO 92/18237 , WO 97/17132 , WO 98/33572 , WO 98/08603 , WO 00/57982 , WO 01/58924 und WO 02/096215 beschrieben werden.
Es versteht sich von selbst, dass das Verfahren speziell auf Systeme industrieller Größenordnung Anwendung finden kann. Damit ist die chromatographische Säule in interessanten Ausbildungen der Erfindung eine chromatographische Säule großer Größenordnung mit wenigstens 10 l sedimentiertem Adsorbens, wie als Menge (Liter) des Adsorbens bestimmt werden kann, das sich beim Betrieb der Säule ohne Fluss absetzen kann. In weiteren interessanten Ausbildungen davon ist die chromatographische Säule eine chromatographische Säule großer Größenordnung mit rund 50 bis 100 l sedimentiertem Adsorbens. Die Menge des sedimentierten Adsorbens beträgt bevorzugt zwischen 100 und 1000 l, stärker bevorzugt zwischen 200 und 900 l, am stärksten bevorzugt zwischen 300 und 800 l.
Darüber hinaus hat die chromatographische Säule für die Produktion in industrieller Größenordnung einen Durchmesser von mindestens 10 cm, bevorzugt von wenigstens 20 cm, stärker bevorzugt in der Größenordnung von rund 50 cm bis 200 cm, wie z. B. 100 bis 150 cm.
Temperatur
Wie erwähnt, verwenden konventionelle Methodologien innerhalb des Bereichs der Fraktionierung und der Isolierung von Bio-Molekülen häufig Temperaturen von rund 15°C oder darunter, wie z. B. 10°C. Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht jedoch in der Verwendung von höheren Temperaturen in chromatographischen Verfahren zur Isolierung von Bio-Molekülen, obwohl hohe Temperaturen unter normalen Umständen die temperaturempfindlichen Bio-Moleküle negativ beeinflussen können. Z. B. können Enzyme ihre enzymatische Kapazität verlieren, wenn sie hohen Temperaturen ausgesetzt werden, wie z. B. Temperaturen über 40°C.
In gegenwärtig interessanten Ausbildungen der Erfindung wird die chromatographische Säule bei Temperaturen von mindestens 40°C betrieben, wie z. B. mindestens 45°C, z. B. mindestens 50°C, wie z. B. mindestens 55°C, z. B. mindestens 60°C, wie z. B. mindestens 65°C, z. B. mindestens 70°C. Allerdings kann es unter Berücksichtigung einiger Bio-Moleküle, die Toleranzen gegenüber hohen Temperaturen aufweisen, jedoch Temperaturen über 80°C nicht vertragen können, eine Obergrenze geben, wie z. B. rund 80°C. Bio-Moleküle mit geringem Molekulargewicht jedoch, wie z. B. Peptide, können hohe Temperaturen tolerieren, wie z. B. Temperaturen im Bereich von 40 bis 100°C, wie z. B. im Bereich von 45 bis 100°C, z. B. im Bereich von 45 bis 90°C, wie z. B. im Bereich von 45 bis 80°C, z. B. im Bereich von 45 bis 70°C, wie z. B. im Bereich von 45 bis 65°C, z. B. im Bereich von 50 bis 100, wie z. B. im Bereich von 55 bis 100°C, z. B. im Bereich von 60 bis 100°C, wie z. B. im Bereich von 65 bis 100°C, z. B. im Bereich von 70 bis 100°C. Daher wird die chromatographische Säule in einigen Ausbildungen bei Temperaturen von bis zu 100°C betrieben.
Wahlweise können die Säule und das Adsorbens innerhalb der Säule vor der Anwendung des bio-molekülhaltigen Fluids auf die gewünschte Betriebstemperatur aufgeheizt werden. Das Spülen der Säule mit heißem Wasser oder einer Pufferlösung mit der gewünschten Temperatur kann diese Temperaturanpassung effizient durchführen.
Wahlweise kann die Säule isoliert oder sogar mit Hitzemangel versorgt sein, um während des Säulenbetriebs eine konstante Temperatur beizubehalten. In vielen Fällen ist dies vielleicht nicht notwendig, doch aufgrund der hohen Durchflussgeschwindigkeit des bio-molekülhaltigen Fluids durch die Säule ist eine Beibehaltung der gewünschten Temperatur angemessen.
In aktuellen interessanten Ausbildungen der Erfindung beträgt die Temperatur des bio-molekülhaltigen Fluids zwischen 50 und 70°C.
Durchflussgeschwindigkeit
Ein großer Vorteil der Erfindung bezieht auf die Nützlichkeit von hohen Durchflussgeschwindigkeiten anstelle der konventionellen Durchflussgeschwindigkeiten, die rund
200 cm/Std. betragen. Gemäß der vorliegenden Erfindung können während des Ladens des bio-molekülhaltigen Fluids auf die chromatographische Säule lineare Durchflussgeschwindigkeiten von rund 1500 bis 12000 cm/Std. angewendet werden. Die lineare Durchflussgeschwindigkeit kann bevorzugt innerhalb eines Bereichs von 1800 bis 10000 cm/Std., betrieben werden, wie z. B. innerhalb eines Bereichs von 2000 bis 10000 cm/Std., wie z. B. im typischen Fall bei linearen Durchflussgeschwindigkeiten von rund 3000 bis 7000 cm/Std..
Die Verwendung von höheren Durchflussgeschwindigkeiten erlaubt das Laden von größeren Mengen von bio-molekülhaltigen Fluiden innerhalb eines kürzeren Zeitraums als herkömmlicherweise möglich. Dies kann jedoch von der Größe der angepassten Säule abhängen. In aktuellen geeigneten Ausbildungen der Erfindung beträgt die auf die Säule anzuwendende Menge rund 2-3500 l/Min.
Mit anderen Worten, die Effizienz des Verfahrens in seiner hierin definierten Form kann durch die Menge an bio-molekülhaltigen Fluiden ausgedrückt werden, die auf 1 Liter Adsorbens pro Stunde angewendet werden kann. Damit beträgt die in einigen Ausbildungen der Erfindung angewendete Menge pro Liter Adsorbens in einer Stunde mindestens 50 l, bevorzugt mindestens 100 l, und stärker bevorzugt mindestens 150 l/Min., wie z. B. mindestens 200 l/Min..
In der gepackten Bett-Methodologie jedoch können hohe Durchflussgeschwindigkeiten zu hohen Rückdrücken innerhalb der chromatographischen Säule führen und damit die Leistung des chromatographischen Systems, z. B. durch Probleme mit Lecks und Zusammenbrüchen der Ausrüstung beeinträchtigen. Die Forscher dieser Erfindung haben herausgefunden, dass das vorliegende Verfahren, das bei hohen Temperaturen arbeitet, wie z. B. oberhalb von 45°C, den Betrieb der chromatographischen Säule mit einem Druck zulässt, der gemessen über die gesamte chromatographische Säule maximal 10 bar beträgt. Im typischen Fall beträgt der Druck maximal 9, 8, 7, 6 oder 5 bar, bevorzugt maximal 4 bar, am stärksten bevorzugt maximal 3 bar, wie z. B. maximal 2,5 bar.
Adsorbens
In dem vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Adsorbens" auf das gesamte in der chromatographischen Säule vorhandene Bett, und der Begriff „Adsorbenspartikel" wird auswechselbar mit dem Begriff „Partikel" verwendet und bezieht sich auf die individuellen Einzelpartikel, die das Adsorbens ausmachen.
Im Allgemeinen soll der Begriff „Adsorbens" zur Kennzeichnung jedes geeigneten Adsorbens stehen, das in chromatographischen Verfahren verwendet wird, wie z. B. Adsorbens, die für die Innenaustausch-Chromatographie, die Protein A- und Protein B Affinitätschromatographie, andere Affinitätschromatographien, hydrophobe Chromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie, Thiophil-Adsorptions-Chromatographie und Adsorptions-Chromatographie gemischter Modi und dergleichen geeignet sind.
Die Durchflussgeschwindigkeit, die Größe der Partikel und die Dichte der Partikel haben jeweils Einfluss auf die Expansion des Fluidbettes, und es ist wichtig, den Grad der Expansion auf eine Weise zu steuern, dass die Partikel innerhalb der Säule verbleiben. Der Grad der Expansion kann als H/H0 bestimmt werden, wobei HO die Höhe des Bettes im gepackten Bettmodus ist (ohne Fluss) und H die Höhe des Bettes in dem expanded Bett-Modus, der erhalten wird, wenn ein Fluss aus einer Flüssigkeit auf die Säule angewendet wird. In einer bevorzugten Ausbildung der vorliegenden Erfindung liegt der Grad der Expansion H/H0 im Bereich von 1,0–20, wie z. B. 1,0–10, z. B. 1,0–6, wie z. B. 1,2 bis 5, z. B.
1,5–4, wie z. B. 4–6, wie z. B. 3–5, z. B. 3–4, wie z. B. 4–6. In einer anderen bevorzugten Ausbildung der vorliegenden Erfindung beträgt der Grad der Expansion H/H0 maximal 1,0, wie z. B. maximal 1,5, z. B. maximal 2, wie z. B. maximal 2,5, z. B. maximal 3, wie z. B. maximal 3,5, z. B. maximal 4, wie z. B. maximal 4,5, z. B. maximal 5, wie z. B. maximal 5,5, z. B. maximal 6, wie z. B. maximal 10, z. B. maximal 20.
Die durchgeführte Analyse der Partikelgröße, auf die in der gesamten Beschreibung und den Beispielen immer wieder hingewiesen wird, basieren auf einer computergestützten Bildanalyse der Perlenpopulation, die die Anzahl der Partikel zu einem bestimmten Partikeldurchmesser im Verhältnis zur Gesamtzahl der in der spezifischen Messung analysierten Partikel aufgibt. Im typischen Fall wird die Gesamtzahl der analysierten Partikel im Bereich von 250 bis 500 Partikeln liegen. Diese Partikelgrößendaten müssen in das von jeder Partikelgröße dargestellte Volumenprozent durch eine routinemäßige mathematische Transformation der Daten übertragen werden, wobei die Menge jeder Perle berechnet und dies mit der von allen in der Messung gezählten Perlen eingenommenen Gesamtmenge ins Verhältnis gesetzt wird.
Die erfindungsgemäße Partikelgrößenverteilung wird bevorzugt derart definiert, dass mehr als 90% der Partikel in einer Größe in einem Bereich zwischen 20% bis 500% des durchschnittlichen Partikeldurchmessers vorhanden sind. Stärker bevorzugt sind 90% der Partikel in einer Größe in einem Bereich zwischen 50 und 200% des durchschnittlichen Partikeldurchmessers vorhanden, am stärksten bevorzugt zwischen 50 und 150% des durchschnittlichen Partikeldurchmessers.
Herkömmlich gepacktes Bettmaterial für die Isolierung von Bio-Molekülen gemäß der Definition hierin haben einen durchschnittlichen Durchmesser von weniger als rund 100 Mikronen, was eine effiziente Bindung des Proteins ermöglicht. Ihr Nachteil ist ihr hoher Strömungswiderstand. Es ist nicht machbar, höhere Durchflussgeschwindigkeiten als 500 cm/Std. anzuwenden, was kein Problem in analytischen Anwendungen darstellt, sondern bei der Verarbeitung in großem Umfang zu einem Einschränkungsfaktor wird.
Bei Durchflussgeschwindigkeiten von mehr als 500 cm/Std. wird der Druckabfall über dem Säulenmaterial steigen, und die Betthöhe wird der begrenzende Faktor sein. Wenn große Mengen von Substanzen verarbeitet werden sollen, sollte der Durchmesser der Säule ziemlich groß sein. Dies erfordert die Konstruktion von Säulen mit hohen Standards, um die erforderliche adäquate Verteilung der Substanzen zu erreichen, die den hohen Drücken standhalten. Die Kosten derartiger Säulen haben einen großen Einfluss auf die Verfahrensökonomie.
Das Niveau der Klärung des Einspeisungsstroms beeinträchtigt ebenfalls den Druckabfall. Herkömmlich gepackte Betten funktionieren als Tiefenfilter, die verstopfen können, was zu einem verstärkten Druckabfall führt, es sei denn, der Zufluss wird grundlegend geklärt.
Sollte die chromatographische Säule eine EBA-Säule sein, hat sich die Dichte des EBA-Adsorbenspartikels für die anwendbaren Durchflussgeschwindigkeiten im Verhältnis zum maximalen Grad der Expansion des Adsorbensbettes innerhalb einer typischen EBA-Säule (z. B. H/H0 maximal 3–5) als sehr erheblich herausgestellt und muss mindestens 1,3 g/ml betragen, stärker bevorzugt mindestens 1,5 g/ml, noch stärker bevorzugt mindestens 1,8 g/ml, noch stärker bevorzugt mindestens 2,0 g/ml, am stärksten bevorzugt mindestens 2,3 g/ml, um eine hohe Produktivität des Verfahrens und einen akzeptablen Grad an Bettexpansion zu ermöglichen.
Wie angegeben, kann das Verfahren der Erfindung unter Verwendung von hohen Durchflussgeschwindigkeiten betrieben werden und dabei gleichzeitig eine hohe Produktivität und eine effiziente Adsorption von Bio-Molekülen am Adsorbens erreichen. Dies kann wenigstens teilweise auf die Begrenzung des durchschnittlichen Partikeldurchmessers des Adsorbenspartikels zurückzuführen sein. In einer bevorzugten Ausbildung der Erfindung hat der Adsorbenspartikel eine durchschnittliche Partikelgröße von maximal 200 μm. Im typischen Fall beträgt die durchschnittliche Partikelgröße maximal 150 μm, insbesondere maximal 120 μm, ganz besonders maximal 100 μm, ganz besonders maximal 90 μm, ganz besonders maximal 80 μm, ganz besonders 70 μm. Im typischen Fall hat der Adsorbenspartikel eine durchschnittliche Partikelgröße im Bereich von 40-150 μm, wie z. B. 40-120 μm, z. B. 40-100, wie z. B. 40-75, z. B. 40-50 μm.
Unter dem Begriff „durchschnittliche Partikelgröße" wird die Partikelgröße verstanden, die 50% der Partikel im Adsorbens aufweisen, gemäß der Bestimmung durch die Anzahl der Partikel.
Mit anderen Worten, in geeigneten Ausbildungen der Erfindung besteht das Adsorbens aus Partikeln, bei denen 50% der Anzahl der Partikel eine Partikelgröße von maximal 200 μm aufweisen, insbesondere maximal 175, 150, 120, 100, 90, 80 oder maximal 70 μm.
Die Partikelgrößen, auf die hierin Bezug genommen wird, bezieht sich auf die längste Distanz, die auf dem Partikel gemessen werden kann.
In einer Kombination von bevorzugten Ausbildungen, bei denen der durchschnittliche Partikeldurchmesser 120 μm oder weniger beträgt, beträgt die Partikeldichte 1,6 g/ml, stärker bevorzugt mindestens 1,9 g/ml. Wenn der durchschnittliche Partikeldurchmesser weniger als 90 μm beträgt, muss die Dichte mindestens 1,8 ml oder stärker bevorzugt mindestens 2,0 g/ml sein. Wenn der durchschnittliche Partikeldurchmesser kleiner als 75 μm ist, muss die Dichte mindestens 2,0 g/ml oder stärker bevorzugt mindestens 2,3 g/ml und noch stärker bevorzugt mindestens 2,5 g/ml betragen.
In einer bevorzugten Ausbildung der bevorzugten Erfindung hat der Adsorbenspartikel eine Dichte von mindestens 1,5 g/ml, wie z. B. mindestens 1,8 g/ml, z. B. mindestens 2,0 g/ml, wie z. B. mindestens 2,5 g/ml, wie z. B. mindestens 2,6 g/ml, z. B. mindestens 3,0 g/ml, wie z. B. mindestens 3,5 g/ml, z. B. mindestens 4,0 g/ml, wie z. B. mindestens 5 g/ml, z. B. mindestens 7 g/ml, wie z. B. mindestens 10 g/ml, z. B. mindestens 15 g/ml.
Die Dichte eines Adsorbenspartikels soll die Dichte des Adsorbens in seinem vollständig gelösten (z. B. hydratisierten) Zustand im Gegensatz zur Dichte eines getrockneten Adsorbens beschreiben.
Der erfindungsgemäß verwendete Adsorbenspartikel musst mindestens teilweise für die zu isolierenden Bio-Molekülsubstanz permeabel sein, um eine erhebliche Bindungskapazität im Gegensatz zu unpermeablen Partikeln zu gewährleisten, die das Zielmolekül nur auf seiner Oberfläche binden können, was zu einer relativ geringen Bindungskapazität führt. Der Adsorbenspartikel kann eine Reihe von unterschiedlichen Strukturen, Zusammensetzungen und Formen haben. Der Adsorbenspartikel kann z. B. durch poröses, hochdichtes Material gebildet werden, wie z. B. poröse Keramikperlen, poröse Glasperlen und poröse Zirkonoxidperlen oder ein hochdichtes Konglomerat, wie nachstehend beschrieben.
Damit können die Adsorbenspartikel aus einer Reihe von chemisch abgeleiteten porösen Materialien mit der notwendigen Dichte und Bindungskapazität gebildet werden, um unter per se gegebenen Durchflussgeschwindigkeiten zu arbeiten. In einer Ausbildung sind die Partikel entweder vom Konglomerattyp, wie in WO 92/00799 beschrieben, und haben mindestens zwei von einem porösen Material umgebene nicht-poröse Kerne oder vom pellikularen Typ mit einem einzigen von einem porösen Material umgebenen nicht-porösen Kern.
Im vorliegenden Kontext bezieht sich der Begriff „Konglomerattyp" auf einen Partikel eines bestimmten Materials, das Perlen aus Kernmaterial unterschiedlicher Typen und Größen umfasst, das durch eine polymerische Basismatrix zusammengehalten wird, z. B. ein Kernpartikel, der aus zwei oder mehr hochdichten, von umgebender Agarose (polymerische Basismatrix) zusammengehaltenen hochdichten Partikeln besteht. Im vorliegenden Kontext bezieht sich der Begriff „pellikularer Typ" auf einen Verbund von Partikeln, in dem jeder Partikel aus nur einem hochdichten Kernmaterial besteht, das mit einer Schicht aus der porösen polymerischen Basismatrix ummantelt ist, z. B. einem hochdichten Edelstahlperlen, der mit Agarose ummantelt ist.
Dementsprechend bezieht sich der Begriff „mindestens ein hochdichter nicht-poröser Kern" entweder auf einen pellikularen Kern, der einen einzigen hochdichten nicht-porösen Partikel umfasst, oder er bezieht sich auf einen Konglomeratkern, der mehr als einen hochdichten, nicht-porösen Partikel umfasst.
Der Adsorbenspartikel umfasst, wie ausgeführt, einen hochdichten, nicht-porösen Kern mit einem den Kern umgebenden porösen Material, und das genannte poröse Material umfasst wahlweise einen Liganden an seiner Außenfläche.
Im vorliegenden Kontext bezieht sich der Begriff „Kern" auf den nicht-porösen Kernpartikel oder die nicht-porösen Kernpartikel innerhalb des Adsorbenspartikels. Der oder die Kernpartikel kann/können innerhalb des porösen Materials zufällig verteilt sein und ist/sind in seiner/ihrer Lokalisierung nicht zum Zentrum des Adsorbenspartikels beschränkt.
Der nicht-poröse Kern bildet im typischen Fall maximal 50% der Gesamtmenge des Adsorbenspartikels, wie z. B. maximal 40%, bevorzugt maximal 30%.
Beispiele für geeignetes nicht-poröses Kernmaterial sind anorganische Verbindungen, Metalle, Schwermetalle, elementare Nicht-Metalle, Metalloxide, Nicht-Metalloxide, Metallsalze und Metalllegierungen, usw., solange die obigen Dichtigkeitskriterien erfüllt sind. Beispiele solcher Kernmaterialien sind Metallsilikate, Metall-Borosilikate; Keramiken einschließlich von Titandiborid, Titankarbid, Zirkondiborid, Zirkonkarbid, Wolframkarbid, Silikonkarbid, Aluminiumnitrid, Siliziumnitrid, Titannitrid, Yttriumoxid, Siliziummetallpulver und Molybdändisilid; Metalloxide und Sulfide, einschließlich Magnesium-, Aluminium-, Titan-, Vanadium-, Chrom-, Zirkon-, Hafnium-, Mangan-, Eisen-, Kobalt-, Nickel-, Kupfer- und Silberoxid; Nicht-Metalloxide; Metallsalze, einschließlich Bariumsulfat; Metallgrundstoffe, einschließlich Wolfram, Zirkon, Titan, Hafnium, Vanadium, Chrom, Mangan, Eisen, Kobalt, Nickel, Indium, Kupfer, Silber, Gold, Palladium, Platin, Ruthenium, Osmium, Rhodium und Iridium sowie Legierungen von Metallgrundstoffen, wie z. B. zwischen den genannten Metallgrundstoffen gebildete Legierungen, z. B. Edelstahl; kristalline und amorphe Formen von Kohlenstoff, einschließlich Graphit, Ruß und Holzkohle. Bevorzugte nicht-poröse Kernmaterialien sind Wolframkarbamid, Wolfram-, Stahl- und Titanperlen, wie z. B. Edelstahlperlen.
Das poröse Material ist eine polymerische Basismatrix, die als Mittel für die Abdeckung und das Zusammenhalten von multiplen (oder einzelnen) Kernmaterialien sowie als Mittel zum Binden des Adsorbensliganden verwendet wird.
Die polymerische Basismatrix kann unter bestimmten Typen von natürlichen oder synthetischen organischen Polymeren gefunden werden, die im typischen Fall ausgewählt werden aus i) natürlichen und synthetischen Polysacchariden und anderen auf Kohlenhydraten basierten Polymeren, einschließlich Agar, Alginat, Karragheenan, Guargummi, Gummi Arabica, Ghattigummi, Tragakanthgummi, Karayagummi, Johannisbrotkernmehl, Xanthangummi, Agarosen, Zellulosen, Pektine, Mucine, Dextrane, Stärken, Heparine, Chitosane, Hydroxystärken, Hydroxypropylstärken, Carboxymethylstärken, Hydroxyethylzellulosen, Hydroxypropylzellulosen und Carboxymethylzellulosen; ii) synthetischen organischen Polymeren und Monomeren, die in Polymeren resultieren, einschließlich Acrylpolymeren, Polyamiden, Polyimiden, Polyestern, Polyethern, polymerischen Vinylverbindungen, Polyalkenen und substituierten Derivaten davon, sowie Copolymeren, die mehr als einem solchen Polymer umfassen, und substituierten Derivaten davon; und iii) einer Mischung davon.
Eine bevorzugte Gruppe von polymerischen Basismatrizen sind Polysaccharide, wie z. B. Agarose.
Von einem Produktionsstandpunkt aus gesehen ist es wichtig, dass das Adsorbens fähig ist, eine große Menge des Bio-Moleküls per Menge des Adsorbens zu binden.
Die bevorzugte Form eines einzigen Adsorbenspartikels ist im Wesentlichen sphärisch. Die Gesamtform der Partikel ist jedoch normalerweise nicht extrem kritisch, so dass die Partikel andere Typen von gerundeten Formen haben können, z. B. ellipsoidisch, Tröpfchen- und Bohnenformen. Für bestimmte Anwendungen jedoch (z. B. wenn die Partikel in einer Wirbelschicht-Bett-Anordnung verwendet werden), wird bevorzugt, dass mindestens 95% der Partikel im Wesentlichen sphärisch sind.
Die erfindungsgemäße Zubereitung des Partikelmaterials kann nach verschiedenen per se bekannten Verfahren durchgeführt werden (z. B. durch herkömmliche Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, siehe z. B. EP 0 538 350 B1 oder WO 97/17132 . z. B. durch Blockpolymerisation von Monomeren; Suspensionspolymerisation von Monomeren; Block- oder Suspensions-Gelbildung von gelbildenden Materialien, z. B. durch Erhitzen oder Abkühlen (z. B. Agarose) oder durch Hinzufügen von gelbildenden „Katalysatoren" (z. B. Hinzufügen eines geeigneten Metallions zu Alginaten oder Karragheenanen); Block- oder Suspensions-Vernetzung von geeignetem löslichem Materialien (z. B. Vernetzung von Dextranen, Zellulosen oder Stärken oder Gelatinen oder anderen organischen Polymeren mit z. B. Epichlorohydrin oder Divinyl-Sulphon); Bildung von Silica-Polymeren durch Versäuerung von Silicalösungen (z. B. Block- oder Suspensionslösungen); gemischte Verfahren z. B. Polymerisierung und Gelbildung; Sprühverfahren; und Fluidbettbeschichtung von Dichte kontrollierenden Partikeln; Kühlung von Emulsionen von Dichte kontrollierenden Partikeln, die in polymerischen Basismatrixen in erhitzten Öllösungen suspendiert sind; oder durch Suspendieren von Dichte kontrollierenden Partikeln und eine aktiven Substanz in einer geeigneten Monomer- oder Polymerlösung, gefolgt von einer Polymerisation.
In einer besonders geeigneten, auf die erfindungsgemäße Zubereitung von Partikelmaterial allgemein anwendbare Ausbildung wird ein partikelförmiges Material mit Agarose als polymerische Basismatrix und Stahlperlen als Kernmaterial durch Erhitzen (auf rund 95°C) einer Mischung aus Agarose in Wasser erhalten, wobei die Stahlperlen der Mischung hinzugefügt werden und die Mischung in ein heißes Öl (z. B. Pflanzenöl) übertragen wird, die Mischung durch heftiges Rühren emulgiert wird (wahlweise durch Hinzufügen eines herkömmlichen Emulgators) und Abkühlen der Mischung. Dem Fachmann wird klar sein, dass die Partikelgröße (d. h. die Menge der polymerischen Basismatrix (hier: Agarose), die in jeden Partikel integriert wird, durch Änderung der Geschwindigkeit des Mixers und das Abkühlverfahren angepasst werden kann. Im typischen Fall kann die Verteilung der Partikelgrößen im Anschluss an die primäre Produktion einer Partikelzubereitung weiter durch Sieben und/oder Fluidbettdekantieren definiert werden.
Die poröse Matrix, wie z. B. Polymeragarose, ist im typischen Fall chemisch mit einer Verbindung mit niedrigerem Molekülgewicht abgeleitet, die hierin als das Ligand bezeichnet wird, und das Adsorbens umfasst ein Ligand mit einer Affinität zu Proteinen. Der Ligand bildet die adsorbierende Funktionalität des Adsorbensmediums, oder das polymerische Rückgrat der Adsorbenspartikel hat eine per se integrierte Bindungsfunktionalität.
Wohlbekannte Ligandenchemien, wie z. B. Kationenaustauscher, z. B. Sulphonsäure, haben sich als wirksame Werkzeuge für die Reinigung von Molkeproteinen erwiesen, wie z. B. Laktoferrin and Laktoperoxidase. Diese Proteine sind selbst bei neutralem pH-Wert positiv geladen, und eine selektive Interaktion mit einem Kationenaustauscher kann erhalten werden. Andere Proteine erfordern eine ausgeklügeltere bindende Interaktion mit dem Liganden, um eine selektive Adsorption zu erreichen.
Solche Affinitätsliganden, wie z. B. ladbare Reste, können mit der Basismatrix durch dem Fachmann bekannte Verfahren verbunden sein, z. B. wie in "Immobilized Affinity Ligand Techniques" von Hermanson et al., Academic Press, Inc., San Diego, 1992 beschrieben. In Fällen, in denen die polymerische Basismatrix nicht die Eigenschaften hat, als eine aktive Substanz zu funktionieren, kann die polymerische Basismatrix (oder die Matrizen, sofern eine Mischung aus Polymeren verwendet wird) derivatisiert werden, um als eine aktive Substanz in den Verfahren von Aktivierung oder Deaktivierung zu funktionieren. Damit können Materialien mit Hydroxyl-, Amino-, Amid-, Carboxyl- oder Thiolgruppen unter Verwendung verschiedener Aktivierungschemikalien aktiviert oder derivatisiert werden, z. B. Chemikalien wie Cyanogenbromid, Divinylsulfon, Epichlorohydrin, Bisepoxyrane, Dibromopropanol, Glutarsäuredialdehyd, Karbodiimide, Anhydride, Hydrazine, Periodate, Benzochinone, Triazine, Tosylate, Tresylate und Diazonium-Ione.
Speziell bevorzugte Verfahren für die chemische Derivatisierung und spezifische Liganden, die erfindungsgemäß anwendbar sind, werden in WO 98/08603 beschrieben.
Es wurde festgestellt, dass zur Gewährleistung einer optimalen Adsorptionsstärke und Produktivität des Adsorbens die Ligandenkonzentration auf dem Adsorbens sehr erheblich ist. Damit trägt das Adsorbens in einer geeigneten Ausbildung Liganden für die Adsorption der bio-molekularen Substanzen in einer Konzentration von mindestens 20 mM, wie z. B. mindestens 30 mM oder mindestens 40 mM, bevorzugt mindestens 50 mM und am stärksten bevorzugt mindestens 60 mM.
Eine Adsorbensuntermenge kann in Bezug auf deren Bindungskapazität an Rinderserumalbumin (BSA) gekennzeichnet werden. Diese Adsorbensuntermenge ist typischerweise die, die aus einem Liganden aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus Folgendem besteht i) Liganden mit aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen (Radikalen) der folgenden Arten von funktionalen Gruppen: Benzoesäuren, wie z. B. 2-Aminobenzoesäuren, 3-Aminobenzoesäuren, 4-Aminobenzoesäuren, 2-Mercaptobenzoesauren, 4-Amino-2-Chlorobenzoesäuren, 2-Amino-5-Chlorobenzoesäuren, 2-Amino-4-Chlorobenzoesäuren, 4-Aminosalicylsäuren, 5-Aminosalicylsäuren, 3,4-Diaminobenzoesäuren, 3,5-Diaminobenzoesäuren, 5-Aminoisophtalsäure, 4- Aminophtalsäure; Zimtsäuren, wie z. B. Hydroxy-Zimtsäuren; Nikotinsäuren, wie z. B. 2-Mercaptonikotinsäuren; Naphthoesäuren, wie z. B. 2-Hydroxy-1-Naphthoesäure; Chinoline, wie z. B. 2-Merkaptochinolin; Tetrazolessigsäuren, wie z. B. 5-Mercapto-1-Tetrazolessigsäure; Thiadiazole, wie z. B. 2-Mercapto-5-Methyl-1,3,4-Thiadiazol; Benzimidazole, wie z. B. 2-Amino-Benzimidazol, 2-Mercaptobenzimidazol und 2-Mercapto-5-Nitrobenzimidazol; Benzothiazole, wie z. B. 2-Aminobenzothiazol, 2-Amino-6-Nitrobenzothiazol, 2-Mercaptobenzothiazol und 2-Mercapto-6-Ethoxybenzothiazol; Benzoxazole, wie z. B. 2-Mercaptobenzoxazole; Thiophenole, wie z. B. Thiophenol und 2-Aminothiophenol; 2-(4-Aminophenylthio-)Essigsäure; aromatische oder heteroaromatische Sulfonsäuren und Phosphonsäuren, wie z. B. 1-Amino-2-Naphtol-4-Sulfonsäure und Phenole, wie z. B. 2-Amino-4-Nitrophenol. Es ist anzumerken, dass in dem Fall, in dem M Agarose ist, SP1 aus Vinylsulfon abgeleitet ist und L 4-Aminobenzoesäure ist, ausdrücklich in Bezug auf die Festphasenmatrizen gemäß der Erfindung verzichtet ist, siehe WO 92/16292 , am stärksten bevorzugt Aminobenzoesäuren, wie 2-Amino-Benzoesäure, 2-Mercapto-Benzoesäure, 3-Aminobenzoesäure, 4-Amino-Benzoesäure, 4-Amino-2-Chlorobenzoesäure, 2-Amino-5-Chlorobenzoesäure, 2-Amino-4-Chlorobenzoesäure, 4-Amino-Salicylsäuren, 5-Amino-Salicylsäuren, 3,4-Diaminobenzoesäuren, 3,5-Diaminobenzoesäuren, 5-5-Aminoisophthalsäure, 4-Aminophthalsäure ii) Liganden mit 2-Hydroxy-Zimtsäuren, 3-Hydroxy-Zimtsäure und 4-Hydroxy-Zimtsäure iii) Liganden mit einer Carboxylsäure und einer Aminogruppe als Substituenten, wie z. B. 2-Amino-Nikotinsäure, 2-Mercapto-Nikotinsäure, 6-Amino-Nikotinsäure und 2-Amino-4-Hydroxypyrimidin-Carboxylsäure iv) Liganden mit Radikalen, die von einem mit einem heteroaromatischen Ringsystem verschmolzenen Benzenring abgeleitet sind, wie z. B. ein aus Benzimidazolen ausgewählte Ligand, wie z. B. 2-Mercapto-Benzimidazol und 2-Mercapto-5-Nitro-Benzimidazol; Benzo-Thiazole, wie z. B. 2-Amino-6-Nitrobenzothiazol, 2-Mercaptobenzothiazol und 2-Mercapto-6-Ethoxybenzothiazol; Benzoxazole, wie z. B. 2-Mercaptobenzoxazol; und v) aus der Gruppe aus Thiophenolen ausgewählte Liganden, wie z. B. Thiophenol und 2-Aminothiophenol.
Innerhalb der Ausbildung, in der der Ligand aus der Gruppe i)-v) ausgewählt ist, haben die Adsorbenten im typischen Fall eine dynamische Bindungskapazität von mindestens 10 g Bio-Molekülsubstanz pro Liter, stärker bevorzugt mindestens 20 g pro Liter, noch stärker bevorzugt mindestens 30 g pro Liter, wenn sie entsprechend den in der jeweiligen Anwendung eingesetzten Bedingungen getestet werden. Die Bindungskapazität des Adsorbens kann in Bezug auf seine Bindungskapazität an Rinderserumalbumin (BSA) bestimmt werden. Die Bindungskapazität ist im typischen Fall derart, dass sich mindestens 10 g/l des BSA gemäß dem Testverfahren A binden.
Verfahren A ist eine für die Bestimmung der Bindungskapazität von ausgewählten Adsorbenten für Rinderserumalbumin verwendete Methode und besteht aus dem folgenden Verfahren:
Rinderserumalbuminlösung, pH-Wert 4,0 (BSA pH 4,0): Gereinigtes Rinderserumalbumin (A 7906, Sigma, USA) wird auf eine endgültige Konzentration von 2 mg/ml in 20 mM Natriumzitrat pH-Wert 4,0 aufgelöst. Adsorbenten werden mit 50 Volumen 20 mM Natriumzitrat, pH-Wert 4,0, gewaschen und auf einem Ansaugfilter drainiert.
Eine Probe von 1,0 ml saugdrainiertem Adsorbens wird unter Hinzufügung von 30 ml BSA, pH-Wert 4,0, in ein 50 ml Teströhrchen gegeben.
Das Teströhrchen wird dann mit einer Propfen verschlossen und die Lösung auf einem Rollermischer 2 Stunden lang bei Raumtemperatur (20–25°C) inkubiert. Das Teströhrchen wird dann 5 Min. lang bei 2000 U/Min. zentrifugiert, um das Adsorbens vollständig zu sedimentieren. Der Überstand wird dann vom Adsorbens per Pipette in ein separates Teströhrchen isoliert, wobei der Übertrag jeglicher Adsorbenspartikel vermieden wird, und die durch einen kleinen, nicht-adsorbierenden 0,2 μm Filter (Millipore, USA) passiert wird. Im Anschluss daran wird eine Bestimmung der Konzentration des nicht-gebundenen BSA im Überstand durch Messung der optischen Dichte (CD) bei 280 nm auf einem Spektrometer durchgeführt.
Die Menge des an das Adsorbens gebundenen BSA wird dann entsprechend der folgenden Formel berechnet:
mg BSA gebunden per ml gesaugdrainiertes Adsorbens = (1-(OD des Testüberstandes/OD der BSA Starterlösung)) × 60 mg BSA/ml Adsorbens.
Waschen
In einer bevorzugten Ausbildung ist die Waschflüssigkeit Wasser, z. B. Leitungswasser, entmineralisiertes Wasser, per Umkehrosmose produziertes Wasser oder destilliertes Wasser, wässrige Puffer oder andere wässrige Lösungen mit hoher Innenstärke. In anderen bevorzugten Ausbildungen ist die Waschflüssigkeit die am Säulenausgang während des Ladens der Säule mit dem bin-molekülhaltigen Fluid aufgefangene Probe; der so genannten Durchlauffraktion. Wenn z. B. Molke auf die Säule geladen wird, kann die Waschflüssigkeit die aufgefangene „Durchlaufprobe" sein, die im Wesentlichen aus den Molkebestandteilen besteht, die nicht an der Säule adsorbiert sind. Im Prinzip kann jedes bio-molekülhaltige Fluid, das auf eine expanded Bettsäule geladen wurde und als „Durchlauffraktion" aufgefangen wurde, angewendet werden, solange die „Durchlauffraktion" die erforderliche Innenstärke hat.
In einer bevorzugten Ausbildung der vorliegenden Erfindung wird die für die implizierten Waschschritte verwendete Durchflussgeschwindigkeit aus den zuvor für konventionelle Methodologien dargelegten Bereichen ausgewählt. Diese sind im Allgemeinen sehr viel niedriger als die linearen Durchflussgeschwindigkeiten, die beim Laden des bio-molekülhaltigen Fluids auf der Säule verwendet werden.
Eluierung
Das eine oder die mehreren Bio-Moleküle) von Interesse wird/werden vom Adsorbens unter Verwendung eines Eluent freigegeben, wie z. B. einem Puffer oder einer anderen Lösung, die zum Ändern z. B. des pH-Wertes innerhalb der Säule fähig ist und die eine allgemein klare und konzentrierte Lösung des einen oder der mehreren Bio-Moleküls/e produziert.
Entsprechende Eluenten hängen von dem Typ des Adsorbens ab, und die Eluierung kann durch jedes konventionell beschriebene und in der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden.
In einigen Ausbildungen der Erfindung, in denen das Bio-Molekül ein Protein ist, wird die Eluierung des adsorbierten Proteins mit einer Lösung durchgeführt, die im typischen Fall aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus verdünnter Base, verdünnter Säure und Wasser besteht. In der Ausbildung, in der der Eluierungs- oder der Waschschritt mit einer solchen Lösung durchgeführt wird, ist die Lösung verdünnt, um die Menge von Salz und anderer unerwünschter, im eluierten Produkt vorhandener Substanzen zu minimieren.
Somit hat die für die Eluierung des Biomoleküls verdünnter Säure oder Base in einer bevorzugten Ausbildung eine Salzkonzentration von weniger als 50 mM, bevorzugt weniger als 30 mM, sogar stärker bevorzugt von weniger als 20 mM. Die Bestimmung der Salzkonzentration wird direkt auf der Eluierungsfraktion durchgeführt, die das zu isolierende Protein oder die Proteine enthält ohne zusätzliche Verdünnung der Eluierungsfraktion. Geläufige, kostengünstige und nicht-toxische Säuren und Basen sind anwendbar. Speziell bevorzugt werden die Basen Natriumhydroxid (NaOH), Kaliumhydroxid (KOH), Kalziumhydroxid (Ca(OH)₂), Ammoniumhydroxid (NH₄OH).
In einer bevorzugten Ausbildung der vorliegenden Erfindung wird die für die implizierten Eluierungsschritt oder -schritte verwendete Durchflussgeschwindigkeit aus den zuvor für die Anwendung von proteinhaltigen Mischungen auf die Adsorbenssäule dargelegten Bereichen ausgewählt.
BEISPIELE
Beispiel 1
Isolierung von Laktoferrin (LF) aus entrahmter Milch unter Einsatz der expanded Bett-Adsorptionschromatographie bei 10°C gegenüber 50°C:
Von einem lokalen Milchproduktehersteller wurde nicht-pasteurisierte entrahmte Milch mit einem pH-Wert von 6,6 beschafft.
Adsorbens
FastLine SP, Produkt Nummer 900–1600 UpFront Chromatography. Das Adsorbens basiert sich auf Agarose mit integrierten Wolframkarbidpartikeln, Dichte von ungefähr 2,9 g/ml, Partikelgröße im Bereich von 40–200 μm mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von 80 μm, starker Kationenaustauscher mit Sulfonsäuregruppen.
Vorbehandlung der nicht-pasteurisierten entrahmten Milch
Für die Durchführung des Experiments bei 10°C wurde die entrahmte Milch auf eine Temperatur von 10°C abgeglichen und während des Experiments bei 10°C gehalten.
Für die Durchführung des Experiments bei 50°C wurde die entrahmte Milch durch einen Wärmetauscher gepumpt, um 50°C zu erreichen, bevor sie auf die Säule geladen wurde. Es wurde keine pH-Wert-Anpassung vorgenommen.
Verfahrensparameter
Das Experiment wurde in einer expanded Bettsäule (∅ = 30 cm) FastLine^® 300 Produkt Nummer 7300–0000, UpFront Chromatography, durchgeführt.
Die Säule wurde mit einer sedimentierten (gepackten) Betthöhe (H₀) von 15 cm mit Adsorbens gepackt und gründlich mit entmineralisiertem Wasser bei 10°C und 50°C ausgeglichen, um ein expanded Bett des Adsorbens mit der gewünschten Temperatur für die beiden Experimente zu schaffen.
Für beide Experimente wurden 3180 l der entrahmten Milch mit einer linearen Durchflussgeschwindigkeit von 1500 cm/Std. auf die Säule geladen.
Für beide Experimente wurde die Säule mit einem wässrigen Puffer, pH-Wert 6,5, mit 25 mM Natriumzitrat und 0,15 M Natriumchlorid gewaschen. Im Anschluss dieser Wäsche wurde Laktoferrin dann unter Verwendung einer Lösung aus 20 mM Natriumhydroxid eluiert, was unverzüglich nach der Eluierung durch Hinzufügen von 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 gebracht wurde.
Bestimmung des Laktoferrins
Die Konzentration des Laktoferrins im Eluat wurde wie in Scand. J. Immunol. Vol. 17, Suppl. 10, 41–56, 1983 beschrieben durch einzelne radialer Immunodiffusion (Single Radial Immunomodiffusion, RID) unter Verwendung von Anti-Rinderlaktoferrin aus Ziegen von Bethyl Laborstories inc. (1 μl pro cm²) bestimmt. Die Konzentration wurde von einer Standardkurve berechnet, die mit bekannten Konzentrationen an Laktoferrin von Sigma (Kat. Nr. L 9507) produziert wurde.
Ergebnisse

Die nachstehende Tabelle zeigt die Mengen der entrahmten Milch und der Puffer, die auf jede Säule geladen wurden:

Fraktion	Verfahren bei 10°C	Verfahren bei 50°C
Menge der geladenen entrahmten Milch in Litern	3180	3180
Menge der Waschlösungen, in Litern	174	210
Eluierung von Laktoferrin, in Litern	105	114
Verarbeitete Gesamtmenge, in Litern	3459	3504
Verfahrensdauer, in Std.	3,26	3,31

Die tatsächliche Durchflussrate durch die Säulen beträgt 100 l/Std./l Adsorbens.

Die nachstehende Tabelle zeigt die Ergebnisse der beiden Experimente. (LF = Laktoferrin)

Temperatur ^°C	g LF im Eluat	Adsorbenskapazität g LF/l Adsorbens	Expansion des Adsorbens während des Ladens der entrahmten	Produktivität g LF/l Adsorbens/St d.
			Milch, H/H₀
10	244	23	10 Mal	7,1
50	461	44	4 Mal	13,2

Die Ergebnisse zeigen, dass die Produktivität, wie sie durch die Menge des pro Liter Adsorbens in einer Stunde isolierten Laktoferrins dargestellt wird, sehr viel höher ist, wenn das Verfahren bei 50°C anstatt bei 10°C betrieben wird.
Durch analytische Standardverfahren, wie z. B. Größenausschlusschromatographie und Natriumdodecyl-Geleketrophorese (SDS_PAGE) konnte weder ein Abbau noch eine Denaturierung der Laktoferrinmoleküle festgestellt werden. Auch wurde dort kein erhebliches Wachstum von gängigen Bakterien in den Durchlauffraktionen und dem Laktoferrineluat festgestellt. Die Reinheit des eluierten Laktoferrins hat sich als höher als 95% erwiesen, wie per SDS-PAGE festgestellt wurde.
Beispiel 2
Isolierung von Laktoferrin aus nicht-pasteurisierter, entrahmter Milch unter Verwendung einer expanded Bett-Chromatographie bei linearen Durchflussgeschwindigkeiten von 1.500, 2100 oder 3000 cm/Std. bei 50°C.
Alle Bedingungen außer der Durchflussgeschwindigkeiten waren dieselben wie in Beispiel 1 beschrieben.
Ergebnisse

Fraktion	Verfahren bei 1500 cm/Std.	Verfahren bei 2100 cm/Std.	Verfahren bei 3000 cm/Std.
Menge der geladenen entrahmten Milch in Litern	3180	3180	3180
Menge der Waschlösungen, in Litern	210	232	302
Eluierung von Laktoferrin, in Litern	114	115	192
Verarbeitete Gesamtmenge, in Litern	3504	3527	3674
Verfahrensdauer, in Std.	3,3	2,4	1,7

Die nachstehende Tabelle zeigt die Ergebnisse der drei Experimente. (LF = Laktoferrin)

Durchfluss geschwindi gkeit cm/Std.	Geladene Volumen l/Std./l Adsorbens	g LF im Eluat	Adsorbenskapa zität g LF/l Adsorbens	Expansion des Adsorbens während des Ladens der entrahmten Milch, H/H₀	Produktivität g LF/l Adsorbens/St d.
1500	100	466	44	3,9 Mal	13,3
2100	140	456	43	4,4 Mal	17,9
3000	200	445	42	8 Mal	24,7

Die Ergebnisse zeigen, dass die Verfahrensproduktivität sowie die Menge, die per Stunde pro Liter Adsorbens geladen werden kann, erheblich steigt, wenn die expanded Bettsäule bei 50°C betrieben wird und die lineare Durchflussgeschwindigkeit von 1500 auf 3000 cm/Std. steigt. Durch analytische Standardverfahren, wie z. B. Größenausschlusschromatographie und SDS-PAGE, konnte weder ein Abbau noch eine Denaturierung der Laktoferrinmoleküle festgestellt werden. Die Reinheit des eluierten Laktoferrins hat sich als höher als 95% erwiesen, wie per SDS-PAGE festgestellt wurde, und es wurde während des Experiments kein mikrobielles Wachstum festgestellt.
Beispiel 3
Isolierung von Laktoferrin aus süßer Molke unter Verwendung einer expanded Bett-Adsorptionschromatographie bei 16°C gegenüber 50°C.
Verfahrensparameter
Das Experiment wurde in einer expanded Bettsäule (∅ = 30 cm) FastLine^®300, Produkt Nummer 7300–0000, UpFront Chromatography, durchgeführt.
Die Säule wurde mit 15 cm Adsorbens (10,6 l) gepackt und mit entmineralisiertem Wasser jeweils bei 16°C oder 50°C ausgeglichen.
3180 l süße Molke, die durch einen Wärmetauscher jeweils bei einer Temperatur von 16°C oder 50°C eingestellt war, wurde mit einer linearen Durchflussgeschwindigkeit von 900 und 1500 cm/Std. auf die Säule geladen.
Die Säule wurde mit wässrigem Puffer, pH-Wert 6,5, mit 25 mM Natriumzitrat und 0,30 M Natriumchlorid gewaschen. Das Laktoferrin wurde dann unter Verwendung einer Lösung aus 20 mM Natriumhydroxid eluiert.
Ergebnisse

Die nachstehende Tabelle zeigt die Menge der süßen Molke und der Puffer, die auf jede Säule geladen wurden:

Fraktion	Verfahren bei einer Durchflussgesch windigkeit von 900 cm/Std., 16°C	Verfahren bei einer Durchflussgesch windigkeit von 1500 cm/Std., 50°C
Menge der geladenen Molke, in Litern	3180	3180
Menge der Waschlösung, in Litern	75	180
Eluierung des Laktoferrins, in Litern	73	150
Verarbeitete Gesamtmenge, in Litern	3328	3510
Verarbeitungsdauer, in Std.	3,1	2,4

Die nachstehende Tabelle zeigt die Ergebnisse aus den beiden Experimenten. (LF = Laktoferrin)

Durch-flussgeschwi ndigkeit cm/Std.	T °C	g LF im Eluat	Adsorbens-kapazität g LF/l Adsorbens	Expansion des Adsorbens H/H₀	Produktivität g LF/l Adsorbens/Std.
900	16	167	15,8	4 Mal	5,1
1500	50	158	14,9	3,3 Mal	6,2

Die Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, die Durchflussgeschwindigkeit von 1500 auf 2100 cm/Std. zu erhöhen, wenn die Temperatur von 16 auf 50°C erhöht wird, und dadurch eine höhere Produktivität zu erhalten. Durch analytische Standardverfahren, wie Größenausschlusschromatogrpahie und Natriumdodecyl-Geleletrophorese, konnte weder ein Abbau noch eine Denaturierung der Laktoferrinmoleküle festgestellt werden.
Beispiel 4
Isolierung von Molkeproteinen aus süßer Molke unter Verwendung der expanded Bett-Adsorption bei 1500 cm/Std.
Bei einem lokalen Milchproduktehersteller wurde süße Molke beschafft, deren pH-Wert 6,3 betrug.
Adsorbens

FastLine PRO, UpFront Chromatography.

Das Adsorbens basiert sich auf Agarose mit integrierten Wolframkarbidpartikeln, Dichte von ungefähr 2,9 g/ml, Partikelgröße im Bereich von 40–200 μm mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von 80 μm. Das Adsorbens umfasst Gemischtmodusliganden, die einen aromatischen Ringstruktur umfassen, mit einem Carboxylsäuresubstituenten. Das Adsorbens bindet Moleküle im pH-Wertbereich von 3 bis 6. Die Moleküle werden durch Erhöhung des pH-Wertes im Eluierungspuffer auf oberhalb von 7 freigesetzt.
Vorbehandlung der süßen Molke
Für die Durchführung des Experiments bei 50°C wurde die süße Molke durch einen Wärmetauscher gepumpt, um 50°C zu erreichen, bevor sie auf die Säule geladen wurde. Der pH-Wert wurde mit 1 M Salzsäure auf 4,7 angepasst.
Verfahrensparameter
Das Experiment wurde in einer expanded Bettsäule (∅ = 30 cm) FastLine^®300 Produkt Nummer 7300–0000, UpFront Chromatography, durchgeführt.
Die Säule wurde mit 15 cm Adsorbens (10,6 l) gepackt und mit entmineralisiertem Wasser auf 50°C eingestellt.
Es wurden 160 l süße Molke bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1500 cm/Std. auf die Säule geladen. Der Volumenfluss durch die Säule wurde in drei Fraktionen aufgefangen. Nicht-gebundenes Material wurde mit entmineralisiertem Wasser (290 l) ausgewaschen. Die gebundenen Proteine wurden in zwei Schritten eluiert.
Schritt 1: 50 mM Fettsäure, 0,1 mg/ml– SDS (Natrium-Dodecylsulfat) pH-Wert 5,3 (275 l).
Schritt 2: 20 mM NaOH (117 l).
Ergebnisse
Jede Fraktion aus dem Experiment wurde mit SDS-PAGE getestet, um den Gehalt und die Art der Proteine einzuschätzen.
SDS PAGE
Für das SDS PAGE wurde Invitrogen SDS Page 4–20% Tris-Glycingel (Kat. Nr. EC6025) verwendet. Zubereitung der Probe: 25 μl Probe und 25 μl Probenpuffer Tris-Glycin Invitrogen (Kat. Nr. LC2676) wurden gemischt und 5 Minuten lang in einem Wasserbad gekocht. Der Laufpuffer 0,024 M Tris (Sigma T1378), 0,19 M Glycin (Merck 5001901000), 0,1% SDS (Natriumdodecylsulfat, JT Baker 2811) pH-Wert 8,6 wurde hinzugefügt.
20 μl Probe wurden in jedem Analyseschlitz angebracht, und der Strom wurde eingestellt, um einen Strom von 40 mA zu ergeben. Als die blaue Linie aus dem Probenpuffer einen cm vom Boden des Gels erreichte, wurde der Strom abgestellt, und das Gel wurde über Nacht im Colloidal Blue Staining Kit (Kat. Nr. LC 6025) auf einem Rütteltisch eingefärbt. Am nächsten Tag wurde das Gel in Wasser überführt und 2 Stunden lang im Wasser entfärbt.
Das SDS-PAGE zeigt, dass der Proteingehalt in den drei Durchflussfraktionen von der Säule stark reduziert ist, wobei der größte Teil des Immunoglobulins G, das Rinderserumalbumin, das β-Laktoglobulin und das α-Laktalbumin an das Adsorbens gebunden sind. Im Eluierungsschritt 1 (unter Verwendung von 50 mM Adipinsäure, 0,1 mg/ml SDS (Natriumdodecylsulfat) pH-Wert 5,3) wird das gesamte gebundene β-Laktoglobulin wieder gewonnen.
Im Eluierungsschritt 2 wird unter Verwendung von 20 mM NaOH das gesamte gebundene Immunoglobulin G, das Rinderserumalbumin und das α-Laktalbumin wieder gewonnen. Durch analytische Standardverfahren, wie Größenausschlusschromatographie und Natriumdodecyl-Gelelektrophorese, wurde weder ein Abbau noch eine Denaturierung der Molkeproteinmoleküle festgestellt.
Beispiel 5
Isolierung von Laktoferrin aus nicht-pasteurisierter, entrahmter Milch unter Verwendung von expanded Bettchromatographie, die bei hoher Ladung mit linearen Durchflussgeschwindigkeiten von 4800 und 6000 cm/Std. und bei einer Temperatur von 50°C durchgeführt wurde.
Mit Ausnahme der Durchflussgeschwindigkeiten und dem Ladungsverhältnis waren alle Bedingungen ähnlich den im Beispiel 1 verwendeten Bedingungen.
Die nicht-pasteurisierte, entrahmte Milch hat eine anfängliche Laktoferrinkonzentration von 150 mg/l.
Ergebnisse
Die nachstehende Tabelle zeigt den aus dem Verfahren resultierenden Laktoferrinausbeute, das mit hoher Ladung und linearen Durchflussgeschwindigkeiten jeweils von 4800 oder 6000 cm/Std. erreicht wurde.

Durchflussge-schwindigkeit, cm/Std. Ausbeute, mg LF/l entrahmte Milch Ladung, l

4800 135 4500

6000 120 6000
Die Tabelle zeigt, dass es möglich ist, das Adsorbens unter Verwendung von linearen Durchflussgeschwindigkeiten von 4800 cm/Std. oder 6000 cm/Std. zu laden und dabei dennoch jeweils 90 Gew.-% und 80 Gew.-% des ursprünglichen Laktoferringehalts in entrahmter Milch wieder zu gewinnen.
Beispiel 6
Isolierung von Immunoglobulin G (IgG) aus süßer Molke unter Verwendung der expanded Bett-Adsorptionschromatographie, die bei unterschiedlichen Säulentemperaturen (jeweils 40°C, 50°C, 55°C, 60°C und 65°C) betrieben werden:
Die süße Molke wurde aus einer Käseproduktion erhalten.
Adsorbens:

FastLine PRO, UpFront Chromatography.

Vorbehandlung der nicht-pasteurisierten süßen Molke:
Für die Durchführung des Experiments jeweils bei 40°C, 50°C, 55°C, 60°C und 65°C wurde die süße Molke durch einen Wärmetauscher gepumpt, um jeweils 40°C, 50°C, 55°C, 60°C und 65°C zu erreichen, bevor sie auf die Säule geladen wurde.
Der pH-Wert der süßen Molke wurde auf 4,7 angepasst, bevor sie auf die Säule geladen wurde.
Verfahrensparameter
Das Experiment wurde in einer expanded Bettsäule (∅ = 30 cm) FastLine®300 Produkt Nummer 7300–0000, UpFront Chromatography, durchgeführt.
Die Säule wurde mit einer sedimentierten Betthöhe von 25 cm des Adsorbens (17,7 l) gepackt und dann mit entmineralisiertem Wasser auf eine Temperatur von jeweils 40°C, 50°C, 55°C, 60°C und 65°C eingestellt:
883 l süße Molke durch einen Wärmetauscher auf die Säule mit einer linearen Durchflussgeschwindigkeit von 1.800 cm/Std. geladen. Die ersten 5-fache Menge der Säulenvolumen der die Säule verlassenden Molke wurde gesammelt und für die folgende Waschung des Adsorbens verwendet.
Das Adsorbens wurde mit der 5-fachen Säulenvolumen gewaschen, die während des Ladens der Molke aufgefangen wurde (88,5 l). Dann wurde der pH-Wert in der Molke auf einen pH-Wert von 5,3 angepasst, bevor sie für die Waschung verwendet wurde. Im Anschluss an die erste Waschung der Säule mit der o. g. Molke (Durchlauffraktion) wurde die Säule mit entmineralisiertem Wasser gewaschen (89 l). Schließlich wurde das IgG aus dem Adsorbens unter Verwendung von 20 mM Natriumhydroxid (61 l) eluiert.
Ergebnisse
Die Konzentration an IgG in der Durchlauffraktion sowie in dem Fluid, das während der Waschung mit entmineralisiertem Wasser und der Eluierung mit NaOH eingesammelt wurde, wurde per einzelner radialer Immunodiffusion (RID) bestimmt. Es wurde Anti-Rinderimmunoglobulin aus Kaninchen von Dako Cytomation, Dänemark (Kat. Nr.: Z247) verwendet (1 μl pro cm2).
Die Menge des in den unterschiedlichen Fraktionen wiedergewonnen IgG wurde als der Prozentanteil des IgG bestimmt, der in jeder Fraktion im Verhältnis zur gesamten geladenen Menge des IgG festgestellt wurde, die auf 100% gesetzt wurde.
Alle Fraktionen aus den Experimenten wurden mit SDS-PAGE getestet, um den Inhalt und die Art der Proteine zu bewerten.
Die nachstehende Tabelle zeigt die Ergebnisse aus den fünf Experimenten.

Temperatur °C % IgG in der Durchlauffra ktion % IgG in der gewaschenen Fraktion % IgG im Eluat

40 25 5 65

50 25 5 65

55 15 0 75

60 15 0 75

65 25 5 40
Die größte Wiedergewinnung des IgG im Eluat wurde erreicht, wenn das Verfahren bei Temperaturen von 55°C oder 60°C betrieben wurden.
Die Ergebnisse der SDS-PAGE zeigen, dass alle Eluate (aus den Experimenten mit Säulentemperaturen von jeweils 40°C, 50°C, 55°C, 60°C und 65°C) als Hauptproteine IgG und Rinderserumalbumin (BSA) enthalten. Als unbedeutendere Proteine werden β-Laktoglobulin und α-Laktalbumin gesehen.
Es wird insbesondere festgestellt, dass die mit den Säulentemperaturen von mehr als 55°C verwendenden Experimenten erhaltenen Eluate eine erhebliche Menge an α-Laktalbumin enthalten.
Die höchste Reinheit des IgG wird erhalten, wenn die Säule bei 40°C oder bei 50°C betrieben wird.
Beispiel 7
Isolierung von IgG aus süßer Molke unter Verwendung der expanded Bett-Adsorptionschromatographie, betrieben bei 50°C und unter Einsatz der 2,5- oder 5,0-fachen Säulenvolumen, die während des Ladens auf das Adsorbens (Durchlaufmenge) aufgefangen wurde, als erste Waschflüssigkeit nach dem Laden der Molke auf das Adsorbens:
Alle Testbedingungen, mit Ausnahme der Menge der zum Waschen verwendeten Molke, der Betthöhe und der Ladungsmenge der Molke, waren dieselben wie die im Beispiel 6 beschriebenen Mengen:
Die Betthöhe beträgt 50 cm
Das Ladungsverhältnis zwischen der Molke und dem Adsorbens beträgt 1:40 (40 Liter Molke pro Liter Adsorbens, Mengen bis 1414 Litern)
Ergebnisse
Die nachstehende Tabelle zeigt die Ergebnisse der beiden Experimente.

Waschmenge CV % IgG im Durchlauf % IgG I Waschfraktion % IgG im Eluat

2,5 20 0 80

5 20 0 80
Es wird festgestellt, dass die Rückgewinnung des IgG in beiden Eluaten unabhängig von der Menge der ersten Waschflüssigkeit dieselbe ist.
Die Ergebnisse der SDS-PAGE zeigen, dass unterschiedliche Proteine in Eluaten vorhanden sind, die aus den Experimenten resultieren, die jeweils das 2,5-fache und das 5-fach der Säulenvolumen an süßer Molke für die erste Waschung des Adsorbens verwenden. z. B. ist β-Laktoglobulin in dem Eluat vorhanden, das aus dem „2,5"-Experiment resultiert, wohingegen das Protein nicht festgestellt wird, wenn die 5-fache Säulenmenge an süßer Molke wie die Waschflüssigkeit, für die erste Waschung des Adsorbens verwendet wird.
Beispiel 8
Isolierung von IgG aus süßer Molke unter Verwendung der expanded Bett-Adsorptionschromatographie, die bei Säulentemperaturen von 50°C und bei zwei unterschiedlichen Betthöhen betrieben werden, jeweils 25 cm und 50 cm:
Mit Ausnahme der Betthöhe waren alle Bedingungen dieselben wie in Beispiel 6 beschrieben:
Ergebnisse
Die nachstehende Tabelle zeigt die Ergebnisse der beiden Experimente

Betthöhe (cm) % IgG in der aufgefangenen Probe des Durchlaufs

25 35

50 25
Ein Anstieg der Betthöhe von 25 auf 50 cm senkt die Menge des IgG im Durchfluss der während des Ladens der Molke auf das Adsorbens aufgefangenen Probe um 10%, was zu einem höheren Ausbeute vom Rohmaterial führt.
Beispiel 9
Isolierung von IgG aus süßer Molke unter Verwendung der expanded Bett-Adsorptionschromatographie bei 50°C. Es wurden unterschiedliche Volumen von süßer Molke auf das Adsorbens geladen; Ladeverhältnis jeweils 1:30, 1:40 und 1:50:
Mit Ausnahme der Betthöhe (50 cm) und des Ladeverhältnisses waren alle Bedingungen dieselben wie im Beispiel 6 beschrieben:
Ergebnisse
Die nachstehende Tabelle zeigt die Ergebnisse der drei Experimente

Ladeverhältnis Menge der Molke (l)/ Menge des Adsorbens (l) Rückgewinnung von IgG (%) in der aufgefangenen „Durchlauffraktion"

30 15

40 15

50 30
Die Menge des wiedergewonnen IgG in der aufgefangenen Fraktion als die Durchflussfraktion beim Laden der Molke auf das Adsorbens steigt mit dem Anstieg des Ladeverhältnisses.
Beispiel 10
Isolierung von IgG aus süßer Molke unter Verwendung der expanded Bett-Adsorptionschromatographie bei 50°C. Die süße Molke wurde unter Verwendung unterschiedlicher linearer Durchflussgeschwindigkeiten auf das Adsorbens geladen: jeweils 1200 cm/Std., 1800 cm/Std. und 2400 cm/Std.:
Mit Ausnahme der Durchflussgeschwindigkeit waren alle Bedingungen dieselben wie in Beispiel 6 beschrieben.
Ergebnisse
Die nachstehende Tabelle zeigt die Ergebnisse aus den drei Experimenten

Durchflussge-schwindigkeit während des Ladens (cm/Std.) Rückgewinnung von IgG (%) in der aufgefangenen „Durchlauffraktion"

1200 7,5

1800 35

2400 50
Die Menge des IgG in der „Durchflussfraktion" steigt mit steigenden Durchflussgeschwindigkeiten
Beispiel 11
Polieren des aus süßer Molke isolierten Rinder-IgG zwecks Erhöhung der Reinheit. Das IgG-haltige Eluat (Produkt), das vom FastLine PRO Adsorbens erhalten wurde, wird durch einen schwachen Anionenaustauscher passiert, um das Rinderserumalbumin zu entfernen. Der schwache Anionenaustauscher bindet das Rinderserumalbumin; aus diesem Grund wird das verbleibende IgG in der Durchlauffraktion aufgefangen. Dies führt zu einer hochgradig gereinigten Probe in Bezug auf das IgG.
Es wurde das IgG-haltige Eluat aus Beispiel 7 (gewaschen mit der 5-fachen Säulenvolumen der aufgefangenen „Durchlauffraktion" der Molke) verwendet.
Das Verfahren wurde mit einem expanded Bettsystem bei Raumtemperatur bei einer linearen Durchflussgeschwindigkeit von 900 cm/Std. durchgeführt.
Adsorbens

FastLine PEI, UpFront Chromatography.

Vorbehandlung des IgG-Produkts
Der pH-Wert des IgG-Produkts wurde vor dem Laden auf die Säule mit 1 M Salzsäure auf eine pH-Wert von 7 angepasst.
Verfahrensparameter
Das Experiment wurde in einer expanded Bettsäule (0 = 10 cm) FastLine®100 Produkt Nummer 7100–0000, UpFront Chromatography, durchgeführt.
Die Säule wurde mit einer sedimentierten Betthöhe von 50 cm Adsorbens (3,9 l) gepackt und mit 1 M NaOH und entmineralisiertem Wasser eingestellt.
Es wurden 121 l BSA-haltiges IgG -Produkt mit einer linearen Durchflussgeschwindigkeit von 900 cm/Std. auf die Säule geladen.
Ergebnisse
Die Durchlauffraktion wurde eingesammelt und auf ihren Gehalt an BSA und IgG getestet.
Bestimmung des BSA und IgG
Die Konzentration an BSA und IgG in der Durchlauffraktion (igG-Produkt) wurde per einzelner radialer Immunodiffusion (RID) bestimmt.
Es wurde Anti-Rinderserumalbumin aus Kaninchen von Dako Cytomation (Kat. Nr.: Z229) verwendet (0,75 μl pro cm2).
Es wurde Anti-Rinderimmunoglobulin aus Kaninchen von Dako Cytomation (Kat. Nr.: 2247) verwendet (1 μl pro cm2).
Die Menge des BSA und des IgG im Durchlauf wird als ein Prozentanteil des BSA und IgG verglichen mit der Gesamtladung an BSA und IgG definiert, die 100% gleichkommt.
Alle Fraktionen aus dem Experiment mit SDS-PAGE wurden getestet, um den Gehalt und die Art des Proteins zu bewerten.
Die SDS-PAGE zeigt, dass 90% des BSA unter Verwendung des oben erwähnten schwachen Anionenaustauschers entfernt worden sind. Es wird davon ausgegangen, dass die gereinigte IgG-Fraktion in Bezug auf das IgG eine Reinheit von mehr als 80% hat.
Beispiel 12
Isolierung von Lysozym aus Eiweiß unter Verwendung der expanded Bett-Adsorptionschromatographie bei 50°C. Das Eiweiß wurde bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1500 cm/Std. auf das Adsorbens geladen.
Das Eiweiß wurde von einem lokalen industriellen Eierproduzenten beschafft.
Adsorbens

FastLine SP, UpFront Chromatography.

Vorbehandlung des Eiweißes:
Zur Durchführung des Experiments bei 50°C wurde das Eiweiß durch einen Wärmetauscher gepumpt, um 50°C zu erreichen, bevor es auf die Säule geladen wurde.
Der pH-Wert des Eiweißes wurde mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 abgestimmt, bevor es auf die Säule geladen wurde.
Verfahrensparameter:
Das Experiment wurde in einer expanded Bett-Säule (∅ = 30 cm) FastLine®300 Produktnummer 7300–0000, UpFront Chromatography, durchgeführt.
Die Säule wurde mit einer sedimentierten Betthöhe von 25 cm Adsorbens (17,7 l) gepackt und mit entmineralisiertem Wasser bei 50°C abgestimmt.
Es wurden 142 l Eiweiß bei einer linearen Durchflussgeschwindigkeit von 1500 cm/Std. auf die Säule geladen.
Das Adsorbens wurde zunächst mit 50 mM Natriumchlorid (177 l) gewaschen. Dann wurde das Lysozym vom Adsorbens unter Verwendung von 20 mM Natriumhydroxid (195 l) eluiert.
Ergebnisse
Die Aktivität des Lysozyms wurde unter Verwendung von Micrococcus Lysodeikticus-Zellen, Sigma Chemicals, USA (Shugar, David. Biochimica et Biophysica Acta 1952, 8,302–309) bestimmt.
Das Eluat enthielt 525 g hochgradig gereinigtes Lysozym. Die Ausbeute des Lysozyms war hoch, ungefähr 100%.
Die Reinheit des Lysozyms erwies sich als hoch und wurde auf mehr als 90% geschätzt, wie unter Verwendung von SDS-PAGE nachgewiesen wurde.
Beispiel 13
Isolierung von Kartoffelproteinen aus Kartoffelsaft unter Verwendung von einer bei 50°C durchgeführten expanded Bett-Adsorptionschromatographie. Der Kartoffelsaft wurde bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1500 cm/Std. auf das Adsorbens geladen.
Der Kartoffelsaft wurde aus gewaschenen Kartoffeln hergestellt. Die Kartoffeln wurden 5 Minuten lang in einem Schnittmixer behandlet, es wurden 30 ml Natriumsulfit pro 2 kg Kartoffeln hinzugefügt, um die enzymatische Braunfärbung des Saftes zu verhindern. Die vermischten Kartoffeln wurden durch ein 100 μm Nylonnetz gedrückt und der Saft wurde aufgefangen.
Adsorbens

FastLine PRO, UpFront Chromatography.

Vorbehandlung des Kartoffelsaftes
Zur Durchführung des Experiments bei 50°C wurde der Kartoffelsaft durch einen Wärmetauscher gepumpt, um 50°C zu erreichen, bevor er auf die Säule geladen wurde.
Der pH-Wert des Saftes wurde mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,5 angepasst, bevor er auf die Säule geladen wurde.
Verfahrensparameter:
Das Experiment wurde in einer expanded Bett-Säule (∅ = 30 cm) FastLine®300 Produktnummer 7300–0000, UpFront Chromatography, durchgeführt.
Die Säule wurde mit einer sedimentierten Betthöhe von 65 cm Adsorbens (46 l) gepackt und mit entmineralisiertem Wasser bei 50°C abgestimmt.
Es wurden 610 l Kartoffelsaft mit einer linearen Durchflussgeschwindigkeit von 1500 cm/Std. auf die Säule geladen.
Das Adsorbens wurde mit 10 mM Natriumzitrat, pH-Wert 4,5 (322 l) gewaschen. Die Proteine wurden mit 10 mM Natriumhydroxid (230 l) vom Adsorbens eluiert.
Ergebnisse:
Das Eluat wurde gefriergetrocknet und der Proteingehalt wurde durch Kjeldahl bestimmt.
Nach dem Gefriertrocknen wurden 525 g Kartoffelpulver gewonnen. Die Proteinanalyse zeigte, dass der Proteingehalt 95% betrug.

Claims

Verfahren zur Isolierung von einem oder mehreren Bio-Molekül(en) aus einem bio-molekülhaltigen Fluid, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: a) wahlweise Einstellung des pH-Wertes des bio-molekülhaltigen Fluids; b) Veranlassung der Temperatur des bio-molekülhaltigen Fluids auf mindestens 40°C zu steigen; c) Anbringung einer Menge des bio-molekülhaltigen Fluids mit einer Temperatur von mindestens 40°C auf eine expanded Bett-Adsorptionssäule, die ein Adsorbens umfasst, wobei die expanded Bettsäule mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von mindestens 1500 cm/Stunde betrieben wird; d) wahlweises Waschen der Säule; e) Eluierung von mindestens einem Bio-Molekül vom Adsorbens.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die expanded Bettsäule eine großformatige Säule ist, die mindestens 10 l sedimentiertes Adsorbens umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2, worin die expanded Bettsäule eine großformatige Säule ist, die ca. 50 bis 100 l sedimentiertes Adsorbens, vorzugsweise ca. 100 bis 1000 l Adsorbens, noch bevorzugter ca. 200 bis 900 l Adsorbens, am meisten bevorzugt ca. 300 bis 800 l Adsorbens umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die expanded Bettsäule einen Durchmesser von mindestens 10 cm, vorzugsweise mindestens 20 cm, noch bevorzugter im Bereich von ca. 50 cm bis 200 cm, wie z.B. 100 bis 150 cm, hat.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin das eine oder mehrere Bio-Moleküle) ein Molekulargewicht von mindestens 1000 Daltons, vorzugsweise mindestens 1500 Daltons, noch bevorzugter mindestens 2000 Daltons hat/haben.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin das eine oder mehrere Bio-Molekül(e) aus der Gruppe bestehend aus Peptiden, Proteinen, Lipiden, Lipoproteinen, Polysacchariden, DNA, RNA, Plasmiden, Polynukleotiden, Viruspartikeln, Zellenbestandteilen, Zellen und Kombinationen davon gewählt ist/sind.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Proteine aus der Gruppe bestehend aus Lactoferrin, β-Lactoglobulin, α-Lactalbumin, Immunoglobulinen und Lactoperoxidase gewählt sind.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin das bio-molekülhaltige Fluid aus der Gruppe bestehend aus Körperflüssigkeiten, Fermentierungsflüssigkeiten, Abwasser, Prozesswasser, Pflanzenextrakten, Gewebeextrakten aus Tieren, Blutplasma aus Tieren, Serum aus Tieren, Synthesemischungen und daraus abgeleiteten Flüssigkeiten gewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die Körperflüssigkeit aus der Gruppe bestehend aus Milch, Plasma, Harn, Eiweiß und daraus abgeleiteten Flüssigkeiten gewählt ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Adsorbens aus Adsorptionspartikeln besteht, worin 50% der Anzahl von Partikeln eine Partikelgröße von höchstens 200 μm, vorzugsweise höchstens 175, 150, 120, 100 oder 80 μm hat.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Adsorbens aus Adsorptionspartikeln besteht, worin 50% der Anzahl von Partikeln eine Partikelgröße von höchstens 200 μm, wie z. B. höchstens 150 μm, insbesondere höchstens 120 μm, insbesondere höchstens 100 μm, insbesondere höchstens 90 μm, insbesondere höchstens 80 μm, insbesondere höchstens 70 μm hat.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Adsorptionspartikel eine Dichte von mindestens 1,5 g/ml hat.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die lineare Fließgeschwindigkeit von ca. 1,500 bis 12,000 cm/Stunde, vorzugsweise von ca. 1,800 bis 10,000 cm/Stunde, wie z. B. ca. 3000 cm/Stunde ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die angebrachte Menge von ca. 2–3500 l/min ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die angebrachte Menge pro Liter Adsorbens in einer Stunde mindestens 50 l, vorzugsweise mindestens 100 l, noch bevorzugter mindestens 150 l/min ist.