BR112015000188B1 - Processo para o isolamento de uma fração de proteína de batata nativa do suco de batata - Google Patents

Abstract

resumo patente de invenção: "isolados de proteína de batata". a presente invenção refere-se a um processo para obter uma fração de proteína de batata com o uso de um absorvente específico. especificamente, a invenção refere-se ao material de carreador, que compreende um material polimérico específico, funcionalizado com ligantes adequados. através do uso de um carreador de apoio funcionalizado de acordo com a presente invenção, uma fração de proteína de batata pode ser obtida com eficácia superior. 23487829v1 1/1 23487829v1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO PARA O ISOLAMENTO DE UMA FRAÇÃO DE PROTEÍNA DE BATATA NATIVA DO SUCO DE BATATA.

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se ao campo de proteínas alimentares, particularmente, o isolamento de uma fração de proteína de batata.

ANTECEDENTES [002] O suco de batata fresco é uma mistura complexa de material solúvel e insolúvel. O mesmo tem um teor de proteína alto e compreende adicionalmente amido residual, minerais, glicoalcaloides tóxicos e fenóis reativos poliméricos e monoméricos. O mesmo é um subproduto da produção de amido de batata e geralmente visto como refugo.

[003] O suco de batata contém uma quantidade relativamente alta de proteínas, até 1,5% em peso. As mesmas podem ser divididas em três grupos: (i) uma fração de peso molecular alto (HMW) de glicoproteínas de 43 kDa ácidas altamente homólogas (40 a 50% em peso de proteína de batata total), (ii) peso molecular baixo básico (LMW) 5 a 25 kDa dentre os quais são glicoproteínas (30 a 40% em peso de proteína de batata total) e (iii) outras proteínas (10 a 20% em peso da proteína de batata total). A patatina é uma família de glicoproteínas que tem atividades de transferase e acil hidrolase lipídica e será predominantemente parte da fração HMW. A fração LMW compreende tipicamente inibidores de protease e outras proteínas geralmente com um peso molecular baixo.

[004] Apesar de o suco de batata ser considerado refugo, a qualidade nutricional das proteínas de batata é maior do que aquela da caseína e comparável àquela do ovo inteiro. A proteína de batata é rica em lisina e teoricamente um excelente suplemento para proteínas

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2/42 pobres em lisina tais como aquelas dos cereais. Apesar de suas qualidades nutricionais únicas, a proteína de batata é atualmente somente usada como alimentação animal, porque os produtos disponíveis exibem várias desvantagens sérias.

[005] Uma das maiores desvantagens é que é difícil isolar as proteínas de batata na forma nativa. A recuperação da proteína de batata do efluente de moinhos de amido de batata é comumente realizada em uma escala industrial por coagulação por calor, o que leva à proteína de batata desnaturada. Na forma desnaturada, as proteínas são desprovidas de suas propriedades funcionais desejáveis, tal como capacidade de emulsificação, capacidade de formação de espuma, capacidade termogelificante, capacidade de ligação de água e similares. Até mesmo a exigência mais essencial para essa aplicação na indústria alimentar, isto é, a solubilidade em água, não pode ser cumprida.

[006] As tentativas precedentes de isolar as proteínas do suco de batata por métodos mais brandos tal como técnicas de filtração por membrana e precipitação têm provado ser ineficazes no ambiente de produção de escala industrial. Isso é por causa da capacidade de separação e perda de fluxo contaminante e incrustação de membrana. Além disso, tais métodos não têm capacidade para a separação entre as várias classes de proteína presentes no suco de batata. A filtração de membrana, por exemplo, não pode separar o produto de proteína de peso molecular alto dos componentes fenólicos polimerizados ou polissacarídeos visto que a membrana tenderá a reter todos os mesmos.

[007] As proteínas de batata nativas foram isoladas antes industrialmente. O documento n^o WO 2008/069650 no nome de Cooperatie Avebe U.A. revela um processo para o isolamento de isolados de proteína de batata nativa com teor de glicoalcaloide baixo. O processo compreende a floculação e a absorção de leito expandido para absor

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3/42 ver as proteínas de batata a um absorvente e eluir subsequentemente o isolado de proteína de batata nativa. Esse processo, entretanto, é custoso e os ligantes de modo misto usados na absorção de Leito Expandido são relativamente instáveis no suco de batata.

[008] O documento n^o WO 2008/092450 no nome de Upfront

Chromatography revela um método para o isolamento e o fracionamento em grande escala das proteínas de batata com o uso de ligantes e fracionamento com base em pH. Entretanto, é revelado que os ligantes são sensíveis a processos oxidativos no suco de batata e, embora a adição de sulfito mitigue esse problema, não impede o mesmo completamente. A degradação oxidativa relativamente rápida dos ligantes permanece um problema. Ademais, não há notícia da influência da porosidade da capacidade de absorção, de modo que as capacidades de absorção variem expressivamente com diferentes absorventes. Por essa razão, muitos dos ligantes mencionados nessa publicação não são adequados de modo algum para o propósito de isolar as proteínas de batata pela operação estável em uma escala industrial econômica.

[009] Assim, permanece uma necessidade de um método melhorado para isolar uma fração de proteína de batata nativa. Esta invenção pertence à revelação de que a natureza do ligante usado no material de absorção, os meios de acoplamento do ligante a esse material de absorção e a porosidade do material absorvente têm, cada um, uma influência forte na eficácia da absorção de proteínas de batata. Assim, um método otimizado para o isolamento de uma fração de proteína de batata nativa é apresentado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0010] Esta invenção refere-se a um método para o isolamento de uma fração de proteína de batata nativa. Especificamente, um método para o fracionamento de proteínas de batata por ponto isoelétrico é

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4/42 discutido, permitindo o isolamento de duas frações, sendo uma fração de peso molecular alto e uma fração de peso molecular baixo. As frações podem ser obtidas sem incrustação e a purificação adicional para remover os compostos coloridos não é exigida.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0011] Figura 1 Fórmulas estruturais para os ligantes Streamline

Direct CST1 (CST1), Sepabead HFA funcionalizado com ácido 4mercaptobenzoico (HFA MBA) e Sepabead EP funcionalizado com ácido 4-mercaptobenzoico (EP MBA). O carreador de suporte é representado por um círculo preenchido.

[0012] Figura 2 Coloração do carreador de suporte funcionalizado em um teste de incrustação acelerada após 3x24 horas de incubação com suco de fruto de batata não estabilizado (que não contém sulfito)

a) com os ligantes ácidos 1-12 e b) com Streamline Direct CST1 e Sepabead HFA com ligantes 4MBA.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0013] A invenção refere-se a um processo para o isolamento de uma fração de proteína de batata nativa do suco de batata que compreende a) ajustar o pH do suco de batata a 4,0 a 6,5; b) contatar o suco de batata com um carreador de suporte funcionalizado que tem poros em que pelo menos 90% dos poros têm um diâmetro de poro entre 10 e 200 nm e em que o carreador é funcionalizado com um ligante de modo misto hidrofóbico que tem um pKa 2,5 a 5, de preferência 4 a 5, tal ligante é acoplado ao carreador através de um átomo de S ou O, de preferência, um grupo tioéter; c) dessorver a fração de proteína de batata do carreador de suporte funcionalizado por eluição e d) concentrar e/ou secar opcionalmente a fração de proteína de batata.

[0014] Para a presente invenção, entende-se que suco de batata significa qualquer tipo de líquido derivado de batata que contém uma

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5/42 quantidade significativa de proteínas de batata nativas e inclui, dentre outros, suco de fruto de batata (PFJ) que é normalmente obtido como um subproduto da produção de amido, assim como PFJ diluído conhecido como água de fruto de batata (PFW). Assim, o mesmo pode ser usado na forma em que é geralmente considerado um fluxo de refugo, por exemplo, a partir da produção de amido de batata ou a partir do processamento de batatas de consumo, ambos em forma diluída ou parcialmente processada.

[0015] O suco de batata pode também ser esgotado de uma fração particular de proteínas de batata, tal como, por exemplo, obtido após a aplicação de um processo de acordo com a presente invenção. Por exemplo, o suco de batata que foi limpo ou parcialmente limpo da fração de inibidor de protease, referida como a fração de peso molecular baixo (LMW), é chamado de suco de batata esgotado de LMW ou parcialmente esgotado de LMW. Além disso, o suco de batata que foi limpo ou parcialmente limpo da fração de patatina, referida como a fração de peso molecular alto (HMW), é chamado de suco de batata esgotado de HMW ou parcialmente esgotado de HMW. Além disso, os mesmos são considerados suco de batata para o uso em um processo de acordo com a presente invenção.

[0016] Os grupos funcionais, conforme definido no presente documento, são grupos que incorrem reatividade química significativa a uma molécula, que resulta na alteração da molécula ou grupo sob consideração. Essa reatividade química é definida principalmente pela reatividade em um ambiente de redução de água, tal como encontrado no suco de batata. Como tal, grupos altamente estáveis tais como anéis aromáticos não substituídos por um grupo que ativa o anel aromático o suficiente para alterar significativamente o grupo em tal ambiente (anéis aromáticos inativados) não são considerados grupos funcionais para o escopo da invenção. Assim, os anéis de fenila e heteroci

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6/42 clos tais como derivados de piridina inativados não são considerados grupos funcionais para o escopo da invenção.

[0017] Um grupo de acoplamento, conforme usado no presente documento, é um átomo ou grupo de átomos através dos quais o ligante é acoplado ao carreador. O mesmo foi formado pelo acoplamento de reação química do ligante ou ao espaçador ou ao carreador de suporte ou pelo acoplamento do espaçador ao carreador de suporte.

[0018] A estrutura principal, conforme usado no presente documento, é a cadeia de átomos que conecta o ligante ao carreador de suporte, incluindo o(s) grupo(s) funcional(is). Mais particularmente, a mesma é a cadeia mais curta de átomos que conecta linearmente o ligante ao carreador de suporte.

[0019] A fração de peso molecular alto (HMW) ou rica em patatina de proteínas de batata tem mais interesse comercial, porque essa fração é mais difícil de obter em forma pura e nativa do que a fração de peso molecular baixo (LMW), que é rica em inibidores de protease. Além disso, a mesma é a fração mais homogênea de proteínas de batata. Por essa razão, a presente invenção foca no isolamento na forma de nativa das proteínas na fração HMW, que compreende predominantemente patatina lábil ao calor ou ácido. Isso é alcançado através do isolamento concomitante da fração LMW de proteínas de batata. Como ambos os produtos em forma pura e nativa são economicamente interessantes contanto que a eficácia de isolamento seja alta, entendese que a presente revelação também pertence à fração LMW isolada da proteína de batata.

[0020] O suco de batata cru é o suco de batata que não passou por qualquer purificação e pode ser usado como tal ou ser primeiro submetido a um pré-tratamento não invasivo que não afeta o teor e a natureza das proteínas de batata incluídas no suco. Tais tratamentos podem, por exemplo, ser o ajuste de pH, clarificação ou remoção de

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7/42 cor, tal como feito por centrifugação, filtração, floculação e/ou absorção. Especificamente, vários processos existem para pré-limpar o suco de batata, com o objetivo de remover, por exemplo, contaminantes indesejados, tal como, por exemplo, glicoalcaloides, (poli)fenóis, pectinas, lipídios, ácidos graxos e/ou proantocianidinas e derivados coloridos dos mesmos, tais como epicatecinas e antocianinas. Os processos para remover um ou mais desses contaminantes, especificamente glicoalcaloides, são descritos em pedidos pendentes WO 2008/056977, que descrevem a absorção de contaminantes de um fluxo de processo de suco de batata pelo contato com um silicato em camadas. Alternativamente, o documento n^o WO 2008/069651 descreve a absorção de contaminantes de uma solução aquosa de um fluxo de processo vegetal pelo contato com carbono ativado. Um processo que compreende o pré-tratamento do suco de batata antes da aplicação do processo da presente invenção pode ser especialmente vantajoso ao usar um pré-tratamento que compreende um processo de floculação, por exemplo, com íons de metal bivalentes tais como sais de cálcio ou magnésio.

[0021] O ponto isoelétrico (IEP) de uma proteína é o valor de pH no qual tanta carga positiva está presente nos aminoácidos quanto há carga negativa. Por essa razão, no IEP, uma proteína tem uma carga neutra líquida. Ao submeter uma proteína a um pH abaixo de seu IEP, a proteína tem uma carga positiva líquida e ao submeter uma proteína a um pH acima de seu IEP uma proteína tem uma carga negativa líquida. O IEP pode ser determinado por procedimentos padrão tal como a focagem isoelétrica (IEF).

[0022] Em uma modalidade preferencial que usa o carreador de suporte funcionalizado descrito no presente documento, as proteínas podem ser fracionadas ao ponto isoelétrico e concomitantemente por peso molecular. Isso permite a separação de uma fração de proteína

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8/42 de batata, tal como, por exemplo, uma fração de patatina ou fração de inibidor de protease. Um aspecto especial da presente invenção é que uma ou mais frações de proteína de batata podem ser ligadas ao carreador de suporte funcionalizado e fracionadas para obter uma ou mais frações de proteína de batata nativas. As proteínas de batata se ligam aos ligantes no carreador de suporte funcionalizado apresentado no presente documento sem a ligação concomitante excessivo de componentes de suco de batata coloridos e o carreador de suporte funcionalizado é estável à deterioração e/ou degradação por componentes de suco de batata.

[0023] O processo da invenção pode ser realizado em dois modos diferentes, referidos como absorção seletiva e eluição seletiva. Por causa dos dois modos diferentes de uso da presente invenção, a invenção pode ser usada para obter todas as proteínas de batata presentes no suco de batata como uma mistura que compreende a fração LMW e HMW. Além disso, a invenção pode ser usada para fracionar as proteínas de batata do suco de batata em uma fração HMW e/ou LMW. A eluição é executada, de preferência, com tampão aquoso.

[0024] Em um modo da invenção, uma fração de proteína de batata é obtida por absorção seletiva. Nesse modo, o pH do suco de batata é ajustado na etapa a) da invenção a entre 4,0 e 6,5, de preferência, 6,0. Subsequentemente, na etapa b) da invenção, o suco de batata é contatado com um carreador de suporte funcionalizado no qual pelo menos 90% dos poros têm um diâmetro de poro entre 10 e 200 nm e em que o carreador é funcionalizado com ligante de modo misto hidrofóbico que tem um pKa 2,5 a 5, de preferência, 4 a 5, tal ligante é acoplado ao carreador através de um átomo S ou O, de preferência, um grupo tioéter. A etapa b) desse modo resulta na absorção seletiva da fração LMW da proteína de batata e, como uma consequência, o suco de batata após o contato com o carreador de suporte funcionalizado é

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9/42 esgotado da fração LMW da proteína de batata. Isso resulta no suco de batata esgotado de LMW. Na etapa c) dessa modalidade, a fração LMW da proteína de batata é dessorvida do carreador de suporte funcionalizado por eluição ácida a um pH menor do que 3 (eluição ácida) ou a um pH maior do que 9 (solução alcalina). A eluição ácida resulta eventualmente em um produto de proteína com uma melhor qualidade em relação a cor, odor e gosto.

[0025] Em outro modo da invenção, tanto as proteínas de batata

HMW quanto as proteínas de batata LMW, se presentes, são primeiro absorvidas ao carreador de suporte funcionalizado como uma mistura de proteína que compreende a fração HMW e LMW, se presentes, da proteína de batata. Portanto, o método pertence à absorção da fração de proteína de batata total. Desse modo, o suco de batata pode ser suco de batata cru ou pré-tratado conforme descrito acima, em tal caso, tanto a fração HMW quanto a LMW das proteínas de batata são absorvidas. Além disso, o suco de batata esgotado de LMW, tal como obtido após a absorção seletiva da fração LMW das proteínas de batata, pode ser convenientemente usado, em tal caso essencialmente somente a fração HMW das proteínas de batata está presente. Nesse caso, esse modo implica a absorção seletiva da fração HMW da proteína de batata do suco de batata esgotado de LMW.

[0026] Esse modo da invenção compreende, na etapa a), uma etapa de ajuste de pH em que o pH do suco de batata é ajustado a entre 4,0 e 6,5, de preferência, 5,2. Subsequentemente, na etapa b), o suco de batata é contatado com um carreador de suporte funcionalizado no qual pelo menos 90% dos poros têm um diâmetro de poro entre 10 e 200 nm e em que o carreador é funcionalizado com um ligante de modo misto hidrofóbico que tem um pKa 2,5 a 5, de preferência, 4 a 5, tal ligante é acoplado ao carreador através de um átomo S ou O, de preferência, um grupo tioéter. Nessa modalidade, a etapa b) resulta na

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10/42 absorção tanto da fração HMW quanto da LMW das proteínas de batata, se presentes. Na etapa c), as proteínas de batata presentes no suco de batata podem ser eluídas como uma única fração de proteína que compreende tanto a fração HMW quanto a LMW por eluição ácida ou eluição alcalina a um pH < 3 ou pH > 9. Também nesse caso, a eluição ácida resulta em produtos de proteína com qualidade superior em relação à cor, odor e gosto.

[0027] Alternativamente para esse modo da invenção, na etapa c), a eluição seletiva pode ser realizada. Nesse caso, na etapa c), a dessorção de uma fração de proteína de batata do carreador de suporte funcionalizado é realizada pela primeira eluição seletiva da fração HMW da proteína de batata a um pH 5,7 a 6,3, de preferência, 6,0. Subsequentemente, a eluição seletiva de uma fração LMW da proteína de batata, se presente, pode ocorrer a um pH menor do que 3 por eluição ácida ou a um pH maior do que 9 por eluição alcalina conforme descrito acima. Quando o suco de batata esgotado de LMW é usado nessa modalidade, um pH de eluição maior pode ser usado, tal como um pH 5,7 a 8,9, de preferência, 8,0, que aumenta a eficácia de eluição da fração HMW.

[0028] Geralmente, na etapa a) da presente invenção, o pH do suco de batata é ajustado a 4,0 a 6,5, de preferência, 5,2 para absorção ao carreador de suporte funcionalizado de todas as frações de proteína de batata presentes no suco de batata e a eluição subsequente de uma fração de proteína de batata. Alternativamente, o pH do suco de batata é ajustado a 4,0 a 6,5, de preferência, 6,0 para a absorção seletiva da fração LMW de proteína de batata.

[0029] O ajuste do pH do suco de batata a 4,0 a 6,5 pode ser feito com o uso de vários ácidos e/ou bases conhecidos na técnica, em forma concentrada ou diluída ou combinados para resultar em um tampão. Consequentemente, vários tipos de ácidos fortes podem ser

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11/42 usados, tal como ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico. Além disso, ácidos fracos podem ser usados, tal como ácido fosfórico, ácido fórmico, ácido acético, ácido cítrico, ácido lático. Além disso, pode ser possível que um pré-tratamento do suco de batata tenha um resultado que o ajuste a um pH maior é exigido. Nesse caso, as bases fortes preferenciais são, por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de cálcio. As bases fracas preferenciais são, por exemplo, sais de sódio e potássio de carbonato, fosfato, acetato, citrato, (bi)sulfito. Quando tampões são usados, as combinações dos ácidos fracos e bases fortes mencionados acima ou outros ácidos fracos e bases fortes conforme conhecidos na técnica são usados para ajustar o suco de batata ao pH exigido.

[0030] Em geral, de preferência, o ácido forte e/ou base é usado para ajustar o pH, de preferência máxima, ácido clorídrico e/ou hidróxido de sódio. Outro ácido mais preferencial para ajustar o pH é ácido fórmico, especialmente quando o teor de cloreto inferior é procurado.

[0031] Na etapa b) da presente invenção, o suco de batata é contatado com um carreador de suporte funcionalizado. O carreador de suporte pode ter múltiplas formas ou formatos, contanto que o mesmo permita o contato suficiente com o suco de batata para permitir a absorção. O carreador de suporte pode tomar qualquer formato, tal como um formato esférico, de feijão, de gota ou elipsoide e inclui, dentre outros, uma microesfera, partícula ou rede, mas outros formatos são concebíveis por aqueles versados na técnica. De preferência, o carreador de suporte é essencialmente esférico e está na forma de partículas. As partículas ou microesferas preferencias têm um tamanho de microesfera de 50 a 150 pm de raio. Esse tamanho de microesfera fornece um bom equilíbrio entre a capacidade de absorção, que é maior para o tamanho de microesfera menor, e a sensibilidade para parâmetros de processo tal como pressão e custo.

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12/42 [0032] Um aspecto importante do carreador de suporte é que o mesmo é um material poroso. Os poros, entretanto, podem ser preenchidos ou revestidos com um hidrogel. Particularmente, o carreador de suporte deve conter poros, pelo menos 90%, de preferência 95% e, de maior preferência, 98% e, de preferência máxima, pelo menos 99% dos quais têm um limite de diâmetro de poro inferior de 10 nm e um limite de diâmetro de poro superior de 200 nm. Assim, entende-se que um diâmetro de poro entre 10 e 200 nm significa que pelo menos 90%, de preferência 95% e de maior preferência 98% e de preferência máxima pelo menos 99% de todos os poros têm um diâmetro de poro entre 10 e 200 nm. De preferência, os poros têm um limite de diâmetro de poro inferior de 20 nm e um limite de diâmetro de poro superior de 150 nm, de preferência 100 nm e, de preferência ainda maior, os poros têm um limite de diâmetro de poro inferior de 30 nm e um limite de diâmetro de poro superior de 100 nm, de preferência 75 nm. O diâmetro de poro é convenientemente determinado por porosimetria com o uso de intrusão de mercúrio, que é uma técnica bem conhecida ao versado na técnica.

[0033] Além disso, um material poroso, nesse contexto, é um material no qual a porosidade, definida como o volume de poro total de todos os poros com um diâmetro menor do que 150 nm, está entre 0,5 ml/g e 1,5 ml/g. De preferência, a porosidade é 0,7 a 1,1 ml/g. A porosidade, em relação a esta invenção, é também determinada por intrusão de mercúrio.

[0034] Para o escopo da presente invenção, o diâmetro de poro e a porosidade do carreador de suporte são de alta importância. Entretanto, o carreador de suporte pode ser montado em um núcleo adequado, de modo que o carreador de suporte cubra a maioria ou todo o núcleo. Alternativamente, o carreador de suporte pode ser descrito por um material de núcleo coberto por um revestimento do material poro

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13/42 so. Tais núcleos podem ser usados por várias razões, tal como para diminuir a quantidade de material poroso exigido ou alterar a densidade ou peso da partícula. O núcleo pode ser de qualquer material para alcançar esses alvos, incluindo materiais poliméricos ou metálicos, assim como materiais inorgânicas tais como óxidos de metal. De preferência, óxido de tungstênio (WC), ferro ou magnetita são usados como um material de núcleo. A razão de entre núcleo e carreador de suporte pode ser qualquer coisa, contanto que a partícula completa cumpre os critérios de porosidade suficiente e retém a possibilidade de ser funcionalizada com um ligante adequado conforme descrito abaixo. Um carreador de suporte funcionalizado de acordo com a invenção é obtido reagindo-se ligantes adequados com o carreador de suporte, obtendo assim um carreador de suporte funcionalizado para o uso na presente invenção.

[0035] Um pré-requisito para o contato suficiente para permitir a absorção é usar um carreador de suporte com um diâmetro de poro de 10 a 200 nm, de preferência 10 a 150 nm, de maior preferência 20 a 100 nm e de preferência ainda maior 30 a 75 nm. Um diâmetro de poro maior é revelado para impedir a absorção, enquanto que poros maiores resultam em superfície de contato menores com capacidade de absorção baixa especialmente da fração HMW como um resultado. O material do qual o carreador de suporte é feito é menos importante, desde que as características mencionadas sejam satisfeitas. Assim, o material pode ser qualquer polímero ou biomaterial que seja estável sob as condições de processo e possa ser preparado para ter poroso com um diâmetro de poro conforme descrito enquanto é funcionalizado com pelo menos um ligante de modo misto hidrofóbico que tem um pKa 2,5 a 5, que é acoplado ao carreador através de um átomo de S ou O, de preferência um grupo tioéter.

[0036] Um carreador de suporte para o ligante pode ser um polí

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14/42 mero sintético poroso, um polissacarídeo poroso, um material inorgânico poroso ou qualquer combinação dos mesmos. De preferência, um carreador de suporte pode ser feito de polímeros sintéticos porosos tal como metacrilato de polimetila (PMMA), poliacril amida, polimetacrilato ou poliestireno, polissacarídeos porosos como celulose, dextrano ou agarose e/ou sílica porosa, vidro de poro controlado ou hidróxiapatita. De preferência máxima, entretanto, a agarose e/ou PMMA são usados como o carreador de suporte.

[0037] Um carreador de suporte que compreende uma combinação de um material sólido poroso, tal como material inorgânico poroso, tal como cerâmica, com um material de hidrogel poroso, dentre os quais, por exemplo, determinados polissacarídeos porosos tal como agarose também podem ser usados.

[0038] Os ligantes a serem ligados ao carreador de suporte são de alta importância para alcançar adsorção suficiente das proteínas de batata ao carreador de suporte funcionalizado. Os ligantes adequados são ligantes de modo misto hidrofóbicos. Isso significa que o comportamento dos mesmos se baseia em uma combinação de interações eletrostáticas e hidrofóbicas. A hidrofobicidade do ligante é importante para ligar a fração de HMW da proteína de batata. Os ligantes hidrofóbicos são conhecidos na técnica, os mesmos podem ser qualquer grupo miscível em não água, isto é não polar. Foi revelado que os grupos hidrofóbicos conforme descritos abaixo permitem colocar a invenção em prática.

[0039] Foi revelado que a patatina prefere um ambiente um pouco hidrofóbico e, portanto, adsorve a um carreador de suporte funcionalizado cm um determinado grau de hidrofobicidade. Os ligantes hidrofóbicos são conhecidos na técnica e podem compreender grupos aromáticos ou heteroaromáticos, assim como outros componentes moleculares hidrofóbicos. Entretanto, ao usar somente ligantes hidrofóbicos

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15/42 sem outra funcionalidade, a absorção da fração HMW, assim como a absorção de espécies coloridas contaminantes dentre as quais fenóis, é observada. Isso tem um impacto negativo no isolamento da fração HMW da proteína de batata. Por essa razão, outra funcionalidade para impedir a contaminação é também desejada.

[0040] Também foi revelado que o pKa do ligante no carreador de suporte de entre 2,5 e 5, de preferência entre 4 e 5, é benéfico para a absorção apropriada da proteína de batata ao carreador de suporte funcionalizado. Assim, de preferência, um grupo ácido carboxílico está presente em um ligante para o uso em um carreador de suporte funcionalizado de acordo com a presente invenção, mas alternativamente, outros ligantes e espaçadores com um pKa nessa faixa podem ser usados.

[0041] Quando um ligante hidrofóbico com um pKa entre 2,5 e 5,0 é usado, a fração LMW das proteínas de batata pode adsorver ao carreador de suporte funcionalizado. Essa faixa de pKa tem a vantagem de que a eluição de uma fração de proteína de batata pode ocorrer com o uso de um tampão ou solução fracamente ácida. A eluição a um pH alto induz a coloração da fração de proteína de batata isolada que é, de preferência, evitada. Além disso, a eluição a um pH menor do que 2,5 pode exigir a presença de um ácido forte e/ou uma quantidade alta de sal, que cria fluxos de refugo custosas e pode afetar a qualidade do isolado de proteína de batata isolada. É preferencial que o pKa do ligante esteja entre 2,5 e 5, porque sob essas condições o equilíbrio entre as desvantagens da eluição a um pH baixo e alto conforme mencionado é ideal, resultando no desempenho ideal.

[0042] Foi adicionalmente revelado que o uso de um carreador de suporte funcionalizado que tem um pKa entre 2,5 e 5, tal como um carreador que possui grupos ácido, reduz significativamente a absorção de espécies contaminantes ao suporte funcionalizado.

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16/42 [0043] Com a combinação da faixa de pKa apropriada e a hidrofobicidade apropriada, foi revelado que tanto a fração HMW quanto a LMW podem absorver ao carreador de suporte funcionalizado, sem absorção significativa das espécies contaminantes tais como fenóis (poliméricos) e outras espécies coloridas. Isso é uma melhora distinta em comparação às resinas de interação hidrofóbica e troca de ânion (de modo misto) carregado positivamente.

[0044] Particularmente, o pKa dos ligantes deve estar, de preferência, entre 2,5 a 5, de maior preferência 4 a 5. Os ligantes podem ser ligantes alifáticos, alifáticos substituídos ou aromáticos, incluindo grupos substituídos e/ou heteroaromáticos ou combinações dos mesmos. Os grupos aromáticos adequados são, por exemplo, estruturas de fenila, naftila, piridina e pirimidina substituídas ou não substituídas.

[0045] Por essa razão, um ligante que pode ser usado para funcionalizar o carreador de suporte é um ligante de modo misto hidrofóbico que tem um pKa 2,5 a 5. Esse ligante deve ser acoplado ao carreador através de um átomo S ou O, de preferência através de um grupo tioéter.

[0046] De preferência, esses ligantes são selecionados a partir do grupo de piridinas substituídas, ácidos benzoicos, ácidos salicílicos, ácidos nicotínicos ou ácidos naftoicos, através dos quais uma substituição está em uma posição de anel disponível com um grupo (CH2)nXH, com n = 0 a 4 e X = O ou S. De preferência, esses ligantes são selecionados a partir do grupo de piridinas substituídas por (CH2)n-SH, ácidos benzoicos, salicílicos e nicotínicos, com n = 0 a 4. De preferência ainda maior, esses ligantes são selecionados a partir do grupo de ácidos benzoicos, salicílicos e nicotínicos substituídos por mercapto (grupos mercapto sendo iguais aos grupos tiol). Os ligantes mais preferenciais são, entretanto, ácido 4-mercaptobenzoico e ácido 2mercaptonicotínico (ácido 2-mercaptopiridini-3-carboxilício), sendo que

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17/42 o ácido 4-mercaptobenzoico é atualmente considerado o melhor dentre esses dois ligantes mais preferenciais.

[0047] Os ligantes devem ser acoplados ao carreador de suporte através de um átomo de S ou O, por exemplo, por um grupo tioéster, tioéter, éter ou éster. Isso significa que o ligante é acoplado ao carreador através de um grupo de acoplamento que contém um átomo S ou O na estrutura principal.

[0048] De preferência, um grupo de acoplamento que contém enxofre é usado, tal como um grupo de acoplamento de tioéter ou a tioéster. De preferência, um grupo tioéter acopla o ligante ao carreador de suporte (por uma ponte de sulfito, -S-). Isso é importante visto que foi revelado que ambos os acoplamentos através de um átomo de S ou O, mas especificamente através de um átomo de S por uso de um grupo tioéter resultam na resistência à degradação pelo suco de batata de qualquer tipo. Em contraste, a presença de um heteroátomo de nitrogênio em um grupo de acoplamento, tal como, por exemplo, um grupo amina ou amida (acoplado por N), resulta na degradação mais rápida do carreador de suporte funcionalizado na presença de suco de batata. Caso múltiplos heteroátomos estejam presentes em um grupo que conecta o ligante ao carreador, é preferencial se pelo menos metades dos heteroátomos forem átomos de S e/ou O, de maior preferência pelo menos 3/4 e de preferência máxima não estiverem presente na estrutura principal. Os heteroátomos incluem átomos de S, O, P e N.

[0049] Os ligantes acoplados através de um grupo que contém oxigênio, tais como ésteres ou éteres e de preferência éteres, exibem resistência aumentada contra degradação (ou oxidação, modificação, descoloração, etc.), mas degradam, embora mais devagar do que ligantes acoplados por amina ou amida.

[0050] Entretanto, os ligantes acoplados por oxigênio, especial

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18/42 mente éteres, não são tão estáveis quanto ligantes acoplados por enxofre, de preferência, tioéteres. Os ligantes acoplados por enxofre, particularmente aqueles nos quais o ligante é acoplado ao carreador de suporte através de um grupo tioéter, exibem uma resistência particularmente alta contra a degradação por suco de batata e são, portanto, especialmente preferidos para o uso no isolamento de proteínas de batata do suco de batata por processos absortivos.

[0051] Ao mesmo tempo, os ligantes acoplados por oxigênio têm capacidade de ligação de HMW menor do que ligantes acoplados por enxofre, particularmente tioéteres. Isso pode ser explicado pelo enxofre tendo eletronegatividade aproximadamente igual ao carbono, de modo que as ligações de conexão entre o carreador de suporte e o ligante tenham somente uma polarização menor, que é importante para maximizar a hidrofobicidade do ligante.

[0052] Por essas razões, o acoplamento por enxofre ou acoplamento por oxigênio do ligante ao carreador de suporte é preferencial e o acoplamento por nitrogênio do ligante ao carreador de suporte não é preferencial. Entre o acoplamento por enxofre e o acoplamento por oxigênio, o acoplamento por enxofre é preferencial. De preferência máxima, um acoplamento por tioéter do ligante ao carreador de suporte é preferencial ao acoplamento por oxigênio.

[0053] Opcionalmente, o ligante pode ser ligado ao carreador de suporte através do uso de um espaçador. Os espaçadores devem ser adequados para engatar em ligação covalente ao carreador de suporte polimérico através de um átomo de O ou S e ao ligante através de um átomo de O ou S. Os espaçadores usados para acoplar o ligante ao carreador de suporte polimérico não compreendem de preferência muitos átomos de nitrogênio na estrutura principal. Caso heteroátomos adicionais estejam presentes na estrutura principal do espaçador, pelo menos metade dos heteroátomos são átomos de S ou O, de preferên

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19/42 cia pelo menos 3/4. De máxima preferência, os espaçadores usados para acoplar o ligante ao carreador de suporte polimérico não compreendem átomos de nitrogênio na estrutura principal.

[0054] Os grupos de espaçador são, de preferência, suficientemente estáveis para ambientes ácidos e básicos e resistentes para condições de redução no suco de batata obtido pela adição de sulfito. Tais espaçadores são altamente estáveis para os componentes compreendidos no suco de batata ou fluxo de processo em geral. Os espaçadores que podem ser usados para acoplar os ligantes da presente invenção incluem aqueles que compreendem epóxidos e tiiranos, derivados de haloacetila e alquila, derivados de acriloil e/ou agentes de arilação. De preferência, os espaçadores que não induzem muita polaridade extra são usados para o acoplamento, tais como epóxidos e tiiranos. O versado na técnica pode pensar em mais espaçadores que resultarão nos acoplamentos por O ou S entre o ligante e o carreador de suporte polimérico, com pelo menos um desses acoplamentos sendo afetado através de um grupo tioéter e tais espaçadores não devem ser excluídos da presente invenção.

[0055] O ligante deve ser ligado ao carreador de suporte em quantidades suficientes para alcançar uma capacidade de ligação de proteína alta. Isso significa que, em geral, os ligantes adequados são ligados ao carreador de suporte em quantidades de 10 a 200 meq/l, de preferência 10 a 120 meq/l e de maior preferência 30 a 80 meq/l. Isso pode ser determinado por métodos bem conhecidos para a determinação da capacidade de troca, um exemplo dos quais é descrito abaixo.

[0056] Em um aspecto adicional da presente invenção, a capacidade de ligação do carreador de suporte funcionalizado de absorver as proteínas de batata deve ser alta o suficiente para permitir o isolamento em escala industrial das proteínas de batata. Por essa razão, a capacidade de absorção do carreador de suporte funcionalizado deve ser

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20/42 pelo menos 25 g/l da proteína total de PFJ, de preferência pelo menos 30 g/l. Além disso, um carreador de suporte funcionalizado deve poder absorver pelo menos 20 g/l de proteínas de batata HMW do PFJ esgotado de LMW, de preferência pelo menos 25 g/l. A capacidade de ligação do carreador de suporte funcionalizado é determinada pela determinação da capacidade de troca.

[0057] Na etapa c) da presente invenção, uma fração de proteína é dessorvida do carreador de suporte funcionalizado por eluição. Isso é feito, de preferência, pelo uso de um tampão aquoso de pH fixo que pode eluir uma fração de proteína, opcional e seletivamente, com base em seu ponto isoelétrico (IEP). Os tampões para o uso na presente invenção podem compreende qualquer composto fracamente ácido ou fracamente básico, assim como combinações com ácidos fortes. A eluição ácida da proteína de batata LMW é preferencial à eluição alcalina para evitar o escurecimento e a desamidação da proteína. Ademais, a eluição da proteína de batata LMW por tampão de alto teor de sal não é preferencial devido a problemas de reciclagem de tampão ou água de refugo. De preferência, tampões para a eluição de uma fração HMW incluem tampões de citrato, acetato, carbonato ou fosfato. Os tampões para a eluição de uma fração LMW podem incluir ácido fórmico, acético, lático, maleico, malônico, málico, cítrico e/ou fosfórico ou combinações de tampões fracamente ácidos com ácidos fortes como ácido clorídrico ou sulfúrico. De preferência, entretanto, tanto uma fração LMW quanto uma HMW, assim como uma combinação das mesmas é eluída com um tampão de ácido fosfórico ou uma mistura de ácido fórmico e ácido clorídrico.

[0058] Quando o pH do suco de batata precisa de ajuste durante o processamento, tal como, por exemplo, a um pH menor ou a um pH maior, ácido ou base é usada para ajustar o pH. Tais ácidos e bases para o ajuste de pH do suco de batata podem ser vantajosamente áci

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21/42 dos fracos, tal como, por exemplo, ácido cítrico, lático, fórmico, acético ou fosfórico ou ácidos fortes como ácido nítrico, ácido clorídrico e/ou sulfúrico. Além disso, pode ser possível que durante o processamento do suco de batata, o ajuste de pH seja exigido. Nesse caso, as bases fortes preferenciais são, por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou hidróxido de cálcio. As bases fracas preferenciais são, por exemplo, sais de sódio e potássio de carbonato, fosfato, acetato, citrato e (bi-)sulfito. Quando tampões são usados, as combinações dos ácidos fracos e bases fortes mencionados acima ou outros ácidos fracos e bases fortes conforme conhecidos na técnica são usados para ajustar o suco de batata ao pH exigido.

[0059] Na etapa d) da invenção uma fração de proteína eluída conforme descrito acima pode ser purificada adicionalmente a jusante através de, por exemplo, (ultra)filtração, centrifugação, sedimentação, microfiltração, precipitação e várias formas de cromatografia, como, por exemplo, cromatografia de troca iônica, filtração de gel, cromatografia de afinidade, cromatografia de interação hidrofóbica e cromatografia em fase reversa. Ademais, a cromatografia por absorção pode ser aplicada com o uso de ligantes diferentes para purificar adicionalmente a fração de proteína obtida.

[0060] De preferência, a fração de proteína de batata nativa é concentrada por ultrafiltração. A escolha do material de membrana de ultrafiltração pode influenciar fortemente a seletividade. De preferência, a membrana de ultrafiltração compreende celulose regenerada, polietersulfonas (PES) e polissulfonas (PS). Os isolados inibidores de protease podem ser concentrados com o uso de membranas à base de PS ou PES com um corte molecular de 2 a 20 kDa, e até certo ponto 30 kDa. Os isolados de patatina podem ser concentrados com o uso de membranas à base de PS ou PES com um corte molecular de 5 a 30 kDa ou uma membrana à base de celulose regenerada com um

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22/42 corte molecular de 5 a 30 kDa. Essas membranas podem ser implantadas como quadro, placa, fibra tubular, enrolada em espiral e oca, ou como unidades de filtro de cisalhamento induzido em corte rotacional. [0061] Os isolados de patatina são ultrafiltrados em valores de pH de 4,0 a 8,0, de preferência pH 6,0 a 7,5. Para isolados inibidores de protease os valores de pH 3 a 7, de preferência 3,2 a 4,5 são usados. Após a remoção de impurezas o pH pode ser aumentado para pH 7 a 10 para possibilitar fluxos altos através das membranas. Os inibidores de protease são, de preferência, processados em pH baixo de 3,0 a 5,0.

[0062] Além das etapas de purificação, os isolados de proteína de batata nativa obtidos pelo processo da invenção podem ser concentrados até mais do que 20% de matéria seca por evaporação, concentração por congelamento, ou precipitação isoelétrica com o uso de dióxido de carbono. A matéria seca desses concentrados pode conter mais do que 85% de proteína, de preferência mais do que 90% de proteína, com base no nível de nitrogênio (teor de nitrogênio de Kjeldahl vezes 6,25). Os produtos secos podem conter mais do que 90%, de preferência mais do que 92% de proteína, com um nível de umidade de 4 a 9%.

[0063] Em um aspecto adicional, a invenção é direcionada na fração de proteína de batata nativa obtenível pelo processo de acordo com a invenção. Essa fração de proteína de batata nativa pode ser a fração de proteína de batata nativa total, a fração de patatina de proteína de batata nativa, ou a fração inibidora de protease de proteína de batata nativa, ou qualquer combinação ou subtração dos mesmos. Essas frações de proteína de batata são caracterizadas pelo seu alto grau de pureza e estabilidade. A fração de proteína de batata nativa total da invenção pode ter um ponto isoelétrico acima de 4,5, um peso molecular maior do que 4 kDa. A fração de proteína de batata é, de

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23/42 preferência, essencialmente livre de aminoácidos e ácidos orgânicos derivados de batata.

[0064] A fração de patatina de proteína de batata nativa da invenção pode ter um ponto isoelétrico abaixo de 5,8, de preferência 4,8 a 5,5, um peso molecular maior do que 30 kDa, de preferência maior do que 35 kDa.

[0065] A fração inibidora de protease de proteína de batata nativa da invenção pode ter um ponto isoelétrico acima de 5,5, de preferência acima de 5,8, um peso molecular abaixo de 35 kDa, de preferência 4 a 30 kDa.

[0066] As proteínas de batata nativa secas podem ser obtidas por secagem por aspersão, secagem pneumática ou secagem por congelamento. Uma fração de patatina, uma fração inibidora de protease e uma total fração de proteína de batata são definidas em um pH adequado para assegurar a boa solubilidade de água. O pH dos concentrados é definido para 7,0 a 9,0, de preferência para 7,0 a 8,0. Os concentrados de inibidores de protease podem ser secados por aspersão com o uso de valores tanto de pH baixo (3,0 a 4,0) quanto de pH alto (7,0 a 9,0). As proteínas de batata nativa obtidas assim têm uma solubilidade de água maior do que 90%, de preferência mais do que 95% em um pH de 7,0 e uma temperatura de 25 °C. A solubilidade é expressa como a porcentagem de proteína no sobrenadante após a centrifugação da solução.

[0067] Em uma modalidade preferencial, o isolado de proteína de batata nativa conforme obtido após a ultrafiltração da concentração tem um teor de proteína maior do que 75% do teor de matéria seca. O teor de proteína no presente documento é definido como o teor de nitrogênio de Kjeldahl vezes 6,25. De preferência, o teor de proteína no isolado de proteína de batata nativa é maior do que 80%, com mais preferência maior do que 90%, e com ainda mais preferência maior do

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24/42 que 95%.

[0068] Os isolados de proteína de batata nativa da invenção podem ser caracterizados por uma análise de eletroforese de gel bidimensional combinada com uma identificação das proteínas-chave no isolado com o uso de análise de espectrometria em massa MALDITOF. As proteínas podem ser separadas na eletroforese de gel bidimensional com o uso de um gradiente de pH de 3 a 8 e um peso molecular de 5 a 100 kDa.

[0069] Para usar a invenção, o carreador de apoio funcionalizado é imobilizado, por exemplo, montando-se o mesmo em uma coluna, mangueira ou tubo enquanto o suco de batata flui além ou através. Nessa modalidade, a absorção é provavelmente alcançada por um processo contínuo ou semicontínuo, como por exemplo, cromatografia em leito recheado, cromatografia em leito expandido, adsorvedores de membrana ou cromatografia de leito magneticamente estabilizado. Além disso, o carreador de apoio funcionalizado pode ser montado nesse tubo na forma de uma rede através da qual o suco de batata flui para entrar em contato com o carreador de apoio funcionalizado. Outros meios são prontamente concebíveis por aqueles indivíduos versados na técnica, e não devem ser excluídos.

[0070] Em outro aspecto da invenção, o carreador de apoio funcionalizado entra em contato com o suco de batata combinando-se o suco de batata e o carreador de apoio em um único vaso, caso no qual essa mistura pode ser agitada, sacudida ou, de outra forma, fisicamente misturada para aumentar o contato entre o carreador de apoio e o suco de batata. Nessa modalidade, a absorção das proteínas de batata é provavelmente um processo de batelada, que é vantajoso quando as soluções de proteína altamente viscosas são usadas.

[0071] Entretanto, qualquer meio para contatar o suco de batata com o carreador de apoio funcionalizado servirá, desde que o contato

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25/42 seja intenso o suficiente para permitir a absorção das proteínas de batata para o carreador de apoio funcionalizado que tem porosidade conforme descrito e permitir a fixação de pelo menos um ligante de modo misto hidrofóbico que tem um pKa 2,5 a 5, que é acoplado ao carreador através de um átomo de S ou O, de preferência um grupo tioéter.

[0072] A invenção será agora ilustrada pelos seguintes Exemplos não restritivos.

MÉTODOS

FUNCIONALIZAÇÃO DO CARREADOR DE APOIO

PRINCÍPIO [0073] A funcionalização do carreador de apoio de Sepabead EP ativada com epóxi (ou HFA) que foram obtidos a partir da Resindion, Binasco, Itália, com ligante acontece em um pH igual ou maior do que

8,5 dependendo do grupo de acoplamento. As soluções de ligante usadas para a funcionalização do carreador de apoio são definidas para um pH fixo conforme a seguir: o pH de uma solução de ligante funcionalizado com mercapto é definido para 8,5, o pH de uma solução de ligante funcionalizado com amino é definido para 9,5 e o pH de uma solução de ligante funcionalizado com hidróxi é definido para igual ou maior do que 11. Se o ligante não dissolver no pH desejado, o pH é aumentado até que o ligante dissolva completamente.

MÉTODO [0074] O ligante (1 M, Sigma Aldrich, Zwijndrecht, Holanda) é dissolvido em 250 ml de água desmineralizada adicionando-se hidróxido de potássio a 5 M até que o pH desejado seja atingido. A solução de ligantes substituídos por mercapto ou amino é tamponada com 100 mM de borato. A reação de acoplamento de ligantes funcionalizados com hidróxi é executada em pH 11 sem a adição de um tampão. Durante a dissolução do ligante, o pH é ajustado e a água desmineralizada é adicionada até que o ligante seja completamente dissolvido no pH

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26/42 desejado e volume de 300 ml. Permite-se que a solução de ligante atinja a temperatura ambiente antes de adicionar o carreador de apoio. [0075] O carreador de apoio de Sepabead EP ativada com epóxi (100 ml, Resindion, Binasco, Itália) é lavado com água desmineralizada em um filtro de vidro até que a condutividade seja menor do que 10 pS/cm e o excesso de água seja removido executando-se sob condições de vácuo. Então, o carreador de apoio é transferido para um frasco de 500 ml com a solução de ligante, fechado com uma rolha e incubado de um dia para o outro a 175 rpm. O pH é verificado após 1 hora e na manhã seguinte.

[0076] Após enxaguar o excesso de ligante com 100 mM de hidróxido de sódio os grupos epóxi remanescentes são hidrolisados incubando-se o carreador de apoio funcionalizado em 1 M de hidróxido de sódio a 50 °C por 2 horas. O carreador de apoio funcionalizado é armazenado em 50 mM de hidróxido de sódio a 4 °C.

[0077] Os carreadores de apoio de agarose e PMMA usados no

Exemplo 2 são ativados com epóxi e, portanto, podem ser funcionalizados com 4MBA de acordo com o mesmo princípio e método conforme descrito para Sepabead EP e HFA acima.

[0078] As unidades de membrana ativadas com epóxi Sartobind foram funcionalizadas de acordo com as instruções do fabricante (Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Alemanha).

CÁLCULO DO PKa [0079] O pKa do ligante identificado é calculado com o software

MarvinSketch (2011) 5.4.1.1 da ChemAxon com as opções de pKa listadas na Tabela 1. A possível alteração da distribuição de elétron causada pela identificação que poderia influenciar o pKa do grupo aniônico é levada em conta calculando-se o pKa com o grupo epóxi do carreador de apoio funcionalizado.

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Tabela 1: As opções de pKa selecionadas para calcular o pKa em MarvinSketch

Modo	macro
Prefixo de ácido/base	estático
pKa básico mínimo	-10
pKa ácido máximo	20
Temperatura (K)	298
Considerar tautomerização	não

CAPACIDADE DE TROCA TOTAL [0080] O princípio da capacidade de troca total é neutralizar grupos aniônicos protonados com um excesso de base (líquido de neutralização). A capacidade de troca do carreador de apoio funcionalizado é determinada com titulação de retorno da base com ácido clorídrico como titulador.

CONDICIONAMENTO DO CARREADOR DE APOIO FUNCIONALIZADO (PROTONAÇÃO DO GRUPO ANIÔNICO) [0081] O carreador de apoio funcionalizado é embalado em uma coluna com um diâmetro de 1 cm e uma altura de leito de 16 cm; essa dimensão corresponde a um volume de leito de 12 ml. Se for requerido limpar o carreador de apoio funcionalizado de forma completa do carreador de apoio funcionalizado é limpo com 50 ml de hidróxido de sódio a 1 M seguido por 150 ml de hidróxido de sódio a 100 mM em 10 ml/min. O carreador de apoio funcionalizado é enxaguado com 200 ml de água em 10 ml/min.

[0082] O ligante no carreador de apoio funcionalizado é protonado com 200 ml de ácido clorídrico a 100 mM em 10 ml/min. O excesso de ácido é enxaguado com 200 ml de água em 10 ml/min ou até que a condutividade seja < 10 pS/cm.

NEUTRALIZAÇÃO DO GRUPO ANIÔNICO [0083] O volume vazio é removido puxando-se um vácuo de serin

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28/42 ga de 50 ml e transferência quantitativa do carreador de apoio funcionalizado com 200 ml de solução de neutralização de 30 mM de hidróxido de sódio em um frasco de 300 ml. Uma rolha é colocada no frasco e é sacudida por pelo menos 1 hora em 175 rpm.

TITULAÇÃO [0084] O consumo de hidróxido de sódio do ligante/carreador de apoio funcionalizado pode ser determinado pela concentração da solução de neutralização de 30 mM de hidróxido de sódio e a concentração após a neutralização (titulação de retorno). Portanto, 25 ml da solução de neutralização e 25 ml da solução de neutralização neutralizada parcialmente são titulados com 100 mM de HCI titulante. O ponto de equivalência da titulação de ácido-base é o ponto de inflexão da curva de titulação conformada em S.

CORREÇÃO PARA O ERRO SISTEMÁTICO E A FORMAÇÃO DE GRUPO CARBOXILA PELA OXIDAÇÀO DE METACRILATO [0085] O volume abandonado após puxar o carreador de apoio funcionalizado de Sepabead seco com uma seringa de 50 ml é estimado em 68% que é 7 ml do volume sugerido de 12 ml (3,5 ml removidos por seringa). O volume remanescente dilui o líquido de neutralização de 30 mM para 29 mM, que é igual a um erro sistemático de 15 meq/l. Para corrigir o erro sistemático e a formação de grupos carboxila pela oxidação do carreador de apoio de metacrilado durante a identificação, um carreador de apoio funcionalizado de Sepabead hidrolisado (branco) é titulado da mesma forma que o carreador de apoio de Sepabead identificado.

CÁLCULO ds de tit. ’ ^'HC. θ θ θ

V -V

ΤΈϊΊΗώ ώΚΛίΤΤΪΙ

TEC = TEC — TEC üjíwjt™. de corr. flj?sart?ü carr&adõrdfi ίψΰϊΰ κώ

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29/42 em que:

[0086] TEC = capacidade de troca total (meq/l) [0087] TECamostra = amostra de capacidade de troca total sem correção de erro sistemático. (meq/l) [0088] TECamostra de corr. = capacidade de troca total corrida para erro sistemático (meq/l) [0089] TECcarreador de apoio não identificado = bloco bruto de capacidade de troca total / erro sistemático (meq/l) [0090] Vamostra de tit. = amostra de volume de titulação (ou bloco bruto) (ml) [0091] Vneutralização de tit. = solução de neutralização de volume de titulação (ml) [0092] chci = concentração de HCl (mmol/ml) [0093] Vfrasco = Volume de NaOH adicionado ao frasco (250 ml) [0094] Vamostra = Volume de amostra (25 ml ~ 25,0 g)

DETERMINAÇÃO DE TAMANHO DE PORO E VOLUME DE PORO [0095] O tamanho de poro e o volume de poro dos carreadores de apoio de Sepabead foram determinados através do uso de porosimetria em um sistema de porosimetria ASAP2400 de acordo com um procedimento padronizado bem conhecido na técnica.

EXPERIMENTOS DE ADSORÇÃO DE PROTEÍNA [0096] Os experimentos de adsorção são executados de acordo com o seguinte procedimento para manter os experimentos tão uniformes quanto possível. LMW significa a fração de peso molecular baixo das proteínas de batata que consiste predominantemente em inibidores de protease, enquanto que HMW significa a fração de peso molecular alto das proteínas de batata que consistem predominantemente em patatina.

[0097] Um lote representativo do suco de fruta de batata (PFJ) e de PFJ esgotado de LMW (Avebe, Gasselternijveen, Holanda) foi con

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30/42 gelado de modo que a comparação precisa da capacidade e da afinidade de cada ligante para os processos de eluição seletiva e adsorção seletiva poderiam ser determinados sem introduzir incerteza com base na variação natural na concentração de proteínas. Antes de um experimento, o PFJ congelado (ou PFJ esgotado de LMW) é descongelado a 4 °C seguido pelo descongelamento adicional em um banho de água a 28 °C conforme requerido. O PFJ (ou PFJ esgotado de LMW) é definido para o pH desejado e centrifugado por 5 minutos em 4.600 g para remover os sólidos restantes.

[0098] O carreador de apoio funcionalizado é recheado em uma coluna com uma superfície interna de 1,767 cm² e com uma altura de leito de 34 cm que corresponde a um volume de leito de 60 cm³. O fluxo é definido para 10 cm/min. O carreador de apoio é equilibrado com citrato de sódio de tampão de lavagem/equilíbrio a 30 mM com a adsorção desejada de pH de 5,2 ou 6,0 até que a coluna atinja o pH desejado. Para a adsorção de proteína total 6 Volumes de Leito (BV) de PFJ o pH 5,2 é carregado. Para a adsorção seletiva de proteínas de batata de LMW do PFJ (pH 6,0) ou proteínas de batata de HMW do PFJ esgotado de LMW (pH 5,2) 9 BV foram carregadas.

[0099] A coluna é lavada com o tampão de lavagem/equilíbrio de mM de citrato de sódio por aproximadamente 2,5 BV para remover os componentes não adsorvidos.

[00100] A proteína adsorvida pode ser eluída com eluentes desejado seguidos por uma dessorção completa de todas as proteínas remanescentes com hidróxido de sódio.

LIGAÇÃO DE PROTEÍNA TOTAL EM PH 5,2:

[00101] Equilibrar a coluna com 30 mM de citrato de sódio (pH 5,2) até que o pH 5,2 seja alcançado.

[00102] Carregar 6 BV de PFJ e coletar a alimentação.

[00103] Lavar com aproximadamente 2,5 BV de tampão de equilí

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31/42 brio de 30 mM de citrato de sódio com pH 5,2 para remover os componentes não adsorvidos e coletar a lavagem para construir um equilíbrio de massa.

ISOLAMENTO DE PROTEÍNA POR ELUIÇÃO ALCALINA:

ELUIÇÃO DE HIDRÓXIDO DE SÓDIO:

[00104] · Eluir com 50 mM de hidróxido de sódio e iniciar a coleta de eluente quando OD280 inclina para > 60 mAU/min.

[00105] · Reter até que o pH > 9,5, OD280 < 150 mAU, inclinar

OD280 > -50 mAU/min e parar de coletar. Continuar para 0,25 BV.

[00106] · Limpar a coluna com 1,5 BV de hidróxido de sódio a 1 M.

[00107] · Substituir a solução de hidróxido de sódio solução a 1 M na coluna com 0,5 BV do 50 mM de hidróxido de sódio para o propósito de armazenamento.

ISOLAMENTO DE HMW EM PH 5,2 ATRAVÉS DA ABSORÇÃO SELETIVA:

[00108] · Equilibrar com 30 mM de tampão de citrato de sódio (pH

5,2) até o pH 5,2 ser alcançado.

[00109] · Carregar 9 BV de PFJ esgotado de LMW e coletar a alimentação.

[00110] · Lavar com aproximadamente 2,5 BV de tampão de equilíbrio em 30 mM de citrato de sódio pH 5,2 para remover os componentes não adsorvidos e coletar a lavagem para construir um equilíbrio de massa.

[00111] · Eluição de carbonato de sódio:

[00112] · Eluir com 100 mM de carbonato de sódio pH 8,0 e aguardar pela coleta até OD280 inclinar > 60 mAU/min.

[00113] · Reter até o pH > 6.0, OD280 < 150 mAU, inclinar OD280 >

-50 mAU/min e parar e coletar. Continuar o fluxo para 0.25 BV.

[00114] · Limpar a coluna com 1.5 BV de hidróxido de sódio a 1 M.

[00115] · O hidróxido de sódio a 1 M é substituído por 0,5 BV de 50

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32/42 mM de hidróxido de sódio durante o propósito de armazenamento. ISOLAMENTO DE LMW EM PH 6,0 ATRAVÉS DA ABSORÇÃO SELETIVA:

[00116] · Equilibrar com 30 mM de citrato de sódio (pH 6,0) até o pH

6,0 ser alcançado.

[00117] · Carregar 9 BV de PFJ e coletar a alimentação.

[00118] · Lavar com aproximadamente 2,5 BV de tampão de equilíbrio em 30 mM de citrato de sódio pH 6,0 para remover os componentes não adsorvidos e coletar a lavagem para construir um equilíbrio de massa.

ELUIÇÃO DE ÁCIDO FOSFÓRICO:

[00119] · Eluir com 50 mM de ácido fosfórico e aguardar pela coleta até OD280 inclinar para > 60 mAU.

[00120] · Reter até o pH < 3,5, OD280 < 150 mAU, inclinar OD280 >

-50 mAU/min e parar de coletar. Continuar o fluxo para 0,25 BV.

[00121] · Eluição de hidróxido de sódio:

[00122] · Eluir com 50 mM de hidróxido de sódio e aguardar a coleta até OD280 inclinar para > 60.

[00123] · Reter até o pH > 9,5, OD280 < 150, inclinar OD280 > -50 mAU/min e parar a coleta e continuar para 0,25 BV.

[00124] · Limpar a coluna com 1,5 BV de hidróxido de sódio a 1 M.

[00125] · Hidróxido de sódio a 1 M é substituído por 0,5 BV de 50 mM de hidróxido de sódio para propósito de armazenamento.

[00126] O teor de proteína é determinado com o analisador de proteína rápido Sprint (empresa CEM) que foi calibrado com o método de Kjeldahl com o fator de conversão de 6,25 genericamente usado para proteínas vegetais. A capacidade de eluição do carreador de apoio funcionalizado é expressa em gramas de proteína por litro. Os experimentos foram verificados através de um equilíbrio de massa de proteína através da verificação de concentrações de proteína em todas as

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33/42 correntes, dentre das quais correntes de alimentação, coleta e lavagem. As recuperações estavam entre 95 e 102% (não mostrado). [00127] A adsorção de proteína total é avaliada pela adsorção de proteína de PFJ em pH 5,2 dentro de 6 volumes de leito seguidos por uma eluição alcalina tanto de frações de proteína tanto de LMW quanto de HMW.

[00128] A adsorção seletiva de HMW é avaliada pela adsorção de proteína de PFJ esgotado de LMW em pH 5,2 dento de 9 volumes de leito seguido por uma eluição leve com o uso de 100 mM de carbonato pH 8,0 para impedir a alteração das proteínas nativas.

[00129] A porcentagem de proteínas de HMW presentes no eluato obtido (proteína total e HMW seletivamente adsorvido) é determinada analisando-se a razão de > 35 kD de proteínas de acordo com o Kit de Análise Experion Pro260 (Bio-rad Laboratories).

[00130] A influência do pKa na eluição ácida é avaliada com uma faixa de ligantes com pKa diferentes. O LMW é adsorvido de 9 BV de PFJ em pH 6,0 e obtido através da eluição com 50 mM de ácido fosfórico, seguido por uma eluição completa da proteína não dessorvida com 50 mM de hidróxido de sódio.

A ESTABILIDADE DO CARREADOR DE APOIO FUNCIONALIZADO EM PFJ NÃO ESTABILIZADO (INCRUSTAÇÃO ACELERADA) PFJ NÃO ESTABILIZADO [00131] Tubérculos frescos são espremidos/raspados em uma centrífuga de suco de Braun. Fibras insolúveis são removidas filtrando-se o suco através de um funil de buchner com um filtro de papel 595. O pH do PFJ deveria ser pH 6,0 ± 0,5, se não ajustar o pH para 6.

CONDICIONAMENTO DO CARREADOR DE APOIO FUNCIONALIZADO [00132] Normalmente, o carreador de apoio funcionalizado é armazenado em 50 mM de NaOH, portanto, é suficiente para enxaguar o

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34/42 carreador de apoio funcionalizado com água deionizada até que a condutividade seja menor do que 50 pS/cm. (Um equilíbrio não é necessário, visto que a capacidade de tempão endógeno de PFJ evitará um aumento de pH).

[00133] · Preencher uma coluna Kontes® (1,0 x 20 cm) para o topo com carreador de apoio funcionalizado (20 cm ~ 16 ml) [00134] · Enxaguar com um mínimo de 100 ml de água deionizada e continuar até que a condutividade seja menor do que 50 pS/cm.

[00135] · Secar o carreador de apoio funcionalizado com uma seringa de 50 ml.

LIMPEZA, ARMAZENAMENTO OU CONDICIONAMENTO DO CARREADOR DE APOIO FUNCIONALIZADO PELA SEGUNDA VEZ. [00136] · Remover o PFJ do carreador de apoio funcionalizado descartando-se o PFJ através de um poro de filtro de vidro 3 e enxaguar o carreador de apoio funcionalizado com água deionizada.

[00137] · Colocar um funil na coluna Kontes® e transferir o carreador de apoio funcionalizado do filtro de vidro para a coluna.

[00138] · Eluir a proteína e cor com 250 ml de NaOH a 50 mM em ml/min.

[00139] · O carreador de apoio funcionalizado pode ser armazenado em 50 mM de NaOH a 4 °C ou enxaguado com 250 ml de água deionizada para a próxima incubação com PFJ. Se o carreador de apoio funcionalizado for usado par a próxima incubação, secar o carreador de apoio funcionalizado com uma seringa de 50 ml.

INCUBAÇÃO COM PFJ NÃO ESTABILIZADO [00140] · Preencher um cilindro graduado com PFJ até 150 ml.

[00141] · A partir de 150 ml, preencher uma seringa de 50 ml com suco PFJ e pressionar o carreador de apoio funcionalizado para fora da coluna de kontes com a seringa no interior de um frasco de 300 ml. [00142] · Medir o pH após 1,5 hora e na próxima manhã.

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35/42 [00143] · Após uma incubação noturna limpar o carreador de apoio funcionalizado conforme descrito acima e repetir a incubação pelo menos duas vezes.

A MATRIZ DE COR DA PROTEÍNA ELUÍDA [00144] A matriz de cor da proteína eluída é expressa como uma razão de cor/proteína em que a adsorção de cor em 310 nm medida espectrofotometricamente é dividida pela concentração de proteína medida pelo analisador de proteína rápido Sprint (À310nm /P(%)). O analisador de proteína de rápido Sprint é uma técnica bem conhecida e padronizada no campo de análise de concentração de proteína, e a determinação de matriz de cor em 310 nm surge de uma determinação de proteína rápida entre 280 e 310 nm em que o comprimento de onda 310 nm é usado para a correção da matriz colorida.

PROCEDIMENTO [00145] · Diluir a amostra de eluição com 100 mM de borato pH

10,0 até a extinção esteja entre 0,1 e 0,8 e diluir o bloco bruto que consiste em água da mesma forma.

[00146] · Autozerar o bloco bruto e medir a amostra em 310 nm.

CÁLCULO

F f

2310/P(%) = ^{310 J}

P(%)

Em que:

[00147] λ310/Ρ(%) = razão de cor/proteína (%^-1) [00148] E310 = extinção no comprimento de onda 310 nm [00149] f = fator de diluição em borato a 100 mM pH 10.0.

[00150] P(%) = concentração de proteína medida por Sprint (%)

EXEMPLO 1: SELEÇÃO DE LIGANTE

RESULTADOS [00151] Essa invenção é ilustrada por experimentos com o uso de 11 ligantes de modo misto que foram selecionados com acidez variada, que são fixados em um carreador de apoio com tamanho de poro

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36/42 de 30 a 150 nm. Dentre esses ligantes estão 10 ligantes de modo misto ácidos fracos e 1 ligante de modo misto ácido forte. Ademais, Streamline Direct CST1 (ligante e composição espaçadora idêntica a GEhealthcare Capto MMC) e Sepabeads HFA (exe065) (em que ambas contêm um espaçador que contém nitrogênio) funcionalizados com ácido 4-mercaptobenzóico da mesma forma que descrito acima foram incluídos nesses experimentos, como o carreador de apoio de interação hidrofóbico Amberlite XAD7HP. Esses ligantes foram testados quanto à capacidade para:

[00152] · Adsorver pelo menos 25, de preferência > 30 g/l de proteína total do suco de batata em pH 5,2 (tabela 2) [00153] · Adsorver pelo menos 20, de preferência > 25 g/l de proteína de batata de HMW do suco de batata esgotado de LMW em pH 5,2 (tabela 3) [00154] · Dessorver a proteína de batata de LMW por eluição ácida seguida pela eluição das proteínas não dessorvidas por eluição alcalina (tabela 4) [00155] · Resistir à oxidação (enzimática-) em um ensaio de envelhecimento acelerado pelo suco de batata sem sulfito adicionado. (Figuras 2 e 3, Tabelas 5 e 6)

Tabela 2: Capacidade de adsorção de proteína de batata total (g/l) para carreadores de apoio com porosidade entre 30 e 150 nm funcionalizada com 11 ligantes de modo misto ácidos diferentes, uma resina de troca de cátion fraca (uma resina de carboxil acrílica) e duas resinas hidrofóbicas (fenil sefarose e XAD7HP). A porcentagem de proteína de batata de HMW no agrupamento de proteína total e a acidez (calculada) de cada ligante é dada nas últimas duas colunas.

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37/42

No	Nome de Ligante	Capacidade (g/l)	% de HMW	pKa
1	Ácido 4-Aminobenzoico (4-ABA)	29,7	23,5	4,75
2	Ácido 3-Aminobenzoico (3-ABA)	31,7	18,7	4,88
3	Ácido 3-Aminobenzenosulfônico (3-ABSA)	35,0	11,7	-2,68
4	Ácido 2-hidroxi-4-aminobenzoico (ácido 4aminosalicíclico, 4-ASA)	33,1	17,8	3,67
5	Ácido 3-Hidroxibenzoico (3-HBA)	31,4	17,4	3,84
6	Ácido 2,4-di-idroxibenzoico (2,4-DHBA)	31,6	15,0	3,08
7	Ácido 4-Hidroxibenzoico (4-HBA)	27,5	17,3	4,36
8	Ácido 2-Mercaptopiridina-3-carboxílico (ácido 2-Mercaptonicotínico (2-MNA)	38,6	22,6	3,70
9	Ácido 4-mercaptobenzoico (4-MBA)	39,1	33,1	4,10
10	Ácido 6-hidroxi-2-naftóico (6-H2NA)	26,2	20,9	3,99
11	Ácido 3,5-di-idroxi-2-naftóico (3,5-H2NA)	34,0	20,0	2,69
12	carboxil (resina acrílica)	10,8	8,5	3,90
13	fenil sefarose	7,8	34,6	N/A
14	Amberlite XAD7HP	9,2	8,0	N/A
15	Streamline Direct CST1	39,9	19,0	3,61

[00156] Daqui se conclui que a capacidade dos ligantes de modo misto aniônicos pare a absorção de proteína de batata está aproximadamente entre 30 e 40 g/l, enquanto a resina de carboxil acrílica tem 11 g/l e as resinas de interação hidrofóbicas (XAD7HP & fenil sefarose) têm uma capacidade baixa de 8 a 9 g/l. Portanto, a capacidade de absorção dos ligantes aniônicos é muito maior.

Tabela 3: Capacidade de adsorção de proteína de batata de HMW (g/l) do suco de batata esgotado de LMW em pH 5,2 para 11 ligantes de modo misto ácidos, um ligante de modo misto acoplado através de um espaçador que contém nitrogênio (CST1), uma resina de troca catiônica fraca (resina de carboxil acrílica) e duas resinas hidrofóbicas (fenil sefarose e XAD7HP). O teor de HMW correspondente (% de HMW,

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38/42 expressa como % de proteínas > 35 kDa) da proteína de batata de HMW obtida é dada na última coluna.

No	Ligante	Capacidade (g/l)	% de HMW
1	Ácido 4-Aminobenzoico	19,8	77,9
2	Ácido 3-Aminobenzoico	22,0	84,1
3	Ácido 3-Aminobenzenosulfônico	14,0	85,1
4	Ácido 2-hidroxi-4-aminobenzoico (ácido 4-aminosalicíclico)	19,5	90,8
5	Ácido 3-Hidroxibenzoico	16,5	86,0
6	Ácido 2,4-di-idroxibenzóico	15,8	82,0
7	Ácido 4-Hidroxibenzoico	13,9	80,1
8	Ácido 2-Mercaptopiridina-3-carboxílico (ácido 2-Mercaptonicotínico)	24,6	79,6
9	Ácido 4-mercaptobenzóico	30,5	84,8
10	Ácido 6-hidroxi-2-naftóico	16,7	77,5
11	Ácido 3,5-di-idroxi-2-naftóico	20,9	94,4
12	carboxil (resina acrílica)	0,9	82,0
13	Fenil sefarose	2,5	85,3
14	Amberlite XAD7HP	1,9	82,4
15	Streamline Direct CST1	22,8	72,1

[00157] Daqui se conclui que a maior capacidade de absorção para a fração de HMW das proteínas de batata de suco de batata esgotado de LMW é observada para ligantes acoplados a tioéter.

Tabela 4: Capacidade de adsorção de proteína de batata de LMW (g/l) para um ligante de modo misto ácido forte (N^o 3) e dois ligantes de modo misto ácidos fracos (N^o 6 & 9). A porcentagem de proteína de LMW dessorvida por eluição ácida e subsequente eluição alcalina é mostrada nas últimas colunas.

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39/42

No	Ligante	Acidez pKa	Capacidade (g/l)	% de áci- do	% de alca- lino
3	Ácido 3-Aminobenzenosulfônico	-2,68	30,0	39	61
6	Ácido 2,4-di-idroxibenzoico	3,08	28,0	84	16
9	Ácido 4-mercaptobenzoico	4,10	40,6	83	17

[00158] A eluição ácida de proteína de batata de LMW é preferencial à eluição alcalina para evitar o escurecimento e deamidação da proteína. Ademais, a eluição de proteína de batata de LMW por tampão de teor de sal alto não é preferencial devido aos problemas de reutilização de tampão ou água de refugo. Os ligantes fortemente ácidos como o número 3 nesse experimento exibem uma eluição ineficaz com tampões fracamente ácidos. Os tampões fracamente ácidos são preferenciais para evitar a desnaturação de proteína. Para permitir a eluição ácida com o uso de tampões fracamente ácidos e um ligante fracamente ácido, como os números 6 e 9 têm um desempenho melhor. Por conseguinte, o uso dos ligantes fracamente ácidos que têm pKa entre

2,5 a 5 é preferencial.

Tabela 5: Aumento da capacidade de troca total após a incubação com suco de batata que não foi estabilizada com sulfito.

N°	Ligante	Porcentagem de aumento da capacidade de troca
1	Ácido 4-Aminobenzoico	125
2	Ácido 3-Aminobenzoico	58
3	Ácido 3-Aminobenzenosulfônico	64
4	Ácido 2-hidroxi-4-aminobenzoico (ácido 4-aminosalicíclico)	98
5	Ácido 3-Hidroxibenzoico	30
6	Ácido 2,4-di-idroxibenzoico	41
7	Ácido 4-Hidroxibenzoico	36
8	Ácido 2-Mercaptopiridina-3-carboxílico (ácido 2-Mercaptonicotínico)	-2
9	Ácido 4-mercaptobenzoico	11

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40/42

N2	Ligante	Porcentagem de aumento da capacidade de troca
10	Ácido 6-hidroxi-2-naftóico	72
11	Ácido 3,5-di-idroxi-2-naftóico	65
12	carboxil (resina acrílica)	2
13	Fenil sefarose	N/A
14	Sepabead HFA com 4MBA	32
15	Streamline Direct CST I da Amersham	106

[00159] Os dados na tabela 4 bem como na figura 1 mostram que os ligantes de modo misto acoplados a nitrogênio são susceptíveis à oxidação por suco de batata. O suco de batata é geralmente estabilizado pela adição de sulfito. Entretanto, a inibição do escurecimento oxidativo por sulfito não é genericamente completa e a deterioração gradual do ligante pode ocorrer com o tempo. Em contraste aos ligantes acoplados a amino, ligantes acoplados a oxigênio e especialmente ligantes acoplados a tioéter são muito mais estáveis para a degradação por, por exemplo, oxidação.

[00160] Conclui-se a partir da Tabela 4 que os ligantes acoplados a amino têm um aumento médio na capacidade de troca em experimentos de incrustação acelerada de 86%, os ligantes acoplados a hidroxila têm 49% e os ligantes acoplados a tioéter têm 5%. Os espaçadores que contêm nitrogênio também exibem incrustação acelerada (entradas 14 e 15). Portanto, os grupos que contêm nitrogênio são menos adequados para o uso no isolamento de proteínas de batata de suco de batata. Os grupos acoplados a oxigênio têm uma resistência superior a incrustação e os grupos acoplados a tio éter têm a maior resistência a incrustação.

Tabela 6: A razão de cor/proteína (λ310/Ρ(%)) para a mesma série de combinações de ligante/carreador de apoio. É determinado dividindose a adsorção de cor em 310 nm pela concentração de proteína medida por Sprint.

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41/42

	Razão de cor/proteína (À310nm /P(%))
Adsorção Total em pH 5,2	Adsorção de HMW em pH 5,2	Adsorção de LMW em pH 6,0
no:	Ligante	NaOH a 50 mM	CO3 pH 8,0	NaOH a 50 mM	H3PO4 a 50 mM	NaOH a 50 mM
1	Ácido 4-Aminobenzoico	3,1	2,3	5,1
2	Ácido 3-Aminobenzoico	2,9	1,9	4,1
3	Ácido 3- Aminobenzenosulfônico	3,0	2,7	4,7	1,1	4,9
4	Ácido 2-hidroxi-4- aminobenzoico	3,2	2,1	3,8
5	Ácido 3-Hidroxibenzoico	3,4	2,6	5,4
6	Ácido 2,4-di-idroxibenzoico	3,3	2,6	4,3	1,3	13,6
7	Ácido 4-Hidroxibenzoico	3,0	3,0	5,2
8	Ácido 2-Mercaptopiridina-3carboxílico	2,6	1,6	3,3
9	Ácido 4-mercaptobenzoico	2,4	1,4	3,0	1,4	9,1
10	Ácido 6-hidroxi-2-naftóico	3,4	2,4	3,8
11	Ácido 3,5-di-idroxi-2- naftóico	3,0	2,0	2,8
12	Resina de carboxil acrílica	2,7	15,9	18,5
13	Fenil sefarose	2,3	3,2	1,7

[00161] Daqui se conclui que o ligante ácido que tem a menor razão de cor/proteína é o ácido 4-mercaptobenzóico para a absorção de proteína e para a absorção de HMW, e o ácido 2-mercaptopiridina-3carboxílico é o segundo menor. Portanto, os ligantes ácidos acoplados a tio éter exibem afinidade baixa para cor ou complexos fenólicos que podem causar a incrustação a longo prazo e resultam em um eluato de proteína menos colorido.

EXEMPLO 2: SELEÇÃO DE CARREADOR

Tabela 7: três sistemas de carreador de apoio funcionalizado com o

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42/42 mesmo ligante de ácido 4-mercaptobenzoico, mas com porosidade diferente foram testados quanto à sua capacidade para absorver a proteína de batata de HMW e LMW. O mesmo procedimento conforme descrito acima foi usado para determinar a capacidade de absorção.

carreador, ligante	diâmetro de poro	Capacidade de LMW g/l	Capacidade de HMW g/l
5% de agarose, 4-MBA	50 a 90 nm	59	32
PMMA-4-MBA	30 a 60 nm	37	33
Membrana, 4-MBA	1 a 5 pm	31	<10

[00162] Daqui se conclui que a capacidade de absorção de HMW satisfaz os critérios em um diâmetro de poro maior do que 30 nm, e permanece o mesmo pelo menos até um diâmetro de poro de 90 nm. Além disso, a partir da diferença em material se conclui que o tamanho de poro é o principal parâmetro para essa diferença. Portanto, é razoável que os tamanhos de poro entre 10 e 200 nm, em combinação com ligantes adequados, exibam características de absorção favoráveis. Portanto, os carreadores de apoio funcionalizados que compreendem ligantes adequados deveriam ter diâmetros de poro entre 10 e 200 nm, de preferência 10 a 150 nm, com mais preferência 20 a 100 nm, e ainda com mais preferência 30 a 75 nm.

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo para o isolamento de uma fração de proteína de batata nativa do suco de batata, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   a) ajustar o pH do suco de batata para 4,0 a 6,5;

   b) colocar o suco de batata em contato com um carreador de apoio funcionalizado que tem poros em que pelo menos 90% dos poros têm um diâmetro de poro entre 10 e 200 nm, e em que o carreador é funcionalizado com um ligante de modo misto hidrofóbico que tem um pKa de 2,5 a 5 cujo ligante é acoplado ao carreador através de um átomo de S ou O;

   c) dessorver a fração de proteína de batata do carreador de apoio funcionalizado através de eluição; e

   d) concentrar e/ou secar opcionalmente a fração de proteína de batata.
2. 2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a eluição é executada em um pH entre 5,7 e 8,9.
3. 3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a fração de proteína de batata é uma fração de patatina.
4. 4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a eluição é executada em um pH acima de 9 ou abaixo de 3.
5. 5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a fração de proteína de batata é uma fração inibidora de protease.
6. 6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a eluição é executada com um tampão aquoso.
7. 7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica

   Petição 870190102553, de 11/10/2019, pág. 51/57

   2/2 ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o ligante de modo misto é escolhido a partir do grupo de ácidos benzoicos substituídos, ácidos salicíclicos, ácidos nicotínicos e ácidos naftoicos, pelo qual a substituição está em uma posição de anel disponível com um grupo (CH2)nXH, com n=0-4 e X = S.
8. 8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o carreador de apoio é um polímero sintético poroso, um polissacarídeo poroso, um material inorgânico poroso, ou qualquer combinação dos mesmos.
9. 9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o ligante de modo misto hidrofóbico é fixado ao carreador de apoio através de um espaçador que se liga ao carreador de apoio através de um átomo de O ou S e que não compreende grupos funcionais que contêm nitrogênio.
10. 10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o pH do suco de batata é ajustado com ácido e/ou base.
11. 11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o suco de batata foi submetido a um pré-tratamento que compreende a absorção de contaminantes para um silicato em camadas e/ou carbono ativado e/ou uma floculação.