DE34043C - Verfahren zur Darstellung reiner nicht organisirter Fermente - Google Patents

Description

PATENTSCHRIFT

KLASSE 12: Chemische Apparate und Processe.

. Patentirt im Deutschen Reiche vom S.Mai 1885 ab.

Man besitzt zur Zeit nur wenige Methoden, um Fermente aus den dieselben einschliefsenden Materialien oder Organen zu isoliren. Das vorliegende Verfahren ermöglicht, nicht organisirte Fermente sowohl aus den drüsigen Organen des Organismus als auch aus anderen Materialien in reinem Zustande als wohl charakterisirbare, klar wasserlösliche Niederschlage zu isoliren und-sogar auch neben einander auftretende Fermente, die in ihren Wirkungen sich gegenseitig beeinträchtigen, von einander zu trennen. Das Verfahren ist erprobt für die Isolirung des Chymosins (Ferment des Labmagens), des Pepsins, Pankreatins und der Diastase.

Es existiren im Handel mehrere Formen nicht organisirter animalischer Fermente, so die genannten Labextracte und die nach verschiedenen Verfahrungsarten gewonnenen Pepsine. Die ersteren, die gewöhnlichen Kälber-■ magenextracte des Handels, welche bei der Fabrikation der Süfsmilchka'se verwendet werden, stellen eine gelbbraune Flüssigkeit dar, welche durch Extraction der Kälbermagen mit Wasser unter Zusatz von Präservirungsmitteln gewonnen wird. Diese Extracte haben für die Verwendung in der Praxis hauptsächlich zwei Nachtheile: . , _; ..

i. Sie enthalten aufser dem wirksamen Labferment noch verschiedene andere schleimige, eiweifsartige Theile des Kälbermagens in Auflösung, welche die gelbe bis braune Farbe der Extracte bedingen und gleichzeitig denselben einen unangenehmen Geruch verleihen, welcher sich bei ihrer Verwendung dem zu producirenden Käse mittheilt. \: ·

2. Sie enthalten eine gröfsere Quantität von Präservirungsmitteln (Borsäure etc.), da nicht nur das Ferment, das nur in minimalen Mengen in den Exfracten vorhanden ist, präservirt werden mufs, sondern auch die weit zersetzbareren, in überwiegender Quantität vorhandenen schleimigen Extractstoffe der Labextracte. Dieser erhöhte Gehalt an Präservirungsmitteln wirkt nun aber schädlich für den Reifungsprocefs der Käse, verlangsamt denselben und kann daher das bisherige Extract, ζ. B. für die Fabrikation der Emmenthaler Käse, nicht verwendet werden.

Die im Handel befindlichen Pepsine sind von aufserordentlich ungleicher Beschaffenheit und Wirkung. Viele sind gänzlich unwirk₇ sam und hat man bisher das Pepsin noch nie rein isolirt und aus dem so abgeschiedenen Product Lösungen oder Gemische produciren können, deren Gehalt an reinem Ferment α priori bekannt war. Die Methoden, das Ferment des Magensaftes aus den Extracten der Schweinemagen z. B. zu isoliren, beruhen einestheils auf einer Fällbarkeit des Ferments durch Alkohol, anderenteils auf Fällbarkeit mit Säuren; endlich wird auch von Scheffer angegeben, dafs durch Lösungen von Kochsalz das Pepsin aus seinen Auflösungen gefällt wird. Diese Methoden der Isolirung haben entweder den Uebelstand, dafs mit dem Ferment noch massenhaft indifferente, verunreinigende Stoffe unter wesentlicher Beeinträchti-gung der fermentativen Kraft niedergeschlagen werden, oder aber z. B. durch Kochsalzlösungen die Fällung nur so unvollkommen erreicht wird, dafs die restirenden Laugen noch

""bedeutende verdauende Kraft äufsern. Das letztere Verfahren ist somit technisch unbrauch-. bar, weil das Ferment nur theilweise isolirt und ,daher zu theuer wird.

Es ist mir nun gelungen, sowohl das Chymosin, das Pepsin, als auch das Ferment der Bauchspeicheldrüse in Form von farblosen, gallertartigen Niederschlügen so vollständig aus den Auszügen der drüsigen Organe zu fällen, dafs die nach Filtration restirenden Mutterlaugen dieser Fermente keine fermentative . Kraft mehr besitzen und die Fermente selbst in Wasser klar lösliche, ungefärbte, geruchlose und geschmacklose Stoffe darstellen, deren weitere Benutzung man nun in beliebiger .Ausdehnung mit vollkommener Sicherheit in der Hand hat.

Das Verfahren stützt sich auf folgende Beobachtungen und Feststellungen:

Chymosin, Pepsin und Pankreatin sind in schwachen Kochsalzlösungen löslich. Diese Fermente lösen sich auch in sehr verdünnt sauer gehaltenen Kochsalzlösungen, jedoch.in verschiedenem Grade. Saure Kochsalzlösungen nehmen aus fermenthaltigen Organen nur wenig SchleimstofTe auf. Reine Kochsalzlösungen lösen neben den Fermenten reichlich Schleim. Aus schwach sauer gehaltenen Kochsalzlösungen werden die Fermente durch Eintragen von , pulverförmigen, wasserlöslichen Salzen der ■Alkalien oder alkalischen Erden (Chlornatrium, Chlorkalium, Chlormagnesium, Chlorcalcium .u.s.w.) bis zur Uebersättigung und Bildung eines bleibenden Niederschlages des Salzzusatzes als gallertartige, weifse Niederschläge ausgeschieden, welche, wenn man während der Abscheidung stark rührt, so vollständig zur Fällung gelangen, dafs die übrig bleibende, übersättigte Lauge kaum noch Spuren fennentativer Kraft besitzt.

Von diesen von mir durch vielfache Verbuche erprobten Eigenschaften der Fermente 'ist bisher nur durch Soxhlet's Untersuchungen bekannt geworden, dafs bei dem Behandeln von sogen. Labmagenextracten mit Salzlösung 'ein fermenthaltiger, schleimiger Niederschlag entsteht, dessen weitere Eigenschaften, insbesondere dessen Reinigung jedoch niemals untersucht worden sind, wie man denn auch nicht wufste, ob und unter welchen Umständen der Fermentgehalt dieser Schleimmassen beim Trocknen seine Wirksamkeit behalt oder einbüfst, sowie ob derselbe beim Aufbewahren wirksam bleibt oder 'nicht. Was man bisher trockenes Labpulver nannte, ist nichts anderes, als die getrocknete, präparirte Schleimhaut des Labmagens, keinenfalls ein in Wasser klar lösliches, schleimfreies Ferment. Es erhellt dies schon aus dem Wirksamkeitscoelficienten, da die trockenen Labpulver etwa eine Wirksamkeit von ι : 300000 aufweisen, während das reine, nach meiner Methode dargestellte Ferment im Verdünnungsgrad von ι : ι oooooo wirksam ist. .

Der Gewinnung reiner Fermente aus den drüsigen Organen geht zunächst eine vorbereitende Beschaffung von rohen, fermenthaltigen Lösungen voraus. Dies kann wie folgt geschehen, wobei stets unter »Salz« bezw. »Salzlösungen« die löslichen Salze der Alkalien öder alkalischen Erden (Chloride, Sulfate, Nitrate, Carbonate, Phosphate etc.) bezw. deren Lösungen zu verstehen sind:

a) Man extrahirt die zerkleinerten drüsigen Organe mit schwachen Salzlösungen unter Zusatz von Präservirungsmitteln, wie Borsäure, Borax, Glycerin, Thymol, ätherischen Oelen oder Alkohol.

b) Man extrahirt mit schwach sauren Flüssigkeiten (mineralische oder organische Säuren) unter Zusatz von Salz.

c) Man extrahirt mit reinen Salzlösungen, d. h. ohne Säuren und Präservirungsmitlel.

d) Man extrahirt zuerst mit stärkeren Salzlösungen unter Zusatz stärkerer Säureinengen und nach dem Abseihen mit reinen SaIz-.lösungen. , . ' . , '

e) Man extrahirt mit Glycerin mit oder ohne Zusatz von Salz.

Von diesen vorbereitenden Verfahren sind die unter c) und d) bezeichneten für die Gewinnung von Fermentlösungen überhaupt noch nicht verwendet, während man die unter a), b) · und e) bezeichneten Operationen bereits kennt. Neu ist jedoch in allen Fällen die Weiterbehandlung dieser Auszüge behufs Isolirung reiner, schleimfreier Fermente. Diese Behandlung ist indessen je nach der Beschaffenheit des ersten Auszuges verschieden.

Ich habe die Beobachtung gemacht, dat's wässerige Lösungen schleimhaltiger Rohfermente, welche sich überaus schwierig filtriren lassen und deshalb einer Behandlung im Gr'ofsbetriebe mit Filtrationsvorrichtungen äufsersten ,Widerstand bieten, mit Leichtigkeit filtrirbar werden, wenn man die Schleimstoffe entfernen kann. Diese Schleimstoffentfernung gelingt aber nach meiner Beobachtung auf Grund der verschiedenen Fällbarkeit der Fermente und des Schleimes in Säuren. Säuert man eine schleimige Fermentlösung an, so ist der zuerst gebildete Niederschlag nahezu -reiner Schleim ohne Fermentwirkungen, später erst fällt das Ferment. Man kann somit durch successiven Säurezusatz, je nach dem bekannten erfahrungsgemäfsen Concentrationsgrad der. Rohfermentlösung, fast sämintlichen Schleim unter Verlust von wenig Ferment von letzterer trennen. Die schleimfreie Fermentlösung läfst sich von dem Schleimniederschlag äufserst . leicht durch Filterpressen abfiltriren. Man erhält eine klare Flüssigkeit, die, mit pulver-

förmigem Kochsalz übersättigt, unter stetem Umrühren und mehrtägigem Stehen einen klar in Wasser löslichen, farblosen, schleim-' freien, reinen Fermentniederschlag entstehen läfst. - Das Kochsalz bildet hierbei gewissermafsen einen Träger des Ferments, der gleichzeitig conscrvirend wirkt. An Stelle von Kochsalz kann auch Chlorkalium, Glaubersalz , Salpeter, schwefelsaures Kali, Zucker oder überhaupt ein unschädlich wirkendes, wasserlösliches und das Ferment conservirendes, im übrigen aber mit Bezug auf das Ferment indifferentes Salz verwendet werden.

Für die Behandlung der Rohfermentniederschläge, welche Gemische von Chymosin und Pepsin enthalten, welche insbesondere entstehen, wenn Labmägenauszüge, die nach meiner Entdeckung beide Fermente enthalten, zur Verarbeitung kommen, ist eine .besondere

. Behandlungsweise erforderlich. Man hat das Pepsin vom Chymosin zu trennen. Das Pepsin ist viel schwieriger in Salzlösungen löslich als Chymosin, leicht löslich jedoch in Säuren. Extrahirt man daher mit stärkeren sauren Salzlösungen, so geht das Pepsin, dagegen kein Chymosin in Lösung. Ebenso kann man, so lange die saure "Reaction der Rohfermentlösung bei der Schleimausfällung erhalten bleibt, sicher sein, dafs das Pepsin in Lösung bleibt. ■ :.

■■. Saturirt man die säure, vom in Kochsalzüberschufs erhaltenen Chymosinniederschlag abfiltrirte Mutterlauge mit Natriumcarbonat oder mit Calciumcarbonat und Natriumphosphat, so erhält man das in der Lösung befindliche Pepsin, das man mit indifferenten, in der Lösung erzeugten Niederschlägen, wie Calcium-

'■ phosphat, Cholesterin etc., niederreifsen kann. Auf diese .Beobachtungen-, stützt sich das Verfahren der Weiterbehandlung der Fermentauszüge aus den Drüsenorganen.

.-■ I. Die ■'. nach ' der Vorbehandlung a) ■ und b) erhaltenen Auszüge werden abgeseiht und darauf filtrirt. Zu dem Filtrat-setzt man ein pulverförmiges, wasserlösliches Alkali oder Erd-· alkalisalz, am besten : die Chloride, bis zur Uebersättigung und unter beständigem Umrühren. Man läfst tagelang stehen. Es bildet sich - ein schleimhaltiger Niederschlag', der nahezu sämmtliches Ferment, Rohferment - einschliefst. Diese Rohfermentfällung kann man auch besonders beim Chymosin, das wenig in Säuren löslich ist, durch Zusatz von Säuren bewerkstelligen^ Das erhaltene Rohferment wird nun weiter verarbeitet, indem man zunächst in Wasser löst, darauf ansäuert, hierdurch den .Schleim ·fällt 'und die "Löslichkeit des Pepsins durch die Ansäuerung erhöht. Die schleimfreie, durch Filtration getrennte Lösung wird mit Kochsalzpulver im Ueberschufs versetzt. Es entsteht unter dauerndem Rühren und mehrtägigem Stehen eine fast fermentfreie Lösung einerseits und ein schleimfreier Fermentniederschlag andererseits. Die saure Lösung wird neutralisirt und läfst dann Pepsin fallen. Uebcrsättigt man mit Natriumcarbonat, so kann man auf Zusatz von Kalksalzen das Pepsin mechanisch mit Kalkcarbo- ' naten niederreifsen.

II. Die nach c) erhaltene reine Salzlösung wird abgeseiht und angesäuert. Es fallt Schleim mit wenig Ferment. Der Niederschlag ist leicht abzufiltriren. Das Filtrat wird dann'mit Salzpulver (wasserlöslichen Salzen der Alkalien oder alkalischen Erden) übersaturirt. Es fällt unter denselben Bedingungen, wie unter L, schleimfreies Ferment, und falls von Labauszügen ausgegangen wurde, pepsinfreies Chymosin.

III. Das unter d) erhaltene Extract liefert in den ersten Auszügen bei Labmagen vorwiegend Pepsin, in den nach saurer Extraction erhaltenen Salzlösungen dagegen vorwiegend oder fast reines Chymosin. Die Pepsinauszüge werden neutralisirt und entweder durch Uebersättigung mit Salzpulver oder durch Erzeugung indifferenter Niederschläge in der neutralisirten Flüssigkeit das Pepsin niedergeschlagen. Die Chymosinlösungen werden genau nach dem Verfahren unter i. weiter verarbeitet.

IV. Aus den Glycerinlösungen läfst sich das Rohferment ebenfalls entweder durch .stärkeres Ansäuern oder durch Alkohol oder durch Salzpulverüberschufs ausscheiden. Die Reinigung des Rohfermentes hat dann zu geschehen, wie vorstehend beschrieben. Die auf obige Weise erhaltenen schleimfreien Ferment- ■ niederschlage werden schliefslich mit gesättigter Kochsalzlösung zur völligen Entfernung ad-, härirender Säurereste und der Mutterlauge aus- . gewaschen und ausgepreist.

Die wenig. fermenthaltigen Schleimniederschläge lassen sich direct zu Labextracten oder Lablösungen verwenden oder nach Ansammlung sich für die Aufarbeitung lohnender Massen auch noch auf reines Ferment verarbeiten. Die bei obigen Behandlungsweisen entstehenden reinen, schleimfreien Fermente können nun entweder im Vacuum oder bei niederer Temperatur getrocknet werden, oder man kann sie auch in gelöster Form als reine, schleimfreie, klare Fermentlösungen in den Handel bringen. Bei der Trocknung empfiehlt sich behufs bequemer Dosirung die Beimengung und Unterreibung eines indifferenten Materials, wie Kochsalz. Will man zu wissenschaftlichen Zwecken das Ferment chemisch rein darstellen, so ist durch Dyalisiren des trocknen Salzfermentgemisches dies mit Leichtigkeit zu erreichen. Das Pankreatm ist nahezu dem Chymosin gleich unlöslich. Auch Diastase läfst sich mittelst der Uebersaturation mit Salz

Claims (1)

1. nahezu vollständig, aus den Malzauszügen iSoliren.

   Unter «Salz« ist im Vorhergehenden, ,wenn nichts besonderes angeführt, stets ein wasserlösliches Salz der Alkalien oder alkalischen Erden zu verstehen. -.'■.-■■

   ι Patent-Ansprüche:

   Verfahren zur Abscheidung reiner, schleimfreier Fermente, und zwar des Pepsins, Chymosins, Pankreatins und der Diastase, indem man die Fermentlösungen mit einem Ueberschufs eines wasserlöslichen Salzes der Alkalien oder alkalischen Erden in Pulverform, insbesondere Kochsalz, versetzt unter starkem Umrühren und mehrtägigem Stehenlassen.

   Verfahren zur Abscheidung der Schleimstoffe und mechanischen Verunreinigungen, welche die rohen, stark fermenthalligen, abgeseihten Flüssigkeiten schwer filtrirbar oder unfiltrirbar machen, dadurch, dafs man dieselben mit Mineralsäuren oder starken organischen Säuren ansäuert bis zur Abscheidung - des Schleimes vor Fällung des Fermentes behufs Erzielung einer reinen, demnächst leicht filtrirbaren Fermentlösung.

   3j Verfahren zur Trennung des Pepsins vom Chymosin in den Rohlabauszügen und den Lösungen des Niederschlages von Rohfermentgeinischen aus Lablösungen, indem man behufs Trennung des Schleimes den . Fermentauszügen zunächst Säuren zusetzt, demnächst mit einem löslichen Salze der Alkalien oder alkalischen Erden, insbesondere Kochsalz, saturirt, behufs Abschei- * dung des Chymosins, endlich aus der sauren, mit Salz übersättigten Lösung nach Neutralisation einen Pepsinniederschlag er_r zeugt oder auch das Pepsin mit indifferenten Niederschlägen zur Ausfällung gelangen läfst.

   4. Verfahren zur Trennung des Pepsins vom Chymosin aus dem Rohfermentniederschlag, · indem man denselben mit salzhaltiger, verdünnter Säure auswäscht, wobei Chymosin zurückbleibt.

   5. Verfahren der Verarbeitung von rohen Fermentauszügen aus den drüsigen Organen, theils durch saure oder neutrale Salzlösungen mit oder ohne Conservirungs-

   • mittel, theils durch Glycerinextraction er- · halten, indem man aus denselben theils durch Salze, theils durch Säuren Rohausfällungen erzeugt, die nach den unter I., II., III. und IV. angegebenen Operationsmethoden weiter verarbeitet werden. ' ■

   6. Die Reinigung der aus saurer Lösung erzeugten schleimhaltigeri oder schleimfreien

   , Fermente durch Auswaschen mit der concentrirten Lösung eines wasserlöslichen Salzes der Alkalien oder alkalischen Erden, insbesondere des Kochsalzes, zwecks Entfernung von Säuren und anhängenden Mutterlaugen.