CN104470368A

CN104470368A - 马铃薯蛋白分离物

Info

Publication number: CN104470368A
Application number: CN201380037257.8A
Authority: CN
Inventors: 马尔克·路易吉·费代里科·朱塞平; 马克·克里斯蒂安·劳斯; 扬·斯赫伊浦尔
Original assignee: Cooperative Avebe UA
Current assignee: Avibe Royal partners
Priority date: 2012-07-11
Filing date: 2013-07-10
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2033-07-10
Also published as: MX358683B; MX2015000120A; JP6170148B2; CN104470368B; CA2873381C; EA201491988A1; WO2014011042A1; JP2015527994A; EA028415B1; US20190248842A1; DK2871968T3; US11753451B2; US20150183840A1; PL2871968T3; EP2871968B1; EP2871968A1; CA2873381A1; BR112015000188A2; BR112015000188B1

Abstract

本发明涉及一种使用特定的吸附剂获得马铃薯蛋白部分的方法。具体的，本发明涉及经适当的配体官能化的载体材料，该载体材料包括特定的聚合物材料。通过使用根据本发明的官能化的支撑载体，可以以较高效率获得马铃薯蛋白部分。

Description

马铃薯蛋白分离物

技术领域

本发明属于食物蛋白的领域，具体涉及马铃薯蛋白部分的分离。

背景技术

新鲜的马铃薯汁液是可溶材料和不溶材料的复杂混合物。它具有高蛋白含量，并且进一步包括残余的淀粉、矿物质、有毒的配糖生物碱，以及单体反应性酚类和聚合的反应性酚类。它是马铃薯淀粉生产的副产物，并且通常被当作废弃物。

马铃薯汁液含有高达1.5％重量的相对大量的蛋白。可以将马铃薯汁液分成三组：(i)43kDa的高度同源的酸性糖蛋白的高分子量部分(HMW)(总马铃薯蛋白的40～50w％)，(ii)5～25kDa的碱性低分子量部分(LMW)(总马铃薯蛋白的30～40w％)，该碱性低分子量部分是糖蛋白；以及(iii)其它蛋白(总马铃薯蛋白的10～20w％)。马铃薯糖蛋白(Patatin)属于糖蛋白家族，具有酯酰水解酶和转移酶活性，并且将主要是HMW部分的一部分。LMW部分典型地包括蛋白酶抑制剂和通常具有低分子量的其它蛋白。

尽管马铃薯汁液被当作废弃物，但是马铃薯蛋白的营养质量高于酪蛋白的营养质量，并且与整蛋(whole egg)的营养质量相当。马铃薯蛋白富含赖氨酸，并且在理论上是低赖氨酸蛋白(诸如谷物蛋白)的优异的补充物。尽管马铃薯蛋白具有独特的营养质量，但是由于可用产物显示出许多严重的缺点，马铃薯蛋白目前仅用作动物饲料。

其中一个主要缺点是难以分离天然形式的马铃薯蛋白。通常在工业规模上，通过热凝结进行马铃薯蛋白从马铃薯淀粉制造厂的废水中的回收，这样产生的是变性的马铃薯蛋白。处于变性形式的蛋白没有它们期望的功能性质，诸如乳化能力、发泡能力、热凝胶化能力、结合水的能力等。甚至在食品工业中应用的最基本的要求(即在水中的溶解性)也不能得到满足。

已经证实，之前通过更加温和的方法(诸如膜过滤和沉淀技术)从马铃薯汁液中分离蛋白的尝试，在工业规模的生产环境中效率是非常低的。这是因为严重的膜污染，并且伴随着流量和分离能力的丧失。另外，这样的方法不具有在马铃薯汁液中存在的各种蛋白种类之间进行分离的能力。例如，膜过滤不能从聚合的酚化合物或多糖中分离高分子量的蛋白产物，因为膜倾向于将它们都保留下来。

之前，已经在工业上分离了天然的马铃薯蛋白。Avebe U.A.的WO 2008/069650公开了分离天然马铃薯蛋白分离物的方法，该天然马铃薯蛋白分离物具有低配糖生物碱含量。该方法包括絮凝及后续的膨胀床吸附，以使马铃薯蛋白吸附至吸附剂上，然后洗脱天然的马铃薯蛋白分离物。但是该方法是昂贵的，并且在膨胀床吸附中使用的混合式配体在马铃薯汁液中相对不稳定。

名称为先期色谱法的WO 2008/092450公开了使用配体和基于pH的分馏进行马铃薯蛋白的大规模分馏和分离的方法。但是，发现配体对马铃薯汁液中的氧化过程敏感，并且虽然添加亚硫酸盐缓解了这一问题，但是仍然不能完全阻止这一问题的发生。配体相对快速的氧化降解仍然是个问题。进一步地，没有注意到孔隙度对吸附能力的影响，从而使得吸附能力在不同的吸收剂之间变化很大。由于这一原因，在这一出版物中提到的很多配体根本不适于以由成本效益的工业规模，通过稳定的操作来分离马铃薯蛋白的目的。

因此，仍然需要一种分离天然马铃薯蛋白部分的改进的方法。本发明与以下发现有关：在吸附材料中使用的配体的性质、配体与该吸附材料的连接的方式以及吸附材料的孔隙度都对马铃薯蛋白的吸附效率有非常大的影响。因此，提供了一种分离天然马铃薯蛋白部分的优化的方法。

发明内容

本发明涉及一种分离天然马铃薯蛋白部分的方法。具体地，讨论了一种通过等电点分类马铃薯蛋白的方法，该方法允许分离两种部分，即高分子量部分和低分子量部分。这些部分能够在没有污染的情况下，并且进一步纯化以去除不需要的有色化合物来获得。

附图说明

图1：配体流线型直接(Streamline Direct)CST1(CST1)、4-巯基苯甲酸官能化的Sepabead HFA(HFA MBA)和4-巯基苯甲酸官能化的Sepabead EP(EPMBA)的结构式。支撑载体由实心圆来表示。

图2：在与不稳定的马铃薯果实汁液(不含亚硫酸盐)一起孵育3x24h后，a)经酸性配体1～12和b)经流线型直接(Streamline Direct)CST1和具有4-MBA配体的Sepabead HFA官能化的支撑载体在加速污染测试中的着色。

具体实施方式

本发明涉及一种从马铃薯汁液中分离天然的马铃薯蛋白部分的方法，该方法包括：a)将马铃薯汁液的pH调节至4.0～6.5；b)使马铃薯汁液与具有孔隙的官能化的支撑载体接触，其中，至少90％的孔隙具有10nm至200nm之间的孔径，并且其中载体经疏水的混合模式的配体官能化，该疏水的混合模式的配体具有2.5～5、优选4～5的pKa，该配体通过S原子或O原子、优选硫醚基团与载体相连；c)通过洗脱，使马铃薯蛋白部分从官能化的支撑载体上解吸附；以及d)任选地，浓缩和/或干燥马铃薯蛋白部分。

对于本发明，马铃薯汁液应理解为指任何种类的马铃薯来源的液体，其包含大量天然马铃薯蛋白，并且包括通常作为淀粉生产的副产物获得的马铃薯果实汁液(PFJ)，以及已知为马铃薯果实水(PFW)的稀释的PFJ。因此，能够以以下形式使用，其中，马铃薯汁液通常被认为是以稀释或经部分加工的形式，例如来自马铃薯淀粉生产或来自消耗马铃薯的加工的废物流。

马铃薯汁液还能够被去除(deplete)马铃薯蛋白的特定部分，例如在应用根据本发明的方法获得的马铃薯汁液。例如，已经清除或部分清除了蛋白酶抑制剂部分(被称为低分子量(LMW)部分)的马铃薯汁液被称为LMW去除或部分LMW去除的马铃薯汁液。另外，已经清除或部分清除了马铃薯糖蛋白部分(被称为高分子量(HMW)部分)的马铃薯汁液被称为HMW去除或部分HMW去除的马铃薯汁液。另外，这些被认为是用于根据本发明的方法的马铃薯汁液。

如本文所限定的，官能团是为分子带来重要的化学反应性的基团，从而使在考虑中的分子或基团产生改变。该化学反应性主要通过在还原性水环境(诸如在马铃薯汁液中发现的还原性水环境)中的反应性来限定。正因如此，不将高稳定性的基团看作是本发明范围内的官能团，高稳定性的基团诸如是未经如下基团取代的芳香环(未经活化的芳香环)：使芳香环活化，足以在这样环境中使基团发生显著改变。因此，不将苯环和杂环(诸如未经活化的吡啶衍生物)看作是本发明范围内的官能团。

如在本文中使用的，连接基团是原子或多个原子的组，配体通过该原子或多个原子的组与载体连接。已经通过化学反应形成了连接基团，从而使配体与间隔体(spacer)或支撑载体相连接，或使间隔体与支撑载体相连接。

如在本文中使用，骨架是多个原子的链(该多个原子使配体与支撑载体相连)，包括连接基团。更具体地，它是使配体与支撑载体直线连接的最短的原子链。

马铃薯蛋白的高分子量(HMW)或富含马铃薯糖蛋白的部分具有最大的商业兴趣，因为该部分比低分子量(LMW)部分更难以以纯的和天然的形式获得，其中低分子量(LMW)部分富含蛋白酶抑制剂。另外，它是马铃薯蛋白中同质性最高的部分。由于这一原因，本发明的重点在于，以天然形式分离HMW部分中的蛋白，其中HMW部分主要包括热和酸不稳定的马铃薯糖蛋白。这是通过同时分离马铃薯蛋白的LMW部分来实现的。因为只要分离效率高，纯的和天然形式的两种产物都是商业上感兴趣的，因此应理解本发现还与马铃薯蛋白的分离的LMW部分有关。

粗制的马铃薯汁液是：还没有经过任何纯化并且本身能被使用的马铃薯汁液；或者是首先进行无侵害性的预处理的马铃薯汁液，该无侵害性的预处理不影响包含在汁液中的马铃薯蛋白的含量和性质。这样的处理例如可以是通过诸如离心、过滤、絮凝和/或吸附进行的pH调节、澄清(clarification)或脱色。具体地，存在用于对马铃薯汁液进行预清洁的各种方法，其目的是去除例如不想要的污染物，例如配糖生物碱、(多)酚类、果胶、脂类、脂肪酸和/或原花青素和其有色的衍生物(诸如表儿茶酸和花青素)。在待定的申请WO2008/056977中记载了用于去除这些污染物中的一种或多种(具体是配糖生物碱)的方法，其中记载了通过与分层的硅酸盐接触，从马铃薯汁液的加工流中吸附污染物。可选择地，WO 2008/069651记载了通过与活性炭接触，从植物加工流的水性溶液中吸附污染物。在使用包括絮凝法的预处理时，包括在应用本发明的方法之前预处理马铃薯汁液的方法可能是特别有利的，其中絮凝法例如使用二价金属离子(诸如钙盐或镁盐)。

蛋白的等电点(IEP)是pH值，在该pH值时，存在于氨基酸上的正电荷与存在的负电荷一样多。因此，在IEP时，蛋白具有净中性电荷(net neutralcharge)。当使蛋白处于低于它的IEP的pH时，该蛋白具有净正电荷，并且当使蛋白处于高于它的IEP的pH时，蛋白具有净负电荷。可以通过标准步骤，诸如等电聚集法(IEF)，来确定IEP。

在本文所描述的使用官能化的支撑载体的优选实施方式中，可以根据等电点，并且同时根据分子量来对蛋白分级。这允许分离马铃薯蛋白部分，例如马铃薯糖蛋白部分或蛋白酶抑制剂部分。本发明的具体方面是一种或多种马铃薯蛋白部分可以被连接到官能化的支撑载体上，并且被分级以获得一种或多种天然的马铃薯蛋白部分。马铃薯蛋白与本文所提出的官能化的支撑载体上的配体连接，且没有有色马铃薯汁液组分的过多的伴随连接，并且，官能化的支撑载体对于由马铃薯汁液组分引起的劣化和/或降解是稳定的。

本发明的方法可以以两种不同的方式来进行，这两种不同的方式称为选择性吸附和选择性洗脱。因为本发明应用的两种不同方式，本发明可以用于获得马铃薯汁液中存在的所有马铃薯蛋白，它们作为包括LMW部分和HMW部分的混合物。另外，本发明还可以用于将来自马铃薯汁液的马铃薯蛋白分级成HMW部分和/或LMW部分。优选使用水性缓冲液进行洗脱。

在本发明的一种方式中，马铃薯蛋白部分通过选择性吸附来获得。在这种方式中，在本发明的步骤a)中，将马铃薯汁液的pH调节到4.0至6.5之间，优选6.0。然后，在本发明的步骤b)中，马铃薯汁液与官能化的支撑载体接触，在该官能化的支撑载体中，至少90％的孔隙具有10nm至200nm之间的孔径，并且其中载体经疏水的混合模式的配体官能化，该疏水的混合模式的配体具有2.5～5、优选4～5的pKa，该配体通过S原子或O原子，优选硫醚基与载体相连。该方式的步骤b)发生马铃薯蛋白的LMW部分的选择性吸附，并且由此，与官能化的支撑载体接触之后的马铃薯汁液被去除了马铃薯蛋白的LMW部分。这样得到LMW去除的马铃薯汁液。在该实施方式的步骤c)中，通过在pH小于3(酸性洗脱)的酸性洗脱或高于9的pH(碱性洗脱)下，使马铃薯蛋白的LMW部分从官能化的支撑载体上解吸附。酸性洗脱最终得到在颜色、气味和味道上质量较好的蛋白产物。

在本发明的另一方式中，HMW马铃薯蛋白和LMW马铃薯蛋白(如果存在的话)都首先作为包括马铃薯蛋白的HMW部分和LMW部分(如果存在的话)的蛋白混合物被吸附至官能化的支撑载体。因此，该方法涉及总马铃薯蛋白部分的吸附。在这种方式中，马铃薯汁液可以是如上所述的粗制的或经预处理的马铃薯汁液，在这种情况中，马铃薯蛋白的HMW部分和LMW部分都被吸附。另外，可以方便地使用LMW去除的马铃薯汁液，诸如通过马铃薯蛋白的LMW部分的选择性吸附之后获得的马铃薯汁液，在这种情况中，基本上仅存在马铃薯蛋白的HMW部分。在这种情况中，该方式需要从LMW去除的马铃薯汁液中选择性吸附马铃薯蛋白的HMW部分。

本发明的这种方式在步骤a)中包括pH-调节步骤，其中将马铃薯汁液的pH调节到4.0至6.5之间，优选5.2。然后，在步骤b)中，马铃薯汁液与官能化的支撑载体接触，在该官能化的支撑载体中，至少90％的孔隙具有10nm至200nm之间的孔径，并且其中载体经疏水的混合模式的配体官能化，该疏水的混合模式的配体具有2.5～5、优选4～5的pKa，该配体通过S原子或O原子、优选硫醚基与载体相连。在这一实施方式中，步骤b)发生马铃薯蛋白的HMW部分和LMW部分(如果存在的话)的同时吸附。在步骤c)中，通过pH＜3或pH＞9的酸性洗脱或碱性洗脱，作为包括HMW部分和LMW部分的单个蛋白部分，洗脱存在于马铃薯汁液中的马铃薯蛋白。另外，在这种情况中，酸性洗脱得到在颜色、气味和味道上质量优良的蛋白产物。

对于本发明的这种方式，可选择地，在步骤c)中可以进行选择性洗脱。在这种情况中，在步骤c)中，通过在pH5.7～6.3、优选pH6.0时的马铃薯蛋白的HMW部分的第一选择性洗脱，进行使马铃薯蛋白部分从官能化的支撑载体上解吸附。然后，通过如上所述的pH低于3的酸性洗脱，或pH高于9的碱性洗脱，可以发生马铃薯蛋白的LMW部分(如果存在的话)的选择性洗脱。当在该实施方式中使用LMW去除的马铃薯汁液时，可以使用较高的洗脱pH，诸如pH 5.7～8.9、优选8.0，较高的洗脱pH提高HMW部分的洗脱效率。

通常，在本发明的步骤a)中，将马铃薯汁液的pH调节至4.0～6.5、优选5.2，用于使存在于马铃薯汁液中的所有马铃薯蛋白部分都吸附至官能化的支撑载体，然后洗脱马铃薯蛋白部分。可选择地，将马铃薯汁液的pH调节至4.0～6.5、优选6.0，用于进行马铃薯蛋白的LMW部分的选择性吸附。

可以使用本领域已知的各种酸和/或碱，以浓缩或稀释的形式或合并以形成缓冲液，将马铃薯汁液的pH调节至4.0～6.5。因此，可以使用各种类型的强酸，诸如盐酸、硫酸、硝酸。另外，也可以使用弱酸，诸如磷酸、甲酸、乙酸、柠檬酸、乳酸。另外，马铃薯汁液的预处理可能具有需要调节至较高pH的结果。在这种情况中，优选的强碱例如是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙。优选的弱碱例如是碳酸盐、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、亚硫酸(氢)盐的钠盐和钾盐。当使用缓冲液时，使用上述或本领域已知的其它弱酸和弱碱的组合，将马铃薯汁液调节到所需的pH。

通常，优选使用强酸和/或碱来调节pH，最优选使用盐酸和/或氢氧化钠。此外，特别是当寻求较低的氯化物含量时，用来调节pH的非常优选的酸是甲酸。

在本发明的步骤b)中，马铃薯汁液与官能化的支撑载体接触。支撑载体可以具有多种形式或形状，只要它允许与马铃薯汁液发生足够的接触以允许发生吸附。支撑载体可以采取任何形状，诸如球形、豆形、液滴形或椭圆形，并且其中包括珠子、颗粒或网格(grid)，但是本领域技术人员可以想到其它形状。支撑载体优选基本是球形的，并且是以颗粒的形式。优选的颗粒或珠子具有半径为50～150μm的珠子尺寸。该珠子尺寸在吸附能力(比较小的珠子尺寸高)和对方法参数(诸如压力和成本)的敏感性之间提供了良好的平衡。

支撑载体的重要方面在于，它是多孔材料。但是孔隙可能会被水凝胶填充或覆盖。具体地，支撑载体应包含孔隙，该孔隙的至少90％、优选95％、更优选98％且最优选至少99％具有10nm的孔径下限和200nm的孔径上限。因此，应理解在10nm至200nm之间的孔径指所有孔隙的至少90％、优选95％、更优选98％且最优选至少99％具有10nm至200nm之间的孔径。优选地，孔隙具有20nm的孔径下限和150nm、优选100nm的孔径上限，并且甚至更优选的，孔隙具有30nm的孔径下限和100nm、优选75nm的孔径上限。通过使用汞注入的孔隙度测定法来便利地确定孔径，使用汞注入的孔隙度测定法是技术人员公知的技术。

另外，在此方面的多孔材料是孔隙度(被定义为直径小于150nm的所有孔的总的孔隙体积)在0.5ml/g至1.5ml/g之间的材料。优选地，孔隙度是0.7～1.1ml/g。对于本发明，也通过汞注入来确定孔隙度。

对于本发明的范围，支撑载体的孔径和孔隙度非常重要。但是，支撑载体可以被安装在适当的核心上，以使支撑载体覆盖核心的大部分或整个核心。可选择的，支撑载体可以用基本被多孔材料涂层覆盖的核心材料来描述。由于多种原因，诸如为了降低所需的多孔材料的量或为了改变颗粒的密度或重量，可以使用这样的核心。核心可以为实现这些目标的任何材料，包括聚合物材料或金属性材料，以及无机材料(诸如金属氧化物)。优选的，使用碳化钨(WC)、铁或磁铁矿作为核心材料。核心与支撑载体的比率可以是任何值，只要整个颗粒满足足够的孔隙度的标准，并且保留有被如下所述的适当的配体官能化的可能性。根据本发明的官能化的支撑载体通过使适当的配体与支撑载体反应来获得，从而获得在本发明中使用的官能化的支撑载体。

用于足以进行吸附的接触的前体是使用孔径为10～200nm、优选10～150nm、更优选20～100nm且甚至更优选30～75nm的支撑载体。发现较小的孔径会阻碍吸附，而较大的孔隙产生较小的接触表面，以致特别是对HMW部分具有低吸附能力。只要满足了上述特征，制成支撑载体的材料就是次要的。因此，该材料可以是在方法条件下稳定的任何聚合物或生物材料，并且可以被制备成具有如上所述孔径的孔隙，同时经pKa 2.5～5的至少一种疏水的混合模式的配体官能化，该疏水的混合模式的配体通过S原子或O原子、优选硫醚基与载体相连。

配体的支撑载体可以是多孔的合成聚合物、多孔的多糖、多孔的无机材料，或它们的任意组合。优选的，支撑载体可以由多孔的聚合物来制成，多孔的聚合物诸如为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯或聚苯乙烯、多孔的多糖(如纤维素、葡聚糖或琼脂糖)和/或多孔的氧化硅、受控多孔玻璃或羟磷灰石。但是，最优选的，使用琼脂糖和/或PMMA作为支撑载体。

还可以使用如下的支撑载体，该支撑载体包括多孔的固体材料(诸如多孔的无机材料，诸如陶瓷)与多孔的水凝胶材料(其中例如为某些多孔的多糖，诸如琼脂糖)的组合。

对于实现马铃薯蛋白至官能化的支撑载体的充分吸附，要附接至支撑载体的配体非常重要。适当的配体是疏水的混合模式的配体。这意味着，它们的表现是基于静电相互作用和疏水相互作用的组合。配体的疏水性对于马铃薯蛋白的HMW部分的连接很重要。疏水配体在本领域中是已知的，它们可以是任何非水溶性的基团，即非极性基团。发现了如下所述的疏水基团允许本发明的实施。

发现了马铃薯糖蛋白更喜欢稍微疏水的环境，并且因此吸附至具有一定程度的疏水性的官能化的支撑载体。疏水配体在本领域中是已知的，并且可以包括芳香基或杂芳香基，以及其它的疏水分子组分。但是，当仅使用没有其它功能性的疏水配体时，观察到HMW部分的吸附，以及污染的有色物(其中有酚类)的吸附。这对马铃薯蛋白的HMW部分的分离有负面影响。因此，还期望有其它的功能性来防止污染。

还发现，在支撑载体上的配体的pKa在2.5至5之间、优选在4至5之间，对于马铃薯蛋白至官能化的支撑载体的恰当吸附是有利的。因此，优选在用于根据本发明的官能化的支撑载体的配体中存在羧酸基，但可选择的，可以使用pKa在此范围中的其它配体和间隔体。

当使用pK_a在2.5至5之间的疏水配体时，马铃薯蛋白的LMW部分能够吸附至官能化的支撑载体。该pK_a范围的优点在于使用弱酸溶液或缓冲液可以发生马铃薯蛋白部分的洗脱。高pH的洗脱引起经分离的马铃薯蛋白部分的着色，这优选是要避免的。另外，pH低于2.5的洗脱可能需要存在强酸和/或大量的盐，这会产生浪费的废物流，并且可能影响经分离的马铃薯蛋白分离物的质量。优选的，配体的pK_a在2.5至5之间，因为在这些条件下，在上述低pH和高pH下进行洗脱的缺点之间的平衡是最佳的，从而得到最佳的性能。

进一步发现，pKa在2.5至5之间的官能化的支撑载体的使用，诸如携带有酸基的载体，大大降低了污染物至官能化的支撑载体的吸附。

具有恰当的pKa范围和恰当的疏水性的组合时，发现HMW和LMW部分可以吸附至官能化的支撑载体，且不会发生污染物(诸如(聚合)酚类和其它有色物)的显著吸附。这与带正电荷(混合模式)的阴离子交换和疏水作用的树脂相比是显著的改进。

具体地，配体的pKa应优选在2.5～5之间，更优选在4～5之间。配体可以是脂肪族配体、经取代的脂肪族或芳香族配体(包括经取代的和/或杂芳香基)，或它们的组合。适当的芳香基例如是经取代的或未经取代的苯基、萘基、吡啶和嘧啶结构。

因此，可以用于官能化支撑载体的配体是具有2.5～5的pKa的疏水的混合模式的配体。该配体应通过S原子或O原子、优选硫醚基与载体相连。

优选的，这些配体选自经取代的吡啶、苯甲酸、水杨酸、烟酸或萘甲酸的组，其中一种取代是在可用环位置处经(CH₂)_n-XH基团取代，其中n＝0～4并且X＝O或S。优选的，这些配体选自经(CH₂)_n-SH取代的吡啶、苯甲酸、水杨酸和烟酸的组，其中n＝0～4。甚至更优选的，这些配体选自经巯基取代的苯甲酸、水杨酸和烟酸的组(巯基相当于硫醇基)。但是，最优选的配体是4-巯基苯甲酸和2-巯基烟酸(2-巯基吡啶-3-羧酸)，目前认为4-巯基苯甲酸是这两种最优选的配体中最好的。

配体应通过S原子或O原子与支撑载体相连，例如通过硫酯基、硫醚基、醚基或酯基与支撑载体相连。这意味着配体通过在骨架中含S原子或O原子的连接基团与载体相连。

优选的，使用含硫的连接基团，诸如硫醚连接基团或硫酯连接基团。优选的，硫醚基(通过硫桥(sulphide bridge)，-S-)使配体与支撑载体相连。这是很重要的，因为发现通过S原子或O原子的连接，但特别是通过使用硫醚基的S原子的连接，会产生对例如任何类型的马铃薯汁液所引起的降解的抗性。相比之下，连接基团中存在氮杂原子，例如胺基或氨基(“N-连接的”)，会产生在马铃薯汁液存在下的官能化的支撑载体的较快降解。在使配体和载体相连的基团中存在多个杂原子的情况中，优选杂原子的至少一半、更优选至少3/4是S原子和/或O原子，并且最优选氮原子不存在于骨架中。杂原子包括S、O、P和N原子。

通过含氧的基团(诸如酯或醚，且优选醚)连接的配体显示出对降解(或氧化、修饰、褪色等)的增强的抗性，但是尽管比胺或氨连接的配体慢，这样的配体仍然会降解。

但是，氧连接的配体，特别是醚，是不像硫连接的配体(优选硫醚)那么稳定的。硫连接的配体，尤其是其中配体是通过硫醚基与支撑载体相连的那些配体，显示出对由马铃薯汁液引起的降解具有特别高的抗性，因此在通过吸附方法从马铃薯汁液中分离马铃薯蛋白中使用是特别有利的。

同时，氧连接的配体具有比硫连接的配体(尤其是硫醚)低的HMW连接能力。这可能被解释为硫具有与碳大约相等的负电性，以致于在支撑载体和配体之间的连接键仅具有较小的极性，这对于使配体的疏水性最大化是很重要的。

因为这些原因，配体至支撑载体的硫连接或氧连接是优选的，并且配体至支撑载体的氮连接是不优选的。在硫连接和氧连接之间，硫连接是优选的。最优选的，配体至支撑载体的硫醚连接比氧连接更优选。

任选的，配体可以通过使用间隔体被附接至支撑载体。间隔体应适于通过O原子或S原子与聚合的支撑载体共价连接，并且通过O原子或S原子与配体共价连接。用于使配体与聚合的支撑载体相连的间隔体优选在骨架中不包括很多氮原子。在间隔体的骨架中存在更多杂原子的情况中，杂原子的至少一半、优选至少3/4是S原子或O原子。最优选的，用于使配体与聚合的支撑载体相连的间隔体在骨架中不包括氮原子。

间隔体基团优选对酸性和碱性环境是足够稳定的，并且对在通过添加亚硫酸盐获得的马铃薯汁液中的还原性条件是有耐受性的。这样的间隔体对通常包含在马铃薯汁液或加工流中的组分是高度稳定的。可用于连接本发明的配体的间隔体包括：含环氧化物和环硫乙烷的那些间隔体、卤代乙酰基和烷基卤化物衍生物、丙烯酰氧基衍生物和/或芳基化剂。优选的，不包括许多附加极性的间隔体用于连接，诸如环氧化物和环硫乙烷。技术人员能够想到将在配体和聚合的支撑载体之间产生O连接或S连接的更多的间隔体，其中这些连接中的至少一种受到硫醚基的影响，并且这样的间隔体不会被排除在本发明之外。

配体应以足够的量被附接至支撑载体，以实现高蛋白连接能力。这意味着，通常适当的配体以10～200meq/l，优选10～120meq/l，并且更优选30～80meq/l的量被附接至支撑载体。这可以通过用于确定交换能力的公知的方法来确定，下面将描述其中的一个实例。

在本发明的又一方面，官能化的支撑载体吸附马铃薯蛋白的连接能力应足够高，以允许对马铃薯蛋白进行工业规模的分离。因此，官能化的支撑载体的吸附能力应为来自PFJ的总蛋白至少为25g/l，优选至少30g/l。另外，官能化的支撑载体应能够从LMW去除的PFJ中吸附至少20g/l的HMW马铃薯蛋白，优选至少25g/l的HMW马铃薯蛋白。官能化的支撑载体的连接能力通过交换能力的确定来确定。

在本发明的步骤c)中，蛋白部分通过洗脱从官能化的支撑载体上解吸附。这优选通过使用具有固定pH的水性缓冲液来进行，该具有固定pH的水性缓冲液可以基于蛋白的等电点(IEP)来(任选地，选择性)洗脱蛋白部分。在本发明中使用的缓冲液可以包括任何弱酸或弱碱化合物，以及与强酸的组合。LMW马铃薯蛋白的酸性洗脱比碱性洗脱更优选，以避免使蛋白发生褐变和脱酰胺化。进一步的，通过高盐含量的缓冲液进行LMW马铃薯蛋白的洗脱是不优选的，因为会有浪费水或缓冲液再循环的问题。优选的，用于HMW部分的洗脱的缓冲液包括柠檬酸盐、乙酸盐、碳酸盐或磷酸盐缓冲液。用于LMW部分的洗脱的缓冲液可以包括甲酸、乙酸、乳酸、马来酸、丙二酸、苹果酸、柠檬酸和/或磷酸，或弱酸缓冲液与强酸(如盐酸或硫酸)的组合。但是，优选的，使用磷酸缓冲液，或甲酸和盐酸的混合物洗脱LMW部分和HMW部分以及它们的组合。

当在加工过程中需要调节马铃薯汁液的pH时，例如需要调节至较低pH或较高的pH时，使用酸或碱调节pH。这样的用于马铃薯汁液的pH调节的酸和碱可以有利地是弱酸，例如是柠檬酸、乳酸、甲酸、乙酸或磷酸，或强酸，如硝酸、盐酸和/或硫酸。另外，在马铃薯汁液加工的过程中可能需要调节到较高的pH。在这种情况中，优选的强碱例如是氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙。优选的弱碱例如是碳酸盐、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐和亚硫酸(氢)盐的钠盐和钾盐。当使用缓冲液时，使用上述或本领域已知的其它弱酸和弱碱的组合，将马铃薯汁液调节到所需的pH。

在本发明的步骤d)中，通过例如(超)过滤、离心、沉降、微孔过滤、沉淀和各种形式的色谱法(例如交换色谱法、凝胶过滤、亲和色谱法、疏水作用色谱法和反相色谱法)，如上所述的经洗脱的蛋白部分可以在下游进行进一步的纯化。进一步的，可以使用不同的配体实施吸附色谱法，以进一步纯化获得的蛋白部分。

优选的，通过超过滤来浓缩天然的马铃薯蛋白部分。超过滤膜材料的选择可以强有力地影响选择性。优选的，超过滤膜包括纤维素、聚醚砜(PES)和聚砜(PS)。可以使用基于PES或PS的膜，浓缩蛋白酶抑制剂分离物，其中PES基或PS基的膜的分子截留为2～20kDa并且在一定程度上为30kDa。可以使用基于PES或PS的膜或基于再生的纤维素的膜，浓缩马铃薯糖蛋白分离物，其中基于PES或PS的膜的分子截留为5～30kDa，基于再生的纤维素的膜的分子截留为5～30kDa。这些膜可以作为管状、螺旋缠绕、中空的纤维、盘和框架，或作为交叉转动感应的剪切过滤装置(cross-rotational induced shear filter unit)来实施。

在pH值为4.0～8.0，优选pH为6.0～7.5时，超过滤马铃薯糖蛋白分离物。对于蛋白酶抑制剂分离物，使用的pH值为3～7，优选3.2～4.5。在去除杂质后，可以使pH升高至pH 7～10，以能够得到通过膜的高流量。优选在低pH 3.0～5.0下对蛋白酶抑制剂进行加工。

除了纯化步骤之外，通过使用二氧化碳的蒸发、冷冻浓缩或等电点沉淀可以使通过本发明的方法获得的天然的马铃薯蛋白分离物浓缩至含高达超过20％的干物质。基于氮的水平(凯氏氮含量倍数(Kjeldahl nitrogen content times)6.25)，这些浓缩物的干物质可以含有超过85％的蛋白，优选超过90％的蛋白。经干燥的产物可以含有超过90％，优选超过92％的蛋白，同时水分水平为4～9％。

在又一方面，本发明涉及通过本发明的方法可获得的天然马铃薯蛋白部分。该天然的马铃薯蛋白部分可以是总的天然马铃薯蛋白部分，天然马铃薯蛋白的马铃薯糖蛋白部分，或天然马铃薯蛋白的蛋白酶抑制剂部分，或它们的任意组合或亚部分。这些马铃薯蛋白部分的特征是它们的高纯度和高稳定性。本发明的总天然马铃薯蛋白部分可以具有4.5以上的等电点，超过4kDa的分子量。马铃薯蛋白部分优选基本没有马铃薯来源的有机酸和氨基酸。

本发明的天然马铃薯蛋白的马铃薯糖蛋白部分可以具有5.8以下、优选4.8～5.5的等电点，超过30kDa、优选超过35kDa的分子量。

本发明的天然马铃薯蛋白的蛋白酶抑制剂部分可以具有5.5以上、优选5.8以上的等电点，35kDa以下、优选4～30kDa的分子量。

可以通过喷雾干燥、急骤干燥(flash drying)或冷冻干燥来获得干燥的天然马铃薯蛋白。马铃薯糖蛋白部分、蛋白酶抑制剂部分和总马铃薯蛋白部分被设定为适当的pH，以确保有良好的水溶性。浓缩物的pH被设定为7.0～9.0，优选为7.0～8.0。可以使用低pH值(3.0～4.0)以及高pH值(7.0～9.0)，来喷雾干燥蛋白酶抑制剂的浓缩物。由此获得的天然马铃薯蛋白在7.0的pH及25℃的温度下，具有超过90％，优选超过95％的水溶性。水溶性被表示为在对溶液进行离心之后，蛋白在上清液中的百分比。

在优选的实施方式中，在超过滤浓缩之后获得的天然马铃薯蛋白分离物具有干物质含量超过75％的蛋白含量。在此，蛋白含量被限定为凯氏氮含量倍数6.25。优选的，天然马铃薯蛋白分离物中的蛋白含量超过80％，更优选超过90％，并且甚至更优选超过95％。

可以通过二维凝胶电泳分析，与使用MALDI-TOF质谱分析对分离物中的关键蛋白的鉴定相组合，来描述本发明的天然马铃薯蛋白分离物的特征。可以在使用pH梯度为3至8，并且分子量为5～100kDa的二维凝胶电泳中，分离蛋白。

为了使用本发明，通过例如将官能化的支撑载体安装在柱子、胶管或管状物中固定该官能化的支撑载体，同时马铃薯汁液流过或通过该官能化的支撑载体。在这样的实施方式中，吸附最可能通过连续或半连续的方法来实现，例如填充床色谱法、扩展床色谱法、膜吸附器或磁性稳定的床色谱法。另外，官能化的支撑载体可以以网格形式被安装在这种管状物中，马铃薯汁液流通过网格与官能化的支撑载体接触。其它方式是本领域技术人员容易想到的，也并不被排除在外。

在本发明的另一方面中，通过将马铃薯汁液和支撑载体组合在单个容器中，使官能化的支撑载体与马铃薯汁液接触，在这种情况中，可以搅拌、摇动或其它物理地混合这样的混合物，以增加支撑载体和马铃薯汁液之间的接触。在这样的实施方式中，马铃薯蛋白的吸附最可能是分批过程，这在使用高粘性的蛋白溶液时是有利的。

但是，能够实施使马铃薯汁液与官能化的支撑载体接触的任何方式，前提是接触足够强以使马铃薯蛋白能够吸附至官能化的支撑载体，该支撑载体具有如上所述的孔隙度并且允许附接至少一种pKa 2.5～5的疏水的混合模式的配体，该疏水的混合模式的配体通过S原子或O原子、优选硫醚基与载体相连。

现在，将通过以下的非限制性实例来例示本发明。

方法

支撑载体的官能化

原理

在等于或高于8.5的pH(依赖于连接基团)，发生配体对经环氧化物活化的Sepabead EP(或HFA)支撑载体(获自Resindion,Binasco(比纳斯科),Italy(意大利))的官能化。将用于支撑载体的官能化的配体溶液如下设定至固定的pH：巯基官能化的配体溶液的pH被设定为8.5，氨基官能化的配体溶液的pH被设定为9.5，并且羟基官能化的配体溶液的pH被设定为等于或高于11。如果配体在期望的pH下不溶解，则升高pH，直至配体完全溶解。

方法

通过添加5M氢氧化钾，直至达到期望的pH，使配体(1M,Sigma Aldrich(西格玛奥瑞奇),Zwijndrecht(兹韦恩德雷赫特),Netherlands(荷兰))溶解在250mL除矿物质的水中。使用100mM硼酸盐，对巯基或氨基取代的配体溶液进行缓冲处理。在pH为11时，实施羟基官能化配体的连接反应，不需要添加缓冲液。在配体的溶解过程中，调节pH并且添加除矿物质的水，直至在期望的pH且体积为300mL时，配体完全溶解。允许在添加支撑载体之前，使配体溶液达到室温。

在玻璃滤器中，使用除矿物质的水清洗经环氧化物活化的Sepabead EP支撑载体(100mL,Resindion,比纳斯科,意大利)，直至电导率低于10μS/cm，并且通过在真空条件下运行支撑载体来去除过量的水。然后，将支撑载体转移到具有配体溶液的500mL的烧瓶中，使用磨口塞封闭烧瓶并且在175rpm下孵育过夜。在1小时后及第二天清晨检验pH。

在使用100mM氢氧化钠冲洗过量的配体后，通过使官能化的支撑载体在50℃的1M氢氧化钠中孵育2小时，使剩余的环氧基水解。将官能化的支撑载体储存在4℃的50mM的氢氧化钠中。

在实例2中使用的PMMA和琼脂糖支撑载体经环氧活化，并且因此能够根据上面的Sepabead EP和HFA中所述的相同的原理和方法，使用4MBA对它们进行官能化。

根据开发商的说明书(Sartorius Stedim Biotech(赛多利斯生物技术公司),Goettingen(哥廷根),Germany(德国))，对Sartobind的经环氧活化的膜装置进行官能化。

pK_a的计算

使用ChemAxon的MarvinSketch(2011)5.4.1.1软件计算经标记的配体的pKa，其中pKa选项列在表1中。通过使用官能化的支撑载体的环氧基计算pKa，考虑到由标记(可能影响阴离子基团的pKa)导致的电子分布的可能改变。

表1：MarvinSketch中计算pK_a的选定的pK_a选项

模式	常量(macro)
		酸/碱前缀	静态的
最小碱性pK_a	-10
		最大酸性pK_a	20
温度(K)	298
		考虑互变	否

总交换能力

总交换能力的原理是使用过量的碱(中和液体)中和质子化了的阴离子基团。使用碱的返滴定，同时盐酸作为滴定剂，确定官能化的支撑载体的交换能力。

官能化的支撑载体的调节(阴离子基团的质子化作用)

将官能化的支撑载体装入直径1cm且床高度为16cm的柱子中；这样的尺寸对应于12mL的床体积。如果需要使官能化的支撑载体完全清洁，则使用50mL的1M氢氧化钠，然后使用150mL的100mM氢氧化钠以10mL/min的速度清洁官能化的支撑载体。使用200ml水，以10mL/min的速度清洗官能化的支撑载体。

使用200mL的100mM盐酸，使官能化的支撑载体上的配体质子化。使用200mL的水以10mL/min的速度清洗过量的酸，或直至电导率＜10μS/cm。

阴离子基团的中和

通过拉出50mL的真空注射器来去除空隙体积(void volume)，并将具有30mM氢氧化钠的200mL中和溶液的官能化的支撑载体定量转移到300mL烧瓶中。将磨口塞置于烧瓶上，并且在175rpm摇动至少1h。

滴定

可以通过30mM氢氧化钠的中和溶液的浓缩，以及在中和(返滴定)之后的浓缩，确定配体/官能化的支撑载体的氢氧化钠的消耗。因此，使用100mMHCl的滴定液，滴定25mL中和溶液和25mL经部分中和的中和溶液。典型的酸碱滴定的等当量点是S形滴定曲线的拐点。

校正系统误差和通过甲基丙烯酸盐的氧化形成羧基

在拉出经50mL注射器干燥的Sepabead官能化的支撑载体之后留下的体积估计在68％之上，为12mL建议体积中的7mL(注射器去除了3.5mL)。剩余的体积将中和液体从30mM稀释到29mM，这等于15meq/L的系统误差。为了校正系统误差并且通过异丁烯酸盐的氧化来形成羧基，在标记经水解的Sepabead官能化的支撑载体(blanco(布兰克))的过程中，以与经标记的Sepabead支撑载体相同的方式滴定支撑载体。

计算

·TEC_corr.样品＝TEC_样品-TEC_{未经标记的支撑载体}

·其中：

TEC＝总交换能力(meq/L)

TEC_样品＝在未经过系统误差校正时的总交换能力(meq/L)

TEC_corr.样品＝经系统误差校正的总交换能力(meq/L)

TEC_{未经标记的支撑载体}＝总交换能力空白/系统误差(meq/L)

V_titr 样品＝滴定体积样品(或空白)(mL)

V_titr.中和＝滴定体积中和溶液(mL)

c_HCl＝浓度HCl(mmol/mL)

V_flask＝体积向烧瓶中添加的NaOH(250mL)

V_sample＝体积样品(25mL≈25.0g)

孔径和孔隙体积的确定

根据本领域公知的标准步骤，使用以Micromeretics ASAP2400孔隙度测定系统为基础的汞注入孔隙度测定法，已经确定了所使用的Sepabead支撑载体的孔径和孔隙体积。

蛋白吸附实验

根据以下使实验尽可能一致的步骤，进行吸附实验。LMW表示主要由蛋白酶抑制剂组成的马铃薯蛋白的低分子量部分，而HMW表示主要由马铃薯糖蛋白组成的马铃薯蛋白的高分子量部分。

冷冻马铃薯果实汁液(PFJ)和LMW去除的PFJ(Avebe(艾维贝),Gasselternijveen,The Netherlands(荷兰))的代表性批次，从而能够确定对于选择性洗脱和选择性吸附过程的每一种配体的能力和亲和性的准确对比，而不会引入基于蛋白浓度中的自然变化产生的不确定性。在实验前，使被冷冻的PFJ(或LMW去除的PFJ)在4℃解冻，如果需要，再在28℃的水浴中进一步解冻。使PFJ(或LMW去除的PFJ)处于期望的pH，并且以4600g离心5分钟以去除剩余的固体。

将官能化的支撑载体装填在内表面1.767cm²并且床高34cm(对应于60cm³的床体积)的柱子中。将流速设置为10cm/min。使用具有5.2或6.0的期望的吸附pH的平衡/清洗缓冲液30mM柠檬酸钠，平衡支撑载体，直至柱子达到期望的pH。装载6个床体积(BV)的pH 5.2的PFJ用于总蛋白的吸附。装载9BV用于从PFJ(pH 6.0)中选择性吸附LMW马铃薯蛋白或从LMW去除的PFJ(pH 5.2)中选择性吸附HMW马铃薯蛋白。

使用大约2.5BV的30mM柠檬酸钠的平衡/清洗缓冲液，清洗柱子，以去除未被吸附的组分。

使用期望的洗脱剂洗脱被吸附的蛋白，然后使用氢氧化钠使所有剩余的蛋白完全解吸附。

在pH5.2处的总蛋白的连接：

·使用30mM柠檬酸钠(pH5.2)平衡柱子，直至实现pH5.2。

·装载6BV的PFJ，并且收集进料。

·使用大约2.5BV的平衡缓冲液pH5.2的30mM柠檬酸钠进行清洗，以去除未被吸附的组分，并且收集清洗物以构建质量平衡。

通过碱性洗脱进行的蛋白分离：

氢氧化钠洗脱：

○使用50mM氢氧化钠进行洗脱，并且当OD280斜率＞60mAU/min时，开始收集洗脱液。

○持续至pH＞9.5，OD280＜150mAU，斜率OD280＞-50mAU/min时终止收集。继续0.25BV。

·使用1.5BV的1M氢氧化钠清洁柱子。

·为了储存，将柱子中的1M氢氧化钠替换为0.5BV的50mM氢氧化钠。

在pH5.2通过选择性吸附进行HMW的分离：

·使用30mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.2)平衡，直至实现pH 5.2。

·装载9BV的LMW去除的PFJ，并且收集进料。

·使用大约2.5BV的平衡缓冲液pH 5.2的30mM柠檬酸钠进行清洗，以去除未被吸附的组分，并且收集清洗物以构建质量平衡。

·碳酸钠洗脱：

○使用pH 8.0的100mM碳酸钠进行洗脱，并且当OD280斜率＞60mAU/min时再进行收集。

○持续至pH＞6.0，OD280＜150mAU，斜率OD280＞-50mAU/min时终止收集。继续流动0.25BV。

·使用1.5BV的1M氢氧化钠清洁柱子。

·为了储存，将1M氢氧化钠替换为0.5BV的50mM氢氧化钠。

在pH6.0通过选择性吸附进行LMW的分离：

·使用30mM柠檬酸钠(pH6.0)平衡，直至实现pH 6.0。

·装载9BV的PFJ，并且收集进料。

·使用大约2.5BV的平衡缓冲液pH 6.0的30mM柠檬酸钠进行清洗，以去除未被吸附的组分，并且收集清洗物以构建质量平衡。

·磷酸洗脱：

○使用50mM磷酸进行洗脱，并且当OD280斜率＞60mAU时再进行收集。

○持续至pH＜3.5，OD280＜150mAU，斜率OD280＞-50mAU/min时终止收集。继续流动0.25BV。

·氢氧化钠洗脱：

○使用50mM氢氧化钠进行洗脱，并且当OD280斜率＞60时，开始收集。

○持续至pH＞9.5，OD280＜150，斜率OD280＞-50mAU/min时终止收集，并且继续0.25BV。

·使用1.5BV的1M氢氧化钠清洁柱子。

·为了储存，将1M氢氧化钠替换为0.5BV的50mM氢氧化钠。

使用通常用于植物蛋白的Sprint(斯普林特)快速蛋白分析仪(CEM公司)确定蛋白含量，Sprint(斯普林特)快速蛋白分析仪(CEM公司)使用Kjeldahl法进行校准，转换因数为6.25。官能化的支撑载体的洗脱能力以g蛋白/L来表示。通过验证所有流体(其中有进料流、收集流和清洗流)中的蛋白浓度，经蛋白质量平衡来验证实验。回收率在95％至102％之间(未示出)。

在6个床体积内，通过在pH 5.2进行从PFJ的蛋白吸附，然后进行LMW和HMW蛋白部分的碱性洗脱，评估总蛋白吸附。

在9个床体积内，通过在pH 5.2进行从LMW去除的PFJ的蛋白吸附，然后使用pH 8.0的100mM碳酸盐进行温和洗脱以防止天然蛋白的改变，评估HMW的选择性吸附。

根据Experion Pro260分析试剂盒(Bio-rad Laboratories(伯乐生命医学产品有限公司))分析＞35kD的蛋白的比率，从而确定在获得的洗出液(总蛋白和被选择性吸附的HMW)中存在的HMW蛋白的百分比。

使用一系列具有不同pK_a的配体，评估pK_a对酸性洗脱的影响。在pH 6.0时，从9BV的PFJ中吸附LMW，并且通过50mM磷酸的洗脱获得该LMW，然后使用50mM氢氧化钠完全洗脱未被吸附的蛋白。

官能化的支撑载体在不稳定的PFJ中的稳定性(加速污染)

不稳定的PFJ

在Braun(布劳恩)的汁液离心机中将新鲜的块茎中榨汁/粗锉。通过在具有595纸滤器的布氏漏斗上过滤汁液，去除不溶的纤维。如果未将pH调节至6，PFJ的pH应是pH 6.0±0.5

官能化的支撑载体的调节

通常，将官能化的支撑载体储存在50mM NaOH中，因此足以使用去离子水冲洗官能化的支撑载体，直至电导率低于50μS/cm。(平衡是不必要的，因为PFJ的内在缓冲能力将防止pH的升高。)

·使用官能化的支撑载体(20cm≈16mL)装满柱子(1,0x 20cm)。

·使用最少100mL去离子水冲洗，并且继续，直至电导率低于50μS/cm。

·使用50mL注射器干燥官能化的支撑载体。

第二次清洁、储存或调节官能化的支撑载体

·通过在玻璃滤器孔隙3上筛除PFJ，从官能化的支撑载体上去除PFJ，并且使用去离子水冲洗官能化的支撑载体。

·将漏斗放置在柱子中，并且将官能化的支撑载体从玻璃滤器转移至柱子。

·使用250mL的50mM NaOH以10mL/min洗脱蛋白并且着色。

·官能化的支撑载体可以被储存在4℃的50mM NaOH中，或经250mL去离子水冲洗以用于与PFJ进行下一次孵育。如果官能化的支撑载体将用于下一次孵育，则使用50mL注射器干燥官能化的支撑载体。

使用不稳定的PJF的孵育

·使用PFJ填充刻度量筒至150mL。

·用来自上述150mL的PFJ汁液填充50mL注射器，并且使用注射器将官能化的支撑载体从kontes柱子按压出来，进入300mL的烧瓶。

·在1.5小时之后及第二天清晨测量pH。

·在一夜孵育之后，如上所述清洁官能化的支撑载体，并且重复孵育至少两次。

被洗脱的蛋白的颜色矩阵

被洗脱的蛋白的颜色矩阵被表示为颜色/蛋白的比率，其中，经分光光度计在310nm测量的颜色吸附除以经斯普林特快速蛋白分析仪(λ310nm/P(％))测量的蛋白浓度。斯普林特快速蛋白分析仪是蛋白浓度分析领域中公知且标准化的技术，并且310nm的颜色矩阵的确定来自于在280nm至310nm之间的快速蛋白测定，其中，使用波长310nm进行着色矩阵的校正。

步骤

·使用pH10.0的100mM硼酸盐稀释洗脱液样品，直至消光在0.1至0.8之间，并且以相同方式洗脱由水组成的空白。

·使空白自动归零，并且在310nm测量样品。

计算

·

λ 310 / P (%) = \frac{E_{310} \cdot f}{P (%)}

·其中：λ310/P(％)＝颜色/蛋白的比率(％^-1)

E₃₁₀＝在波长310nm处的消光

f＝pH 10.0的100mM硼酸盐中的稀释系数。

P(％)＝通过斯普林特测量的蛋白浓度(％)

实例1：配体选择

结果

通过使用11种混合模式的配体的实验例示本发明，这11种混合模式的配体已以不同酸度进行选择，并且被附接在孔径为30～150nm的支撑载体上。在这些配体中，有10种弱酸性的混合模式的配体和1种强酸性的混合模式的配体。进一步地，按与如上相同的方式经4-巯基苯甲酸官能化的流线型直接CST1(配体和间隔体组合物与GE-healthcare(GE医疗)Capto MMC相同)和SepabeadsHFA(exe065)(都含有含氮的间隔体)已经被包括在这些实验中，同样，也包括疏水作用的支撑载体Amberlite XAD7HP。已经测试了这些配体具有如下能力：

·在pH 5.2，从马铃薯汁液中吸附至少25g/L、优选＞30g/L的总蛋白(表2)

·在pH 5.2，从LMW去除的马铃薯汁液中吸附至少20g/L、优选＞25g/L的HMW马铃薯蛋白(表3)

·通过酸性洗脱，使LMW马铃薯蛋白解吸附，然后通过碱性洗脱，洗脱未被吸附的蛋白(表4)

·通过没有添加亚硫酸盐的马铃薯汁液阻止加速老化测试中的(酶的)氧化。(图2和图3，表5和表6)

表2：孔隙在30～150nm之间的支撑载体的总蛋白吸附能力(g/L)，其中支撑载体为经11种不同的酸性混合模式的配体官能化的支撑载体，弱阳离子交换树脂(羧基丙烯酸树脂)和两种疏水树脂(苯基琼脂糖和XAD7HP)。在最后两栏中给出了总蛋白池中HMW马铃薯蛋白的百分比和每一种配体的(经计算的)酸度。

由此得出结论，混合模式的阴离子配体对马铃薯蛋白的吸附能力大体在30g/L至40g/L之间，同时羧基丙烯酸树脂具有11g/L，并且疏水作用的树脂(XAD7HP&苯基琼脂糖)具有8～9g/L的低能力。因此，阴离子配体的吸附能力高很多。

表3：在pH 5.2，对11种酸性混合模式的配体、一种通过含氮间隔体连接的混合模式的配体(CST1)、弱阳离子交换树脂(羧基丙烯酸树脂)和两种疏水树脂(苯基琼脂糖和XAD7HP)，从LMW去除的马铃薯汁液中吸附HMW马铃薯蛋白的能力(g/L)。在最后一栏中给出了获得的HMW马铃薯蛋白中对应的HMW含量(％HMW，表示为％蛋白＞35kDa)。

由此得出结论，观察到硫醚连接的配体具有从LMW去除的马铃薯汁液中吸附马铃薯蛋白的HMW部分的最高吸附能力。

表4：一种强酸(编号3)和两种弱酸的混合模式的配体(编号6和9)的LMW马铃薯蛋白的吸附能力(g/L)。在最后一栏示出了通过酸性洗脱和后续的碱性洗脱解吸附的LMW蛋白的百分比。

LMW马铃薯蛋白的酸性洗脱比碱性洗脱更优选，以避免使蛋白发生褐变和脱酰胺化。进一步的，通过高盐含量的缓冲液进行LMW马铃薯蛋白的洗脱是不优选的，因为会有浪费水或缓冲液再循环的问题。强酸性配体(诸如本实验中的编号3)显示出使用弱酸性缓冲液的效率低的洗脱。弱酸性缓冲液是优选的，以避免蛋白变性。为了允许进行使用弱酸性缓冲液的酸性洗脱，弱酸性配体(诸如编号6和9)表现最好。因此，优选使用pK_a在2.5～5之间的弱酸性配体。

表5：在使用还未经亚硫酸盐稳定的马铃薯汁液孵育之后的总交换能力的提高。

表4中的数据以及图1示出，氮连接的混合模式的配体易受到被马铃薯汁液氧化的影响。常常通过添加亚硫酸盐使马铃薯汁液稳定。但是，由亚硫酸盐抑制氧化性褐变一般是不彻底的，并且迟早会出现配体的逐渐劣化。与氨基连接的配体相比，氧连接的配体并且特别是硫醚连接的配体对于由例如氧化导致的降解要稳定很多。

由表4可知，氨基连接的配体在加速污染实验中的交换能力具有86％的平均提高，羟基连接的配体具有49％的平均提高，并且硫醚连接的配体具有5％的平均提高。含氮的间隔体还显示出加速污染(入场权14和15)。因此，含氮基团不太适用于从马铃薯汁液中分离马铃薯蛋白。氧连接的基团对污染具有较高的抗性，并且硫醚连接的基团对污染具有最高的抗性。

表6：同一系列的配体/支撑载体组合的颜色/蛋白(λ310/P(％))的比率。这是通过310nm的颜色吸附除以经斯普林特测量的蛋白浓度确定的。

由此得出结论，对于总蛋白吸附和HMW吸附，具有最低颜色/蛋白比率的酸性配体是4-巯基苯甲酸，并且2-巯基吡啶-3-羧酸是倒数第二低。因此，硫醚连接的酸性配体显示出对颜色或酚复合物具有低亲和性，颜色或酚复合物长远来看会导致污染并且产生着色较少的蛋白洗出液。

实例2：载体的选择

表7：已经对三种具有相同的4-巯基苯甲酸配体但是具有不同孔隙度的官能化的支撑载体系统测试了它们吸附HMW和LMW马铃薯蛋白的能力。使用与如上所述相同的步骤确定吸附能力。

载体，配体	孔径	LMW能力g/L	HMW能力g/L
				5％琼脂糖，4-MBA	50-90nm	59	32
PMMA-4-MBA	30-60nm	37	33
				膜，4-MBA	1-5μm	31	≤10

由此得出结论，HMW吸附能力满足孔径大于30nm的标准，并且在至少高达90nm的孔径时都维持此HMW吸附能力。另外，由材料的差异得出，孔径是导致该差异的主要参数。因此，在10nm至200nm之间的孔径与适当的配体组合将显示出有利的吸附特性是合理的。因此，包括适当的配体的官能化的支撑载体的孔径应在10nm至200nm之间，优选为10nm～150nm，更优选为20nm～100nm，并且甚至更优选为30nm～75nm。

Claims

1.一种用于从马铃薯汁液分离天然的马铃薯蛋白部分的方法，包括以下步骤：

a)将所述马铃薯汁液的pH调节至4.0～6.5；

b)使所述马铃薯汁液与具有孔隙的官能化的支撑载体接触，其中，至少90％的所述孔隙具有10nm至200nm之间的孔径，并且其中，所述支撑载体经pKa为2.5～5的疏水的混合模式的配体官能化，该配体通过S原子或O原子与所述支撑载体相连；

c)通过洗脱，使所述马铃薯蛋白部分从官能化的所述支撑载体解吸附；以及

d)任选地浓缩和/或干燥所述马铃薯蛋白部分。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，洗脱在5.7至8.9之间的pH下进行。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述马铃薯蛋白部分是马铃薯糖蛋白部分。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，洗脱在9以上或3以下的pH下进行。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述马铃薯蛋白部分是蛋白酶抑制剂部分。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使用水性缓冲液进行洗脱。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述混合模式的配体选自经取代的苯甲酸、水杨酸、烟酸和萘甲酸的组，其中取代是在可用的环位置处经(CH₂)_n-XH基团的取代，(CH₂)_n-XH中，n＝0～4并且X＝S。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述支撑载体是多孔的合成聚合物、多孔的多糖、多孔的无机材料，或它们的任意组合。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述疏水的混合模式的配体通过间隔体被附接至所述支撑载体，所述间隔体通过O原子或S原子与所述支撑载体连接，并且所述间隔体不包括含氮的官能团。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使用酸和/或碱调节所述马铃薯汁液的pH。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述马铃薯汁液已经经过了预处理，所述预处理包括将污染物吸附至分层的硅酸盐和/或活性炭，和/或絮凝。

12.一种通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的天然的马铃薯蛋白部分。