JP3313790B2 - 低分子蛋白質の精製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は，トリプシンインヒビタ
ー，α─アミラーゼインヒビター等の低分子蛋白質を，
大量に高純度に精製することができる，低分子蛋白質の
精製方法に関する。

【０００２】

【従来技術】分子量２００００程度の低分子蛋白質とし
ては，例えば，トリプシンインヒビター，α─アミラー
ゼインヒビター等がある。これらの低分子蛋白質は，後
述するごとく，水産加工品の品質改良剤等に用いられ，
近年注目されている。

【０００３】この低分子蛋白質を精製する方法として
は，従来，例えば，特開平２─７６９００号，“Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ”，
Ｖｏｌ．１７３，Ｎｏ．１（１９９０）に記載された方
法がある。

【０００４】

【解決しようとする課題】しかしながら，上記従来の精
製方法は実験的なもので，大量に生産することが困難で
あり，その製造法が複雑なためコスト高となり，得られ
た低分子蛋白質は極めて高価なものとなる。また，その
精製純度も比較的低く，用途面での制約も生じている。
本発明はかかる従来の問題点に鑑み，低分子蛋白質を大
量に高純度に精製することができる，低分子蛋白質の精
製方法を提供しようとするものである。

【０００５】

【課題の解決手段】本発明は，大豆，米，小麦，大麦，
じゃがいも等の植物の破砕物を極性溶媒により抽出し，
その抽出物の水溶液を疎水性樹脂を充填したカラムに通
すことにより，分子量１５０００〜３００００の低分子
蛋白質を疎水性樹脂に吸着させ，これを親水性有機溶媒
を用いて溶出することを特徴とする低分子蛋白質の精製
方法にある。

【０００６】本発明は，分子量１５０００〜３００００
の低分子蛋白質を精製する方法である。該低分子蛋白質
には，トリプシンインヒビター，α─アミラーゼインヒ
ビター等がある。本発明において最も注目すべきこと
は，上記抽出物の水溶液を，疎水性樹脂のカラムに通
し，上記低分子蛋白質を吸着させて，これを精製してい
ることである。

【０００７】上記極性溶媒としては，水，メタノール，
エタノール，アセトン等を用いる。上記疎水性樹脂は，
非極性であり，多数の細孔を有する表面積の大きなポリ
マーである。そして，その微粒子表面は，疎水性であ
る。かかる疎水性樹脂としては，ＨＰ−２０（三菱化成
（株）製），ＨＰ−４０（三菱化成（株）製）等を用い
る。上記低分子蛋白質の原料として用いる植物として
は，大豆，米，小麦，大麦，じゃがいも，じゃがいもの
皮，なた豆，米糠，トウモロコシ，アルファルファ，大
豆胚芽等低分子蛋白質を含有する植物がある。

【０００８】以下，上記低分子蛋白質の精製方法につい
て詳説する。まず，上記植物を水に浸漬する。このと
き，これに先立って，上記植物を破砕する。ここに破砕
は，上記植物を細片状に切り刻むこと，クラッシュする
こと，粉砕することなど，上記植物から低分子蛋白質を
溶出しやすくする処理をいう。

【０００９】次いで，得られた浸漬液をフィルターによ
り濾過する。次いで，得られた濾液を，上記疎水性樹脂
を充填したカラムに通す。これにより，低分子蛋白質等
を疎水性樹脂に吸着させる。次いで，アセトン，アルコ
ール等の親水性有機溶媒を上記カラムに通すことによ
り，疎水性樹脂に吸着した低分子蛋白質を溶出させる。
次に，この溶出液中の親水性有機溶媒を留去する。

【００１０】上記低分子蛋白質は，練製品の品質改良
剤，膵臓疾患治療薬，組織培養用培地添加剤など，多く
の用途が考えられ，特に加工食品の分野において注目さ
れている。更に，その後，低分子蛋白質を凍結乾燥，ス
プレードライ，減圧乾燥等により粉末化することが好ま
しい。これにより，低分子蛋白質の活性安定化を図るこ
とができる。これにより，分子量１５０００〜３０００
０の低分子蛋白質が得られる。

【００１１】

【作用及び効果】本発明においては，上記植物中に含ま
れる低分子蛋白質を浸漬液中に抽出し，次いでこれを疎
水性樹脂に吸着させている。そのため，得られた低分子
蛋白質は，純度が高い。また，本発明の精製方法は，工
程数が少ない。

【００１２】そのため，効率よく大量に，かつ高純度に
低分子蛋白質を精製することができ，コストも安い。ま
た，低分子蛋白質は，植物における廃棄部分，例えばじ
ゃがいもの皮，米糠等にも多量に含まれている。そのた
め，これら低分子蛋白質含有植物の廃棄物を原料とする
こともでき，この点においてもコスト安となる。本発明
によれば，低分子蛋白質を大量に高純度に精製すること
ができる，低分子蛋白質の精製方法を提供することがで
きる。

【００１３】

【実施例】実施例１ 本例は，低分子蛋白質としてのトリプシンインヒビター
を，大豆から精製する方法である。以下，その方法につ
いて説明する。まず，大豆１００ｇを蒸留水５００ｍｌ
に５℃，８時間浸漬する。次いで，ミキサーにより粉砕
し，サラシ木綿により濾過する。これにより大豆抽出物
を含有する水溶液３００ｍｌ（ｐＨ６．６）を得る。

【００１４】この水溶液を，疎水性樹脂ＨＰ−２０（三
菱化成（株）製）５０ｍｌを充填したカラム（口径２ｃ
ｍ，長さ１６ｃｍ）に，空間速度ＳＶ２で通す。次い
で，該疎水性樹脂に水１００ｍｌを通して洗浄する。

【００１５】次に，親水性有機溶媒（９０％アセトン，
１０％水）を上記疎水性樹脂にＳＶ２で通すことによ
り，上記疎水性樹脂に吸着した低分子蛋白質を溶出す
る。次いで，この溶出液中の親水性有機溶媒を減圧下に
蒸発除去し，乾固する。これにより，低分子蛋白質０．
５６ｇが得られた。次に，該低分子蛋白質のトリプシン
阻害活性値をカゼイン消化方法により測定した。その結
果，該低分子蛋白質は，約１０００ｕ／ｇのトリプシン
阻害活性を示した。

【００１６】次に，本例の作用効果について説明する。
上記のごとく，本例の方法によれば，得られた低分子蛋
白質は高いトリプシン阻害活性を示し，純度が高いもの
であった。また，本例の精製方法は工程数が少ない。そ
のため，効率よく，低コストで低分子蛋白質を精製する
ことができる。

【００１７】また，上記低分子蛋白質の精製方法を豆乳
の生産ラインに加えることにより，大豆中に含まれるリ
ポキシゲナーゼと共にトリプシンインヒビターを効率的
に除去することができる。得られた豆乳は，豆乳独特の
異臭もなく，非常に飲みやすいものである。

【００１８】実施例２ 本例は，大量の低分子蛋白質を大豆から精製する方法で
ある。まず，大豆１００ｋｇを蒸留水５００リットルに
５℃，６時間浸漬する。次いで，この大豆をマスコライ
ザーにより粉砕し，フィルタープレスにより濾過する。
これにより，大豆抽出物を含む水溶液（ｐＨ６．６）４
００リットルを得る。この水溶液を，疎水性樹脂５０リ
ットルを充填したカラム（口径３０ｃｍ，長さ７１ｃ
ｍ）に空間速度ＳＶ２で通す。疎水性樹脂としては，Ｈ
Ｐ−２０（三菱化成（株）製）を用いた。

【００１９】次いで，該疎水性樹脂に水１００リットル
を通して洗浄する。次に，親水性有機溶媒（９０％エタ
ノール，１０％水）を上記疎水性樹脂にＳＶ２で通すこ
とにより，疎水性樹脂に吸着した低分子蛋白質を溶出す
る。この溶出液中の親水性有機溶媒を減圧下に蒸発除去
し，乾固する。これにより，低分子蛋白質１．２ｋｇが
得られた。該低分子蛋白質は，トリプシンインヒビター
である。この低分子蛋白質のトリプシン阻害活性値を実
施例１と同様に測定したところ，約１２００ｕ／ｇの活
性を示した。

【００２０】実施例３ 本例においては，前記実施例１，２により得られたトリ
プシンインヒビターの，トリプシンに対する阻害度を測
定した。測定に当たっては，トリプシンインヒビターに
より活性抑制されたトリプシンを用いてカゼインを分解
し，その未分解のカゼインの濃度を分光光度計にて測定
した。

【００２１】以下，その測定法について詳説する。ま
ず，実施例１で得たトリプシンインヒビターを１０００
０倍に希釈することにより阻害液を調製する。次に，
０．１モルのリン酸バッファー（ｐＨ８．０）と，１．
５％のカゼイン溶液（ｐＨ８．０）と，トリプシン（３
０ＵＳＰ ｕｎｉｔｓ／ｍｇ；和光純薬２０３─１１３
０２）と，４％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）とを準備す
る。上記カゼイン溶液は，上記リン酸バッファーに溶解
させたものである。上記トリプシンは，上記リン酸バッ
ファー中にトリプシンを４ｍｇ／ｍｌ，または２ｍｇ／
ｍｌ溶解させたものである。

【００２２】次に，トリプシンインヒビターにより活性
抑制されたトリプシンによるカゼイン分解液（Ａｓ液）
を調製する。即ち，まず，トリプシン１ｍｌに上記阻害
液１ｍｌを加え，３７℃，１０分間加温し，これを阻害
液入酵素液とする。一方，カゼイン２ｍｌを３７℃，１
０分間加温し，これを基質液とする。

【００２３】次いで，該基質液２ｍｌ中に上記阻害液入
酵素液１ｍｌを加え，３７℃，１５分間反応を行う。Ｔ
ＣＡ２ｍｌを加え，３７℃，２０分間放置することによ
り反応を終了させる。得られた反応終了液を，濾紙（Ｎ
ｏ．１３１，ヒダ折り）により濾過する。これにより，
上記Ａｓ液を得る。

【００２４】一方，上記Ａｓ液のブランク液（Ａｂ液）
を調製する。即ち，上記阻害液入酵素液の代わりに，阻
害液０．５ｍｌとリン酸バッファー０．５ｍｌとを，上
記基質液２ｍｌに加える。次に，上記Ａｓ液と同様に反
応を行う。これにより，上記Ａｂ液を得る。

【００２５】次に，トリプシンによるカゼイン分解液
（Ａｏ液）を調製する。即ち，まず，トリプシン１ｍｌ
にリン酸バッファー１ｍｌを加え，３７℃，１０分間加
温し，酵素液を得る。一方，カゼイン２ｍｌを３７℃，
１０分間加温し，これを基質液とする。次いで，該基質
液２ｍｌ中に上記酵素液１ｍｌを加え，３７℃，１５分
間反応を行う。ＴＣＡ２ｍｌを加え，３７℃，２０分間
放置して，反応を終了させる。得られた反応終了液を，
濾紙（Ｎｏ．１３１，ヒダ折）により濾過する。これに
より，上記Ａｏ液を得る。

【００２６】一方，上記Ａｏ液のブランク液（Ａｂｓ
液）を調製する。即ち，上記酵素液の代わりに，リン酸
バッファー１ｍｌを，上記基質液２ｍｌに加える。次
に，上記Ａｏ液と同様に反応を行った。これにより，上
記Ａｂｓ液を得る。

【００２７】次に，上記４種類の溶液（Ａｓ液，Ａｂ
液，Ａｏ液，Ａｂｓ液）について，それぞれ吸光度（Ｏ
Ｄ２８０ｎｍ）を測定し，以下に示す式によりトリプシ
ンに対するトリプシンインヒビターの阻害度を求めた。 阻害度（％）＝１００×〔（Ａｏ−Ａｂｓ）−（Ａａ−
Ａｂ）〕／（Ａｏ−Ａｂｓ）

【００２８】その結果，実施例１のトリプシンインヒビ
ターの阻害度は，５０．６％であった。実施例２では，
４８％であった。また，比較のために，大豆より単離し
たトリプシンインヒビターの標品（和光純薬（株）製）
の阻害度を同様に測定したところ，９２％であった。

【００２９】尚，該標品を精製するに当たっては，ま
ず，大豆の水抽出物の水溶液をゲル濾過した。得られた
濾液をイオン交換クロマトグラフィにより精製した。次
いで，これを脱脂し，水抽出をし，ゲル濾過を行った。
次に，該濾液をＤＥＡＥ−カラムクロマトグラフィによ
り精製した。

【００３０】このことから，本例によれば，米糠由来の
濾液を疎水性樹脂に吸着し，溶出するという，極めて簡
便な操作を行うことにより，上記のごとく多数の工程を
経て精製された標品にも劣らない程度の阻害度を有する
トリプシンインヒビターが精製されたことがわかった。

【００３１】実施例４ 本例は，低分子蛋白質としてのトリプシンインヒビター
を，米糠から精製する方法である。まず，米糠１００ｇ
を蒸留水５００ｍｌ，５℃に浸漬し，マグネティックス
ターラーにより半日攪拌する。その後，冷蔵庫中に６時
間静置する。次いで，サラシ木綿により濾過し，最後に
絞る。これにより米糖抽出物を含む水溶液４３０ｍｌ
（ｐＨ６．６）が得られる。

【００３２】次に，該水溶液を，疎水性樹脂（ＨＰ−２
０，三菱化成（株）製）５０ｍｌを充填したカラム（口
径２ｃｍ，長さ１６ｃｍ）にＳＶ２で通す。次いで，こ
の疎水性樹脂に水１６０ｍｌを通すことにより，最終流
液が無色透明になるまで疎水性樹脂を洗浄した。

【００３３】次いで，親水性有機溶媒（９０％アセト
ン，１０％水）１００ｍｌを上記疎水性樹脂にＳＶ２で
通すことにより，疎水性樹脂に吸着した低分子蛋白質を
溶出する。得られた溶出液中の親水性有機溶媒を，浴温
３０℃以下，減圧下で蒸発除去し，乾固する。その後，
棚温３７℃以下で凍結乾燥する。これにより，低分子蛋
白質１．１８ｇを得る。該低分子蛋白質は淡褐色綿状結
晶であった。

【００３４】また，該低分子蛋白質の阻害度を実施例３
の方法で測定した。測定の結果，本例のトリプシンイン
ヒビターのトリプシンに対する阻害度は，１２．７％で
あった。また，実施例３で用いた比較例にかかる，トリ
プシンインヒビターの標品は，９２％の阻害度であっ
た。

【００３５】実施例５ 本例は，低分子蛋白質としてのトリプシンインヒビター
を，馬鈴薯の生皮から精製する方法である。まず，馬鈴
薯の生皮１８０ｇに水４００ｍｌを加えてミキサーにか
ける。そして，ミキサーから粉砕物を出して，水１００
ｍｌでよく洗い落とし，上記粉砕物と合わせる。

【００３６】得られた粉砕液は，５００ｍｌの水中に生
皮１８０ｇが粉砕，混合されたものである。これを６時
間冷蔵庫内で静置する。次いで，サラシ木綿により濾過
し，最後に絞る。これにより馬鈴薯抽出物を含有する水
溶液５６０ｍｌ（ｐＨ６．６）が得られる。

【００３７】次に，該濾液を，疎水性樹脂（ＨＰ−２
０，三菱化成（株）製）５０ｍｌを充填したカラム（口
径２ｃｍ，長さ１６ｃｍ）に空間速度ＳＶ２．０〜３．
０で通す。次いで，この疎水性樹脂に水１００ｍｌを通
すことにより，最終流液が無色透明になるまで疎水性樹
脂を洗浄した。

【００３８】次いで，親水性有機溶媒（９０％アセト
ン，１０％水）１００ｍｌを上記疎水性樹脂にＳＶ１〜
２で通すことにより，疎水性樹脂に吸着した低分子蛋白
質を溶出する。得られた溶出液中の親水性有機溶媒を，
浴温２０〜２５℃以下，減圧下で蒸発除去し，乾固す
る。その後，棚温３７℃以下で凍結乾燥する。

【００３９】得られた低分子蛋白質は，約２００ｍｇで
ある。低分子蛋白質は吸湿性である。また，上記低分子
蛋白質の阻害度を実施例３の方法により測定した。上記
サンプルは約１００００倍に希釈して測定に供した。測
定の結果，本例のトリプシンインヒビターのトリプシン
に対する阻害度は，３０．０％であった。また，実施例
３で用いた比較例にかかる，トリプシンインヒビターの
標品は，９２％の阻害度であった。

【００４０】実施例６ 本例は，低分子蛋白質としてのα─アミラーゼインヒビ
ターを大麦から精製する方法である。以下，その精製方
法について説明する。まず，大麦粉末１５０ｇを水７５
０ｍｌに浸漬し，濾過する。これにより大麦抽出物を含
む水溶液（ｐＨ＝６．０）５００ｍｌを得る。以下，実
施例１と同様の操作を行ない，低分子蛋白質０．７ｇを
得た。また，本例により得られた低分子蛋白質につい
て，Ｂｌｕｅ Ｖａｌｕｅ法（Ｂ・Ｖ法）によりα−ア
ミラーゼインヒビター阻害活性を測定した。その結果，
α−アミラーゼに対する阻害活性が高かった。

【００４１】実施例７ 本例においては，上記大麦抽出物と低分子蛋白質とを電
気泳動させた。その結果を図１，図２に示す。図１にお
いて，，はＭＷ−ＳＤＳ−２００ Ｋｉｔ（Ｓｉｇ
ｍａ社（株）製）のパターンを，は上記大麦抽出物の
パターンを示す。図２において，はＳＤＳ ＰＡＧＥ
Ｓｔａｎｄａｒｄ（低分子蛋白質用）（Ｂｉｏ Ｒａ
ｄ社（株）製）のパターンを，は上記低分子蛋白質の
パターンを，はα−アミラーゼインヒビターの標品
（和光純薬（株）製）のパターンを示す。

【００４２】その結果，本例の低分子蛋白質は，分子約
２００００であり，上記標品と同様の分子量を有してい
ることがわかった。これにより，上記の分子量約２００
００の低分子蛋白質はα−アミラーゼインヒビターであ
ることが確認された。また，前記実施例１，２，４，５
にかかる低分子蛋白質としてのトリプシンインヒビター
を，上記と同様にして電気泳動させたところ，約２００
００の分子量を有していることがわかった。

【００４３】実施例８ 本例においては，種々の疎水性樹脂を用いて，低分子蛋
白質としてのトリプシンインヒビターを，大豆１００ｇ
から精製した（試料Ｎｏ．１〜６）。その他の精製方法
は，実施例１と同様である。上記各試料のトリプシン阻
害度，及び収量を測定した。トリプシン阻害度は，実施
例３と同様にして測定した。その結果を表１に示す。

【００４４】尚，試料Ｎｏ．１，２の疎水性樹脂は，三
菱化成（株）製品である。試料Ｎｏ．３，４の疎水性樹
脂は，住友化学工業（株）製品である。試料Ｎｏ．５，
６の疎水性樹脂は，ローム・アンド・ハース社（株）製
品である。その結果，表１より知られるごとく，いずれ
の疎水性樹脂においても，十分な収量が得られた。トリ
プシン阻害度も良好であった。

【００４５】また，分子量約１０万のトリプシンインヒ
ビターを含むウシプラズマ２００ｍｌを，上記実施例１
と同様にして疎水性樹脂（ＨＰ−２０）に吸着させ，溶
出した。得られた溶出物は０．３５ｇであった。該溶出
物のトリプシン阻害度を測定したところ０％であり，溶
出物中にはトリプシンインヒビターが含まれていなかっ
た。このことから，上記疎水性樹脂は，分子量約１０万
の蛋白質を吸着しないことが確認された。このことから
も，本例によれば，効率よく分子量２万程度の低分子蛋
白質が得られることがわかる。

【００４６】

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例７にかかる，大麦抽出物の電気泳動図。

【図２】実施例７にかかる，低分子蛋白質の電気泳動
図。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 大豆，米，小麦，大麦，じゃがいも等の
   植物の破砕物を極性溶媒により抽出し， その抽出物の水溶液を疎水性樹脂を充填したカラムに通
   すことにより，分子量１５０００〜３００００の低分子
   蛋白質を疎水性樹脂に吸着させ，これを親水性有機溶媒
   を用いて溶出することを特徴とする低分子蛋白質の精製
   方法。