ITGE20110041A1 - Metodo di ottenimento di acido carnosico e triterpeni, come composti puri o come fitocomplessi arricchiti, da piante della famiglia delle lamiaceae - Google Patents
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Classifications
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Description
DESCRIZIONE dell'Invenzione Industriale dal titolo: "Metodo di ottenimento di acido carnosico e triterpeni, come composti puri o come fitocomplessi arricchiti, da piante della famiglia delle Lamiaceae"
TESTO DELLA DESCRIZIONE
La presente invenzione ha per oggetto un metodo di ottenimento di fitocomplessi arricchiti in acido carnosico, acido carnosico puro e fitocomplessi arricchiti in acidi triterpenici da piante della famiglia delle Lamiaceae, in particolare da Salvia spp. e Rosmarinus spp.
L'invenzione à ̈ anche relativa all'uso di composti e fitocomplessi arricchiti in acido carnosico e fitocomplessi arricchiti in acido oleanolico ed ursolico, ottenuti tramite il procedimento, come agro farmaci e per la preparazione di agrofarmaci.
Molte sostanze ottenute da piante possono infatti mostrare elevata efficacia per il contenimento, ambientalmente sostenibile, di patogeni e parassiti delle piante (Hallahan, D. L. Monoterpenoid Biosynthesis in Glandular Trichomes of Lamiaceae Plants. In Advances in Botanical Research; Hallahan, D. L., Gray, J. C., Callow, J. A., Eds.; Academic Press: San Diego, CA, 2000; Voi. 31, pp 77111) e di conseguenza utili per preparare prodotti utilizzabili in agricoltura.
In particolare oggetto della presente invenzione à ̈ un metodo che consente di ottenere sostanze antiossidanti con un elevato rendimento e con un elevato grado di purezza, in particolare acido carnosico puro o una miscela di composti ossia un fitocomplesso altamente arricchito in acido carnosico.
Il metodo oggetto della presente invenzione consente anche di ottenere un fitocomplesso arricchito di acido ursolico e oleanolico.
L'acido carnosico à ̈ un diterpene fenolico con formula bruta C20H28O4.
E' stato identificato in varie specie del genere Salvia come ad es. Salvia officinalis (H.Linde. Ein neues Diterpen aus Salvia oficinalis L. und eine Notiz zur Konstitution von Pikrosalvin. Helv. Chim Acta 47, 1234-1239, 1962), Salvia canariesis (G. Marreo et al. Semisynthesis of Rosmanol and Its Derivatives. Easy Access to Abietatriene Diterpenes Isolated from thà ̈ Genus Salvia with Biological Activities. J. Nat. Prod. 65, 986-989, 2002), etc. e Rosmarinus officinalis (Wenkert et al. Chemical Artifacts from thà ̈ Family Lamiaceae. J. Org. Chem.
30, 2931-2934, 1965) e risulta particolarmente concentrato a livello fogliare.
Molti altri diterpeni fenolici, con struttura simile all'acido carnosico, sono stati isolati da specie di Salvia e Rosmarinus spp., come ad esempio carnosolo, rosmanolo.
Wenkert et al., 1965 hanno dimostrato che questi composti sono derivati dalla ossidazione dell'acido carnosico.
Questa ossidazione ha luogo in presenza di ossigeno sia dopo la raccolta di rosmarino e salvia nelle foglie lasciate seccare all'aria (può essere dimostrato che le foglie tagliate di fresco non contengono carnosolo) sia quando le foglie sono soggette a estrazione con solventi o quando gli estratti sono soggetti ad operazioni di frazionamento, di arricchimento e di purificazione.
La concentrazione di acido carnosico e di altri composti correlati come il carnosolo à ̈ fortemente dipendente dalle condizioni climatiche (S. Munné-Bosh et al. The Formation of Phenolic Diterpenes in Rosmarinus officinalis L. under Mediterranean climate. Eur. Food Technol. 210, 263-267,2000).
Fitoestratti contenenti acido carnosico sono utilizzati come additivi antiossidanti da aggiungere nelle preparazioni alimentari (Use of rosemary extracts as a food additive The EFSA Journal 2008, 721, 1-3).
Le principali attività dell'acido carnosico sono:
proprietà anticancerogene e antivirali (Extraction of carnosic acid from sage and rosemary with anticarcinogenic and antiviral properties. Aeschbach, Robert; Philippossian, Georges., Societe des Produits Nestle S. A., Switz)(EP 582318),
attività di antiaggregante piastrinico (Antiplatelet activity of carnosic acid, a phenolic diterpene from Rosmarinus officinalis. Lee, Jung-Jin; Jin, Yong-Ri; Lee, Ju-Hyun; Yu, Ji-Yeon; Han, Xiang Hua; Oh, Ki-Wan; Hong, Jin Tae; Kim, Tack-Joong; Yun, Yeo-Pyo. Pianta Medica, 2007, 73(2), 121-127,),
attività antimicrobica (Antioxidant and antimicrobial activity of rosemary extract in chicken frankfurters . Riznar, Klavdija; Celan, Stefan; Knez, Zeljko; Skerget, Mojca; Bauman, Davorin; Glaser, Roman. Journal of Food Science, 2006, 71(7), C425-C429; S. Weckesser et al.Screening of plant extracts for antimicrobial activity against bacteria and yeasts with dermatological relevance, Phytomedicine 14 508-516 (2007),
- attività anti-ulcera (US 6,638,523), attività di promotore della sintesi del fattore di crescita nervoso ("NGF": "Nerve Growth Factor", US 6,391,344),
inibitore dell'assorbimento dei lipidi (Carnosic acid, a new class of lipid absorption inhibitor from sage. Ninomiya, Kiyofumi; Matsuda, Hisashi; Shimoda, Hiroshi; Nishida, Norihisa; Rasajima, Naoki; Yoshino, Tomoe; Morikawa, Toshio; Yoshikawa, Masayuki. Kyoto Pharmaceutical University, Yamashina-ku, Kyoto, Japan. Bioorganic & Medicinal Chemistry Lettere, 2004, 14(8), 1943-1946).
Il composto puro o fitocomplessi estrattivi arricchiti in acido carnosico possono quindi essere utilizzato in preparati farmaceutici, nutraceutici, cosmetici, agrofarmaceutici.
Il brevetto US 6,391,344 prevede la preparazione di un estratto di rosmarino e/o salvia, preferibilmente tramite etanolo o etanolo acquoso, contenente acido carnosico e carnosolo. L'estratto può essere utilizzato come componente di prodotti alimentari o farmaceutici.
Sono note diverse tecniche di ottenimento di acido carnosico da specie vegetali.
Il brevetto US 5,256,700 descrive un processo di estrazione di acido carnosico da salvia e rosmarino che prevede l'utilizzo di un solvente apolare o una miscela di solventi apolari per ottenere un estratto, contenente acido carnosico; adsorbimento selettivo su opportuno supporto solido e successivo desadsorbimento dell'acido con un solvente polare.
La tecnica prevede l'utilizzo di foglie secche di salvia e rosmarino finemente tritate oppure prevede anche la possibilità di utilizzare residui ottenuti dalla distillazione di oli essenziali. In ogni caso l'estrazione fornisce un estratto molto complesso dal quale si giunge all'acido carnosico mediante svariati passaggi successivi di lavorazione.
Il brevetto US 5,859,293 descrive un metodo per estrarre e isolare acido carnosico da piante della famiglia delle Lamiaceae mediante estrazione con un solvente miscibile con acqua, precipitazione e separazione delle impurezze ad un pH basico controllato trattenendo in soluzione l'acido carnosico come sale idrosolubile, precipitazione finale dell'acido carnosico grezzo mediante acidificazione.
Il brevetto US 6,335,373 descrive un metodo per estrarre e isolare acido carnosico da foglie di rosmarino secche tramite alcoli alitatici a basso peso molecolare in presenza di acidi idrosolubili.
L'acido ursolico e l'acido oleanolico hanno mostrato attività epatoprotettiva, antinfiammatoria.
antitumorale, antiperlipidemica, antiulcera e antimicrobica (Jie Liu: Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid. Journal of Ethnopharmacology 49, 1995, 57-68).
L'acido ursolico e oleanolico sono stati identificati come i responsabili dell'attività antiinfiammatoria di Salvia officinalia e Roamarinus officinalia (D. Baricevic et al.: Topical antiinflammatory activity of Salvia officinalia L. leaves: thà ̈ relevance of ursolic acid. Journal of Ethnopharmacology 75, 2001, 125-132; G. Altinier et al.: Characterization of Topical Antiinflammatory Compounds in Roamarinus officinalia L. Journal of Agricultural and Food Chemistry 55, 1718-17232007): questi composti inoltre risultano essere non tossici e presentano numerosi effetti benefici.
Per gli acidi ursolico, oleanolico e loro derivati à ̈ stata descritta anche una attività di disappetenza (antifeedant) verso insetti fitopatogeni (Shukla, Y. N. et al.: Antifeedant activity of ursolic acid isolated from Duboisia myoporoides, Phytotherapy Research, 10, 359-360, 1996; Mallavadhani, Uppuluri V. et al.: Antifeedant activity of some pentacyclic triterpene acide and their fatty acid ester analogs, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 1952-1955, 2003) E' altresì noto l'uso di acido ursolico, acido oleanolico e fitoestratti contenenti detti acidi per la preparazione di prodotti cosmetici (JP 2004091438, EP 1327438, KR 2006044298, WO 2006080768, FR 2000-8758).
I metodi noti di estrazione delle sostanze sopra indicate prevedono l'utilizzo diretto di parti della pianta quali le foglie preventivamente essiccate. Detti metodi consentono di ottenere miscele estrattive molto complesse, ossia composte da una elevata varietà di sostanze. Tale complessità rende più lungo e laborioso il processo di lavorazione per l'ottenimento di acido carnosico puro con conseguente aumento della probabilità della sua ossidazione dal momento che, come già detto in precedenza, l'acido carnosico, come difenolo catecolico, à ̈ un composto molto reattivo, altamente sensibile all'ossidazione.
Anche il processo di essiccazione delle foglie può portare ad una parziale ossidazione dell'acido carnosico, ad esempio, a carnosolo. Tutti questi fattori quindi tendono ad abbassare la resa estrattiva dell'acido carnosico.
E' da notare però che nella forma cristallizzata e purificata il composto presenta una maggiore stabilità .
Grande interesse riveste la possibilità di utilizzare alcuni dei prodotti sopracitati nella lotta a patogeni e parassiti delle piante coltivate ad uso alimentare, agroindustriale e ornamentale La sempre più limitata disponibilità o la completa assenza - nel caso delle cosiddette "colture minori" - di mezzi chimici per la difesa da parassiti e patogeni ha stimolato negli ultimi anni lo sviluppo di soluzioni alternative a quelle chimiche, introducendo, per esempio, mezzi ammissibili in agricoltura biologica (microrganismi antagonisti o iperparassiti, insetti predatori o parassitoidi, prodotti estratti da piante), o tecniche colturali in grado di contenere la diffusione e l'incidenza degli attacchi dei parassiti (ventilazione e riscaldamento degli ambienti di coltivazione), o, ancora, strategie complesse che combinano le tecniche e i mezzi sopra indicati.
Scopo della presente invenzione à ̈ quello di fornire un processo di estrazione, da rosmarino e salvia, che sia, semplice, veloce, economico, che possa essere riprodotto su vasta scala e che permetta di ottenere un fitocomplesso arricchito in acido carnosico, con buona attività antifungina e acido carnosico puro con una elevata resa estrattiva utilizzabili come agrofarmaci naturali nella lotta contro fitopatie ed e/o come antiossidanti o come componenti nella preparazione di agrofarmaci oppure per la preparazione di altri prodotti in campo alimentare, farmaceutico, parafarmaceutico, cosmetico.
Un ulteriore scopo della presente invenzione à ̈ quello di ottenere da specie vegetali quali Salvia spp., Rosmarinus spp. un fitocomplesso arricchito negli acidi triterpenici, oleanolico e ursolico, utilizzabile direttamente per la preparazione di formulazioni ad utilizzo cosmetico, alimentare, farmaceutico e agrofarmaceutico.
Dette finalità vengono raggiunte grazie ad un metodo di estrazione che prevede l'utilizzo di parti aeree fresche di piante appartenenti alla famiglia delle Lamiaceae, in particolare al genere Salvia spp. e Rosmarinus spp.
Per parti aeree si intende qualsiasi parte della pianta che emerge dal terreno ossia fusto, foglie, fiori. E' possibile utilizzare tutte queste parti della pianta assieme, anche se à ̈ preferibile utilizzare le foglie, parti in cui sono maggiormente concentrate le sostanze naturali oggetto del metodo di estrazione della presente invenzione.
In particolare il metodo di estrazione di acido carnosico e triterpeni oggetto della presente invenzione prevede l'utilizzo dell'essudato di superficie delle parti aeree fresche di Salvia spp. e Rosmarinus spp.
Il metodo prevede l'utilizzo di parti aeree fresche di Salvia somalensis e/o Salvia officianalis e/o Rosmarinus spp.
Preferibilmente il metodo descritto prevede l'uso di Salvia somalensis per l'estrazione dell'acido carnosico e di Salvia officinalis e Rosmarinus officinalis per l'estrazione del fitocomplesso arricchito negli acidi triterpenici ursolico ed oleanolico.
Con la presente invenzione infatti à ̈ stato rilevato che l'acido carnosico à ̈ estraibile con rese maggiori da Salvia somalensis e il fitocomplesso arricchito in acidi triterpenici à ̈ estraibile con rese maggiori da Salvia officinalis e Rosmarinus officinalis.
L'essudato di superficie viene ottenuto tramite:
rapido lavaggio delle parti aeree fresche della pianta con almeno un opportuno solvente apolare,
filtrazione della soluzione di lavaggio ed evaporazione del solvente.
Detta sequenza di fasi può essere ripetuta.
Preferibilmente il solvente o i solventi apolari utilizzati sono scelti nel gruppo di solventi clorurati, in particolare il solvente migliore, ossia che garantisce il miglior risultato, Ã ̈ diclorometano.
L'essudato di superficie si presenta come un ammasso ceroso-mieloso o un solido amorfo-vetroso contente acido carnosico, carnosolo, acido ursolico, oleanolico e altri componenti apolari.
Il rendimento del passo di ottenimento può variare in base al periodo di raccolta.
Il passo di ottenimento dell'essudato di superficie risulta essere particolarmente vantaggioso nel processo di estrazione di fitocomplesso da salvia e rosmarino in guanto porta ad una miscela base di partenza per i successivi passi di estrazione che risulta essere priva di clorofilla, caroteni e molti altri componenti presenti all'interno del tessuto vegetale che renderebbero più difficoltoso il processo di separazione e di purificazione delle sostanze di interesse, in particolare dell'acido carnosico.
La preparazione inoltre dell'essudato di superficie da pianta fresca evita la necessità di dover avere come biomassa estrattiva di partenza di rosmarino e salvia essiccata e triturata, o polverizzata. Questo permette di rendere più veloce il processo estrattivo complessivo.
L'utilizzo di piante fresche consente di avere più acido carnosico nell'estratto iniziale ("essudato") e una minore quantità dei suoi prodotti di ossidazione.
Il metodo prevede quindi almeno un passo di estrazione di un fitocomplesso arricchito in acido carnosico e/o un fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico a partire da detto essudato di superficie .
Il passo di estrazione del fltocomplesso arricchito in acido carnosico e/o del fltocomplesso arricchito in acido ursollco e oleanolico prevede l'utilizzo di opportuni solventi, In particolare una soluzione acquosa di un alcol allfatlco a basso peso molecolare, (preferibilmente una soluzione acquosa di metanolo all'80%) e/o n-esano (o petroletere).
Detto passo prevede almeno le seguenti fasi:
lavaggio dell'essudato di superficie con nesano (petroletere),
separazione della fase solida Insolubile tramite filtrazione,
- essiccazione,
estrazione della fase solida insolubile in esano con metanolo acquoso, e filtrazione per ottenere una fase solida costituita da un residuo solido insolubile o fltocomplesso, arricchito in acido ursolico e olenolico e una fase liquida costituita dalla soluzione estrattiva metanolica contenente l'acido carnosico,
evaporazione della soluzione estrattiva metanolica per ottenere un residuo contenente l'acido carnosico sotto forma di fltocomplesso arricchito.
E' possibile prevedere una fase di triturazione che può essere eseguita sull'essudato di superficie dopo il lavaggio con n-esano.
Secondo il presente metodo la fase di lavaggio dell'essudato di superficie avviene per mezzo di una digestione sotto agitazione dell'essudato con n-esano a caldo, preferibilmente a 55-60°C per alcuni minuti, seguita da raffreddamento della miscela, filtrazione del residuo insolubile, e almeno un lavaggio con nesano freddo del residuo stesso ottenuto.
L'estrazione della fase solida insolubile in esano con metanolo acquoso avviene per mezzo di almeno un lavaggio sotto agitazione della fase o residuo solido insolubile polverizzato con metanolo acquoso a caldo, preferibilmente a 45-50°C, seguito da raffreddamento della miscela, filtrazione del residuo insolubile e almeno un lavaggio con metanolo acquoso freddo.
Nel caso in cui a seguito dell'evaporazione del metanolo acquoso non si ottenga un residuo solido, ma un residuo con consistenza mielosa si procede con un altro passo che prevede:
miscelazione a caldo del residuo con consistenza mielosa con una piccola quantità di cloroformio (preferibilmente mL di cloroformio corrispondenti numericamente circa ad 1/5 dei g di essudato trattati),
- precipitazione del fitocomplesso arricchito in acido carnosico tramite aggiunta di n-esano bollente (preferibilmente mL di n-esano corrispondenti numericamente circa ai g di essudato trattati) e raffreddamento .
Con il termine " a caldo" si intende l'utilizzo di un liquido riscaldato ad una temperatura inferiore a quella di ebollizione, generalmente tra i 40 e 55°C.
Il trattamento del residuo mieloso con cloroformio/n.esano permette di ottenere un fitocomplesso di consistenza solida più maneggevole per la successiva estrazione dell'acido carnosico grezzo con bicarbonato di sodio.
In alternativa à ̈ possibile che il passo di estrazione di un fitocomplesso arricchito in acido carnosico e/o di un fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico a partire da detto essudato di superficie preveda almeno le seguenti fasi:
- estrazione dell'essudato di superficie con nesano bollente, ripetuta più volte, il quale n-esano viene filtrato rapidamente dalla fase solida che costituisce il residuo solido insolubile o fitocomplesso, arricchito in acido ursolico e oleanolico,
concentrazione delle soluzioni esaniche filtrate mediante evaporazione parziale sottovuoto e successivo raffreddamento sino ad ottenere un precipitato che filtrato e lavato con esano costituisce il fitocomplesso arricchito in acido carnosico .
In alternativa à ̈ possibile che il passo di estrazione di un fitocomplesso arricchito in acido carnosico e/o di un fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico a partire da detto essudato di superficie preveda almeno le seguenti fasi:
estrazione dell'essudato di superficie con metanolo acquoso il quale metanolo acquoso viene filtrato dalla fase solida che costituisce un residuo solido insolvibile costituito da acido ursolico, acido oleanolico, cere e idrocarburi,
evaporazione della soluzione metanolica acquosa per ottenere, come residuo, il fitocomplesso arricchito in acido carnosico,
essiccazione del residuo solido insolubile costituito da acido ursolico, acido oleanolico, cere e idrocarburi, triturazione, e lavaggio con n-esano per ottenere, dopo essiccazione, una fase, definibile come residuo solido insolubile o fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico.
La fase di estrazione dell'essudato di superficie con metanolo acquoso avviene per mezzo di almeno un lavaggio dell'essudato sotto agitazione con metanolo acquoso a caldo, preferibilmente a 55-60°C per alcuni minuti, raffreddamento, filtrazione e successivamente almeno un lavaggio con metanolo acquoso a freddo, seguito da essiccazione.
La fase di lavaggio del residuo solido insolubile costituito da acido ursolico, acido oleanolico, cere e idrocarburi con n-esano prevede almeno un lavaggio con detto solvente seguito da essiccazione .
Nel caso in cui a seguito dell'evaporazione del metanolo acquoso non si ottenga un residuo solido, ma un residuo con consistenza mielosa si procede con un passo ulteriore che prevede:
miscelazione a caldo del residuo con consistenza mielosa con una piccola quantità di cloroformio (preferibilmente mL di cloroformio corrispondenti numericamente circa ad 1/4-1/10 dei g di essudato trattati),
- precipitazione del fitocomplesso arricchito in acido carnosico tramite aggiunta di n-esano bollente (preferibilmente mL di n-esano corrispondenti numericamente circa allo stesso numero od al doppio dei g di essudato trattatile raffreddamento.
Il trattamento del residuo mieloso con cloroformio/n.esano permette di ottenere un fitocomplesso di consistenza solida più maneggevole per la successiva estrazione dell'acido carnosico grezzo con bicarbonato di sodio.
Il metodo di estrazione del fItocomplesso risulta quindi essere semplice in quanto la materia di partenza ossia l'essudato di superficie risulta essere privo di composti polari e pigmenti lipofili come clorofilla e caroteni.
Grazie al metodo oggetto della presente invenzione à ̈ possibile ottenere un fitocomplesso arricchito in acido carnosico che contenga almeno il 20 % di acido carnosico, preferibilmente dal 20 all'80%, ed un fitocomplesso arricchito in acido ursolico ed oleanolico che contenga una miscela di detti acidi dal 25% all'80%.
Il metodo oggetto della presente invenzione consente quindi, partendo dall'essudato di superficie di ottenere, sia un fitocomplesso arricchito in acido carnosico sia un fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico, essendo le fasi di ottenimento del fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico eseguite in alternativa o in parallelo con le fasi di ottenimento del fitocomplesso arricchito in acido carnosico.
La presente invenzione ha come oggetto quindi l'uso di un procedimento per ottenere un fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico da utilizzare direttamente, ossia senza che venga miscelato con altre sostanze di origine naturale o sintetica, o miscelato altre sostanze di origine naturale o sintetica per la preparazione di composti o formulazioni da utilizzare in campo alimentare, farmaceutico, parafarmaceutico, cosmetico.
Il metodo prevede quindi almeno un passo di ottenimento dell'acido carnosico grezzo, dal fitocomplesso arricchito in acido carnosico, ottenuto a partire da detto essudato di superficie, ed eventualmente anche carnosolo, come sottoprodotto di recupero, dalle madri di ricristallizzazione dell'acido carnosico.
L'acido carnosico può infatti essere estratto dal fitocomplesso arricchito sotto forma di sale idrosolubile, separando la soluzione acquosa mediante filtrazione e precipitando l'acido grezzo libero mediante acidificazione. Il sale idrosolubile preferito à ̈ quello sodico.
Si sono scelti bicarbonato di sodio per la preparazione del sale idrosolubile e acido fosforico per ottenere la precipitazione dell'acido.
Il passo prevede almeno le seguenti fasi:
estrazione del fitocomplesso arricchito in acido carnosico con soluzione acquosa di bicarbonato di sodio e rapida filtrazione della soluzione acquosa,
- rapida acidificazione della soluzione liquida filtrata con precipitazione dell'acido carnosico grezzo,
- filtrazione, lavaggio con acqua ed essicazione del precipitato.
La fase di estrazione del fitocomplesso arricchito in acido carnosico con soluzione acquosa di bicarbonato di sodio prevede la miscelazione del fitocomplesso arricchito in acido carnosico sotto agitazione con una soluzione dal 2,5% al 5% di bicarbonato di sodio a 50-55°C seguita da filtrazione e raffreddamento.
Oppure la fase di estrazione del fitocomplesso arricchito in acido carnosico con soluzione acquosa di bicarbonato di sodio prevede la miscelazione del fitocomplesso polverizzato arricchito in acido carnosico con sodio bicarbonato con l'aggiunta di acqua fredda e/o calda a 50-55°C, la quale miscela prima di essere filtrata viene posta sotto agitazione per alcuni minuti a temperatura ambiente e/o a temperature superiori.
La fase di acidificazione della soluzione liquida filtrata avviene con una soluzione all'85% di acido fosforico fino a pH 2.
Il passo sopra descritto eseguito sul fitocomplesso arricchito in acido carnosico può essere ripetuto per ottenere una maggiore quantità di acido carnosico.
In alternativa, anche se può risultare più lungo e laborioso, a detto passo di ottenimento di acido carnosico grezzo à ̈ possibile prevedere che la separazione dell'acido carnosico grezzo avvenga tramite separazione su colonna cromatografica di Sephadex LH-20 impiegando cloroformio/metanolo (70:30) come miscela eluente. Portando a secco le frazioni con acido carnosico (identificate tramite controllo TLC) e cristallizzando con cloroformio/nesano si ottiene acido carnosico cristallino.
Secondo il presente metodo à ̈ possibile prevedere la purificazione dell'acido carnosico grezzo tramite cristallizzazione .
Il passo consente l'ottenimento di acido carnosico cristallino in elevata quantità .
La cristallizzazione prevede:
dissoluzione dell'acido carnosico in cloroformio bollente.
- precipitazione dell'acido carnosico in forma cristallina tramite aggiunta di n-esano a caldo e successivo raffreddamento.
Dalla soluzione madre di cristallizzazione à ̈ possibile ottenere carnosolo (come confermato da comparazione con campione autentico mediante TLC, spettro IR, punto di fusione) utilizzando metodi noti (E. Wenkert et al. Chemical Artifacts from the Family Lamiaceae. J. Org. Chem. 30, 2931-2934,1965).
Data l'elevata concentrazione dell'acido carnosico nel fitocomplesso ottenuto con il presente metodo à ̈ possibile utilizzare direttamente senza ulteriori passi di purificazione detto fitocomplesso come agrofarmaco o come componente nella preparazione di agrofarmaci oppure per la preparazione di altri prodotti in campo alimentare, farmaceutico, parafarmaceutico, cosmetico.
Secondo la presente invenzione inoltre la purificazione dell'acido carnosico a partire dal fitocomplesso consente di ottenere un prodotto solido cristallino costituito da acido carnosico ad una concentrazione superiore al 50% nel caso di Salvia officinalis, all'85% nel caso di Rosmarinus officinalis e del 95% nel caso di Salvia Somalensis.
Il metodo oggetto della presente invenzione consente quindi di preparare:
- acido carnosico puro, o comunque ad elevato titolo di purezza,
un fitocomplesso arricchito in acido carnosico,
una miscela o fitocomplesso contenente una elevata quantità di triterpeni come l'acido ursolico e l'acido oleanolico,
il quale composto o i quali fitocomplessi possono essere utilizzati direttamente da soli o in combinazione con altre sostanze per preparazioni di prodotti cosmetici, per preparazioni alimentari, agrofarmaceutiche, farmaceutiche e/o parafarmaceutiche. In particolare l'invenzione prevede l'uso di un fitocomplesso arricchito in acido carnosico come antifungino o del fitocomplesso stesso o dell'acido carnosico per la formulazione di preparati antifungini.
La presente invenzione à ̈ quindi relativa anche: - all'uso di un procedimento come sopra descritto per ottenere acido carnosico ad elevato titolo di purezza da utilizzarsi direttamente o miscelato altre sostanze di origine naturale o sintetica in preparazioni di interesse alimentare, farmaceutico, parafarmaceutico, agrofarmaceutico, cosmetico,
all'uso di un procedimento per ottenere un fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico da utilizzare, direttamente o miscelato altre sostanze di origine naturale o sintetica, per la preparazione di formulati utilizzabili in campo alimentare, farmaceutico, parafarmaceutico, cosmetico.
La presente invenzione à ̈ anche relativa all'uso di un procedimento per ottenere acido carnosico o un fitocomplesso arricchito in acido carnosico, o anche un essudato, utilizzabili come agrofarmaci. L'attività antifungina del fitocomplesso arricchito in acido carnosico à ̈ stata dimostrata sia in vivo che in vitro.
Prove in vitro ed in vivo hanno dimostrato attività di inibizione dello sviluppo micelico, paragonabile a quella di molti mezzi chimici attivi nei confronti dei patogeni target.
In particolare à ̈ stato dimostrato che il dosaggio necessario per avere attività antifungina in vivo à ̈ minore del dosaggio richiesto in vitro.
Il fitocomplesso arricchito in acido carnosico ha mostrato una buona efficacia antifungina nei confronti di parassiti vegetali in vitro e/o in vivo quali: Colletotrichum acutatum, Colletotrichum coccodes, Colletotrichum gloeosporidea, Fusarium sp., Fusarium oxysporum, f.sp. basilici, F. oxysporum f.sp. cyclaminis, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum.
Nei saggi in vitro i patogeni sono stati allevati a 23°C in capsule di Petri, dove il fitocomplesso arricchito in acido carnosico da saggiare à ̈ stato disciolto in metanolo e miscelato nel substrato di PDA (Agar Potato Destrosio) sino ad ottenete una concentrazione finale di lmg/ml per il prodotto e di lmL/lOOmL per il metanolo. La crescita radiale del patogeno à ̈ stata misurata dopo 7 giorni ed à ̈ stato valutato l'effetto del composto saggiato. Il confronto à ̈ stato fatto con la crescita di patogeni su substrati liberi da sostanze o su substrato con metanolo.
Risultati delle prove effettuate in vitro.
S. ttamento F. chrysanthemi B. cinerea
sclerotiorum 25,Oc 30,Ob 30,Oc
anolo 1% 18,3b 28,Ob 13,7b
ocomplesso
icchito in ac. 9,Oa 20,7a 6,Oa nosico (80%,
S. sornaiensis)
(<A>): le medie della medesima colonna seguite dalla stessa lettera non differiscono significativamente tra di loro con una probabilità del 5% secondo il test di Duncan.
(<AA>):accrescimento in capsula (mm) a partire da punto di inoculo.
Risultati delle prove effettuate in vivo su basilico (Ocimxxm basilicum) per il contenimento di Botrytis cinerea e Sclerotinia sclerotiorum con f itocomplesso arricchito in acido carnosico.
Risultati delle prove effettuate in vivo.
n. piante colpite su 200 osservate Trattamento dopo 7-10 gg dall'Inizio della prova
B.cinerea ° S.sclerotorium ° 30,Ob O 30,Ob Metanolo 1% 28,Ob 13,7b Fitocomplesso arricchito in ac.
carnosico (80%, da S. 4,3a 0,0a somalensis )
Cyprodinil Fludioxonl
(dose: 187,5+125,0 g/ha di 2,5a 0,Oa prodotto commerciale)
(<A>): le medie della medesima colonna seguite dalla stessa lettera non differiscono significativamente tra di loro con una probabilità del 5% secondo il test di Duncan.
(<AA>): Il fitocomplesso à ̈ stato disciolto in metanolo e successivamente disperso in acqua fino ad ottenere una concentrazione di 1 ml /100ml di metanolo e 1 mg/ml di fitocomplesso . Tale dispersione à ̈ stata spruzzata sulla pianta.
° :Inoculazione effettuata con una sospensione conidica 1x104 CFU/ml.
L'invenzione à ̈ illustrata negli esempi riportati di seguito.
Sono descritti esempi per l'ottenimento dell'essudato di superficie di specie del genere Salvia spp. e Rosmarino spp.
L'essudato di superficie si presenta come un prodotto ceroso-mieloso o un solido amorfo-vetroso.
In particolare di seguito à ̈ descritto il procedimento di ottenimento dell'essudato da Salvia somalensis .
ESEMPIO 1.1
3,38 Kg di parti aeree fresche di Salvia somalensis sono state lavate per due volte con 5,5 litri di diclorometano .
La soluzione ottenuta à ̈ stata filtrata ed il solvente à ̈ stato allontanato tramite evaporazione sotto vuoto.
Si sono ottenuti 51,5 g di essudato di superficie (rendimento 1,52%).
ESEMPIO 1.2
1,7 Kg di parti aeree fresche di Salvia somalensis sono state lavate per quattro volte con 4,5 litri di diclorometano.
La soluzione ottenuta à ̈ stata filtrata ed il solvente à ̈ stato allontanato tramite evaporazione sotto vuoto.
Si sono ottenuti 49,6 g di essudato di superficie (rendimento 2,8%).
Sono di seguito descritti esempi per l'ottenimento di un fitocomplesso arricchito di acido carnosico e di un fitocomplesso arricchito di acido ursolico e oleanolico a partire dall'essudato di superficie di Salvia somalensis.
ESEMPIO 2.1
10 g di essudato di superficie, ottenuto tramite il procedimento sopra descritto nell'esempio 1.1 e corrispondente a 656 g di parti aeree fresche della pianta, sono stati sottoposti a digestione ad una temperatura di 55-60°C sotto agitazione per 4-5 minuti con 50 mL di n-esano.
Dopo raffreddamento, per ottenere la separazione della fase solida insolubile, il residuo insolubile, ossia la fase solida insolubile, Ã ̈ stata filtrato e lavato due volte con 5 mL di n-esano freddo.
11 residuo, dopo essere stato essiccato, Ã ̈ stato triturato e/o polverizzato e miscelato per pochi minuti con 25 mL con metanolo acquoso riscaldato a 45-50°C (80% metanolo).
Dopo raffreddamento il residuo insolubile à ̈ stato filtrato e lavato prima con 15 mL e poi con 10 mL di metanolo acquoso (80% metanolo) freddo.
La fase solida insolubile ottenuta (0,92 g) Ã ̈ un fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico. Efficienza estrattiva a partire da parti aeree fresche di pianta: 0,14%.
Un confronto diretto, utilizzando campioni autentici degli acidi, tramite cromatografia su strato sottile (TLC) su gel di silice (miscela eluente cloroformio-metanolo 95:5, spruzzando con soluzione 50% H2SO4e riscaldando; gli acidi isomerici ursolico e oleanolico hanno lo stesso fattore di migrazione o Rf) ha mostrato una macchia principale corrispondente a quella dei due acidi. Il controllo analitico HPLC (Bibliografia: HPLC quantif ication of two isomerie triterpenic acids isolated from Mitracarpus scaber and antimicrobial activity on Dermatophilus congolensis. Fernand Gbaguidi et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedicai Analysis 39 (2005) 990-995) ha rivelato la presenza di miscela di acido ursolico e acido oleanolico per un titolo complessivo del 77%.
La fase liquida costituita dalla soluzione estrattiva metanolica à ̈ stata sottoposta ad evaporazione ed il residuo ottenuto (consistenza mielosa) à ̈ stato miscelato con 2 mL di cloroformio caldo. Sono stati poi aggiunti 10 mL di n-esano caldo .
Dopo raffreddamento, si à ̈ formato un precipitato costituito dal fitocomplesso arricchito in acido carnosico (2,64 g). Efficienza estrattiva a partire da parti aeree fresche di pianta: 0,40%. Un confronto diretto con TLC, come sopra descritto, utilizzando un campione autentico dell'acido, ha mostrato una macchia principale corrispondente a quella dell'acido carnosico .
Il controllo analitico HPLC ha rivelato un titolo del 64% in acido carnosico (Bibliografia: N. Troncoso, H. Sierra, L. Carvajal, P. Delpiano, G. Gunther. Fast high performance liqui chromatography and ultraviolet-visible quantif ication of principal phenolic antioxidants in fresh Rosemary. Journal of Chromatography A, 1100, 20-25, 2005 e Michael A.
Thorsen, Katia S. Hildebrandt . Quantitative determination of phenolic diterpenes in rosemary extracts. Journal of Chromatography A, 995, 119-125, 2003.).
ESEMPIO 2.2
10 g di essudato di superficie ottenuto tramite il procedimento sopra descritto nell'esempio 1.1, corrispondente a 656 g di parti aeree fresche della pianta, à ̈ stato estratto a caldo ripetutamente con n.esano, filtrando ogni volta rapidamente. In particolare l'essudato à ̈ stato estratto per nove volte con 40 mL di n.esano bollente e filtrato rapidamente .
La fase solida insolubile ottenuta (2,2 g) Ã ̈ un fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico .
Efficienza estrattiva a partire da parti aeree fresche di pianta: 0,34%. (Analisi HPLC: miscela di acido ursolico / oleanolico con un titolo complessivo del 26%).
La fase liquida costituita dai liquidi di estrazione filtrati sono stati concentrati sotto vuoto fino a circa 40 mL. Tramite raffreddamento à ̈ precipitato il fitocomplesso arricchito in acido carnosico (1,55 g). Efficienza estrattiva a partire da parti aeree fresche di pianta: 0,23%. (Titolo HPLC: 32 %).
ESEMPIO 2.3
18,8 g di essudato di superficie ottenuto tramite il procedimento sopra descritto nell'esempio 1.1, corrispondente a 1230 g di parti aeree fresche della pianta, Ã ̈ stato sottoposto a digestione sotto agitazione con 70 mL di metanolo acquoso (80% metanolo) caldo (55-60°C) per 10 minuti. Successivamente sono stati aggiunti, sempre sotto agitazione altri 30 mL di metanolo acquoso caldo (80% metanolo).
La miscela à ̈ stata raffreddata tramite acqua e/o ghiaccio e poi filtrata.
Dopo raffreddamento e filtrazione il residuo insolubile, ossia la fase solida insolubile, Ã ̈ stato:
lavato con metanolo acquoso (80% metanolo) freddo: prima con 20 mL, poi 15mL e infine 10 mL di metanolo acquoso (80% metanolo) freddo,
- essiccato, triturato e/o polverizzato,
- lavato più volte (tre volte) con 10 mL di nesano,
essiccato per ottenere un fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico (1,65 g) Efficienza estrattiva a partire da parti aeree fresche di pianta: 0,13%. (Titolo complessivo della miscela acido ursolico/oleanolico 82%).
La fase liquida costituita dalla soluzione estrattiva à ̈ stata sottoposta ad evaporazione ed il residuo mieloso ottenuto à ̈ stato miscelato con 3-4 mL di cloroformio riscaldato a cui à ̈ stato rapidamente aggiunto di n-esano riscaldato (15 mL).
Dopo raffreddamento, dalla soluzione esanocloroformica à ̈ precipitato un fitocomplesso arricchito in acido carnosico (5,42 g).
Efficienza estrattiva a partire da parti aeree fresche di pianta: 0,44%. (Titolo HPLC: 80%).
Sono di seguito descritti esempi per l'ottenimento di acido carnosico e carnosolo da un fitocomplesso arricchito di acido carnosico ottenuto a partire dall'essudato di superficie di Salvia somalensis .
ESEMPIO 3.1
3 g del fitocomplesso arricchito in acido carnosico preparato secondo la procedura descritta nel precedente esempio 2.3 e corrispondente a 681 g di parti aeree fresche della pianta, sono stati mescolati sotto agitazione per 3-4 minuti a 50-55°C con 50 mi di una soluzione acquosa al 5% di bicarbonato di sodio e filtrati.
La soluzione filtrata, contenente il sale sodico idrosolubile dell'acido carnosico, à ̈ stata raffreddata e rapidamente acidificata con di acido fosforico all'85% sino a pH 2, ottenendo la precipitazione dell'acido carnosico libero grezzo che à ̈ stato separato mediante filtrazione.
Il residuo à ̈ stato ancora estratto con 30 mL di una soluzione acquosa al 5% di bicarbonato di sodio, filtrato, lavato tre volte con 40 mL di acqua calda (50-55°C).
La soluzione filtrata à ̈ stata rapidamente acidificata con di acido fosforico all'85% fino a pH 2, ottenendo la precipitazione di ulteriore acido carnosico grezzo che à ̈ stato separato mediante filtrazione .
Il precipitato filtrato à ̈ stato lavato con acqua ed essiccato ottenendo 2,25 g di acido carnosico grezzo.
Efficienza estrattiva a partire da parti aeree fresche di pianta: 0,33%. (Titolo HPLC: 82 %).
ESEMPIO 3.2
9,4 g del fitocomplesso arricchito in acido carnosico preparato secondo la procedura descritta nell'esempio 2.3 e corrispondenti a 2133 g di parti aeree fresche di pianta, sono stati triturati e/o polverizzati con 9,4 g di sodio bicarbonato.
Sono stati aggiunti 100 mi di acqua.
La miscela à ̈ stata posta sotto agitazione per 3-4 minuti a temperatura ambiente e poi a 50-55°C.
Sono stati aggiunti 100 mL di acqua calda (50-55°C).
La miscela à ̈ stata posta sotto agitazione alla stessa temperatura (50-55°C) per 6-7 minuti, filtrata e la soluzione filtrata à ̈ stata rapidamente acidificata con acido fosforico all'85% fino a pH 2, ottenendo la precipitazione dell'acido carnosico grezzo che à ̈ stato separato mediante filtrazione.
Il residuo à ̈ stato ancora estratto con 120 mL per cinque volte e poi con 60 mi per 12 volte di soluzione acquosa calda (50-55°C) al 2,5% di bicarbonato di sodio, filtrando poi la soluzione del sale sodico dell'acido carnosico.
La soluzione filtrata à ̈ stata rapidamente acidificata con acido fosforico all'85% fino a pH 2, e raffreddata, ottenendo la precipitazione dell'acido carnosico grezzo che à ̈ stato separato mediante filtrazione.
Il precipitato filtrato à ̈ stato lavato con acqua ed essiccato ottenendo 7,2 g di acido carnosico grezzo.
Efficienza estrattiva a partire da parti aeree fresche di pianta: 0,34%.
L'acido carnosico grezzo può essere ulteriormente purificato mediante cristallizzazione.
Di seguito à ̈ descritto un esempio del processo di purificazione dell'acido carnosico grezzo tramite cristallizzazione.
ESEMPIO 1
9,45 g di acido carnosico grezzo ottenuto tramite le procedure descritte negli esempi 3.1 e 3.2, corrispondenti a circa 2800 g di parti aeree fresche di pianta, sono stati ricristallizzati da cloroformio/n-esano ottenendo 7,1 g di acido carnosico (efficienza estrattiva a partire da parti aeree fresche di pianta: 0,25%.), con punto di fusione 190-192°C (dee.) e con spettri<13>C-NMR e -NMR praticamente identici a quelli riportati in letteratura (S.L. Richheimer et al., Antioxidant Activity of Lipid-Soluble Phenolic Diterpenes from Rosemary, JAOCS 73, 504-514 1996). (Titolo HPLC: 98%).
Le acque madri di cristallizzazione evaporate e disciolte in soluzione acquosa di metanolo (95% metanolo) mantenute a temperatura ambiente per 4 settimane hanno permesso di ottenere 1,2 g di cristalli di carnosolo grezzo (identificato, dopo ricristallizzazione da cloroformio/metanolo, mediante confronto diretto TLC, IR e punto di fusione con campione autentico).
Sono descritti esempi per l'ottenimento dell'essudato di superficie da Salvia officinalis.
ESEMPIO 1.1
1,5 Kg di parti aeree fresche di Salvia officinalis sono state lavate per quattro volte con 3 litri di diclorometano.
La soluzione ottenuta à ̈ stata filtrata ed il solvente à ̈ stato allontanato tramite evaporazione sotto vuoto.
Si sono ottenuti 28,1 g di essudato solido di superficie (rendimento 1,87%).
ESEMPIO 1.2
1,8 Kg di parti aeree fresche di Salvia officinalis sono state lavate per due volte con 5 litri di diclorometano.
La soluzione ottenuta à ̈ stata filtrata ed il solvente à ̈ stato allontanato tramite evaporazione sotto vuoto.
Si sono ottenuti 25,9 g di essudato solido di superficie (rendimento 1,44%).
Sono di seguito descritti esempi per l'ottenimento di un fitocomplesso arricchito di acido carnosico e di un fitocomplesso arricchito di acido ursolico e oleanolico a partire dall'essudato di superficie di Salvia officinalis .
ESEMPIO 2.1
12 g di essudato di superficie ottenuto tramite il procedimento sopra descritto nell'esempio 1.1, corrispondente a 640 g di parti aeree fresche della pianta, Ã ̈ stato sottoposto a digestione sotto agitazione con 65 mL di soluzione acquosa di metanolo (80% metanolo) riscaldato (55-60°C) per 5 minuti.
La miscela à ̈ stata poi raffreddata con acqua e/o ghiaccio e poi filtrata.
Il residuo insolubile, ossia la fase solida rimasta sul filtro, Ã ̈ stato:
lavato con metanolo acquoso freddo (80% metanolo) : prima con 40 mL e poi due volte con 30 mL di metanolo acquoso (80% metanolo) freddo
- essiccato,
- lavato con n-esano: prima con 50 mL e poi tre volte con 30 mL di n.esano,
- essiccato,
per ottenere un fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico (5,9 g. Efficienza estrattiva a partire da parti aeree fresche di pianta: 0,92%.).(Titolo HPLC complessivo: 84%).
La fase liquida costituita dalle soluzioni filtrate à ̈ stata sottoposta ad evaporazione ed il residuo di tipo mieloso ottenuto à ̈ stato miscelato con 3 mL di cloroformio caldo. Sono stati poi aggiunti 25 mL di n-esano sempre a caldo.
Dopo raffreddamento, Ã ̈ precipitato un fitocomplesso arricchito in acido carnosico (1,3 g).
Efficienza estrattiva a partire da parti aeree fresche di pianta: 0,2%.
ESEMPIO 2.2
12 g di essudato di superficie ottenuto tramite il procedimento sopra descritto nell'esempio 1.2, corrispondente a 834 g di parti aeree fresche della pianta, Ã ̈ stato sottoposto a digestione sotto agitazione con 60 mL di metanolo acquoso (80% metanolo) riscaldato (55-60°C) per 6 minuti.
La miscela à ̈ stata poi raffreddata con acqua e/o ghiaccio e poi filtrata.
Dopo raffreddamento il residuo insolubile, ossia la fase solida insolubile, Ã ̈ stato:
lavato con metanolo acquoso freddo (80% metanolo): lavato per tre volte con 20 mL di metanolo acquoso (80% metanolo) freddo,
- essiccato,
- lavato con n-esano: lavato per tre volte con 15 mL di n-esano,
- essiccato.
La fase solida insolubile ottenuta (4,1 g) Ã ̈ un fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico. Efficienza estrattiva a partire da parti aeree fresche di pianta: 0,49%. (titolo HPLC complessivo: 72%).
La fase liquida costituita dalle soluzioni filtrate à ̈ stata sottoposta ad evaporazione ed il residuo tipo mieloso ottenuto à ̈ stato miscelato con 2 mL di cloroformio riscaldato. Sono stati poi aggiunti 25 mL di n-esano riscaldato.
Dopo raffreddamento, Ã ̈ precipitato un fitocomplesso arricchito in acido carnosico (1,64 g). Efficienza estrattiva a partire da parti aeree fresche di pianta: 0,19%. (titolo HPLC: 36%).
Viene di seguito descritto un esempio per l'ottenimento di acido carnosico da un fitocomplesso arricchito di acido carnosico ottenuto a partire dall'essudato di superficie di Salvia officinalis.
ESEMPIO 3.1
1,3 g del fitocomplesso arricchito in acido carnosico preparato secondo la procedura descritta nel precedente esempio 2.1, sono stati triturati e/o polverizzati con 1,3 g di sodio bicarbonato.
Sono stati aggiunti 100 mi di acqua.
La miscela à ̈ stata posta sotto agitazione per 4 minuti a temperatura ambiente e poi a 55°C e filtrata.
La soluzione filtrata à ̈ stata rapidamente acidificata con acido fosforico all'85% fino a pH 2, ottenendo la precipitazione dell'acido carnosico grezzo che à ̈ stato separato mediante filtrazione.
Il residuo à ̈ stato ancora estratto due volte con 100 mL di soluzione acquosa calda (50-55°C) al 2,5% di bicarbonato di sodio, filtrato e la soluzione filtrata à ̈ stata trattata trattato come sopra.
Il precipitato di acido carnosico grezzo filtrato, ottenuto tramite acidificazione, viene lavato con acqua ed essiccato ottenendo 0,40 g di acido carnosico grezzo. Efficienza estrattiva a partire da parti aeree fresche di pianta: 0,06%. (titolo HPLC 50 %).
L'acido carnosico grezzo ottenuto à ̈ stato cristallizzato da n-esano ottenendo un prodotto con punto di fusione 170-178°C (dee). (titolo HPLC 50 %).
Sono descritti esempi per l'ottenimento dell'essudato di superficie da Rosmarinus officinalis.
ESEMPIO 1.1
2,417 Kg di parti aeree fresche di Rosmarinus officinalis sono state lavate per due volte con 3,9 litri di diclorometano.
La soluzione ottenuta à ̈ stata filtrata ed il solvente à ̈ stato allontanato tramite evaporazione sotto vuoto.
Si sono ottenuti 31,6 g di essudato solido di superficie (rendimento 1,31%).
ESEMPIO 1.2
1,348 Kg di parti aeree fresche di Rosmarinus officinalis sono state lavate per quattro volte con 3,7 litri di diclorometano.
La soluzione ottenuta à ̈ stata filtrata ed il solvente à ̈ stato allontanato tramite evaporazione sotto vuoto.
Si sono ottenuti 39,4 g di essudato solido di superficie (rendimento 2,9%).
Viene di seguito descritto un esempio per l'ottenimento di un fitocomplesso arricchito di acido carnosico e di un fitocomplesso arricchito di acido ursolico e oleanolico a partire dall'essudato di superficie di Rosmarinus officinalis.
ESEMPIO 2.1
10 g di essudato di superficie ottenuto tramite il procedimento sopra descritto nell'esempio 1.2, corrispondente a 342 g di parti aeree fresche della pianta, Ã ̈ stato miscelato sotto agitazione con 40 mL di metanolo acquoso (80% metanolo) caldo (55-60°C) per 5 minuti.
La miscela à ̈ stata poi raffreddata con acqua e/o ghiaccio e poi filtrata.
11 residuo insolubile à ̈ stato ancora estratto come sopra, ossia la fase solida insolubile, à ̈ stata:
lavata con metanolo acquoso freddo (80% metanolo): lavato per due volte con 15 mL di metanolo acquoso (80% metanolo) freddo,
- essicata,
- lavato con n-esano: lavato per tre volte con 20 mL di n-esano,
-essiccata.
La fase solida insolubile ottenuta (6,1 g) Ã ̈ un fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico. Efficienza estrattiva a partire da parti aeree fresche di pianta: 1,78%. (titolo HPLC comlessivo: 47%).
La fase liquida costituita dalle soluzioni filtrate à ̈ stata sottoposta ad evaporazione per ottenere un residuo tipo mieloso il quale residuo à ̈ stato sciolto in circa 1 mL di cloroformio a cui sono stati rapidamente aggiunti 9 mL di n-esano bollente.
Mediante raffreddamento, dalla miscela cloroformio/n-esano à ̈ precipitato un fitocomplesso arricchito in acido carnosico (1,38 g. Efficienza estrattiva a partire da parti aeree fresche di pianta: 0,40% (titolo HPLC: 23%).
Viene di seguito descritto un esempio per l'ottenimento di acido carnosico da un fitocomplesso arricchito di acido carnosico ottenuto a partire dall'essudato di superficie di Rosmarinus officinalis .
ESEMPIO 3.1
1,35 gr del fitocomplesso arricchito in acido carnosico preparato secondo il procedimento descritto nell'esempio 2.1 e corrispondente a 335 g di parti aeree fresche di pianta, sono stati triturati e/o polverizzati con 1,3 g di sodio bicarbonato.
Sono stati aggiunti 30 mi di acqua.
La miscela à ̈ stata posta sotto agitazione per 4 minuti a temperatura ambiente e poi per 4 minuti a 55°C.
La miscela riscaldata à ̈ stata rapidamente filtrata e la soluzione filtrata à ̈ stata raffreddata e rapidamente acidificata con acido fosforico all'85% fino a pH 2, ottenendo la precipitazione dell'acido carnosico grezzo.
Il residuo à ̈ stato ancora estratto quattro volte con 40 mL e poi tre volte con 80 mL di soluzione acquosa calda (50-55°C) al 2,5% di bicarbonato di sodio come sopra.
Dopo acidificazione il precipitato di acido carnosico grezzo viene filtrato, lavato con acqua ed essiccato ottenendo 0,15 g di acido carnosico grezzo. Efficienza estrattiva a partire da parti aeree fresche di pianta: 0,04% (titolo HPLC: 64%).
L'acido carnosico grezzo ottenuto à ̈ stato cristallizzato da n-esano ottenendo acido carnosico, ottenendo acido carnosico, con punto di fusione 175-184°C (dee.) (titolo HPLC: 87%).
Claims (23)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo di ottenimento di acido carnosico e triterpeni, come composti puri o miscelati ad altre sostanze naturali, da piante della famiglia delle Lamiaceae, in particolare da Salvia spp. e Rosmarinus spp. caratterizzato dal fatto che prevede l'utilizzo dell'essudato di superficie di parti aeree fresche di dette piante, ossia quelle parti della pianta che emergono dal terreno quali fusto, foglie, fiori le quali parti aeree non sono state sottoposte a processo di essiccazione o simili, il quale essudato à ̈ ottenuto mediante rapido lavaggio delle parti aeree fresche della pianta con almeno un opportuno solvente apolare clorurato, preferibilmente diclorometano, filtrazione della soluzione di lavaggio ed evaporazione del solvente, ed essendo detto passo di ottenimento dell'essudato eseguibile almeno una volta su dette parti aeree fresche di piante.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che prevede almeno un passo di estrazione di un fitocomplesso arricchito in acido carnosico e/o un fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico a partire da detto essudato di superficie tramite opportuni solventi, in particolare una soluzione acquosa di un alcol alifatico a basso peso molecolare, preferibilmente metanolo acquoso all'80% e/o n-esano o petroletere.
- 3. Metodo secondo la rivendicazione 2 caratterizzato dal fatto che detto passo di estrazione prevede almeno le seguenti fasi: - lavaggio dell'essudato di superficie con nesano o petroletere. separazione della fase solida insolubile tramite filtrazione, - essiccazione, estrazione della fase solida insolubile in esano con metanolo acquoso, e filtrazione per ottenere una fase solida costituita da un residuo solido insolubile o fitocomplesso, arricchito in acido ursolico e oleanolico e una fase liquida costituita dalla soluzione estrattiva metanolica contenente l'acido carnosico, evaporazione della soluzione estrattiva metanolica per ottenere un residuo contenente acido carnosico sotto forma di fitocomplesso arricchito che si presenta come un ammasso ceroso -mieloso o come solido amorfo vetroso, essendo previsto nel caso il residuo si presenti come ammasso ceroso-mieloso una ulteriore fase che prevede miscelazione a caldo del residuo con cloroformio, precipitazione del fitocomplesso arricchito in acido carnosico tramite aggiunta di n-esano bollente e raffreddamento.
- 4. Metodo secondo la rivendicazione 3 caratterizzato dal fatto che la fase di lavaggio con esano dell'essudato di superficie, avviene per mezzo di una digestione sotto agitazione dell'essudato con n-esano a caldo, preferibilmente a 55-60°C per alcuni minuti, seguita da raffreddamento della miscela, filtrazione del residuo insolubile ottenuto, e almeno un lavaggio con n-esano freddo del residuo stesso ottenuto.
- 5. Metodo secondo la rivendicazione 3 caratterizzato dal fatto che l'estrazione della fase solida insolubile in esano con metanolo acquoso avviene per mezzo di almeno un lavaggio sotto agitazione della fase o residuo solido insolubile polverizzato con metanolo acquoso a caldo, preferibilmente a 45-50°C, seguito da raffreddamento della miscela, filtrazione del residuo insolubile e almeno un lavaggio con metanolo acquoso freddo.
- 6. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 2 a 5 caratterizzato dal fatto che prevede almeno una fase di triturazione che può essere eseguita sull'essudato di superficie dopo il lavaggio con n-esano.
- 7. Metodo secondo la rivendicazione 2 caratterizzato dal fatto che detto passo di estrazione di un fitocomplesso arricchito in acido carnosico e/o un fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico a partire da detto essudato di superficie prevede almeno le seguenti fasi: - estrazione dell'essudato di superficie con nesano bollente ripetuta più volte, il quale n-esano viene filtrato rapidamente dalla fase solida che costituisce il residuo solido insolubile o fitocomplesso, arricchito in acido ursolico e oleanolico, concentrazione delle soluzioni esaniche filtrate mediante evaporazione parziale sottovuoto e successivo raffreddamento per ottenere un precipitato che filtrato e lavato con esano costituisce il fitocomplesso arricchito in acido carnosico.
- 8. Metodo secondo la rivendicazione 2 caratterizzato dal fatto che detto passo di estrazione di un fitocomplesso arricchito in acido carnosico e/o un fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico a partire da detto essudato di superficie prevede almeno le seguenti fasi: - estrazione dell'essudato di superficie con metanolo acquoso il quale metanolo acquoso viene filtrato dalla fase solida che costituisce il residuo solido insolubile costituito da acido ursolico, acido oleanolico, cere e idrocarburi, evaporazione della soluzione metanolica acquosa per ottenere come residuo il fitocomplesso arricchito in acido carnosico, che si presenta come un ammasso ceroso-mieloso o come solido amorfo vetroso, essendo previsto nel caso il residuo si presenti come ammasso ceroso-mieloso una ulteriore fase che prevede miscelazione a caldo del residuo con cloroformio, precipitazione del fitocomplesso arricchito in acido carnosico tramite aggiunta di nesano bollente e raffreddamento, essiccazione del residuo solido insolubile costituito da acido ursolico, acido oleanolico, cere e idrocarburi, triturazione e lavaggio con n-esano per ottenere, dopo essiccazione, una fase, definibile come residuo solido insolubile o fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico.
- 9. Metodo secondo la rivendicazione 8 caratterizzato dal fatto che la fase di estrazione dell'essudato di superficie con metanolo acquoso avviene per mezzo di almeno un lavaggio dell'essudato sotto agitazione con metanolo acquoso a caldo, preferibilmente a 55-60°C per alcuni minuti, raffreddamento, filtrazione e successivamente almeno un lavaggio con metanolo acquoso a freddo, seguito a essiccazione.
- 10. Metodo secondo la rivendicazione 8 caratterizzato dal fatto che la fase di lavaggio del residuo solido insolubile costituito da acido ursolico, acido oleanolico, cere e idrocarburi con nesano prevede almeno un lavaggio con detto solvente seguito da essiccazione.
- 11. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che prevede almeno un passo di ottenimento dell'acido carnosico grezzo dal fitocomplesso arricchito in acido carnosico, ottenuto a partire da detto essudato di superficie, il quale passo di estrazione à ̈ eseguito almeno una volta su detto fitocomplesso arricchito in acido carnosico e consente l'estrazione dell'acido carnosico tramite preparazione di sale idrosolubile e successiva precipitazione dell'acido.
- 12. Metodo secondo la rivendicazione 11 caratterizzato dal fatto che il passo di estrazione prevede almeno le seguenti fasi: estrazione del fitocomplesso arricchito in acido carnosico con soluzione acquosa di bicarbonato di sodio e rapida filtrazione della soluzione acquosa, - rapida acidificazione della soluzione liquida filtrata con precipitazione dell'acido carnosico grezzo, filtrazione, lavaggio con acqua ed essiccazione del precipitato.
- 13. Metodo secondo la rivendicazione 12 caratterizzato dal fatto che la fase di estrazione del fitocomplesso arricchito in acido carnosico con soluzione acquosa di bicarbonato di sodio prevede la miscelazione del fitocomplesso arricchito in acido carnosico sotto agitazione con una soluzione dal 2,5% al 5% di bicarbonato di sodio a 50-55°C seguita da filtrazione e raffreddamento.
- 14. Metodo secondo la rivendicazione 12 caratterizzato dal fatto che la fase di estrazione del fitocomplesso arricchito in acido carnosico con soluzione acquosa di bicarbonato di sodio prevede la miscelazione del fitocomplesso polverizzato arricchito in acido carnosico con sodio bicarbonato con l'aggiunta di acqua fredda e/o calda a 50-55°C, la quale miscela prima di essere filtrata viene posta sotto agitazione per alcuni minuti a temperatura ambiente e/o a temperature superiori.
- 15. Metodo secondo la rivendicazione 12 caratterizzato dal fatto che la fase di acidificazione della soluzione liquida filtrata avviene con una soluzione all'85% di acido fosforico fino a pH 2.
- 16. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che prevede almeno un passo di cristallizzazione dell'acido carnosico grezzo mediante ricristallizzazione da opportuni solventi organici, quali miscele di cloroformio - n.esano o n.esano.
- 17. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che prevede l'utilizzo di parti aeree fresche di Salvia somalensis e/o Salvia òfficianalis e/o Rosmarinus spp.
- 18. Fitocomplesso arricchito in acido carnosico e/o fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico ottenuto secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 1 a 17 caratterizzato dal fatto che contengono almeno il 20% ed almeno il 25% rispettivamente di acido carnosico e miscela di acido ursolico e oleanolico
- 19. Composto solido cristallino costituito da acido carnosico ottenuto secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 1 a 17 caratterizzato dal fatto che detto composto à ̈ costituito da acido carnosico ad una concentrazione superiore al 50% nel caso di Salvia officinalis, all'85% nel caso di Rosmarinus officinalis e del 95% nel caso di Salvia Somalensis .
- 20. Uso di un procedimento secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 1 a 17 per ottenere acido carnosico ad elevato titolo di purezza da utilizzarsi direttamente o miscelato altre sostanze di origine naturale o sintetica in preparazioni di interesse alimentare, farmaceutico, parafarmaceutico, agrofarmaceutico, cosmetico.
- 21. Uso di un fitocomplesso arricchito in acido carnosico come antifungino o del fitocomplesso stesso per la formulazione di preparati antifungini.
- 22. Uso di un fitocomplesso arricchito in acido carnosico contro patologie causate da Colletotrichum acutatum, Colletotrichum coccodes, Colletotrichum gloeosporides, Fusarium sp., Fusarium oxysporum f.sp basilici, F. cyclaminis, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, S. sclerotiorum.
- 23. Uso di un procedimento per ottenere un fitocomplesso arricchito in acido ursolico e oleanolico da utilizzare, direttamente o miscelato altre sostanze di origine naturale o sintetica, per la preparazione di formulati utilizzabili in campo alimentare, farmaceutico, parafarmaceutico, cosmetico.
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