Verfahren zur Entfernung von Verunreinigungen aus gegen die Anämia perniciosa wirksame Stoffe enthaltenden Extrakten. Der Anti-Anämia-perniciosa-Fal#,tor , oder kurz Antiperniziosalaktor , enthält wahr scheinlich zwei oder möglicherweise mehr als zwei voneinander verschiedene Wirksubstan zen, von denen die eine in neuerer Zeit unter der Bezeichnung Vitamin B12 bekannt gewor den ist.
Diese Wirksubstanzen können aus der Leber gewonnen werden. Es sind zahlreiche Methoden zür Gewinnung von an Wirksub stanz reichen Extrakten aus Leber vorgesehla- gen worden. Nei--terdings wurde bekannt, dass <U>gegen</U> Anämia pernieiosa wirksame Substan zen aueh durch gewisse.-L#likroorgaiiismen, wie z. B. Streptomyces griseus, erzeug ,
#t werden.
Allerdings entstehen auf mikrobiologisehem Wege bisweilen Stoffe, die an sieh noch keine Antiperniziosawirksanikeit aufweisen und für die Reinigung schlecht geeignet sind. In sol- ehen Fällen kann es sieh als notwendig erwei sen, das im brit. Patent NTr. <B>665485</B> beschrie bene Verfahren anzuwenden, um die eigent- liehe Wirksubstanz<B>7u</B> erhalten.
Es sei im übrigen bemerkt, dass man zür Zeit nur durch klinische Versuche mit Sicher heit fest-stellen kann, ob ein gegebenes Ma terial Antiperniziosa.wirksamkeit besitzt oder nicht.
Immerhin werden durch eine Unter suchung der mikrobiologisehen Wirksamkeit des 3-laterials mittels des sogen. Platten-Zylin- der-Versuches -unter Verwendung von Lacto- baeillus laetis Dorner oder Lactobaeillus Leiehmanii und von reineni Vitamin B12 als Standardsubstanz (siehe beispielsweise Cuth- bertson, Biochem. J.,
1949, Proe. V) Angaben über die Antiperniziosawirksamkeit gewonnen, die im allgemeinen zuverlässig sind. Mit dem Ausdruck Vitamin-B,2-Aktivität, -wird im folgenden die nach der oben angeführten Me thode mikrobiologisch bestimmte Wirksamkeit zur Unterscheidung von der durch klinische Versuche bestimmten Wirksamkeit bezeichnet.
Aus Leber oder aus Mikroorganismen ge wonnene W irksubstanz ist. gewöhnlich von Verunreinigungen begleitet, von denen ein Teil Aminosäuren und Peptide sind, die in folge ihres amphoteren Charakters schwer ab zutrennen sind. Das Verf ahren cemäss der vorliegenden Erfindung gestattet nun, Roh extrakte ohne Verlust an Antiperniziosawirk- samkeit von solchen Verunreinigungen zu be freien.
Es wurde nämlich überraschenderweise ge funden, dass die in Betracht stehenden Wirk substanzen ihre Antiperniziosawirksamkeit nicht verlieren, wenn sie mit salpetriger Säure behandelt werden, und zwar wurde festge stellt, dass bei der Behandlung eines Wirk- substanzes und Aminosäuren und Peptide. als Verunreinigungen enthaltenden E-,r-traktes mit salpetriger Säure die genannten Verunreini- gun.gen in 0-"#,vsä-Liren übergeführt werden,
die sieh leichter von den -g"irksubstanzen abtren nen lassen. Das den Gegenstand der vorliegenden t r- findung bildende Verfahren zur Entfernung von aus Aminosäuren bzw. Peptiden bestehen den Verunreinigungen aus gegen Anämia perniciosa wirksame Stoffe enthaltenden Ex trakten ist somit dadurch gekennzeichnet, dass die Extrakte mit salpetriger Säure behandelt und die dadurch in leicht abtrennbare Form gebrachten VerLinreinigungen beseitigt wer den.
Die bei der Behandlung mit salpetriger Säure entstandenen Ox)-sä-Liren können z. B. dadurch beseitigt werden, dass man sie aus den Reaktionslösaiigen extrahiert. Man kann aber auch die Wirkstoffe aus den Lösungen extra hieren, wozu man zweckmässig zaerst die Lö sungen neutral oder alkalisch stellt.
Man kann von wässrigen Extrakten ver schiedenen Reinheitsgrades bzw. verschiedener Konzentration ausgehen. So kann man bei spielsweise einen rohen wässrigen Leberextrakt oder einen aus --,Wiluoorganismen hergestellten rohen Extrakt, der beispielsweise nach der im. brit. Patent Nr. <B>665485</B> beschriebenen Me thoden erhalten wurde, verwenden. Man kann. aber auch vor der Behandlung mit salpetriger Säure eine oder mehrere Reinigungsbehand lungen, wie z.
B. Adsorption an Kohle, Ex traktion mittels Lösmigsmitteln und derglei chen, darchführen.
Die Behandlung mit salpetriger Säure kann in verschiedenem Weise durchgeführt werden. 'So kann man beispielsweise den wässrigen Extrakt der Wirksl--Lbstanz an säuern und ein Nitrit, z. B. Natriumnitrit, zu setzen. -Man kann den Extrakt beispielsweise aber aueli mit nitrosen Gasen behandeln oder die salpetrige Säure aus einem Allcylnitrit, wie z, B. Amylnitrit, freisetzen.
Da die Wirksubstanz unter stark sauren Bedingungen zerstört werden kann, sollte die Behandlung mit salpetriger Säure natürlich nicht in allzu stark saurem Niedium ausge führt werden. Es wurde festgestellt, dass bei einem p.H von<B>1</B> bis<B>5</B> im allgemeinen befriedi gende Resultate erzielt werden.
In der Praxis wird vorzugsweise so vor gegangen, dass man den wässrigen Extrakt mit einer organischen Säure, wie, z. 13. Pssigs#ure, oder einer Mineralsäure, wie z. B. Salzsäure, auf ein pi, von etwa 4 ansäuert und die erhal tene Lösung mit NatriLim- oder Kaliumnitrit behandelt, wobei, wenn nötig, weitere Säure mengen zugesetzt werden, um das pH auf etwa 4 zu halten.
Die salpetrige Säure wird vorzugsweise im Überschuss verwendet. Um die erforderliche Menge festzustellen, sollte das Ausgangs material einer Aminogruppenbestimmung, bei spielsweise nach der bekannten Methode von Van Slyke, unterzogen werden. Nach Beendi gung der Reaktion kann die überschüssige salpetrige Säure, wenn gewünscht, zerstört werden, beispielsweise durch Zugabe von 1.Tarnstoff, Die Behandlung mit s#alpetriger Säure kann bei Raumtemperatar ausgeführt werden. Im allgemeinen wird jedoch das Reaktions gemisch vorzugsweise leicht erwärmt.
Es ist indessen züi bemerken, dass'eine allzu hohe Reak tionstemperatur die Zerstörung, des aktiven Materials verursachen kann.
Wie bereits erwähnt -vnirde, können die be handelten Verunreinigungen auf zweierlei Arten von der Wirksubstanz abgetrennt wer- cl den. Sollen die saaren Verunreinigungen aus der Lösung extrahiert werden, so kann man züi diesem Zweck die bekannten Methoden zür Extraktion von Oxysäuren aus ihren wässrigen Lösungen anwenden.
So kann man beispiels weise die von der Behandlung mit salpetriger Säure herrührende Lösung unter sauren Be dingungen mit einem organischen Löstings- mittel, das Oxysä-Liren zu lösen vermag, extra hieren. Für diesen Zweck<U>kommen</U> zahlreiche organische Lösungsmittel in Frage.
Als be sonders geeignet haben sich indessen die fol genden Lösungsmittel erwiesen: Äther, Chloro form, niedere aliphatisehe Ester, Butyl- -and Amylalkohole. Gewisse Lösungsmittel, insbe sondere Butyl- und Amylalkohole, können unter Umständen auch einen Teil der Wirk substanz extrahieren. Es ist deshalb im all gemeinen zweckmässig, den Extrakt seinerseit#z mit. einer gewissen Menge Wasser zu extra- hieren, um etwa durch'das Lösungsmittel ex trahierte Wirksubstanz zurüekzugewinnen.
Die Extraktion der Säuren mit Lösungs mitteln sollte nicht unter stark sauren Bedin- guingen, unter welchen die Wirksubstanz zer stört würde, durchgeführt werden. Diese Ex traktion wird vorzugsweise bei einen' PH Voll <B>1</B> bis<B>5</B> durchgeführt.
Andere anwendbare Methoden zur Extrak tion von Säuren beruhen auf der Verwendung von Anionenaustauschharzen, wie z. B. von Deaeidite oder der Amberlite -Harze IRA. 400 und IR-4B (Markenprod-akte), ferner auf der Fällung mittels Metallsalzen <B>USW.</B> Sollen die Wirksubstanzen aus den von der Behandlung mit salpetriger Säure her rührenden Lösungen extrahiert werden, so werden die letzteren, wie gesagt, zweckmässig zuerst neutral oder alkalisch gestellt. Als Lösungsmittel für die Extraktion der Wirk stoffe aus den neutralen oder alkalischen Lö sungen eignen sieh z. B.
Alkohole, die, in Was ser bei Raumtemperatur im Ausmass von<B>3</B> bis <B>25</B> Vol.1/o löslich sind, Gemische solcher Alko hole, Gemische von Phenol undloder einem oder mehreren der Kresole mit einem Alkohol der genannten Art,
Gemische von Phenol undloder einein oder mehreren der Kresole mit nicht mehr als dem 3fachen ihres Ge- wiehtes an irgendeinem bei gewöhnlichen Tem- peraturen im Ausmass von <B>3</B> bis 25 Vol.% in Wasser löslichen Keton oder Ester,
Gemische von Phenol undlocler einem oder mehreren der Kresole mit nicht mehr als dem 3fachen ihres Gewichtes an Diäthylät.her, Diisopropyläther, Benzol, Toluol -undloder Xylol, Genüsche von Phenol und/oder einem oder mehreren der Kresole mit einer zu ihrer Verflüssigung ge nügenden Menge Wasser,
Propylalkohol oder Isopropylalkohol mit einem Gehalt von<B>5</B> bis 25 Vol.% Wasser. Wenn wässriger Propyl- oder Isopropyl- alkohol verwendet wird, so sollte die wässrige Lösung zwecks Verhinderung -volrständiger Mischbarkeit eine genügende Menge eines Aus- salzmittels enthalten.
<B>-</B> Vorzugsweise wird Phenol oder ein Ge misch von Phenol mit Butanol verwendet. Das, Reaktionsgemisch kann mittels verschiedener alkalischer Stoffe neutral oder alkalisch ge stellt werden; vorzugsweise wird Natrium- oder Kaliumhydroxyd oder -carbonat verwen det. Es ist jedoch zu bemerken, dass unter stark alkalischen Bedingungen eine Zerstö rung der Wirksubstanzen wahrscheinlich ist. Das p.H des Gemisches sollte deshalb während dieser Extraktion vorzugsweise den Wert von <B>9</B> nicht überschreiten.
Im Anschlass an die Entfernung der Oxy- säuren können beliebige andere Reinigungen durchgeführt werden.
<I>Beispiel<B>1:</B></I> <B>50</B> ems einer teilweise gereinigten wäss- rigen Lösung von gegen Anämia perniciosa wirksamer Substanz (hergestellt aus einer durch Züchtung von Streptomyces Grise-Lis nach der im brit. Patent Nr. <B>665485</B> beschrie benen Methode erhaltenen Kultur durch teil weise Reinigung mittels Adsorption an Kohle,
Eluierung mit<B>10</B> 1/o Wasser enthaltendem Phe nol und Entfernung des Phenols durch Be- handlung mit Äther und Wasser) wurden mit, Eisessig aLif ein pl, von 4 angesäuert und mit <B>5</B> ems gesättigter Natritimnitritlösung versetzt. Das Gemisch wurde während<B>5</B> Minuten auf etwa 8011 <B>C</B> erhitzt und dann während 20 Mi nuten kühlen gelassen.
Die kalte Lösung wurde dreimal mit glei chen Volumina Chloroform und hierauf zwei mal mit gleichen Volumina Butanol extrahiert. Die Butanollösungen wurden mit wenig Was ser zurückgewaschen, worauf die Waschwasser der wässrigen Hauptlösung zugesetzt wurden. Dieser wässrige Extrakt wurde hierauf mittels festem Natri-Lunbiearbonat auf ein pl, von <B>7,5</B> gestellt und. dreimal mit einem Butanol- Phenol <B>-</B> Gemisch (Volumenverhältnis<B>3 : 1)</B> extrahiert.
Die im Butanol-Phenol-Extrakt enthaltene Wirksubstanz wurde in wässrige Lösung über geführt, indem<B>5</B> Volumina Diäthyläther zu gesetzt wurden und die Phenol-Äther-Schieht mit W asser gewaschen wurde. Das Phenol wurde durch weiteres Waschen mit Äther voll ständig aus der wässrigen Lösung entfernt,. Die schliesslich erhaltene Lösung, welche die Wirksubstanz enthielt, wies eine hellbraune Farbe auf. Der grösste Teil der gefärbten Verunreinigungen war durch die Extraktion entfernt worden.
Vor der Behandlung mit salpetriger Säure wies der Extrakt eine der Menge von 665"v Vitamin BI2 entsprechende Wirksamkeit auf und enthielt 2,43<B>g</B> feste Bestandteile. Nach der Behandlung wies er eine der Menge von <B>650 y</B> Vitamin B12 entsprechende Wirksam keit auf und enthielt<B>0,35 g f</B> este Bestandteile. Die Vitamin-B,2-Wirksamkeit wurde mittels des Alikroorganismus Lactobacilltis laetis Dor- ner bestimmt.
<I>Beispiel 2:</I> <B>25</B> em3 einer Wirksubstanzlösung, die durch teilweise Reinigung einer durch Züeh- tuÜg des Organismus Streptomyee.9 griseLis er haltenen Kultur hergestellt worden war, wurde mit Eisessig auf pH 4 eingestellt und mit<B>3</B> eins gesättigter Natriumnitritlösung versetzt.
Das Gemisch wurde während<B>15</B> Minuten bei Rauintemperattir stehen gelassen und hierauf dreimal mit gleichen Volumina Butanol extra hiert, wobei das Butanol mit wenig Wasser 7urückgewaschen wurde, -um Verluste an Wirksubstanz ni verhindern. Die wässrige Lösung wurde hierauf mittels Natriumbiear- bonat. auf ein pu von<B>7,3</B> eingestellt und drei mal mit Butanol-Phenol (Vollinienverhältnis <B>3 : 1)</B> extrahiert.
Die phenolische Schicht wurde mit<B>5</B> Volumina Diäthyläther verdünnt, worauf das Gemisch mit kleinen Mengen Was ser extrahiert wurde. Die vereinigten wäss- rigen Lösungen wurden<B>'</B> schliesslich mit Di- äthyläther extrahiert, um die letzten Spuren des Phenols zu entfernen. T'or der Extraktion wies die Lös Ling eine der Menge von<B>487 y</B> Vitamin B12 entspre- ehende -Wirksamkeit auf und enthielt 1,22<B>g</B> feste Bestandteile.
Nach der Behandlung mit salpetriger Säure und der Extraktion mit Bu- tanol und Phenol wies die Lösung eine der Menge von 4501 Vitamin B12 entsprechende Wirksamkeit auf und enthielt<B>0,76 g</B> feste Bestandteile. Die Vitamin-B12-Wirksamkeit <B>50</B> wurde mittels des Organismus Laetobaeillus laetis Dorner bestimmt.
<I>Beispiel<B>3:</B></I> <B>100</B> ems einer Leberextraktfraktion, die<B>20,3</B> feste Bestandteile enthielt und eine der Menge von<B>8000 y</B> Vitamin B12 entsprechende Wirk samkeit aufwies, wurde mit 4<B>g</B> Natriumnitrit und konz. Salzsäure bei pl, 4 behandelt und während<B>1</B> Stunde leicht erwärmt. Die Lösung wurde dann auf p.H <B>3</B> angesäuert und mit 4 gleichen Volumina n-B-Litanol extrahiert.
Die Extrakte wurden mit' kleinen Mengen Was ser zurückgewaschen und die Wasehwasser mit der wässrigen Hauptschicht vereinigt. Diese Lösung wurde hierauf neutra'lisiert -Lin(1 dreimal mit 11/2 Volumina eines Gemische- von Phenol und Butanol <B>(1</B> :2) extrahiert. Die Extrakte wurden mit mehreren Volumina Äther verdünnt, worauf die Wirksubstanz durch Extr aktion mit kleinen Mengen Wasser zurückgewonnen wurde.
Das Produkt enthielt nur <B>1,77 g</B> feste Be standteile und wies eine der Menge von 4000"" Vitamin BI2 entsprechende Wirksamkeit auf. <I>Beispiel 4:</I> <B>25</B> eins einer Lösung von Wirksubstanz, die durch teilweise Reinigung einer durch Züehtung des Organismus Streptomyees griseu-, erhaltenen Kultur hergestellt worden war, wurde mit Eisessig auf pi, 4 angesäuert und mit<B>3</B> em3 gesättigter Natriumnitritlösung ver setzt.
Diese Lösung wurde hierauf dreimal mit einem Gemisch von Butanol und Phenol (Volumenverhältnis<B>3 : 1)</B> extrahiert, worauf die phenolische Schicht mit<B>5</B> Volumina Di- äthyläther verdünnt und das Gemisch mit kleinen Mengen Wasser extrahiert wurde. Schliesslich -wurden die vereinigten wässrigen Lösungen mit Diäthyläther extrahiert, um die letzten Spuren von Phenol zu entfernen.
Vor der Extraktion enthielt die Lösung 1,22<B>g</B> fesie Bestandteile und wies eine der Menge von 487<B>y</B> Vitamin B12 entsprechende Wirksamkeit auf. Nach der Behandlung mit salpetriger Säure und der Extraktion mit Bu- tanol und Phenol enthielt die Lösung<B>0,89 g</B> feste Bestandteile und wies eine der Menge von 437", VitaminB12 entsprechende Wirk samkeit auf. Die Vitamin-B,2-Wirksamkeit wurde mittels Laetobaeillus laetis Dorner be stimmt.
<I>Beispiel<B>5:</B></I> <B>50</B> mg einer Wirksubstanzlösung, die durch teilweise Reinigung einer durch Züehtung des Organismus Streptomyees griseus erhaltenen Kultur hergestellt worden war, wurde mit Eisessig auf pl, 4 angesäuert und mit<B>1,5 -,</B> Natriumnitrit in Form einer gesättigten Lö sung versetzt. Das Gemisch wurde während <B>5</B> Minuten auf <B>800 C</B> erhitzt und dann wäh rend 20 Minuten abkühlen gelassen.
Das p", wurde mit festem Natriumbiearbonat auf<B>7,3</B> eingestellt, worauf die Lösung dreimal mit Butanol-Phenol (Volumenverhältnis<B>3 : 1)</B> extrahiert wurde. Die phenolische Schicht wurde mit<B>5</B> Volumina Diäthyläther verdünnt, worauf das Gemiseh mehrere Male mit kleinen Mengen Wasser extrahiert wurde. Sehliessli eh wurden die vereinigten wässrigen Portionen mit Diäthylät.her extrahiert, um die letzten Spuren von Phenol züi entfernen.
Die Ausgangslösung wies vor der Behand lung mit salpetriger Säure und mit, Butanol- Phenol eine der Menge von<B>500 y</B> Vitamin B12 entspreehende Wirksamkeit auf Lind enthielt <B>5,6 g</B> feste Bestandteile. Naeh der Reinigung wies die Lösung eine der Menge von 450<B>y</B> Vi tamin B12 entspreehende Wirksamkeit auf und enthielt 1,47<B>g</B> feste Bestandteile.
Die Vitamin-B12-Wirksamkeit -wurde mittels des Organismus Laetobaeillus laetis Dorner be stimmt.
<I>Beispiel<B>6:</B></I> <B>300</B> ems durch Kultivierung von Strepto- invees griseus erhaltene rohe Flüssigkeit mit einem Gehalt von<B>23,5 g</B> festen Bestandteilen und einer der Menge von etwa 24<B>y</B> Vitamin Bl#_, entspreehenden Wirksamkeit wurde bei einem 1)j-, von 4 in Gegenwart von 12<B>g</B> l#,"atriumnitrit auf<B>701 C</B> erhitzt, während<B>5</B> Minuten auf <B>700</B> C gehalten und dann abgekühlt.
Die Lö sung wurde auf p,1 <B>7</B> eingestellt und mit<B>3</B> gleichen Volumina eines Gemisches von Phenol und Benzol<B>(1</B> .3) extrahiert. Den vereinig ten organisehen Schichten wurden 2 Volumina Benzol zugesetzt, worauf das Gemisch mit mehreren Portionen Wasser erschöpfend ex trahiert wurde.
Die kombinierten wässrigen Extrakte enthielten insgesamt<B>5,15 g</B> feste Be standteile (das heisst etwa 221/o des anfäng lichen Feststoffgehaltes) -und wiesen eine der Menge von 20,1<B>y</B> Vitamin B12 entsprechende Wirksamkeit auf (das heisst etwa 85% der anfängliehen Wirksamkeit).
<I>Beispiel<B>7:</B></I> <B>300</B> ems dureh Kultivierang von Strepto- myces grise-Lis erhaltene rohe Flüssigkeit, die <B>23,5 g</B> feste Bestandteile enthielt und eine der Menge von etwa<B>24y</B> Vitamin B12 ent sprechende Wirksamkeit aufwies, wurden zu sammen mit<B>9-,4g</B> Natri-timnifrit während <B>9-0</B> Minuten bei einem pl, von 4 bei Raum temperatur stehen gelassen. Die Lösung wurde hierauf in der in Beispiel<B>6</B> beschriebenen Weise behandelt.
Der Gesamtleststoffgehalt der zuletzt erhaltenen -wässri-en Extrakte be trug 3,4<B>g</B> (das heisst 14,4a/o des anfänglichen Peststoffgehaltes). Die Vitamin-B,2-Wirk- samkeit der vereinigten Extrakte entspraeh 83% der anfänglichen Wirksamkeit.