CN104530274B

CN104530274B - 一种利用超高交联树脂吸附分离古龙酸的方法

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Publication number: CN104530274B
Application number: CN201510001811.8A
Authority: CN
Inventors: 应汉杰; 柯旭; 吴菁岚; 周精卫; 庄伟�; 陈勇; 朱晨杰
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2015-01-04
Filing date: 2015-01-04
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2035-01-04
Also published as: CN104530274A

Abstract

本发明公开了一种利用超高交联树脂吸附分离古龙酸的方法，将经过预处理的古龙酸发酵液通过装有超高交联树脂的吸附柱，经吸附、洗杂和解吸的过程得到古龙酸溶液；其中，所述的超高交联树脂是以聚苯乙烯‑二乙烯基苯为骨架，通过Friedel‑Crafts交联反应制备得到，该超高交联树脂弱极性，亲水性好；平均粒径为0.42‑0.56mm，含水量为43wt％，孔径为1.92nm，孔隙率30‑40％，湿密度1.09g/cm³，平均比表面积1645.5m²/g，平均孔容0.732cm³/g，功能基团为羰基。本发明方法所选用的吸附介质具有对古龙酸吸附容量大、吸附选择性好、解吸条件温和、再生容易、使用周期长等优点。

Description

一种利用超高交联树脂吸附分离古龙酸的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及利用超高交联树脂从原料液中提取古龙酸的方法。

背景技术

古龙酸(又名：2-酮基-L-古龙酸)，英文名α-keto-L-gulnoic-acid(缩写为KGA或2-KLG)，在医药工业和食品工业上市场需求庞大。古龙酸是维生素C的重要前体。维生素C是一种人体代谢所必需的维生素，Vc在人体内的生理作用主要包括：1)参与体内氧化还原反应；2)对抗自由基损伤；3)改善机体免疫功能；4)参与胶原蛋白和细胞间质的合成；5)参与神经递质的合成；6)参与氨基酸代谢与铁代谢；7)抑制血小板及白细胞活化等等。因此，Vc在坏血病、心血管缺陷、糖尿病、神抑郁症、危重型克山病等疾病的临床治疗中均具有重要的用途。此外，Vc还可以用作食品添加剂、饲料添加剂、农作物催熟剂、化妆品防锈剂等等。

近年来由于环保要求以及未来社会绿色化工的需要，生物合成法已成为主要的研究方向，其中微生物二步发酵法制备古龙酸已实现工业化生产。通过利用生物体内的代谢途径来替代化学合成法中的氧化过程，精简了生产流程，减少了对丙酮、氯气、苯等有害物质的使用，降低了生产成本和环保费用。在发酵液中古龙酸的含量约为7％，且菌丝体、蛋白质和悬浮微粒等杂质较多，色泽偏深，直接导致提取工艺的复杂性，致使下游处理费用占成本比例较大，不利于提高经济竞争力。故如何从发酵液中分离得到高纯度和浓度的古龙酸对降低总生产成本至关重要。

目前在生产工业上古龙酸的提取方法主要有：加热沉淀法(AndersonS，MakrsC，LazaricsR，etal.Production of 2-keto-L-gulonate，an intermediateinL-ascobratesynthesis by a genetically modified Ewrinia Hebricola Science)，耗能多，且会造成有效成分的降解损失。化学凝絮法的上层清液中仍存在一定量的可溶性蛋白，加入的化学物质会使蛋白逐步析出，致使产品收率和质量受到污染。

超滤法(王清格，Vc生产新工艺的讨论)要求发酵液必须经过预处理后进行超滤，否则会造成严重的膜堵塞情况，膜通量在该过程中会急剧下降，同时预处理的时间长，费用大，并会造成产品的损失。溶媒萃取法，采用0.5mol/L DOA-20％正庚醇-醋酸混合溶剂通过三级逆流萃取和一级反萃取从发酵液中提取，收率可达90％以上。但反萃取液中会使用大量HCl。

专利(CN1733747)公开了一种合成专用的螯合树脂，利用模拟移动床技术，在20℃～75℃的操作温度下，以水为洗脱剂，使维生素C与古龙酸完全分离，得到富含古龙酸的组分。并采用常规的浓缩结晶分离方法，得到古龙酸产品。

目前，工业上一般采用离子交换法分离古龙酸，该工艺成熟，但是单元操作多且离子交换树脂的再生需要消耗大量的酸、碱等试剂，污染严重。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种从发酵液中提取古龙酸的方法，以解决古龙酸工业中下游分离难题，并减少古龙酸分离过程的能耗比。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种利用超高交联树脂吸附分离古龙酸的方法，将经过预处理的古龙酸发酵液通过装有超高交联树脂的吸附柱，经吸附、洗杂和解吸的过程得到古龙酸溶液。

其中，所述的超高交联树脂是以聚苯乙烯-二乙烯基苯为骨架，通过Friedel-Crafts交联反应制备得到，该超高交联树脂弱极性，亲水性好；平均粒径为0.42-0.56mm，含水量为43wt％，孔径为1.92nm，孔隙率30-40％，湿密度1.09g/cm³，平均比表面积1645.5m²/g，平均孔容0.732cm³/g，功能基团为羰基。该树脂命名为HD-01。该树脂对共存的杂质基本不吸附。

其中，所述的超高交联树脂是按照如下方法制备得到：

将氯甲基化聚苯乙烯树脂在硝基苯或二氯乙烷中充分溶胀，加入傅氏催化剂和交联剂二乙烯基苯，并将温度上升至80～120℃，进行Friedel-Crafts反应，制得含羰基功能基团的具有弱极性的超高交联树脂，用乙醇洗涤，抽滤后，利用稀盐酸水溶液浸泡固化，乙醇中保存备用。

其中，所述的氯甲基化聚苯乙烯树脂，简称氯球，比表面积为200～400m²/g，含氯量1-10wt％(最佳控制在2％以下)，孔容1.2-1.4cm³/g，孔径1.46-2.69nm，平均粒径为0.64mm。上述氯甲基化聚苯乙烯树脂可以从市场上购买，或者请树脂加工厂商制备得到。

其中，所述的傅氏催化剂为AlCl₃；傅氏催化剂的用量为氯甲基化聚苯乙烯树脂重量的2.5～6％；硝基苯或二氯乙烷的用量为氯甲基化聚苯乙烯树脂重量的5～10倍；交联剂二乙烯基苯用量为氯甲基化聚苯乙烯树脂重量的15～30％。

其中，加入傅氏催化剂和交联剂二乙烯基苯后，保持在室温反应1～2h，再以1℃/min～1℃/10min速率升温至80～120℃。

其中，待温度上升至80～120℃后，进行Friedel-Crafts反应8～10h，反应后，在体系中加入乙醇停止反应并逐渐冷却至室温，乙醇的加入体积为待加入的反应体系的20～30％；所述的稀盐酸水溶液中，溶质HCl的浓度为0.1～0.5mol/L。

其中，所述的发酵液是利用芽孢杆菌属或假单胞菌属发酵制备得到的古龙酸发酵液；所述的预处理包括过滤和超滤。所述的超滤优选用4000～10000Dalton的超滤膜进行超滤，去除菌体和杂蛋白。

其中，所述的吸附，条件为：待吸附的料液浓度为含有20～50g/L的古龙酸，待吸附料液的pH为原始pH，吸附温度为室温，吸附流速1～4BV/h，采用固定床吸附，树脂柱高径比为9～14。

其中，所述的洗杂，条件为：去离子水洗杂。

其中，所述的解吸，条件为：解吸剂为0.1～1mol/L NaOH水溶液，解吸流速为0.5～2.0BV/h。

其中，经过吸附、洗杂和解吸的过程的吸附柱可通过再生操作，然后重新进行吸附、洗杂和解吸；再生条件为：以去离子水为再生剂，再生剂流速为1～3BV/h。

本发明通过分析吸附质古龙酸分子的结构与理化性质、料液的组成和吸附剂的骨架结构、孔径、比表面积和极性等各方面的因素，筛选出一种性能优良的超高交联树脂，该树脂对料液中的古龙酸具有较高的吸附容量和吸附选择性，且较易解吸，古龙酸的收率可达95％以上，并可将古龙酸提浓2～4倍。解吸后的树脂用水即可再生。

有益效果：与现有技术相比，本发明提供了一种分离提取古龙酸的方法，其优点在于：

1)采用吸附柱分离料液中的古龙酸，且所有操作均可在室温下进行，大大降低了分离过程的能耗。

2)所选用的吸附介质具有对古龙酸吸附容量大、物化性质稳定性高、吸附选择性好、解吸条件温和、再生容易、使用周期长等优点。

3)本发明的超高交联树脂HD-01，再生时不需要消耗酸碱或有机溶剂，可降低能耗减少废水排放量，避免环境污染问题，是一种清洁环保的生产工艺。同时不仅可用于古龙酸的提取过程，还可应用于各种有机酸、醇类发酵液的分离过程。

附图说明

图1本发明超高交联树脂HD-01的扫描电镜图(SEM图)；

图2本发明超高交联树脂HD-01的孔径分布图；

图3本发明超高交联树脂HD-01的BET图；

图4用Langmuir和Freundlich模型模拟古龙酸在超高交联树脂HD-01上的吸附等温线。从图中可知，温度越高，树脂对古龙酸的吸附容量越大，说明该吸附介质对古龙酸的吸附过程可能为吸热过程。在T＝313.15K时，其对古龙酸的最大吸附容量可达145.12mg/g。

图5是饱和吸附剂的解吸曲线。实验所用料液中古龙酸浓度均为35g/L，用0.1～1mol/L的NaOH溶液进行解吸，对古龙酸的收率均保持在95％以上。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

以下实施例中使用外标法对料液中的古龙酸浓度进行检测，色谱条件为：

1)色谱柱：Bio-rad HPX-87(250mm×4.6mm i.d.,5μm)

2)流动相：5mmol/L硫酸；

3)流速：0.6mL/min；

4)柱温：55℃；

5)进样体积：20μL。

检测方法及步骤：

1)色谱柱的平衡：配置好的流动相5mmol/L硫酸用孔径0.22μm的混合微孔滤膜过滤，再进行超声处理30min。用处理好的流动相以0.6mL/min的流速冲洗色谱柱，同时开启柱温箱，开始采集基线，待基线趋于直线时，平衡结束。

2)样品的检测：按照色谱条件编写进样序列及方法，将过膜处理后的标准品及样品按照进样序列置于自动进样器的相应位置上，开始进样并收集图谱信息。

使用以下公式计算解吸后的古龙酸的收率：

收率(％)＝m_解吸/m_进*100％

其中m_解吸、m_进分别表示为古龙酸在解吸前进样与解吸下来的质量之比。

实施例1：古龙酸料液的获得。

由Bacillus megaterium and Ketogulonicigenium vulgare发酵所得的发酵液中古龙酸的百分含量为35％(w/w)，其发酵过程如下：配制平板培养基：8.0％L-山梨糖，1.0％玉米浆，0.2％尿素，0.1％KH₂PO₄，0.01％MgSO₄·7H₂O，0.5％NaCl，1.5％琼脂于121℃下灭菌15min。发酵液pH调至7.0左右。营养物质初始添加一半，后续逐步添加。于Bugbox厌氧罐37℃培养72h，搅拌速度300rpm。所得发酵液中古龙酸～35g/L，残留L-山梨糖<1g/L。

可将上述Bacillus megaterium and Ketogulonicigenium vulgare替换为其他芽孢杆菌，即可实现由不同菌株发酵制备而得的含古龙酸的发酵液。

将所得的发酵液先进行粗过滤，再用离心机以12000rpm，离心10min，再用截留分子量为4000～10000Dalton的超滤膜进行超滤，以除去菌体和一些杂蛋白，此时发酵液中主要含古龙酸，备用。

实施例2：超高交联树脂HD-01的制备。

2000mL三口烧瓶中，加入200g干燥氯甲基化聚苯乙烯树脂，加入1500g硝基苯，搅拌混匀在室温下充分溶胀2h，加入12g三氯化铝和40g二乙烯基苯，于室温下搅拌反应1h，以1℃/min速率升温至95℃，进行交联反应。反应8h后，加入300mL乙醇以停止反应，并冷却至室温。抽滤，用乙醇洗去残留的溶剂和催化剂，真空干燥即可得到弱极性超高交联树脂HD-01。所得产物为暗棕色圆颗粒状，平均粒径为0.42-0.56mm，含水量为43wt％，孔径为1.92nm，孔隙率30-40％，湿密度1.09g/cm³，平均比表面积1645.5m²/g，平均孔容0.732cm³/g。合成后的树脂扫描电镜图见图1，孔径分布图和BET图分别见图2和图3。

实施例3：超高交联树脂HD-01的预处理。

用2BV 1mol/L的HCl溶液以1BV/h的流速冲洗树脂，再用水洗至中性；用2BV1mol/L的NaOH溶液以1BV/h的流速冲洗树脂，再用水洗至中性；最后用2BV的乙醇以2BV/h的流速冲洗树脂，用去离子水冲去乙醇，备用。

实施例4：超高交联树脂HD-01的吸附等温线的绘制。

图4是用Langmuir和Freundlich模拟古龙酸的吸附等温线，其实验过程为配置5～50g/L的古龙酸，分别取50mL于100mL的三角烧瓶中，再各加入2g的超高交联树脂HD-01。封口后分别置于293K、303K、313K的恒温摇床中，设定转速为120rpm，待吸附平衡后，测定溶液中的古龙酸的浓度。对所获取的实验数据用Langmuir和Freundlich等温模型进行拟合。

结果如图4所示，可见古龙酸的吸附过程符合Langmuir吸附等温模型。

实施例5：固定床树脂柱分离。

预处理后的料液中古龙酸的含量约为35g/L，将此料液以4BV/h的流速由上向下通过吸附柱(装有超高交联树脂HD-01，树脂柱高径比为13.6)，古龙酸被选择性吸附，吸附130min后停止进料，并将柱内液体排干。用去离子水洗杂，直至流出液中不含残糖等杂质，再将去离子水放干。向吸附柱顶端以0.5BV/h的流速滴加1.0mol/L NaOH水溶液，解吸90min后，流出液中基本没有古龙酸，解吸完毕。经解吸后的古龙酸收率达96.1％，纯度98.2％，古龙酸提浓3.35倍。再以1BV/h的流速通入去离子水，将树脂吸附的杂质洗净，再生完成后即可用于下一次的吸附操作。最后浓缩结晶即可得纯古龙酸。

实施例6：固定床树脂柱分离。

预处理后的料液中古龙酸的含量约为35g/L，将此料液以2.5BV/h的流速由上向下通过吸附柱(装有超高交联树脂HD-01，树脂柱高径比为13.6)，古龙酸被选择性吸附，吸附200min后停止进料，并将柱内液体排干。用去离子水洗杂，直至流出液中不含残糖等杂质，再将去离子水放干。向吸附柱顶端以1.0BV/h的流速滴加1.0mol/LNaOH水溶液，解吸60min后，流出液中基本没有古龙酸，解吸完毕。经解吸后的古龙酸收率达95.7％，纯度97.8％，古龙酸提浓2.8倍。再以2BV/h的流速通入去离子水，将树脂吸附的杂质洗净，再生完成后即可用于下一次的吸附操作。最后浓缩结晶即可得纯古龙酸。

实施例7：固定床树脂柱分离。

预处理后的料液中古龙酸的含量约为35g/L，将此料液以1.0BV/h的流速由上向下通过吸附柱(装有超高交联树脂HD-01，树脂柱高径比为13.6)，古龙酸被选择性吸附，吸附280min后停止进料，并将柱内液体排干。用去离子水洗杂，直至流出液中不含残糖等杂质，再将去离子水放干。向吸附柱顶端以2.0BV/h的流速滴加1.0mol/L NaOH水溶液，解吸45min后，流出液中基本没有古龙酸，解吸完毕。经解吸后的古龙酸收率达95.2％，纯度97.5％，古龙酸提浓2.45倍。再以3BV/h的流速通入去离子水，将树脂吸附的杂质洗净，再生完成后即可用于下一次的吸附操作。最后浓缩结晶即可得纯古龙酸。

Claims

1.一种利用超高交联树脂吸附分离古龙酸的方法，其特征在于，将经过预处理的古龙酸发酵液通过装有超高交联树脂的吸附柱，经吸附、洗杂和解吸的过程得到古龙酸溶液；

其中，所述的超高交联树脂是以聚苯乙烯-二乙烯基苯为骨架，通过傅-克交联反应制备得到，该超高交联树脂弱极性，亲水性好；平均粒径为0.42-0.56mm，含水量为43wt％，孔径为1.92nm，孔隙率30-40％，湿密度1.09g/cm³，平均比表面积1645.5m²/g，平均孔容0.732cm³/g，功能基团为羰基；

所述的吸附，条件为：吸附流速1～4BV/h，采用固定床吸附，树脂柱高径比为9～14；

所述的洗杂，条件为：去离子水洗杂；

所述的解吸，条件为：解吸剂为0.1～1mol/L NaOH水溶液，解吸流速为0.5～2.0BV/h；

经过吸附、洗杂和解吸的过程的吸附柱通过再生操作，然后重新进行吸附、洗杂和解吸；再生条件为：以去离子水为再生剂，再生剂流速为1～3BV/h。

2.根据权利要求1所述的利用超高交联树脂吸附分离古龙酸的方法，其特征在于，所述的超高交联树脂是按照如下方法制备得到：

将氯甲基化聚苯乙烯树脂在硝基苯或二氯乙烷中充分溶胀，加入傅氏催化剂和交联剂二乙烯基苯，并将温度上升至80～120℃，进行傅-克反应，制得含羰基功能基团的具有弱极性的超高交联树脂，用乙醇洗涤，抽滤后，利用稀盐酸水溶液浸泡固化，乙醇中保存备用。

3.根据权利要求2所述的利用超高交联树脂吸附分离古龙酸的方法，其特征在于，所述的傅氏催化剂为AlCl₃；傅氏催化剂的用量为氯甲基化聚苯乙烯树脂重量的2.5～6％；硝基苯或二氯乙烷的用量为氯甲基化聚苯乙烯树脂重量的5～10倍；交联剂二乙烯基苯用量为氯甲基化聚苯乙烯树脂重量的15～30％。

4.根据权利要求2所述的利用超高交联树脂吸附分离古龙酸的方法，其特征在于，加入傅氏催化剂和交联剂二乙烯基苯后，保持在室温反应1～2h，再以1℃/min～1℃/10min速率升温至80～120℃。

5.根据权利要求2所述的利用超高交联树脂吸附分离古龙酸的方法，其特征在于，待温度上升至80～120℃后，进行傅-克反应8～10h，反应后，在体系中加入乙醇停止反应并逐渐冷却至室温，乙醇的加入体积为待加入的反应体系的20～30％；所述的稀盐酸水溶液中，溶质HCl的浓度为0.1～0.5mol/L。

6.根据权利要求1所述的利用超高交联树脂吸附分离古龙酸的方法，其特征在于，所述的发酵液是利用芽孢杆菌属或假单胞菌属发酵制备得到的古龙酸发酵液；所述的预处理包括过滤。