AT112736B

AT112736B - Verfahren zur Darstellung der phosphor- und eisenhaltigen Kerne der im Eigelb enthaltenen Proteide.

Info

Publication number: AT112736B
Authority: AT
Inventors: Swigel Dr Posternak; Theodore Posternak
Original assignee: Swigel Dr Posternak; Theodore Posternak
Priority date: 1926-03-31
Filing date: 1927-03-29
Publication date: 1929-04-10

Description

Verfahren zur Darstellung der phosphor- und eisenhaltigen Kerne der im Eigelb enthaltenen Proteide.

Seitdem Miescher (med. ehem. Untersuchungen Hoppe Seylers, Heft 4,1871, S. 502) auf die Existenz von organisch gebundenem Phosphor im mit Alkohol und Äther extrahierten Eigelb hinge iesen hat-er nahm an, dass es sich um echte Nucleine handelte - suchten verschiedene Forscher die phosphor-
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(Zeitschrift für physiologische Chemie, Band 9, S. 49, 1885) eine Substanz vor, welche 5'19% P und 0'29% Fe enthält, gegenüber 6'7 bis 7'8% P im Mieschersehen Präparat. Dann versuchte Altmann (Archiv für Anatomie und Physiologie, 1889) nach seiner allgemeinen Darstellungsmethode der Nucleinsäuren eine ähnliche Säure aus dem Eidotter abzuscheiden. Sie enthielt rund 7% P.

Nach Milroy (Zeitschrift für physiologische Chemie, 22, S. 307) handelte es sich aber nicht um echte Nucleinsäure. Sie gab nämlich nach Hydrolyse mit Mineralsäuren keine Xanthinbasen, zeigte eine ausgesprochene Biuret-, jedoch
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(Zeitschrift für physiologische Chemie, Bd. 31, 1901, S. 543) ihre Avivitellinsäure dar durch Behandlung von gereinigtem Vitellin mit 25% igem Ammoniak in der Kälte, Keutralisieren mit Essigsäure, Abscheiden der Eiweissstoffe mit Hilfe von Pikrinsäure und Fällen der oben genannten Säure mit Alkohol. Die durch Umlösen gereinigte Substanz enthielt im Mittel 9'88% P und 0'57% fie. Sie gab die Biuret-und Millonsehe Reaktion.

Nach Hydrolyse wurden 17'8% des Totalstickstoffes in Form des Arginins und 3% in Form des Histidins festgestellt. Vier Jahre später beschrieben Hugounenq und Morel (Comptes rendus 140, S. 1065. 1905) ein nach Bunge dargestelltes aber angeblich viel weiter gereinigtes Präparat (die Reinigungs-
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Phosphorgruppe der Eigelbproteide in chemisch reiner Form zu isolieren.

Es konnte nun festgestellt werden, dass im Eigelb nicht eine einzige prostethische Phosphorgruppe vorhanden ist, sondern drei, welche durch die Buchstaben (1, ss, y bezeichnet werden sollen.

Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein Verfahren zur Darstellung eines Gemisches dieser drei Phosphorkerne sowie der einzelnen Bestandteile frei von fremden Eiweissspaltprodukten in Form
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es der Verdauung nach Aufschluss mit Pepsinsalzsäure zugänglich.

2. Die Einwirkung der Pepsinsalzsäure kann in jedem Augenblick der Verdauung angehalten werden, indem man die Salzsäure mit der entsprechenden Menge Alkalicarbonat abstumpft oder mit Alkaliacetat umsetzt. Die mehr oder weniger weitgehend verdauten Proteide werden dadurch gefällt.

3. Die Trypsinverdauung spaltet die phosphorhaltigen Kerne ab.

Es wurde weiter gefunden, dass man die drei Phosphorkerne o :, ss und auf Grund der verschiedenen Löslichkeit ihrer Salze oder der freien Säuren in Lösungsmitteln, wie Wasser, Alkohol u. dgl. voneinander trennen und entweder einzeln oder paarweise isolieren kann.

Durch Fällung der tryptischen Verdauungsflüssigkeit mit Erdalkalisalzen unter Zusatz von Alkohol
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metallsalze. Aus den letzteren gewinnt man die in Wasser löslichen Alkalisalze durch Behandeln mit solchen Alkaliverhindungen, deren Anion mit dem betreffenden Schwermetall unlösliche Verbindungen

bildet. Aus der wässerigen Lösung der Alkalisalze der Phosphorkerne werden diese durch säurehaltige Alkohol in Form ihrer freien Säuren abgeschieden.

Der Phosphorkern fl. ist in kaltem Wasser nur wenig löslich, ganz unlöslich in mit Mineralsäuren angesäuerten Mineralsalzlösungen, durch welche er leicht abgeschieden werden kann. Er bildet lösliche
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halten. Er gibt eine schöne Biuret-, jedoch keine Millonsche und Molischsche Reaktion. Bei der Hydrolyse mit kochenden Mineralsäuren erhält man als stickstoffhaltige Produkte nur Ammoniak, Serin und Lysin.

Dies ist um so merkwürdiger, als es keinem der vielen Autoren, welche sich mit den Spaltungsproduktes des Vitellins beschäftigt haben (z. B. Abderhalden und Hunter, Zeitschrift für physiologische Chemie, Bd. 48, S. 505,1906, Osborne und Jones, Am. Journal of Physiologique, Bd. 24, S. 1531909, Levene und Alsberg, Journal biologischer Chemie, Bd. 2, S. 117 1906), Serin zu isolieren gelungen ist. Die Phosphorsäuregruppen sind offenbar mit den Hydroxylgruppen der Serine verestert. Der P-Gehalt der Verbindung bewegt sich zwischen und 13'5%.

Der Phosphorkern ss ist der Eisenträger des Eigelbes. Seine physikalischen und chemischen Eigenschaften sind denjenigen des Phosphorkernes or. ähnlich. Er enthält zirka 3'5% Fe, also mehr als siebenmal soviel als das Präparat von Hugounenq und Morel (Comptes rendus, Bd. 140, S. 1065, 1. 905) und zwölfmal soviel wie das Haematogen von Bunge (Zeitschrift für physiologische Chemie, Bd. 9, S. 49, 1885). Der P-Gehalt beträgt rund 12%, das Atomverhältnis von P : N 1 :
Der Phosphorkern y ist von den zwei vorhergehenden grundverschieden. Er ist in Wasser sehr löslich, gibt lösliche Erdalkalisalze und unlösliche Metallsalze. Der P-Gehalt beträgt rund 8%. Das
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Millonsche Reaktion.

Phosphorkern a stellt ungefähr 55%, Phosphorkern ss ungefähr 27%, Pbosphorkern ï zirka 18% des Totalphosphors der Eigelbproteide dar.

Das Trennungsverfahren beruht auf folgenden Beobachtungen :
1. Wenn man zu einer wässerigen Lösung des nach Beispiel 2 hergestellten Gemisches der Natrium-
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der beiden Phosphorkerne @ und ss in Form ihrer Erdalkalisalze ab.

2. Gibt man zur wässerigen Lösung des Gemisches der Alkalisalze der drei Phosphorkerne unter Rühren allmählich Alkohol, so bildet sich plötzlich eine flockige Fällung, welche das Natriumsalz des eisenhaltigen Kerns ss darstellt.

3. Aus einer Mischung der Natriumsalze der Phosphorkerne (J. und y fällen lösliche Erdalkalisalze die in Wasser unlöslichen Erdalkalisalze des Phosphorkerns or.. Der Phosphorkern @ wird dabei nicht gefällt, da er wasserlösliche Erdalkalisalze gibt.

4. Wenn man eine wässerige Lösung einer Mischung der Natriumsalze der Phosphorkerne @, ss, @ mit Kochsalz sättigt und Mineralsäure zusetzt, so fallen die Phosphorkerne or und ss aus, der Phosphor- keen Y bleibt in Lösung.

5. Der Phosphorkem y kann aus seinen wässerigen Lösungen als freie Säure oder in Form von Erdalkalisalzen mit Alkohol gefällt werden.

Die neuen'Produkte sollen zu therapeutischen Zwecken verwendet werden.

Vom Verfahren der österr. Patentschrift Nr. 101335 unterscheidet sich das vorliegende Verfahren unter anderem dadurch, dass eine Vorverdauung mit Pepsinsalzsäure im Falle von Eivitellin unentbehrlich ist und dass die Endprodukte etwa doppelt soviel Phosphor enthalten, als die entsprechenden Produkte aus Kasein. Der Phosphorkern des Milehkaseins enthält auch kein organisch gebundenes Eisen.

Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung wird durch folgende Beispiele erläutert :
Beispiel 1 : 10 leg des mit kochendem Sprit extrahierten, getrockneten und fein gemahlenen Eigelbs werden in 500l Wasser aufgeschlelnmt, mit 2'8 kg konzentrierter Salzsäure und 100 g Pepsin oder einer entsprechenden Menge eines Salzsäureauszuges der Magenschleimhaut des Schweines versetzt und bei 37-40 unter stetigem Rühren erwärmt, bis das Eigelb in Lösung gegangen ist. Nach zirka 10 Stunden setzt man 3'8 kg Natriumacetat oder kg Natriumkarbonat und 1 kg Eisessig zu.

Man filtriert, zweckmässig auf der Filterpresse, wäscht mit Wasser nach und nimmt den Rückstand
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leicht angesäuert, filtriert und das Filtrat mit Kalziumehlorid oder Kalziumacetat und mit einem Volumen Alkohol gefällt. Die Fällung wird filtriert, mit Alkohol nachgewaschen und getrocknet. Man erhält auf diese Weise ein gelblich weisses, geschmackloses Pulver, welches nur zum Teil in Wasser löslich ist, rund 10'5% P, 1% Fe und 9-10% Ca enthält.

Beispiel 2@ Die tryptische Verdauungsflüssigkeit, wie sie im Beispiel 1 erhalten wurde, wird nach Ansäuern mit Essigsäure und Abfiltrieren des Ungelösten mit Bleizuckerlösung versetzt, so lange ein Niederschlag entsteht. Die Bleifällung wird filtriert, mit Wasser ausgewaschen und mit einer eigen Sodalösung verrührt, bis die Mischung auf Phenolphtaleinpapier sehwach rosa anschlägt. Die Phosphorverbindungen gehen als Natriumsalze in Lösung, das Blei bleibt als Karbonat unlöslich zurück. Die

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in Wasser löslichen gelbliehen Pulvers.

Beispiel 3 : Die Lösung der Natriumsalze, wie sie nach Beispiel 2 erhalten wird, wird mit einer Lösung von Kalziumchlorid oder Kalziumacetat versetzt und die Fällung mit Hilfe von 1 Volumen Alkohol vervollständigt. Man erhält das gleiche Kalziumsalz wie im Beispiel 1.

Beispiel 4 : Die Lösung der Xatrmmsalze, wie man sie nach Beispiel 2 erhält, wird in 3% Salzsäure enthaltenden Alkohol gegossen, die Fällung filtriert, mit Alkohol gründlich gewaschen und getrocknet.

Die erhaltene Substanz stellt die phosphorhaltigen Kerne des Eigelbs im freien Zustande dar. Die Verbindung stellt ein weisses Pulver dar, welches in Wasser nur teilweise löslich ist, mit Alkalien lösliche Salze gibt, mit löslichen Erdalkali-und Metallsalzen teils lösliche, teils unlösliche Salze gibt, gegenüber kalten Säuren ziemlich beständig, gegenüber Ätzalkalien sehr unbeständig ist. Die Verbindung gibt eine ausgesprochen Biuretreaktion, keine Millonsche Reaktion, dagegen eine Reaktion nach Molisch.

Es ist selbstverständlich, dass man statt Soda bei der Trypsinverdauung Pottasche und ebenso bei der Pesinverdauung statt Salzsäure eine andere Mineralsäure verwenden kann. Ferner kann man als Schwermetallsalze statt Blei-auch Kupfer-, Quecksilber, Eisensalze u. dgl. verwenden. Endlich kann man bei der Überführung der Schwermetallsalze in Alkalisalze statt Alkalikarbonat andere Alkaliverbindungen verwenden, deren Anionen mit den betreffenden Schwermetallen schwerlösliche Ver- bindungen bilden.
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aus 10 kg mit kochendem Alkohol extrahierten Eigelbes wird in 10 l Wasser gelöst. Man setzt langsam unter stetigem Rühren 2 t/23 l Alkohol zu.

Es bildet sich plötzlich eine flockige Fällung, welche abfiltriert, in Wasser, wenn notwendig unter Zugabe von etwas Soda wieder gelöst, mit Alkohol neuerdings gefällt, gewaschen und im Vakuum getrocknet wird. Das Natriumsalz des Phosphorkerns ss stellt ein gelblich gefärbtes, in Wasser etwas träge lösliches Pulver dar.

Die Lösung dieses Salzes kann durch doppelte Umsetzung mit löslichen Erdalkali-und Metallsalzen in die entsprechenden unlöslichen Erdalkali-oder Metallsalze, wie z. B. das Magnesium-, Kalzium-, Eisen-, Queeksilbersalz u. dgl., übergeführt werden.

Das alkoholische Filtrat des Phosphorkerns ss wird durch Destillation im Vakuum vom Alkohol befreit und mit einer Kalziumchlorid- oder Kalziumazetatlösung versetzt, worauf das Kalziumsalz des Phosphorkems-x ausfällt. Man filtriert, wäscht in Wasser nach und trocknet. Das so erhaltene Calciumsalz stellt ein weisses, in Wasser unlösliches, geschmackloses Pulver dar. Durch Behandlung mit der berechneten Menge Natriumoxalat in der W ärme kann man das Kalziumsalz in das entsprechende Natriumsalz überführen, aus welchem durch doppelte Umsetzung mit löslichen Erdalkali-und Metallsalzen verschiedene Erdalkali-und Metallsalze hergestellt werden können.

Endlich wird das Filtrat vom Kalziumsalz des Phosphorkerns (J. entweder mit Alkohol gefällt,
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Sodalösung gelöst und mit soviel Alkohol unter stetigem Rühren versetzt, bis eine plötzliche Fällung entsteht, Diese Fällung stellt den Phosphorkern ss dar und wird nach Beispiel fi weiterverarbeitet. Das alkoholische Filtrat, enthaltend den Phosphorkern C, wird entweder vom Alkohol befreit und mit einem löslichen Erdalkalisalz als Erdalkalisalz abgeschieden, oder in mit Salzsäure angesäuertem Alkohol eingegossen und als freie Säure isoliert.

Es ist klar, dass der Umfang dieser Erfindung nicht auf obige Beispiele beschränkt ist, sondern dass auch jede andere äquivalente Methode, sei es der Isolierung der gesamten Phosphorkerne aus dem Ver- dauungsgemisch in Form der Salze oder der freien Säuren, sei es der Trennung der einzelnen Kerne voneinander auf Grund der verschiedenen Löslichkeiten der Salze bzw. der freien Säuren in Lösungsmitteln, wie Wasser, Alkohol usw. unter das vorliegende Verfahren fallen.

PATENT-ANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Darstellung der phosphor-und eisenhaltigen Kerne der im Eigelb enthaltenen Proteide, dadurch gekennzeichnet, dass man entfettetes Eigelb zunächst in Gegenwart einer Mineralsäure der peptischen Verdauung unterwirft, bis nach erfolgter Auflösung des Eigelbs ein unlöslicher Nieder- schlagentsteht, die Verdauung durch Abstumpfung der angewandten Mineralsäure bzw.

Ersatz derselben durch eine organische Säure unterbricht, die Fällung filtriert und einer tryptischen Verdauung in schwach alkalischem Medium unterwirft, die erhaltene Verdauungsflüssigkeit hernach schwach ansäuert, filtriert, aus dem Filtrat entweder durch Behandlung mit Erdalkalisalzen und Alkohol die entsprechenden Erdalkalisalze des Gemisches der phosphorhaltigen Kerne abscheidet, oder durch Behandlung mit Schwermetallsalzen eine Abscheidung der Schwermetallverbindungen der phosphorhaltigen Kerne bewirkt, diese mit solchen Alkaliverbindungen zersetzt, deren Anionen mit dem betreffenden Schwermetall
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aus denen gewünsehtenfalls die einzelnen Phosphorkerne auf Grund der verschiedenen Löslichkeiten ihrer Salze oder der freien Säuren in Lösungsmitteln, wie Wasser, Alkohol u. dgl. gesondert oder paarweise gewonnen werden können.

Claims

2". Ausführungsform des Verfahrens gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die nach Anspruch 1 erhaltenen Alkaliverbindungen der phosphorhaltigen Kerne durch Behandlung mit Erdalkalisalzen in Form ihrer Erdalkaliverbindungen abscheidet. a. Ausführungsform des Verfahrens gemäss Anspruch l r dadurch gekennzeichnet, dass man die nach Anspruch 1 erhaltenen Alkaliverbindungen der phosphorhaltigen Kerne durch Behandlung mit säurehaltige Alkohol in Form ihrer freien Säuren abscheidet.

4. Verfahren gemäss. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zunächst aus der Lösung der Alkalisalze der drei Phosphorkerne das Alkalisalz des eisenhaltigen Phosphorkerns ss mit Alkohol ausfällt und aus der verbleibenden Lösung der Alkalisalze der Phosphorkerne a und y den Phosphorkern a mit EMI4.2 entweder als solche mit Alkohol fällt oder mit Sohwermetallsalzen behandelt, die so erhaltene Schwermetallverbindung des Phosphorkerns y mit solchen Wasserstoff- oder Alkaliverbindungen umsetzt, deren Anionen mit den betreffenden Schwermetallen unlösliche Salze bilden und dadurch den Phosphorkern y in Form der freien Säure oder als Alkalisalz gewinnt.

5. Verfahren gemäss Anspruch f, dadurch gekennzeichnet, dass man aus der Lösung der nach Anspruch 1 erhaltenen Alkalisalze der Phosphorkerne @, ss und @ mit löslichen Erdalka lisalzen den Phosphor- EMI4.3