FI78303B - Foerfarande foer avskiljande av lipoproteiner med hjaelp av derivatiserad polyhydroximetylen. - Google Patents

Description

1 78303

Menetelmä lipoproteiinien erottamiseksi derivatisoidun poly-hydroksimetyleenin avulla

Keksintö koskee menetelmää lipoproteiinien erottamisek-5 si vesipitoisista nesteistä sitomalla ne polyhydroksimetylee-niin, joka sisältää oksastettua oksetyloitua alkoholia tai oksastettua oksetyloitua karboksyylihappoa.

Valmistettaessa kestävää plasmaa tai seerumia ihmis-tai eläinverestä terapeuttisiin tai diagnostisiin tarkoituk-10 siin, on osoittautunut tarkoituksenmukaiseksi poistaa kaikki labiilit proteiinit, mikäli ne eivät ole ko. käytön kannalta tarpeellisia. Lipoproteiinit kuuluvat plasman ja seerumin aineosiin, jotka yllä mainittujen liuosten kannalta ovat erityisen haitallisia.

15 Lipoproteiinit toimivat biologisissa nesteissä tri- glyseridien, kolesteroliesterien ja fosfolipidien vesiliukoisena kuljetusmuotona. Näiden vesiliukoisuus johtuu proteiineista, jotka vaipoittavat sinänsä veteen liukenemattomat lipidit. Ääritapauksessa voi proteiinien osuus lipopro-20 teiinista olla vain muutama prosentti. Veteen liukenemattomien lipidien vaihtelevan suuri osuus on myös syynä lipopro-teiiniliuosten huonoon stabiilisuuteen proteiineihin ja gly-koproteiineihin verrattuna. Sekä terapeuttisesti että myös diagnostisesti käytettävien biologisten nesteiden käytölle 25 tämä liuosstabiilisuus on kuitenkin ehdoton edellytys. Niinpä onkin nähty paljon vaivaa lipoproteiinien poistamiseksi plasmasta tai seerumista siten, että poisto ei muuttaisi käyttäjän kannalta tärkeitä biologisia aktiivisuuksia. Tällainen muuttuminen voi ilmetä esim. antiseerumin vasta-aine-30 pitoisuuden pienenemisenä tai hyytymistekijän ei-toivottuna -:· aktivoitumisena.

Tekniikan tasolla on käytettävissä kolme menetelmää lipoproteiinien poistamiseksi biologisista nesteistä, kuten plasmasta ja seerumista: 35 Menetelmät, joissa lipoproteiinit vaahdotetaan lisää mällä tiheyttä, edellyttävät nopeasti pyörivien sentrifugien 2 78303 käyttöä. Kaikki lipoproteiinit voidaan poistaa seerumista kohottamalla tiheys arvoon 1,21 mikä tapahtuu yleensä lisäämällä kaliumbromidia. Koska on välttämätöntä palauttaa ei-lipoproteiinit fysiologiseen ympäristöön ennen niiden tera-5 peuttista käyttöä, tästä muodostuu lisähaitta pyrittäessä soveltamaan tätä tekniikkaa suuriin tilavuuksiin.

Lipoproteiinien adsorboimiseksi selektiivisesti sitoviin adsorbentteihin on kuvattu joukko adsorbenttejä, joille on yhteistä helmien muodossa oleva hydrofiilinen, 10 polysakkarideihin pohjautuva matriisi, johon on sidottu fe-nyyli- tai alkyyliryhmiä. Haittana ovat ei-toivotut vuorovaikutukset biologisten liuosten komponenttien, kuten fib-rinogeenin kanssa ja myös matriisin alttius entsymaattisel-le hajoamiselle. Lipoproteiineja sitoviin adsorbentteihin 15 kuuluvat myös piidioksidipohjaiset adsorbentit. Näitä kaup- £ panimellä Aerosil myytäviä piidioksideja voidaan käyttää vain sekoitusmenetelmässä, jolloin liuenneita aineita sisältävää nestettä voi joutua sulkeuksiin sedimenttiin. Nämä aineet voidaan tosin saada talteen pesemällä, mutta ne ovat 20 tämän jälkeen käyttökelvottomassa muodossa. Piidioksidiad-sorbenttien lisähaittana on niiden huomattava liukoisuus pH-arvossa 7 ja sen yläpuolella. Selektiivisyyskin on monissa tapauksissa riittämätön, joten ei esim. ole mahdollista poistaa lipoproteiinit ihmis- ja eläinplasmasta ja samalla 25 säilyttää niiden hyytymisominaisuudet.

Lisäksi on tunnettua saostaa lipoproteiinit poly-anioneilla kuten dekstraanisulfaatilla tai hepariinilla. Tällöin pitää mukana olla kationeja kuten Mg++ tai Mn++.

Sitten on poistettava jäljellä oleva polyanionien ylimäärä.

30 Niinpä ei ole ollut mahdollista poistaa lipoproteii nit ihmis- tai eläinperäisestä plasmasta tai seerumista 100 litran mittakaavassa, koska on vältettävä elektrolyyttisuh-teiden ja pH-arvon muutokset, plasman tai seerumin laimentuminen, aineiden kuten bakteeriperäisten pyrogeenien mukaan 35 tulo, jotka terapeuttisessa käytössä saattavat johtaa yhteensopimattomuuteen sekä liuokseen proteiinien määräsuhteiden muuttuminen. Lisäksi menetelmä on voitava toteuttaa steriileissä olosuhteissa.

3 78303

Niinpä keksinnön tehtävänä on ollut keksiä menetelmä lipoproteiinien poistamiseksi vesipitoisista nesteistä mainitut ehdot täyttävällä tavalla.

On yllättäen havaittu, että veteen liukenematon po-5 lyhydroksimetyleeni, johon on oksastettu oksetyloitu alkoholi tai oksetyloitu, alifaattinen karboksyylihappo, pystyy sitomaan lipoproteiineja vesipitoisista liuoksista.

Niinpä keksinnön kohteena on menetelmä lipoproteiinien erottamiseksi vesipitoisesta nesteestä, jolle menetel-10 mälle on tunnusomaista, että neste saatetaan kosketukseen polyhydroksimetyleenin kanssa, joka sisältää oksastettua, oksetyloitua alkoholia tai oksastettua, oksetyloitua karbok-syylihappoa, jolloin alkoholi on 4-30 hiiliatomia sisältävä alkanoli tai karboksyylihappo on 4-20 hiiliatomia 15 sisältävä alifaattinen karboksyylihappo, erotetaan neste ja valinnaisesti eluoidaan lipoproteiinit polyhydroksi-metyleenistä.

Tällainen derivatisoitu polyhydroksimetyleeni (PHM) voidaan valmistaa DE-hakemusjulkaisun 2 556 759 (US-patent-20 ti 4 098 771) mukaan.

Erityisen sopiva on em. hakemusjulkaisun esimerkkien mukaan valmistettu PHM.

Polymeroinnissa käytetään 1-20, mieluiten 2-10 pai-no-% oksetyloitua alkoholia tai oksetyloitua karboksyyli-25 happoa. Tällaisen polymeerin erikoisedut johtuvat joukosta aineominaisuuksia, jotka erottavat sen muista tunnetuista adsorbenteistä. Polyhydroksimetyleeni on synteettinen polymeeri, jossa on katkeamaton hiiliketju. Eräässä suositeltavassa toteuttamismuodossa tähän ketjuun on liitetty al-30 kyyliryhmiä eetterisidosten välityksellä. Näin ollen lopputuote sisältää pelkästään sidostyyppejä, joilla tiedetään olevan suuri kemiallinen ja terminen sekä myös hyvä ent-symaattinen stabiilisuus.

Koska polyhydroksimetyleenissä ei ole ionogeenisiä 35 ryhmiä, se ei pysty osallistumaan ei-toivottuihin ionogee-nisiin reaktioihin.

4 78303 OH-ryhmien, jotka liittyvät polyhydroksimetyleenin jokaiseen hiiliatomiin/ ansiosta vesiliuokset kostuttavat hyvin adsorbentin ja tällä on edullinen vaikutus proteiinien, joiden liuoksia käsitellään polyhydroksimetyleenillä, 5 natiivirakenteen säilymiseen. Emässtabiilisuutensa ansiosta voidaan oksetyloldulla alkoholilla derivatisoitua polyhydr-oksimetyleeniä käsitellä kuumalla emäsiiuoksella ja tähän voi neutraloinnin jälkeen liittyä steriili ja pyrogeenitön käyttö. Terapeuttisesti käytettävien proteiiniliuosten jat-10 kotyöstön kannalta tällaisen toimenpiteen mahdollisuus on erittäin tärkeää. Joskin patenttivaatimuksen mukaisesti de-rivatisoitu polyhydroksimetyleeni pystyy sitomaan lipoproteiineja sekä laajalla pH-alueella että myös liuoksista, joissa elektrolyyttilajit ja -konsentraatiot vaihtelevat, 15 on erityinen etu, että käytettäessä polyhydroksimetyleeniä plasmaan tai seerumiin, sillä on nämä ominaisuudet myös fysiologisissa suola- ja pH-olosuhteissa. Tällä tavoin ei ole tarpeen ennalta muuttaa reaktio-olosuhteita ja palauttaa ne adsorptiovaiheen jälkeen.

20 Sitominen voidaan suorittaa sekoitusmenetelmän tai pylvästekniikan avulla.

Polyhydroksimetyleeniä voidaan käyttää hydraattimuo-dossaan tai kylmäkuivattuna. Jälkimmäisessä tapauksessa on mahdollista puristaa adsorbentti määrättyyn muotoon. Poly-25 vinyleenikarbonaatti, josta PHM valmistetaan hydrolysoimal-la, saadaan sopivasti DE-patenttihakemuksen 3 243 591 mukaan polymeroimalla dispergointiaineiden läsnä ollessa. Koska derivatisoitu polyhydroksimetyleeni saostetaan emäsliuok-sesta, on mahdollista suorittaa saostus hienojakoisten hiuk-30 kasten läsnä ollessa. Nämä joutuvat sulkeuksiin saostuvaan polyhydroksimetyleeniin ja voivat siten antaa kerasaostu-malle ominaisuuksia, jotka helpottavat myöhempää käyttöä tai tekevät käytön ylipäänsä mahdolliseksi. Niinpä voidaan magnet iittihiukkassulkeumilla aikaansaada magneettivaikutus.

35 Esim. silikageelisulkeumilla voidaan parantaa pylvään 5 78303 täytteenä käytettävän polyhydroksimetyleenin juoksevuutta. Hiilihiukkassulkeumat voivat parantaa adsorptiota.

Jos polyhydroksimetyleenlin sitoutuneet lipoproteii-nit halutaan saada talteen, voidaan käyttää kaikkia eluoin-5 tiaineita, jotka dissosioivat hydrofobisia sidoksia.

Esimerkki 200 g US-paten.tin 4 098 771 mukaan valmistettua po-lyvinyleenikarbonaattia suspendoitiin VA-teräsastiaan, jossa oli 3 000 ml 5-m NaOH-liuosta. Suspensiota kuumennettiin 10 sekoittaen 30 minuuttia 90°C:ssa. Tällöin polymeeri liukeni täysin. Tämän jälkeen vielä kuuma liuos laimennettiin sekoittaen 40 litralla vettä. Tällöin veteen liukenematon po-lyhydroksimetyleeni saostui amorfisena sakkana. Saostumisen nopeuttamiseksi suspensioon lisättiin 400 g kiinteää nat-15 riumkloridia. Kolmen tunnin kuluttua sakan päällä oleva neste poistettiin suurimmaksi osaksi lapolla. Astiaan jääneeseen panoksen loppuosaan lisättiin sekoittaen niin paljon 10-m HCl:ää, että suspension pH-arvoksi tuli 12. Kiintoaine ja neste erotettiin toisistaan suodattamalla ja suodattimel-20 le jäänyttä sakkaa pestiin 0,15-m NaCl-liuoksella emästäh-teiden poistamiseksi. Näin saatu tuote sekoitettiin suspensioksi 0,15-m NaCl-liuokseen, jonka pH oli säädetty arvoon 7,5 1-m HCl:llä ja täytettiin kolmeksi litraksi.

Tähän polyhydroksimetyleenijohdannaisen suspensioon 25 liuotettiin 11g trinatriumsitraattia. Lopuksi tämä suspensio pakattiin kromatografiapylvääseen, halkaisija 19 cm.

1,4 litraan ihmisplasmaa, joka oli saatu käyttämällä sit-raatti-ioneja kompleksinmuodostajana, lisättiin 27 ^.ug hepatiitti Bs-antigeeniä ja valutettiin pylvään läpi.

30 Pylvään läpi valuneesta nesteestä otettiin fraktioi ta ja proteiinipitoisimmat fraktiot yhdistettiin. Niiden yhteinen tilavuus oli 1,6 litraa ja ne sisälsivät 89 % lähtö-plasman proteiineista.

Näin saadusta plasmasta ei voitu tunnetuin menetelmin 35 todeta kolesterolia (CHOD-PAP-menetelmä), apo-B-proteiinia (turbidimetrinen immuunireaktio) eikä HBsAgrtä (ELISA-tek-niikka).