DE69726612T2

DE69726612T2 - Ein neues verfahren zur herstellung von stabilisierter carnosinsäure in hoher kontentration

Info

Publication number: DE69726612T2
Application number: DE69726612T
Authority: DE
Inventors: Gil Ben-Yosef; Arkady Garbar
Original assignee: Lycored Natural Products Industries Ltd
Current assignee: Lycored Ltd
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1997-04-16
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2017-04-17
Also published as: EP0975572A1; ATE255556T1; CA2286801C; NO994852L; DE69726612D1; CA2286801A1; NO994852D0; IL132370A0; ES2210511T3; BR9714605A; WO1998046554A1; AU726687B2; US6335373B1; JP2001518072A; AU2305997A; NO314627B1; EP0975572B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein verbessertes Verfahren für die Extraktion eines wichtigen biochemischen Reagens, Carnosinsäure. Die vorliegende Erfindung beschreibt genauer ein verbessertes Verfahren für die Extraktion von Carnosinsäure aus Rosmarinblättern, ein Verfahren zum Stabilisieren der Säure vor Zersetzung und ein Verfahren zur Herstellung der Säure in hoher Konzentration. Carnosinsäure ist charakterisiert durch seine antioxidative Funktion und ist der wirksamste Inhaltsstoff bei der Prävention der Oxidation von Fettsäuren. Von Linde wurde im Jahr 1962 herausgefunden, dass das biochemische Reagens in slavia officinalis existiert, und von Wenkert im Jahr 1965, dass es in rosmarinus offinalis existiert. Später wurde herausgefunden, dass die Carnosinsäure auch in anderen Pflanzen der gleichen Familie wie z. B. s. canariesis, s. sclarea und s. triloban. existiert. Carnosinsäure ist Phenolditerpen (C₂₀H₂₈O₄), das durch Brieskorn und Domling im Jahr 1964 als sehr wirksames Antioxidans identifiziert wurde. Von seiner antibiotischen Wirkung gegen Stephilococus und Dentalkaries wurde ebenfalls berichtet.
Zahlreiche Verfahren für die Extraktion der Carnosinsäure sind beschrieben in U.S. Patent Nummer 5,256,700, deren Inhalte durch deren Erwähnung eingeschlossen sind. Weitere Verfahren werden in den folgenden U.S. Patenten gefunden: 2,124,706; 4,012,531; 4,363,823; und 4,450,097 und in WO 93/06190.
Insbesondere offenbart WO 93/06190 ein Verfahren für die Herstellung von einer Oleoresinzusammensetzung. Die beschriebenen Extraktionslösungen können einen weiten Bereich an Konzentrationen in Ethanol haben. Wie WO 93/06190 erklärt, kann nicht jede Konzentration von Alkohol erfolgreich verwendet werden, um Carnosinsäure zu extrahieren, entweder wegen der niedrigen Löslichkeit des Produkts in einer niederen Konzentration von Alkohol (Seite 9, letzter Paragraph, Zeilen 1– 6) oder wegen der unerwünschten Extraktion von Unreinheiten bei einer hohen Konzentration an Alkohol (Seite 10, Zeilen 5–8).
ZIELE DER ERFINDUNG
Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, um Carnosinsäure aus Rosmarinblättern zu extrahieren. Es ist ebenfalls das Ziel der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, um Carnosinsäure aus Rosmarinblättern zu extrahieren, das die Carnosinsäure vor der Zersetzung stabilisiert. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, das sehr hohe Konzentrationen an Carnosinsäure liefert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird ein neues Verfahren bereitgestellt, um Carnosinsäure aus Rosmarinblättern zu extrahieren, das das Behandeln der Rosmarinblätter mit einer wässerigen Lösung eines Niederalkylalkohols in der Anwesenheit einer wasserlöslichen Säure umfaßt, und weiterhin wahlweise das Reinigen der Carnosinsäure durch Extraktion.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Niederalkylalkohole, die als für die vorliegende Erfindung geeignet gefundenen wurden, werden gewählt aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Pentanol und Mischungen dieser, wobei Ethanol bevorzugt ist.
Die Niederalkylalkohole sind in dem Extraktionsmedium anwesend in einer Konzentration von 40% bis 70% Alkohol, vorzugsweise 55% bis 65% Alkohol und am meisten bevorzugt 60% Alkohol. Die Extraktion unter Verwendung von wässerigen Niederalkylalkoholen kann in einem oder mehreren Schritten ausgeführt werden.
Die wasserlöslichen Säuren, die als für die vorliegende Erfindung geeignet gefunden wurden, werden gewählt aus der Gruppe bestehend aus Phosphorsäure und Ascorbinsäure, Chlorwasserstoffsäure, Essigsäure, Citronensäure und Mischungen dieser, wobei Phosphorsäure bevorzugt ist. Die Säuren sind anwesend in einer Konzentration von 0,1% bis 30%, vorzugsweise 0,1 bis 2%. Die Carnosinsäure wird aus den wässerigen alkoholischen Lösungen durch Behandeln mit pflanzlichem Öl entfernt, wobei fast jede Sorte von pflanzlichem Öl allein oder in Kombination mit einem anderen pflanzlichem Öl verwendet werden kann.
Die Carnosinsäure, die in dem pflanzlichem Öl aufgelöst ist, kann weiter konzentriert werden durch Extraktion unter Verwendung eines Puffers von Dinatriumtetraborat bei einem pH Bereich von 7,5 bis 9,5, vorzugsweise 8,5 bis 9,5, um Carnosinsäure in der Konzentration von so viel wie 80% bis 90% zu liefern.
Beispiele 1, 2, 6 bis 8 zeigen das Verfahren der Extraktion mit Alkylalkohol und die erhaltene gute Ausbeute. Beispiele 3 bis 5 sind Vergleichsbeispiele, die die niedrigere Ausbeute zeigen, die unter Verwendung von anderen organischen Lösungsmitteln erhalten wird.
Beispiel 9 zusammen mit Tabelle 1 zeigen den Effekt der Säure auf die Stabilität der Carnosinsäure und die Vorteile von Ascorbinsäure und Phosphorsäure, insbesondere von Phosphorsäure.
Beispiel 10 zeigt, wie die Konzentrationen von Carnosinsäure durch aufeinanderfolgende Extraktion in der Anwesenheit eines Puffers von Dinatriumtetraborat erhöht werden können.
Die vorliegende Erfindung beschreibt insbesondere die selektive Extraktion von Carnosinsäure direkt aus der Pflanze, unter Verwendung einer sauren polaren Lösung, die Wasser, Niederalkylalkohol und Säure enthält. Die Verwendung dieser besonderen Extraktionslösung ist sehr nützlich in Bezug auf die folgenden Ergebnisse: a) Hohe Ausbeute von Carnosinsäure in dem Konzentrat. b) Die Extraktion der Carnosinsäure ist sehr selektiv. Sehr wenige andere Chemikalien, wie beispielsweise pro-Oxidationsmittel aus den Pflanzen werden extrahiert. c) Eine weitere Oxidation der Carnosinsäure zu Carnosol oder in dem Extraktionsverfahren wird verhindert. Zusätzlich ist die Carnosinsäure in dieser Lösung stabil für einen Zeitraum von mehr als 24 Stunden. d) Der hohe Verteilungskoeffizient der Extraktionslösung resultiert in einem effektiven Extraktionsverfahren von Carnosinsäure. Nach der Extraktion wandert die Carnosinsäure zur apolaren Phase als ein Ergebnis der Veränderung in dem Verteilungskoeffizienten der Lösung, da der Alkohol verdampft wird. Eine Kontrolle der Alkoholkonzentration in der Lösung befähigt die unerwünschten Fraktionen, daß diese zu der polaren Phase wandern. Als eine apolare Phase kann man eine nicht-Carnosinsäure verwenden. Alternativ kann die polare Phase die flüchtigen Lösungsmittel von Anspruch 1 sein, wodurch die Kristallisation der Carnosinsäure ermöglicht wird.
Während die Erfindung nun in Verbindung mit bevorzugten Ausführungsformen in den folgenden Beispielen beschrieben wird, wird es verstanden werden, dass es nicht beabsichtigt ist, die Erfindung auf diese besonderen Ausführungsformen zu begrenzen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Zu 1,6 Liter von Ethanol (60%), enthaltend 1% Phosphorsäure, wurden 200 gr trockene und fein vermahlene Rosmarinblätter hinzugefügt, die eine Konzentration von 4,3% Carnosinsäure hatten. Die Extraktion wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. 1,26 Liter Extrakt wurden durch Vakuumfiltration der Biomasse erhalten, 45 gr von pflanzlichem Öl wurden hinzugefügt und von 0,86 Liter Alkohol verdampft. Die zwei Phasen wurden getrennt und das restliche Wasser und der Alkohol, der in der Ölphase anwesend ist (ca. 30% Alkohol) wurden durch eine Vakuumpumpe entfernt, was 56 gr einer braunen Flüssigkeit ergab. Die Carnosinsäurekonzentration ist 10,3% und die Gesamtausbeute des Verfahrens ist 67,1%.
Vergleichsbeispiel 2
Zu 1,6 Liter absolutem Ethanol, enthaltend 1% Phosphorsäure, wurden 200 gr trockene und fein vermahlene Rosmarinblätter hinzugefügt, die eine Konzentration von 4,3% Carnosinsäure hatten. Die Extraktion wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. 1,29 Liter Extrakt wurden durch Vakuumfiltration der Biomasse erhalten, 45 gr von pflanzlichem Öl wurden hinzugefügt und das Konzentrat wurde verdampft. Restliches Lösungsmittel wurde durch eine Vakuumpumpe entfernt, so daß 83,4 gr einer viskosen dunkelgrünen Paste erhalten wurden. Die Carnosinsäurekonzentration ist 7,1% und die Gesamtausbeute des Verfahrens ist 68,6%.
Beispiel 3
Zu 1,6 Liter Hexan wurden 200 gr trockene und fein vermahlene Rosmarinblätter hinzugefügt, die eine Konzentration von 4,3% Carnosinsäure hatten. Die Extraktion wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. 1,31 Liter Extrakt wurden durch Vakuumfiltration der Biomasse erhalten, 45 gr von pflanzlichem Öl wurden hinzugefügt und das Hexan wurde verdampft. Restliches Lösungsmittel wurde durch eine Vakuumpumpe entfernt, so daß 50,5 gr einer dunkelgrünen Flüssigkeit erhalten wurden. Die Carnosinsäurekonzentration ist 2,1% und die Gesamtausbeute des Verfahrens ist 12,5%.
Beispiel 4
Zu 1,6 Liter Benzen wurden 200 gr trockene und fein vermahlene Rosmarinblätter hinzugefügt, die eine Konzentration von 4,3% Carnosinsäure hatten. Die Extraktion wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. 1,28 Liter Extrakt wurden durch Vakuumfiltration der Biomasse erhalten, 45 gr von pflanzlichem Öl wurden hinzugefügt und das Benzen wurde verdampft. Restliches Lösungsmittel wurde durch eine Vakuumpumpe entfernt, so daß 54,6 gr einer dunkelgrünen Flüssigkeit erhalten wurden. Die Carnosinsäurekonzentration ist 2,8% und die Gesamtausbeute des Verfahrens ist 17,8%.
Beispiel 5
Zu 1,6 Liter Ethylacetat wurden 200 gr trockene und fein vermahlene Rosmarinblätter hinzugefügt, die eine Konzentration von 4,3% Carnosinsäure hatten. Die Extraktion wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. 1,24 Liter Extrakt wurden durch Vakuumfiltration der Biomasse erhalten, 45 gr von pflanzlichem Öl wurden hinzugefügt und das Ethylacetat wurde verdampft. Restliches Lösungsmittel wurde durch eine Vakuumpumpe entfernt, so daß 71,3 gr einer dunkelgrünen viskosen Paste erhalten wurden. Die Carnosinsäurekonzentration ist 8,5% und die Gesamtausbeute des Verfahrens ist 70,4%.
Beispiel 6
Zu 1,6 Liter Ethanol (73%), enthaltend 1% Phosphorsäure, wurden 200 gr trockene und fein vermahlene Rosmarinblätter hinzugefügt, die eine Konzentration von 4,3% Carnosinsäure hatten. Die Extraktion wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. 1,28 Liter Extrakt wurden durch Vakuumfiltration der Biomasse erhalten, 45 gr von pflanzlichem Öl wurden hinzugefügt und 1,1 Liter Alkohol verdampfte. Die zwei Phasen wurden getrennt und das restliche Wasser und Alkohol, der in der Ölphase anwesend war (ca. 30% Alkohol), wurden durch eine Vakuumpumpe entfernt, was zu 62,2 gr einer braunen Flüssigkeit führte. Die Carnosinsäurekonzentration ist 9,5% und die Gesamtausbeute des Verfahrens ist 68,7%.
Beispiel 7
Zu 1,6 Litern Ethanol (50%), enthaltend 1% Phosphorsäure, wurden 200 gr trockene und fein vermahlene Rosmarinblätter hinzugefügt, die eine Konzentration von 4,3% Carnosinsäure hatten. Die Extraktion wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. 1,23 Liter Extrakt wurden durch Vakuumfiltration der Biomasse erhalten, 45 gr von pflanzlichem Öl wurde hinzugefügt und 0,49 Liter Alkohol verdampfte. Die zwei Phasen wurden getrennt und das restliche Wasser und Alkohol, der in der Ölphase anwesend war (ca. 30% Alkohol), wurden durch eine Vakuumpumpe entfernt, was zu 53,1 gr einer braunen Flüssigkeit führte. Die Carnosinsäurekonzentration ist 8,9% und die Gesamtausbeute des Verfahrens ist 54,9%.
Beispiel 8
Zu 1,6 Liter Ethanol (40%), enthaltend 1% Phosphorsäure, wurden 200 gr trockene und fein vermahlene Rosmarinblätter hinzugefügt, die eine Konzentration von 4,3% Carnosinsäure hatten. Die Extraktion wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. 1,19 Liter Extrakt wurde durch Vakuumfiltration der Biomasse erhalten, 45 gr von pflanzlichem Öl wurden hinzugefügt und 0,24 Liter Alkohol verdampfte. Die zwei Phasen wurden getrennt und das restliche Wasser und Alkohol, der in der Ölphase anwesend war (ca. 30% Alkohol) wurden durch eine Vakuumpumpe entfernt, was zu 49,2 gr einer braunen Flüssigkeit führte. Die Carnosinsäurekonzentration ist 4,0% und die Gesamtausbeute des Verfahrens ist 22,9%.
Beispiel 9
Stabilisierung von Carnosinsäure für einen Zeitraum von mehr als 24 Stunden
Zu 4,0 Liter Ethanol (60%) wurden 500 gr rockene und fein vermahlene Rosmarinblätter hinzugefügt, die eine Konzentration von 4,3% Carnosinsäure hatten. Die Extraktion wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. 3,22 Liter Extrakt wurden durch Vakuumfiltration der Biomasse erhalten. Das Konzentrat wurde in 200 ml Anteile geteilt, wobei verschiedene Säuren bei verschiedenen Konzentrationen zu diesen Anteilen hinzugefügt wurden. Alle Anteile wurden in der Dunkelheit gehalten und die Carnosinsäure-Konzentrationsschwankungen der verschiedenen Anteile wurden überprüft. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse, in denen sichtbar wird, daß ein Mangel an Säure zu einer Verminderung von 50% Carnosinsäure führt. Nur unter sauren Bedingungen wurde die Konzentration von Carnosinsäure aufrechterhalten, wobei die optimalen Säuren Phosphorsäure und Ascorbinsäure sind.
Tabelle 1 DER EFFEKT DES PH AUF DIE KONZENTRATION VON CARNOSINSÄURE Konzentration von Carnosinsäure (mg/ml)
Das Aussetzen von Carnosinsäure in einem Extrakt, wenn sie Raumtemperatur und Licht ausgesetzt wurde, verursacht eine merkliche Verminderung in einer Konzentration von Carnosinsäure, wenn der pH des Extrakts über 6 ist.
Beispiel 10
ERHÖHUNG DER KONZENTRATION VON CARNOSINSÄURE
300 gr einer 5% Natriumbicarbonatlösung (pH = 8,16) wurde zu 100 gr eines flüssigen Produkts hinzugefügt, das 4,3% Carnosinsäure enthielt, wie aus den anfänglichen Extraktionen von Rosmarinblättern erhalten, und es wurde für 10 Minuten gerührt.
Die Phasen wurden getrennt und die Wasserphase wurde verworfen. Das Material wurde aus der Ölphase mit 300 gr 0,01 Dinatriumtetraboratpuffer (pH = 9,18) für 20 Min. extrahiert und die Schichten wurden getrennt. Der pH der wässerigen Phase wurde durch Hinzufügen von HCl von 7,96 auf 1,5 erniedrigt. Das erhaltene Präzipitat wurde gefiltert, unter 40°C luftgetrocknet, was zu einem 0,59 gr getrockneten Präzipitat führte, das 70% Carnosinsäure enthielt. Zu der restlichen Ölphase wurden 300 gr 0,01 M Dinatriumtetraboratpuffer (pH = 9,18) hinzugefügt und die Lösung wurde für 20 Min. gerührt. Die Phasen wurden getrennt, wobei der pH der wässerigen Phase durch Hinzufügen von HCl von 7,93 auf 1,52 erndiedrigt wurde. Das erhaltene Präzipitat wurde gefiltert, luftgetrocknet unter 40°, was zu zusätzlichen 1,29 gr getrocknetem Präzipitat führte, das 80% Carnosinsäure enthielt. Zu der restlichen Ölphase wurde 300 gr 0,01 M Dinatriumtetraboratpuffer (pH = 9,18) hinzugefügt und die Lösung wurde für 20 Minuten gerührt. Die Phasen wurden getrennt, wobei der pH der wässerigen Phase durch Hinzufügen von HCl von 8,08 auf 1,5–2 erniedrigt wurde. Das erhaltene Präzipitat wurde gefiltert, luftgetrocknet unter 40°C, was zu einem 1,39 gr getrockneten Präzipitat führte, das 89% Carnosinsäure enthielt. Zu der vorher dreimal extrahierten Ölphase wurden 0,01 M Dinatriumtetraboratpuffer (pH = 9,18) hinzugefügt und die Lösung wurde für 20 Minuten gerührt. Die Phasen wurden getrennt, wobei der pH der wässerigen Lösung durch Hinzufügen von HCl von 8,68 auf 1,5 erniedrigt wurde, und ein Ölpräzipitat wurde erhalten. Die Ausbeute an Carnosinsäure ist 65%.

Claims

Ein Verfahren zur Herstellung von Carnosinsäure aus Rosmarinblättern, das das Behandeln der Blätter mit einer wässerigen Lösung umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung aus 40–73% eines niederen Alkylalkohols besteht, gewählt aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol, Propanol, Pentanol und Mischungen aus diesen und einer wasserlöslichen Säure.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, das die folgenden Schritte umfaßt a) In Kontakt bringen der Rosmarinblätter mit der wässerigen Lösung; b) Abtrennen der festen Phase, die die Blätter enthält, von der wässerigen Lösung; c) Mischen von pflanzlichem Öl in die wässerige Phase; d) Entfernen eines Teils des Alkohols aus der Mischung, die in Schritt c erhalten wurde; e) Trennen des pflanzlichen Öls und der wässerigen Phasen, um eine Ölphase zu erhalten, die Carnosinsäure enthält.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der niedere Alkylalkohol Ethanol ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der niedere Alkylalkohol in der wässerigen Lösung in einer Konzentration von 40% bis 70% anwesend ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 4, worin der niedere Alkylalkohol in der wässerigen Lösung in einer Konzentration von 60% anwesend ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die wasserlösliche Säure gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phosphorsäure, Ascorbinsäure, Salzsäure, Essigsäure, Citronensäure und Mischungen davon.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 6, worin die wasserlösliche Säure Phosphorsäure ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Säure in der wässerigen Lösung in einer Konzentration von 0,1 bis 30% anwesend ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 8, worin die Säure in der wässerigen Lösung in einer Konzentration von 0,1 bis 2% anwesend ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Rosmarinblätter einmal oder in mehreren Schitten mit wässeriger Lösung extrahiert werden.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die wässerige Lösung 55 bis 65% Ethylalkohol in der Anwesenheit von 0,1 bis 2% Phosphorsäure enthält.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die resultierende Lösung von Carnosinsäure weiter behandelt wird mit einer wässerigen Bicarbonatlösung, gefolgt von der Extraktion der resultierenden Ölphase mit einer wässerigen Pufferlösung von Dinatriumtetraborat.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 12, worin der pH der Pufferlösung im Bereich von 7,5 bis 9,5 ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 13, worin der pH der Pufferlösung im Bereich von 8,5 bis 9,5 ist.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 13 und 14, worin die Säure enthaltende Ölphase mit vier getrennten Anteilen von wässeriger Dinatriumtetraboratlösung extrahiert wird.