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Verfahren zur Reinigung von Vitamin B12 enthaltenden Konzentraten
Gegenstand
der Erfindung bildet ein Verfahren zur Reinigung von Konzentraten, die Vitamine
der B12-Gruppe enthalten, auf dem Wege über phenolhaltige Solventien.
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Das Verfahren zur Reinigung von Vitaminen der Bj2-Gruppe sieht die
Überführung der Vitamine aus einer organischen in eine wäßrige Phase vor. Zur Überführung
der Vitamine der Bl2-Gruppe aus einer wäßrigen Lösung in eine organische Phase hat
man wiederholt von der Beobachtung Gebrauch gemacht, daß Phenol oder alkylierte
Phenole die Eigenschaft besitzen, die Vitamine der Bç2-Gruppe in einem »apolaren«
Lösungsmittel, wie z. B. Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Benzol usw., löslich
zu machen und sie auf diese Weise aus einer wäßrigen Lösung in eine organische Phase
überzuführen. Aus dieser Phase müssen dann die Vitamine der B,,'Gruppe zwecks weiterer
Reinigung ausgefällt oder wieder in eine wäßrige Phase übergeführt werden, wobei
zu bemerken ist, daß der Ausdruck »apolar« nicht ganz zutreffend angewandt worden
ist, weil z. B. Chloroform eine polare Verbindung ist.
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Die Überführung der Vitamine der Bç2-Gruppe aus phenolhaltigen Medien
in die wäßrige Phase geschieht bisher ausschließlich entweder durch Zusatz großer
Mengen von Flüssigkeiten, die als solche die Vitamine der Bl2-Gruppe nicht lösen
und zugleich mit Wasser nicht mischbar sind, wie z. B.
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Äther, Pletroläther, Chloroform oder aber durch Entfernen des Phenols
durch Wasserdampfdestillation.
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Allen diesen Methoden haften noch mancherlei Nachteile an. So mußte
man, um die Vitamine der
Bl2-Gruppe aus der organischen Phase zu
verdrängen und in die wäßrige Phase überzutrei,ben, nach den bisherigen Verfahren
stets sehr große Mengen von den genannten Flüssigkeiten verwenden, meist mehr als
das Volumen der organischen Phase.
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Es wurde nun gefunden, daß die -den bisherigen Methoden anhaftenden
Mängel durch das erfindungsgemäße Verfahren beseitigt werden können.
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Dieses beruht auf der überraschenden Beobachtung, daß die Vitamine
der Bt2-Gruppe ganz allgemein aus den phenolhaltigen Lösungsmitteln bzw. Lösungsmittelgemitschen
durch Zusatz sehr geringer Mengen gewisser sauerstoffhaltiger polarer Stoffe glatt
verdrängt und in die wäßrige Phase übergeführt werden können.
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Dies wird durch folgende Beispiele verdeutlicht: Man geht von einem
Konzentrat aus, das im Verlauf der Reinigung der Vitamine der Bt2-Gruppe aus einem
natürlichen Substrat erhalten wurde.
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Wird dieses Konzentrat mittels Trichloräthylen + p-Chlorphenol extrahiert,
so erhält man z.B.
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100 ccm Extrakt, der neben verschiedenen Verunreinigungen aus 20°/o
p-Chlorphenol in Trichloräthylen mit 7,5 bis 10 mg Vitamin B12 besteht. Zu diesem
Extrakt werden 50 ccm Wasser zugesetzt.
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In dem so entstehenden Zweiphasensystem befinden sich die Vitamine
der B12-Gruppe ausschließlich in der organischen Phase, während die wäßrige Phase
völlig farblos ist und praktisch keine Vitamine der Bj2-Gruppe enthält. Diese Mischung
wird nun mit einem der folgenden Stoffe- in den angeführten Mengen, stets bezogen
auf 100 ccm der organischen Phase, versetzt und geschüttelt: 3,5 ccm Äthylacetat,
5,occm Äther, 5,occm Dioxan, 5,0 ccm Aceton, 6,o ccm- Methyläthylketon, 7,5 ccm
n-Butanol, 7,5 ccm Amylalkohol, I5,0 ccm Methanol. Föllen gehen -die Vitamine der
12 In allen Gruppe schlagartig und praktisch quantitativ in die wäßrige Phase über.
Die Wirkung ist sehr instruktiv und überraschend. Da die sonstigen gefärbten Verunreinigungen
in der organischen Phase zurückbleiben, ist die wäßrige Lösung intensiv und reinrot
gefärbt. Hiervon kann man sich auch leicht durch Aufnahme des Absorptionsspektrums
überzeugen.
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6 Es versteht sich von selbst, daß die in del-obigen Tabelle angeführten
Zahlen-nur einen Anhaltspunkt vermitteln und sowohl nach oben wie auch nach unten
lin gewissen Grenzen überschritten werden können. Der Zusatz polarer sauerstoffhaltiger
Stoffe zu dem Zweiphasensystem Wasser-Kohlenwasserstoff + Phenolkörper verschiebt
den. Verteilungskoeffizienten der Vitamine der Bj2-Gruppe zugunsten des Wassers
bzw. erhöht die Löslichkeit der Vitamine der Bl2-Gruppe im Wasser. Je nachdem, ob
man mehr oder-weniger an sauerstoffhaltigem polarem Stoff zusetzt, wird der Verteilungskoeffizient
mehr oder weniger verschoben, was wieder - zur Folge hat, daß man bei der anschließenden
Extraktion der Vitamine der Bt2-Gruppe mit Wasser mit mehr oder weniger häufigen
Ausschüttelungen auskommt.
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Die Bedeutung des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Reinigung
der Vitamine der B12-Gruppe wird besonders deutlich, wenn man das erfindungsgemäße
Verfahren und die nach den bisherigen Verfahren anzuwendende Arbeitsweise vergleicht.
Ein ähnlicher Effekt hinsichtlich der Überführung der Vitamine der Bl2-Gruppe aus
der organischen in die wäßrige Phase läßt sich nämlich nach den bereits bekannten
Verfahren erst durch Zusatz des gleichen Volumens von Trichloräthylen, ,hloroform,
Tetrachlorkohlenstoff, Schwefelkohlenstoff oder eines etwas geringeren Volumens
an Benzol usw. erzielen, also in obigem Beispiel erst durch Zusatz von mindestens
75 bis 100 ccm Lösungsmittel. Der Unterschied ist mithin außerordentlich deutlich.
Während nämlich die bei den bisher bekanntgewordenen Verfahren angewendeten Lösungsmittel
lediglich- die Funktion haben, die phenolhaltige organische Phase so weit zu verdünnen,
daß das Phenol seine Eigenschaft verliert, die Vitamine der Bt2-Gruppe in der organischen
Phase zu halten, tritt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem nicht die Verdünnung,
sondern die polaren Zusätze eine entscheidende Rolle spielen, ein völlig neuartiger
Effekt ein, der eine sehr beträchtliche Einsparung an Verdrängungsmitteln bedingt.
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Zur Abgrenzung von den bisher bekanntgewordenen Verfahren sei noch
auf folgendes hingewiesen: Unter den in der obigen Aufstellung genannten polaren
Stoffen wurde bisher lediglich Äther zur Überführung der Vitamine der Bt2-Gruppe
in die wäßrige Phase verwendet. In diesem Falle wurde aber zum Unterschied von dem
erfindungsgemäßen Verfahren vor Anwendung des- äther der eigentliche Phenolträger,
nämlich Benzol, beseitigt.
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Ferner wurde ein zehnfaches Volumen des Ethers angewendet, also im
gLeichen-Sinne wie bei einem »apolaren« Medium, nämlich zum Verdünnen des Phenols,
um es auf diese Weise im Hinblick auf sein Lösungsvermögen für die Vitamine der
B32-Gruppe unwirksam zu machen. Diese Anwendung entspricht daher weder dem Sinne
noch dem Umfang nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, denn dieses beruht auf der
erstmaligen Erkenntnis, daß die Wirkung des Äthers, wie auch der anderen, obengenannten
polaren Medien, - in zderenv igenschaft besteht, - -mit Phenolen; Solvate bzw: Komplexe
zu bilden, die die Vitamine der B>2-Gruppe nicht mehr zu lösen vermögen.
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Die in der obigen Tabelle angeführten Mengen an sauerstoffhaltigen
polaren Stoffen verursachen in Abwesenheit von Wasser bereits die Bildung einer
die Vitamine der B12-Gruppe ,enthaltenden Ausflockung in den phenol- oder phenolderivathaltigen
Solventien. Ein geringer, weiterer Zusatz an Verdrängungsmitteln kann zur völligen
Ausfällung der Vitamine der Bt2-Gruppe in der organischen Phase führen; dies trifft
z: B. für Ketone, Ester, Äther u. dgl. zu, also für jene polaren Stoffe, die die
Vitamine der Bf2-Gruppe nicht zu lösen vermögen. - Alkohole verursachen in den oben
angeführten Mengen zwar auch eine Ausfiockung, die
aber nicht quantitativ
ist. Ob durch den Zusatz eines geeigneten sauerstoffhaltigen polaren Stoffes zu
einer die Vitamine der B12-Gruppe enthaltenden Mischung von Phenol oder einem Phenolderivat
mit einem geeigneten Lösungsmittel eine quantitative oder nur teilweise Auflockerung
der Vitamine der Bl2-Gruppe in Ider organischen Phase stattfindet, ist an sich belanglos.
Auf jeden Fall wird aber durch das erfindungsgemäße Verfahren die Löslichkeit der
Vitamine der Bj2-Gruppe in dem betreffenden Medium so weit herabgesetzt, daß sie
ohne weiteres mit Wasser extrahiert werden können.
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Die theoretische Erklärung der Wirkungsweise der genannten sauerstoffhaltigen
polaren Stoffe besteht wohl darin, daß Phenol mit ihnen Solvate bzw. Komplexe zu
bilden vermag. Ein derartiges, mit gewissen polaren Molekülen beladenes Phenolmolekül
besitzt offenbar nicht mehr das Vermögen, als Träger für Vitamin Bi2 zu dienen.
Infolgedessen besitzt Phenol nicht die Fähigkeit, polaren Medien, die nicht Lösungsmittel
für Vitamin Bj2 sind, ein Lösungsvermögen für Vitamin Bt2 zu erteilen.
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Ebensowenig besitzt Phenol das Vermögen, in polaren Medien, die Vitamine
Bt2 zu lösen vermögen, die Löslichkeit für dieses zu erhöhen, falls das Molekülverhältnis
Phenol zu polares Medium kleiner ist als I. Polare Medien, die abnormal hohe Zusätze
an Phenol enthalten, besitzen selbstverständlich das Vermögen, Vitamin B,2 zu lösen
und es aus Wasser zu extrahieren. Diese Beobachtungen ,stehen in guter Übereinstimmung
mit der Feststellung, daß z.B. sehr geringe Mengen von Methanol (z. B. 0,5 O/o)
in einer Lösung von Phenol in Chloroform das Absorptionsspektrum des Phenols beträchtlich
verändern. Bereits 2,5 0/0 Methanol in Chloroform bewirken,ldaß das Absorptionsspektrum
des Phenols die gleiche Gestalt annimmt, wie in reinem Methanol. Dies spricht dafür,
daß schon bei diesem geringen Methanolgehalt eine völlige Solvatisierung von Phenol
stattgefunden hat.
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Im folgenden wird die Erfindung an Hand einiger Beispiele näher erläutert.
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Beispiel I 40 ccm einer Lösung, die 2,9 mg Vitamine der Bt2-Gruppe
neben verschiedenen Verunreinigungen in einem Gemisch enthält, das aus 20°/o p-Chlorphenol
in Trichloräthylen, das aus einem Reinigungsprozeß der Vitamine der B12-Gruppe aus
Faulschlamm stammt, besteht und deren Trockensubstanz etwa IO/oig an Vitaminen der
Bj2-Gruppe ist, werden mit 2 ccm n-Butanol versetzt und viermal mit je 10 ccm Wasser
ausgeschüttelt. Die vereinigten intensiv rotgefärbten wäßrigen Extrakte werden zweimal
mit je 10 ccm n-Butanol und dreimal mit je I5 ccm Äther gewaschen. Man erhält eine
rein rotgefärbte wäßrige Lösung, die 2,8 mg Vitamine der Bj2-Gruppe enthält. In
der in dieser Lösung befindlichen Trockensubstanz wurden die Vitamine der B12-Gruppe
auf etwa 6 0/o angereichert.
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Beispiel 2 35 ccm eines aus dem gleichen Ausgangsmaterial, -wie in
Beispiel 1, stammenden Vitamin B12-Konzentrates, bestehend aus einem Gemisch von
10 0/o p-Chlorphenol in Trichloräthylen, mit einem Gehalt von 5,2 mg Vitaminen der
Bl2-Gruppe werden mit 3,5 ccm Methyläthylketon versetzt, wobei ein karminroter flockiger
Niederschlag ausfällt. Dieser wird abgetrennt, mit etwas Trichloräthylen gewaschen
und anschließend in 5 ccm Wasser gelöst.
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Die anfallende Lösung kann mit Vorteil zur weiteren Reinigung und
Kristallisation der Vitamine der Bl2-Gruppe benutzt werden.